JP2018509933A - Cl及び/又はch1が突然変異された薬剤コンジュゲーションのための抗体 - Google Patents
Cl及び/又はch1が突然変異された薬剤コンジュゲーションのための抗体 Download PDFInfo
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
Abstract
Description
- 管理書類の整理のためにより単純な製品の特徴づけ、より良好に定義された製品仕様書、及び
- 低下したオフターゲット又はバイスタンダー毒性
- 潜在的により制御された薬理学(考慮に入れる種がより少ない)
- 投与量要件(1グラムあたり)を潜在的に低下させて、同様の薬理学的効果を達成する-副作用の潜在的な発生率の低下(たとえば、免疫原性、毒性等)
- より高いコンジュゲーションの収率及び投与量の低下(投与するADCの所要量)によるコストの低下
a)位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445からなる群から選択される残基を、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸で置換すること、又は
b)位置的付番の慣例に従って、LC T180C、LC S208C、LC S171C、LC S182C、LC A184C、LC V191C、LC S202C、LC S203C、LC T206C、HC S160C、HC T190C、HC S443C、HC S447C、HC S139C、HC S168C、HC V170C、HC V176C、HC T200C、HC S445Cからなる群から選択される残基に、システイン置換を導入すること、又は
c)Xが、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、又は非天然アミノ酸である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと、又は
d)Xが、システイン残基である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと
によって部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、単離又は操作された抗体又はその断片若しくは派生体を更に提供する。
(i)1つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異残基で置き換えることによって親抗体の核酸配列を突然変異誘発して、抗体をコードする工程と、
(ii)突然変異抗体を発現させる工程と、
(iii)突然変異抗体を単離する工程と
を含み得る。
(i)突然変異抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させて、親和性標識した抗体を作製する工程と、
(ii)親和性標識した抗体と捕捉媒体との結合を測定する工程と
を更に含み得る。
LC T180とLC S208の組合せ、
LC T180とLC S171の組合せ、
LC T180とLC S182の組合せ、
LC T180とLC A184の組合せ、
LC T180とLC V191の組合せ、
LC T180とLC S202の組合せ、
LC T180とLC S203の組合せ、
LC T180とLC T206の組合せ、
LC T180とHC S160の組合せ、
LC T180とHC T190の組合せ
LC T180とHC S443の組合せ、
LC T180とHC S447の組合せ、
LC T180とHC S139の組合せ、
LC T180とHC S168の組合せ、
LC T180とHC V170の組合せ、
LC T180とHC V176の組合せ、
LC T180とHC T200の組合せ、
LC T180とHC S445の組合せ。
LC T180CとLC S208Cの組合せ、
LC T180CとLC S171Cの組合せ、
LC T180CとLC S182Cの組合せ、
LC T180CとLC A184Cの組合せ、
LC T180CとLC V191Cの組合せ、
LC T180CとLC S202Cの組合せ、
LC T180CとLC S203Cの組合せ、
LC T180CとLC T206Cの組合せ、
LC T180CとHC S160Cの組合せ、
LC T180CとHC T190Cの組合せ、
LC T180CとHC S443Cの組合せ、
LC T180CとHC S447Cの組合せ、
LC T180CとHC S139Cの組合せ、
LC T180CとHC S168Cの組合せ、
LC T180CとHC V170Cの組合せ、
LC T180CとHC V176Cの組合せ、
LC T180CとHC T200Cの組合せ、
LC T180CとHC S445Cの組合せ。
配列番号33及び配列番号22、
配列番号33及び配列番号23、
配列番号33及び配列番号24、
配列番号33及び配列番号25、
配列番号33及び配列番号26、
配列番号33及び配列番号27、
配列番号33及び配列番号28、
配列番号33及び配列番号29、
配列番号33及び配列番号30、
配列番号33及び配列番号31、
配列番号33及び配列番号32、
配列番号33及び配列番号34、
配列番号33及び配列番号35、
配列番号33及び配列番号36、
配列番号33及び配列番号37、
配列番号33及び配列番号38、
配列番号33及び配列番号39、
配列番号33及び配列番号40。
LC T206とLC S208の組合せ、
LC T206とLC S171の組合せ、
LC T206とLC S182の組合せ、
LC T206とLC A184の組合せ、
LC T206とLC V191の組合せ、
LC T206とLC S202の組合せ、
LC T206とLC S203の組合せ、
LC T206とLC T180の組合せ、
LC T206とHC S160の組合せ、
LC T206とHC T190の組合せ
LC T206とHC S443の組合せ、
LC T206とHC S447の組合せ、
LC T206とHC S139の組合せ、
LC T206とHC S168の組合せ、
LC T206とHC V170の組合せ、
LC T206とHC V176の組合せ、
LC T206とHC T200の組合せ、
LC T206とHC S445の組合せ。
LC T206とLC T180の組合せ、
LC T206とHC S160の組合せ、
LC T206とHC T190の組合せ
LC T206とHC S443の組合せ、
LC T206とHC S447の組合せ、
LC T206CとLC T180Cの組合せ、
LC T206CとHC S160Cの組合せ、
LC T206CとHC T190Cの組合せ
LC T206CとHC S443Cの組合せ、
LC T206CとHC S447Cの組合せ。
HC S160とLC S208の組合せ、
HC S160とLC S171の組合せ、
HC S160とLC S182の組合せ、
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HC S160とLC S202の組合せ、
HC S160とLC S203の組合せ、
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HC S160とLC T206の組合せ、
HC S160とHC T190の組合せ、
HC S160とHC S443の組合せ、
HC S160とHC S447の組合せ、
HC S160とHC S139の組合せ、
HC S160とHC S168の組合せ、
HC S160とHC V170の組合せ、
HC S160とHC V176の組合せ、
HC S160とHC T200の組合せ、
HC S160とHC S445の組合せ。
HC S160とLC T180の組合せ、
HC S160とLC T206の組合せ、
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HC S160とHC S443の組合せ、
HC S160とHC S447の組合せ、
HC S160CとLC T180Cの組合せ、
HC S160CとLC T206Cの組合せ、
HC S160CとHC T190Cの組合せ、
HC S160CとHC S443Cの組合せ、
HC S160CとHC S447Cの組合せ、
HC T190とLC S208の組合せ、
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HC S447とLC S208の組合せ、
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LC S208とLC A184の組合せ、
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配列番号40及び配列番号22、
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配列番号40及び配列番号33、
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配列番号40及び配列番号37、
配列番号40及び配列番号38、
配列番号40及び配列番号39。
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LC S182とHC S160の組合せ、
LC S182とHC T190の組合せ、
LC S182とHC S443の組合せ、
LC S182とHC S447の組合せ、
LC S182CとLC T180Cの組合せ、
LC S182CとLC T206Cの組合せ、
LC S182CとHC S160Cの組合せ、
LC S182CとHC T190Cの組合せ、
LC S182CとHC S443Cの組合せ、
LC S182CとHC S447Cの組合せ。
LC A184とLC S208の組合せ、
LC A184とLC S171の組合せ、
LC A184とLC S182の組合せ、
LC A184とLC V191の組合せ、
LC A184とLC S202の組合せ、
LC A184とLC S203の組合せ、
LC A184とLC T180の組合せ、
LC A184とLC T206の組合せ、
LC A184とHC S160の組合せ、
LC A184とHC T190の組合せ、
LC A184とHC S443の組合せ、
LC A184とHC S447の組合せ、
LC A184とHC S139の組合せ、
LC A184とHC S168の組合せ、
LC A184とHC V170の組合せ、
LC A184とHC V176の組合せ、
LC A184とHC T200の組合せ、
LC A184とHC S445の組合せ。
LC A184とLC T180の組合せ、
LC A184とLC T206の組合せ、
LC A184とHC S160の組合せ、
LC A184とHC T190の組合せ、
LC A184とHC S443の組合せ、
LC A184とHC S447の組合せ、
LC A184CとLC T180Cの組合せ、
LC A184CとLC T206Cの組合せ、
LC A184CとHC S160Cの組合せ、
LC A184CとHC T190Cの組合せ、
LC A184CとHC S443Cの組合せ、
LC A184CとHC S447Cの組合せ。
LC V191とLC S208の組合せ、
LC V191とLC S171の組合せ、
LC V191とLC S182の組合せ、
LC V191とLC A184の組合せ、
LC V191とLC S202の組合せ、
LC V191とLC S203の組合せ、
LC V191とLC T180の組合せ、
LC V191とLC T206の組合せ、
LC V191とHC S160の組合せ、
LC V191とHC T190の組合せ、
LC V191とHC S443の組合せ、
LC V191とHC S447の組合せ、
LC V191とHC S139の組合せ、
LC V191とHC S168の組合せ、
LC V191とHC V170の組合せ、
LC V191とHC V176の組合せ、
LC V191とHC T200の組合せ、
LC V191とHC S445の組合せ。
LC V191とLC T180の組合せ、
LC V191とLC T206の組合せ、
LC V191とHC S160の組合せ、
LC V191とHC T190の組合せ、
LC V191とHC S443の組合せ、
LC V191とHC S447の組合せ、
LC V191CとLC T180Cの組合せ、
LC V191CとLC T206Cの組合せ、
LC V191CとHC S160Cの組合せ、
LC V191CとHC T190Cの組合せ、
LC V191CとHC S443Cの組合せ、
LC V191CとHC S447Cの組合せ。
LC S202とLC S208の組合せ、
LC S202とLC S171の組合せ、
LC S202とLC S182の組合せ、
LC S202とLC A184の組合せ、
LC S202とLC V191の組合せ、
LC S202とLC S203の組合せ、
LC S202とLC T180の組合せ、
LC S202とLC T206の組合せ、
LC S202とHC S160の組合せ、
LC S202とHC T190の組合せ、
LC S202とHC S443の組合せ、
LC S202とHC S447の組合せ、
LC S202とHC S139の組合せ、
LC S202とHC S168の組合せ、
LC S202とHC V170の組合せ、
LC S202とHC V176の組合せ、
LC S202とHC T200の組合せ、
LC S202とHC S445の組合せ。
LC S202とLC T180の組合せ、
LC S202とLC T206の組合せ、
LC S202とHC S160の組合せ、
LC S202とHC T190の組合せ、
LC S202とHC S443の組合せ、
LC S202とHC S447の組合せ、
LC S202CとLC T180Cの組合せ、
LC S202CとLC T206Cの組合せ、
LC S202CとHC S160Cの組合せ、
LC S202CとHC T190Cの組合せ、
LC S202CとHC S443Cの組合せ、
LC S202CとHC S447Cの組合せ。
LC S203とLC S208の組合せ、
LC S203とLC S171の組合せ、
LC S203とLC S182の組合せ、
LC S203とLC A184の組合せ、
LC S203とLC V191の組合せ、
LC S203とLC S202の組合せ、
LC S203とLC T180の組合せ、
LC S203とLC T206の組合せ、
LC S203とHC S160の組合せ、
LC S203とHC T190の組合せ、
LC S203とHC S443の組合せ、
LC S203とHC S447の組合せ、
LC S203とHC S139の組合せ、
LC S203とHC S168の組合せ、
LC S203とHC V170の組合せ、
LC S203とHC V176の組合せ、
LC S203とHC T200の組合せ、
LC S203とHC S445の組合せ。
LC S203とLC T180の組合せ、
LC S203とLC T206の組合せ、
LC S203とHC S160の組合せ、
LC S203とHC T190の組合せ、
LC S203とHC S443の組合せ、
LC S203とHC S447の組合せ、
LC S203CとLC T180Cの組合せ、
LC S203CとLC T206Cの組合せ、
LC S203CとHC S160Cの組合せ、
LC S203CとHC T190Cの組合せ、
LC S203CとHC S443Cの組合せ、
LC S203CとHC S447Cの組合せ。
HC S139とLC S208の組合せ、
HC S139とLC S171の組合せ、
HC S139とLC S182の組合せ、
HC S139とLC A184の組合せ、
HC S139とLC V191の組合せ、
HC S139とLC S202の組合せ、
HC S139とLC S203の組合せ、
HC S139とLC T180の組合せ、
HC S139とLC T206の組合せ、
HC S139とHC S160の組合せ、
HC S139とHC T190の組合せ、
HC S139とHC S443の組合せ、
HC S139とHC S447の組合せ、
HC S139とHC S168の組合せ、
HC S139とHC V170の組合せ、
HC S139とHC V176の組合せ、
HC S139とHC T200の組合せ、
HC S139とHC S445の組合せ。
HC S139とLC T180の組合せ、
HC S139とLC T206の組合せ、
HC S139とHC S160の組合せ、
HC S139とHC T190の組合せ、
HC S139とHC S443の組合せ、
HC S139とHC S447の組合せ、
HC S139CとLC T180Cの組合せ、
HC S139CとLC T206Cの組合せ、
HC S139CとHC S160Cの組合せ、
HC S139CとHC T190Cの組合せ、
HC S139CとHC S443Cの組合せ、
HC S139CとHC S447Cの組合せ。
HC S168とLC S208の組合せ、
HC S168とLC S171の組合せ、
HC S168とLC S182の組合せ、
HC S168とLC A184の組合せ、
HC S168とLC V191の組合せ、
HC S168とLC S202の組合せ、
HC S168とLC S203の組合せ、
HC S168とLC T180の組合せ、
HC S168とLC T206の組合せ、
HC S168とHC S160の組合せ、
HC S168とHC T190の組合せ、
HC S168とHC S443の組合せ、
HC S168とHC S447の組合せ、
HC S168とHC S139の組合せ、
HC S168とHC V170の組合せ、
HC S168とHC V176の組合せ、
HC S168とHC T200の組合せ、
HC S168とHC S445の組合せ。
HC S168とLC T180の組合せ、
HC S168とLC T206の組合せ、
HC S168とHC S160の組合せ、
HC S168とHC T190の組合せ、
HC S168とHC S443の組合せ、
HC S168とHC S447の組合せ、
HC S168CとLC T180Cの組合せ、
HC S168CとLC T206Cの組合せ、
HC S168CとHC S160Cの組合せ、
HC S168CとHC T190Cの組合せ、
HC S168CとHC S443Cの組合せ、
HC S168CとHC S447Cの組合せ。
HC V170とLC S208の組合せ、
HC V170とLC S171の組合せ、
HC V170とLC S182の組合せ、
HC V170とLC A184の組合せ、
HC V170とLC V191の組合せ、
HC V170とLC S202の組合せ、
HC V170とLC S203の組合せ、
HC V170とLC T180の組合せ、
HC V170とLC T206の組合せ、
HC V170とHC S160の組合せ、
HC V170とHC T190の組合せ、
HC V170とHC S443の組合せ、
HC V170とHC S447の組合せ、
HC V170とHC S139の組合せ、
HC V170とHC S168の組合せ、
HC V170とHC V176の組合せ、
HC V170とHC T200の組合せ、
HC V170とHC S445の組合せ。
HC V170とLC T180の組合せ、
HC V170とLC T206の組合せ、
HC V170とHC S160の組合せ、
HC V170とHC T190の組合せ、
HC V170とHC S443の組合せ、
HC V170とHC S447の組合せ、
HC V170CとLC T180Cの組合せ、
HC V170CとLC T206Cの組合せ、
HC V170CとHC S160Cの組合せ、
HC V170CとHC T190Cの組合せ、
HC V170CとHC S443Cの組合せ、
HC V170CとHC S447Cの組合せ。
HC V176とLC S208の組合せ、
HC V176とLC S171の組合せ、
HC V176とLC S182の組合せ、
HC V176とLC A184の組合せ、
HC V176とLC V191の組合せ、
HC V176とLC S202の組合せ、
HC V176とLC S203の組合せ、
HC V176とLC T180の組合せ、
HC V176とLC T206の組合せ、
HC V176とHC S160の組合せ、
HC V176とHC T190の組合せ、
HC V176とHC S443の組合せ、
HC V176とHC S447の組合せ、
HC V176とHC S139の組合せ、
HC V176とHC S168の組合せ、
HC V176とHC V170の組合せ、
HC V176とHC T200の組合せ、
HC V176とHC S445の組合せ。
HC V176とLC T180の組合せ、
HC V176とLC T206の組合せ、
HC V176とHC S160の組合せ、
HC V176とHC T190の組合せ、
HC V176とHC S443の組合せ、
HC V176とHC S447の組合せ、
HC V176CとLC T180Cの組合せ、
HC V176CとLC T206Cの組合せ、
HC V176CとHC S160Cの組合せ、
HC V176CとHC T190Cの組合せ、
HC V176CとHC S443Cの組合せ、
HC V176CとHC S447Cの組合せ。
HC T200とLC S208の組合せ、
HC T200とLC S171の組合せ、
HC T200とLC S182の組合せ、
HC T200とLC A184の組合せ、
HC T200とLC V191の組合せ、
HC T200とLC S202の組合せ、
HC T200とLC S203の組合せ、
HC T200とLC T180の組合せ、
HC T200とLC T206の組合せ、
HC T200とHC S160の組合せ、
HC T200とHC T190の組合せ、
HC T200とHC S443の組合せ、
HC T200とHC S447の組合せ、
HC T200とHC S139の組合せ、
HC T200とHC S168の組合せ、
HC T200とHC V170の組合せ、
HC T200とHC V176の組合せ、
HC T200とHC S445の組合せ。
HC T200とLC T180の組合せ、
HC T200とLC T206の組合せ、
HC T200とHC S160の組合せ、
HC T200とHC T190の組合せ、
HC T200とHC S443の組合せ、
HC T200とHC S447の組合せ、
HC T200CとLC T180Cの組合せ、
HC T200CとLC T206Cの組合せ、
HC T200CとHC S160Cの組合せ、
HC T200CとHC T190Cの組合せ、
HC T200CとHC S443Cの組合せ、
HC T200CとHC S447Cの組合せ。
HC S445とLC S208の組合せ、
HC S445とLC S171の組合せ、
HC S445とLC S182の組合せ、
HC S445とLC A184の組合せ、
HC S445とLC V191の組合せ、
HC S445とLC S202の組合せ、
HC S445とLC S203の組合せ、
HC S445とLC T180の組合せ、
HC S445とLC T206の組合せ、
HC S445とHC S160の組合せ、
HC S445とHC T190の組合せ、
HC S445とHC S443の組合せ、
HC S445とHC S447の組合せ、
HC S445とHC S139の組合せ、
HC S445とHC S168の組合せ、
HC S445とHC V170の組合せ、
HC S445とHC V176の組合せ、
HC S445とHC T200の組合せ。
HC S445とLC T180の組合せ、
HC S445とLC T206の組合せ、
HC S445とHC S160の組合せ、
HC S445とHC T190の組合せ、
HC S445とHC S443の組合せ、
HC S445とHC S447の組合せ、
HC S445CとLC T180Cの組合せ、
HC S445CとLC T206Cの組合せ、
HC S445CとHC S160Cの組合せ、
HC S445CとHC T190Cの組合せ、
HC S445CとHC S443Cの組合せ、
HC S445CとHC S447Cの組合せ。
本明細書中で使用する以下の用語には以下の定義を与える。
- システイン(cys)に突然変異させる残基は、同様の物理化学的特性を有するか、又は小さな非疎水性の非荷電の残基(ser、val、thr、ala)でなければならない。
- システインに突然変異させることを受け入れられる残基は、抗体又はその断片の軽鎖(Cκ、Cλ)又は重鎖(CH1、CH2、又はCH3)のいずれかの定常領域中のものでなければならない。
- 改変抗体又は足場を使用する場合、分子の生物活性と干渉する危険性を最小限にするため、導入されたcysはすべての標的結合界面又はドメインから>5Åの距離にあるべきである。
- cysへの突然変異は、局所的環境及びタンパク質の特性の変更をもたらす鎖内水素結合を生じるべきでない。
- cysへの突然変異は、抗体(又は足場)の鎖又はドメイン間の界面中に配置されていてはならない。通則として、改変は、鎖-鎖又はドメイン-ドメインの界面のどちらかに関与している残基から>5Åの距離にあるべきである。
- cysへの突然変異は、抗体のすべてのネイティブcysから>5Åの距離にあるべきであり、Fcのグリコシル化部位と干渉するべきでない(すなわち、グリコシル化が起こる残基Asn295から>5Åの距離に配置されるべきである)。
- cysへの突然変異は、化学分解の危険性を増加させるべきでない/望ましくない翻訳後修飾を導入するべきでない。
軽鎖:SER171、VAL191、SER208、SER182、THR180、THR206、ALA184、SER203、SER202
重鎖:VAL170、VAL176、THR190、SER445、SER443、SER139、SER160、SER447、THR200、SER168。
- 上清中及びタンパク質A精製後の生成物の力価によって推定されるタンパク質収率は、親分子の少なくとも70%以上でなければならない。
- サイズ排除クロマトグラフィーHPLCによって測定した、コンジュゲーション後に失われた単量体のパーセンテージは、好ましくは≦35%、より好ましくは≦5%、≦10%、≦15%、≦20%、≦25%、又は≦30%である。
- コンジュゲートした分子のパーセンテージ凝集は、好ましくは<5%、<10%、<15%、又は<20%である。
- コンジュゲートした抗体のパーセンテージ断片化は、好ましくは<5%、<10%、<15%、<20%、<25%、<30%、<32%、<35%、又は<40%である。
- コンジュゲートした変異体の解離定数(KD)は、突然変異させていない抗体又は親抗体の参照標準のKDよりも2桁以下(≦2)小さくなければならない。本明細書中に記載の抗体では、参照標準はherceptin(トラスツズマブ)であるが、異なる親抗体を使用した場合は、その親を参照標準として使用できることを理解されたい。
抗体又は抗体変異体の収率は、上清中及びタンパク質A精製後の生成物の力価によって推定する(たとえば、280nmの吸光度を用いたサンドイッチELISAによって、又はHPLCタンパク質A定量によって)。
コンジュゲーションは、標準の技法であるJunutula J Rら、Nature Biotechnology 2008、8、925〜932頁、Jeffrey S Cら、Bioconjugate Chem. 2013、24、1256〜1263頁による、遊離チオール基とのビオチン-マレイミドコンジュゲーションを用いて実施した。
コンジュゲーションの前後で、抗体の凝集及び/又は断片化が原因で失われた単量体のパーセンテージを、サイズ排除クロマトグラフィーHPLC(SEC-HPLC)を使用して定量的に、及びSDS PAGEを使用して定性的に測定した。後者では、それぞれの変異抗体をベータメルカプトエタノールで処理したか、又は処理を与えず、SDS PAGEでサイズ分画した。変異体の明らかな凝集又は断片化は視覚的に見られなかった。
また、石英結晶マイクロバランスを使用して、変異体の結合動力学も分析した。ERB2/HER2 Fcキメラをカルボキシルチップ上に固定し、それぞれの変異体(コンジュゲートしたもの及びコンジュゲートしていないもの)の3つの異なる濃度を試験した。以下の表は、それぞれの変異体のKdを要約している。
最後に、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化-タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS又はLC-ESI-MS)によって、変異体のそれぞれについてDARを決定した。様々な変異体のDAR値は、1つの抗体あたり2つの部位特異的コンジュゲーション部位が存在するため、>1.7及び<2.2でなければならない。
ADCの安定性をin vitroで分析した場合、8日間にわたる、コンジュゲートした分子の損失の平均のパーセンテージは<39%であるべきである。
条件1:35℃で2時間の還元(上述)
条件2:25℃で2時間の還元
条件3:35℃で1時間の還元。
サイズ排除クロマトグラフィーSECを使用
PLRP HPLC又はESI-MS方法を使用
MMAEコンジュゲーション後、ADC変異体をin vitro細胞毒性について試験した。分析は標準の技法によって実施した(Andreotti, P.E.ら、Cancer Res 1995.55、5276〜82頁、Gerhardt, R.T.ら、Am. J. Obstet. Gynecol 1991 165、245〜55頁)。アッセイ用に選択された細胞はNeve R.M.ら、Cancer Cell 2006 10、515〜527頁に基づく。
1日目:培地(McCoy5A+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のSKBR3細胞(5k/ウェル)、培地(DMEM/F12+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のBT474細胞(8k/ウェル)、及び培地(RPMI+10%のFBS+1×Pen/Strep)中のMCF7細胞(4k/ウェル)を、それぞれ3つの96ウェルプレートに播種する。37℃の加湿CO2インキュベーター内で18時間インキュベートする。
- 96ウェルプレートから培地を吸引する。
- 100ulのCell-Titer Glo試薬(Promega Inc.社)をそれぞれのウェルに加える。室温で10分間インキュベートする。
- Tecan Ultraプレートリーダーを使用して発光を決定する。
- パーセント生存度対濃度(nM)又はランダム発光のどちらかとしてデータを分析及びプロットする。
Claims (57)
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の180位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含む、請求項1に記載の抗体。
- 180位の野生型残基がTである、請求項1又は2に記載の抗体。
- 180位の突然変異残基が、システイン(C)、リシン(K)、グルタミン(Q)、又は非天然アミノ酸から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
- 残基206(軽鎖)、160(重鎖)、190(重鎖)、443(重鎖)、及び447(重鎖)(位置的付番)から選択される1つ又は複数の位置の1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- 突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項5に記載の抗体。
- 突然変異残基がLC T180CとHC S160Cの組合せである、請求項5に記載の抗体。
- 位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号33のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 配列番号22〜32及び34〜40からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含み、それぞれのXが、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項9に記載の抗体。
- 配列番号33及び配列番号23のアミノ酸配列を含み、XがCである、請求項10に記載の抗体。
- 標的分子と結合する可変領域と、
a)位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S208、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445からなる群から選択される残基を、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸で置換すること、又は
b)位置的付番の慣例に従って、LC T180C、LC S208C、LC S171C、LC S182C、LC A184C、LC V191C、LC S202C、LC S203C、LC T206C、HC S160C、HC T190C、HC S443C、HC S447C、HC S139C、HC S168C、HC V170C、HC V176C、HC T200C、HC S445Cからなる群から選択される残基に、システイン置換を導入すること、又は
c)Xが、システイン残基、リシン残基、グルタミン残基、若しくは非天然アミノ酸である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと、又は
d)Xがシステイン残基である、配列番号22〜40からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むこと
によって部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、単離又は操作された抗体又はその断片若しくは派生体。 - 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、1つ又は複数の突然変異が、軽鎖の208位(位置的付番)の突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 2つの導入された部位特異的コンジュゲーション部位を含む、請求項14に記載の抗体。
- 208位の野生型残基がSである、請求項14又は15に記載の抗体。
- 208位の突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から選択される、請求項14から16のいずれか一項に記載の抗体。
- 208位の突然変異残基がシステインである、請求項17に記載の抗体。
- 位置的付番の慣例に従って、軽鎖(LC)T180、LC S171、LC S182、LC A184、LC V191、LC S202、LC S203、LC T206、重鎖(HC)S160、HC T190、HC S443、HC S447、HC S139、HC S168、HC V170、HC V176、HC T200、HC S445から選択される1つ又は複数の突然変異を更に含む、請求項14から18のいずれか一項に記載の抗体。
- 突然変異残基が、システイン、リシン、グルタミン、又は非天然アミノ酸から独立して選択され、最も好ましくはシステインである、請求項19に記載の抗体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が配列番号40のアミノ酸配列を含み、XがC、K、Q、又は非天然アミノ酸から選択される、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 配列番号22〜39からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を更に含み、それぞれのXが、C、K、Q、又は非天然アミノ酸から独立して選択される、請求項21に記載の抗体。
- XがCである、請求項21又は22に記載の抗体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21の残基109〜214のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項25に記載の抗体。
- IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む群から選択される、請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体。
- 定常領域が、IgG1定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の抗体。
- 定常領域が、IgG1定常領域のCκ、CH1、及びCH3ドメインのうちの1つ又は複数、好ましくはすべてを含む、請求項28に記載の抗体。
- Fab、二重特異性抗体断片(タンデムscFv-Fc、scFv-Fc、ノブ-イントゥ-ホール、scFv-Fc-scFv、F(ab')2、Fab-scFv、(Fab'scFv)2、scジアボディ-Fc、又はscジアボディ-CH3)、IgGに基づく二重特異性抗体(ハイブリッドハイブリドーマ、共通の軽鎖を有するノブ-イントゥ-ホール、トゥー-イン-ワンIgG、二重VドメインIgG、IgG-scFv、scFv-IgG、IgG-V、V-IgG)、ミニボディ、トリビ-ミニボディ、ナノボディ、及びジ-ジアボディからなる群から選択される、請求項1から29のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒト、ヒト化、又はキメラである、請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体。
- アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、エファリツマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、ベドリズマブ、ラムシルマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、セクキヌマブ、ジヌツキシマブから選択される、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する1つ又は複数の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。
- 配列番号2から配列番号12までから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項33に記載の抗体。
- 1つ又は複数のFcエフェクター機能を欠く、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体。
- ADCC活性を欠く、請求項35に記載の抗体。
- ADCC活性が増加している、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体。
- リンカーを更に含む、請求項1から37のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から38のいずれか一項に記載の抗体と、ペイロードと、ペイロードを抗体に連結させるリンカーとを含む免疫コンジュゲート。
- リンカーが、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PAB)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル、(4-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、SPDB、ヒドラゾン、マレイミドカプロイル、及び6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンイルオキシカルボニル(MC-vc-PAB)から選択されるか、又は、ペプチド鎖を含み、o-ヒドロキシp-アミノベンジル型アルコールに由来する分枝状リンカーであって、ペプチド鎖がp-アミノ基を介してフェニル環と接続しており、ペイロードがベンジル型アルコール部分を介してフェニル環と接続しており、抗体がo-ヒドロキシ基を介してフェニル環と接続している、リンカーである、請求項38に記載の抗体又は請求項39に記載の免疫コンジュゲート。
- ペイロードが、放射性核種、化学療法剤、細胞毒性剤、微生物毒素、植物毒素、ポリマー、炭水化物、サイトカイン、蛍光標識、発光標識、酵素-基質標識、酵素、ペプチド、ペプチド模倣体、ヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、RNA模倣体、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項39又は40に記載の免疫コンジュゲート。
- 標的分子と結合する可変領域と、抗体、断片、又は派生体とペイロードとのコンジュゲーションを許容するように選択された部位特異的コンジュゲーション部位を導入する2つ以上の突然変異を含む定常領域とを有する、抗体又はその断片若しくは派生体であって、2つ以上の突然変異が
LC T180とLC S208の組合せ、
LC T180とLC S171の組合せ、
LC T180とLC S182の組合せ、
LC T180とLC A184の組合せ、
LC T180とLC V191の組合せ、
LC T180とLC S202の組合せ、
LC T180とLC S203の組合せ、
LC T180とLC T206の組合せ、
LC T180とHC S160の組合せ、
LC T180とHC T190の組合せ
LC T180とHC S443の組合せ、
LC T180とHC S447の組合せ、
LC T180とHC S139の組合せ、
LC T180とHC S168の組合せ、
LC T180とHC V170の組合せ、
LC T180とHC V176の組合せ、
LC T180とHC T200の組合せ、及び
LC T180とHC S445の組合せ
からなる群から選択される突然変異を含む、抗体又はその断片若しくは派生体。 - ペイロードが、90Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、ドラスタチン、ベドチン、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE);DM1及びDM4を含めたメイタンシノイド、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、センタナマイシン、イリノテカン、並びにドキソルビシン、アルファ-アマニチン、メラトニン、膜破壊ペプチド、シュードモナス属外毒素A、ジフテリア毒素、リシン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、並びにマンノシル残基からなる群から選択される、請求項41に記載の免疫コンジュゲート。
- ペイロードが微小管破壊剤又はDNA改変剤である、請求項41に記載の免疫コンジュゲート。
- 請求項1から44のいずれか一項に記載の抗体又は免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
- 請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体をペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む、免疫コンジュゲートを作製する方法。
- (i)1つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異残基で置き換えることによって親抗体の核酸配列を突然変異誘発して、抗体をコードする工程と、
(ii)突然変異抗体を発現させる工程と、
(iii)突然変異抗体を単離する工程と
を含む方法によって調製される、請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体。 - 原核又は真核細胞、好ましくは哺乳動物又は昆虫細胞中で発現される、請求項47に記載の抗体。
- (i)突然変異抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させて、親和性標識した抗体を作製する工程と、
(ii)親和性標識した抗体と捕捉媒体との結合を測定する工程と
を更に含む、請求項47又は48に記載の抗体。 - 請求項1から38又は42のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離又は組換えポリヌクレオチド。
- 請求項50に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ポリヌクレオチドと作動可能に連結された誘導性プロモーターを更に含む、請求項51に記載のベクター。
- 請求項51又は請求項52に記載のベクターを含む宿主細胞。
- (a)請求項53に記載の宿主細胞を含む培養培地を用意する工程と、
(b)培養培地を抗体が発現される条件下に置く工程と、任意選択で(c)抗体を単離する工程と
を含む、抗体を産生する方法。 - 2つ以上の突然変異がLC T180とHC S160の組合せを含む、請求項42に記載の抗体。
- 2つ以上の突然変異がLC T180CとHC S160Cの組合せを含む、請求項55に記載の抗体。
- 突然変異残基がシステインに突然変異されている、請求項4、8、又は9のいずれか一項に記載の抗体。
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