JP2018506976A - 生きている大腸菌を埋め込むための改良された乾燥マトリクス、その製造方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年2月11日に、Eric Nadeauによって出願された米国仮特許出願番号第62/114,829号についての利益を主張する。その全体を参照することにより、本開示に上記参照文献の内容が援用される。
これより、本開示の原理を実践することができる態様を説明するために、特定の実施例を記載する。
a.大腸菌の培養
図1に準拠して、最初のステップ100において非動物由来トリプティック・ソイ・アガーで大腸菌(E.coli)株を培養した。次いで、単離した6つのコロニーを用い、2番目のステップ200において大腸菌株を、非動物由来トリプティック・ソイ・ブロス(TSB;TSB1Lに対して、ソイペプトンA3 SC(Organotechnie)20g、無水デキストロース(USP規格、J.T.Baker)2.5g、塩化ナトリウム(USP規格、J.T.Baker)5g、二塩基性リン酸カリウム(USP規格、Fisher Chemical)2.5g)30mL中において、37℃で2時間、200rpmで撹拌培養した。生じた培養液1をTSBで10倍希釈し、次いで、3番目のステップ300において大腸菌株を、非動物由来TSB100mL中において、37℃で2時間、200rpmで撹拌培養するのに用いた。生じた培養液2をTSBで10倍希釈し、次いで、4番目のステップ400において大腸菌株を、非動物由来TSB 1L中において、37℃で5時間、200rpmで撹拌培養するのに用いた。次いで、生じた培養液3をマトリクスに大腸菌を埋め込むために用いた。本明細書記載の培養プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると当業者にとって明らかになる。例えば、非病原性大腸菌を、当該技術分野で公知のプロトコール(Son & Taylor, Curr. Protcoc. Microbiol., 2012, 27: 5A.4.1-5A.4.9)に従って、嫌気条件で培養しても良い。以下の実施例のビーズを調製する際に、カナダ国際寄託当局(IDAC)に2005年1月21日に、アクセッション番号IDAC210105-01で寄託した非病原性大腸菌株を選択しても良い。
混合液を得るために、BactoTMペプトン(1.5g、BD, Mississauga, Canada)を加温した水1.5Lに混合した。アルギン酸塩(30g Grindsted(登録商標)、DuPontTMDanisco(登録商標)、Mississauga、Canada)を、360rpmでマグネティック・バーを用いて混合しながら、混合液にゆっくりと添加した。2%アルギン酸塩(m/v)溶液を得るため、アルギン酸塩の完全な可溶化液を約3時間かけて得た。次いで、溶液(マグネティック・バーを含む)を標準的な条件でオートクレーブした。本明細書に記載されたマトリクスの調製プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
スラリー(slurry)を得るために、マグネティック・バーで撹拌しつつ、オートクレーブ済みのマトリクス溶液に、以下のものを順に添加した。非動物由来TSB 1L、非動物由来TSB 1L中の、生じた大腸菌の培養液3を0.5L(図1に準拠)。スラリーは、Thermo ScientificTMReacti−VapTMエバポレーターから続く9穴吐出シリンジシステムを用いて、重合槽(水中、300mM塩化カルシウム、0.1wt/v%のBactoTMトリプトン、0.1wt/v%のBactoTMペプトン及び0.05wt/v%のBactoTMイーストエクトラクト)に押し出され、ビーズを形成した。重合槽は、スラリーを注入する間、ゆっくりと撹拌した。マトリクスビーズを約30分間クロスリンクさせ、次いで、生じた硬化したビーズを回収した。本明細書に記載された埋め込みプロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
保存溶液の各々について、乾燥及び試験を少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500において、マトリクスに大腸菌を埋め込んだビーズを保存溶液S1、保存溶液S2、保存溶液S3又は保存溶液S4に入れ、約20分間、ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後の総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける、総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
乾燥したマトリクスを飼料へ取り込むプロトコール、例えば飼料添加物の形状での取り込みは当該技術分野において公知である。それを行う説明的実例は、例えば1トンの飼料に500g〜1000gの乾燥したマトリクスビーズを取り込ませることによって行うことができる。所望により、飼料は、不活性化したイースト産物も適量含み得る。例えば、埋め込まれた大腸菌を含む乾燥したマトリクスビーズは、他の全ての含有物と共にホモジナイゼーション槽において混合される。好ましくは、混合物はペレット化工程の間、連続して混合する。次いで、混合された材料は、エクストルーダーに向かって送られる。次いで、エクストルーダーに送られるときに、混合した材料に蒸気があてられる(すなわち、そのために、この段階において混合物の温度は上昇する)。次いで、エクストルーダー内部の経路を通過する間、混合物には適した圧力がかけられる(圧力と温度は上昇し、最高温度の到達点は約75℃である)。次いで、形成されたペレットはエクストルーダーから冷却槽に排出される(更なる冷却によって30〜40℃に急激に温度が低下し、周囲の温度に達する)。飼料添加物(埋め込まれた大腸菌を含むマトリクス)を含むペレット化された飼料は、次いで、例えば袋/容器で保管され得る。本明細書に記載されたペレット化プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り、調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S5、保存溶液S6又は保存溶液S7に入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S0、保存溶液S8又は保存溶液S9のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S10、保存溶液S11又は保存溶液S12のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S13、保存溶液S14又は保存溶液S15のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠し、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S16、保存溶液S17又は保存溶液S18のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1又は保存溶液S19のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総CFU550を決定した。次いで、2番目のステップ600においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A)を用いてセミドライビーズで水分活性(aw)650を測定した。次いで、3番目のステップ700において、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス800は、少なくとも2ステップ:セミドライビーズを得るために、室温で24時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ600、及びドライビーズを得るために64時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ700、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総CFU750を決定し、水分aw760を測定した。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。図2に準拠して、1番目のステップ500においては、実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S2、保存溶液S3及び保存溶液S4に入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S5、保存溶液S6及び保存溶液S7に入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S0、保存溶液S8及び保存溶液S9のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S10、保存溶液S11及び保存溶液S12のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S13、保存溶液S14及び保存溶液S15のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1、保存溶液S16、保存溶液S17及び保存溶液S18のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも3重で行った。実施例1にある通り調製したビーズを保存溶液S1及び保存溶液S19のいずれかに入れ、約20分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約24時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約64時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性awが0.3以下のドライビーズを得た。
Claims (49)
- マトリクスに埋め込まれた、生きている大腸菌(E.coli)であって、親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライドを含み、前記マトリクスの水分活性(aw)が0.3以下である、大腸菌。
- 0.04≦aw≦0.3である、請求項1に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記マトリクスが、10より小さいジサッカライド/第二のポリサッカライド比を含み、前記比が重量%/重量%である、請求項1又は2に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記比が5より小さい、請求項3に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記比が約1である、請求項3に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記親水コロイドを形成するポリサッカライドがアルギン酸塩である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記マトリクスがL−グルタミン酸の塩を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記塩がL−グルタミン酸のナトリウム塩である、請求項7に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記第二のポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 前記第二のポリサッカライドがデキストランである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- 非病原性大腸菌である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の、マトリクスに埋め込まれた大腸菌。
- マトリクスを形成するための組成物であって、親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライド、並びに大腸菌を含む、組成物。
- 前記マトリクスが、10より小さいジサッカライド/第二のポリサッカライド比を含み、前記比が重量%/重量%である、請求項12に記載の組成物。
- 前記比が5より小さい、請求項13に記載の組成物。
- 前記比が約1である、請求項13に記載の組成物。
- 前記親水コロイドを形成するポリサッカライドがアルギン酸塩である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記マトリクスがL−グルタミン酸の塩を更に含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記塩がL−グルタミン酸のナトリウム塩である、請求項17に記載の組成物。
- 前記第二のポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項12〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第二のポリサッカライドがデキストランである、請求項12〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記大腸菌が非病原性大腸菌である、請求項12〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 生きている大腸菌を含む粒子を提供するための方法であって、前記方法が:
・親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライド、並びに大腸菌を含む粒子を提供すること;及び
・水分活性(aw)を0.3以下にするために前記粒子を乾燥させること、
を含む方法。 - 前記乾燥させることが0.04≦aw≦0.3とするために行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記粒子を提供することが:
・混合物を形成するために前記大腸菌を第一のポリサッカライドと混合すること;
・前記混合物に由来する粒子を形成すること;及び
・前記粒子を、スクロース又はトレハロース及び第二のポリサッカライドを含む保存溶液と接触させること、
を含む請求項22又は23に記載の方法。 - 前記保存溶液が、10より小さいジサッカライド/第二のポリサッカライド比を含み、前記比が重量%/重量%である、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比が5より小さい、請求項25に記載の方法。
- 前記比が約1である、請求項25に記載の方法。
- 前記親水コロイドを形成するポリサッカライドがアルギン酸塩である、請求項22〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マトリクスがL−グルタミン酸の塩を更に含む、請求項22〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩がL−グルタミン酸のナトリウム塩である、請求項29に記載の方法。
- 前記第二のポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項22〜30のいずれか一項に記載の前記方法。
- 前記第二のポリサッカライドがデキストランである、請求項22〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 非病原性大腸菌である、請求項22〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記乾燥させることが空気乾燥させることを含む、請求項22〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記乾燥させることが空気乾燥機中で前記粒子を乾燥させることを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記乾燥させることがデシケーター中で前記粒子を乾燥させることを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記乾燥させることが最初に空気乾燥機中で乾燥させ、次にデシケーター中で乾燥させることを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記乾燥させることがフリーズドライさせることを含む、請求項22〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 生きている大腸菌を含むマトリクスであって、親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライドを含み、前記マトリクスの水分活性(aw)が0.3以下である、マトリクス。
- 0.04≦aw≦0.3である、請求項39に記載のマトリクス。
- 前記マトリクスが、10より小さいジサッカライド/第二のポリサッカライド比を含み、前記比が重量%/重量%である、請求項39に記載のマトリクス。
- 前記比が5より小さい、請求項41に記載のマトリクス。
- 前記比が約1である、請求項41に記載のマトリクス。
- 前記親水コロイドを形成するポリサッカライドがアルギン酸塩である、請求項39〜43のいずれか一項に記載のマトリクス。
- 前記マトリクスがL−グルタミン酸の塩を更に含む、請求項39〜44のいずれか一項に記載の前記マトリクス。
- 前記塩がL−グルタミン酸のナトリウム塩である、請求項45に記載のマトリクス。
- 前記第二のポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項39〜46のいずれか一項に記載のマトリクス。
- 前記第二のポリサッカライドがデキストランである、請求項39〜46のいずれか一項に記載のマトリクス。
- 非病原性大腸菌である、請求項39〜48のいずれか一項に記載のマトリクス。
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