JP2018502603A - 新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
薬物治療:
関節リウマチの従来の一般的な治療薬物としては、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)、病状を緩和する抗リウマチ薬(DMARDs)、糖質コルチコイド(GCS)などがある。
TNF−αおよびインターロイキン−1(Interleukin−1、IL−1)は、関節リウマチの発症メカニズム中の最も重要サイトカインであり、近年では、TNF−αやIL−1などを標的とする生物学的製剤は、より多くの選択肢をRA患者に提供した。この種類の薬物は直接に免疫系内の特定の炎症メディエータを対象とし、これによって炎症の進行を急速に制御することに関与し、痛みや硬直などの症状を著しく緩和できる上に、関節損傷をさらに防止することもできる。海外で既に市販されているこの種類の薬物としては、米国Centocor社によって開発・生産されるインフリキシマブ(Infliximab、商品名「Remicade(商標)」)、腫瘍壊死因子受容体−抗体融合タンパク質(エタネルセプト(Etanercept)、商品名「Enbrel(商標)」、米国Amgen社)、および組換え抗TNF−α完全ヒト型モノクローナル抗体(アダリムマブ(Adalimumab)、商品名「Humira(商標)」、米国Abbott社)がある。中国国内で市販されているものとしても、注射用組換えII型腫瘍壊死因子受容体−抗体融合タンパク質(商品名「益賽普(登録商標)」、中信国健;商品名「強克」、上海賽金)、西安ヤンセンによって輸入される注射用インフリキシマブモノクローナル抗体(商品名:「類克(登録商標)」)がある。上記の3種類のTNF−α阻害剤は、リウマチ因子と抗環状シトルリン化ペプチド抗体(CCP)の力価を著しく低下することができ、統計によると、この3種類の薬物によるRA治療の総有効率は50〜70%である。
本格的な内科的治療によっても顕著な効果がなく、血清に高力価の自己抗体がある難治性関節リウマチ患者に対しては、免疫吸着やリンパ球除去などの免疫除去療法を採用することができるが、該方法はDMARDsとの併用によって初めて病状を長期に緩和できる。該方法は血漿交換、免疫吸着やリンパ球除去などを含む。
手術治療としては、滑膜切除術、関節癒合術、骨切り術および人工関節置換術があり、通常は人工関節置換術と滑膜切除術が常用である。しかし、関節置換術は末期の奇形で且つ正常機能を失った関節に適用する。人工関節の寿命は15〜20年であることから、一般的には年齢が50歳超の患者にしか適用されず、常用の場所は膝、股関節および肩部関節である。手術治療は疾患を完治できず、関節の機能の改善および患者のセルフケア能力の向上しかできない。
他の治療方法としては、一般的な治療方法、植物薬による治療、末梢血幹細胞移植、遺伝子治療などの方法がある。
幹細胞移植法は重症・難治性のRAに用いられる。遺伝子治療は、スタートが比較的に遅いが、ヒトゲノムプロジェクトの完成につれて、該方法もRAの治療において特に有用になる。
本発明は上記課題を解決し、ウイルスによる汚染のリスクを低下させ、免疫原性を低減させるために、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法を提供して、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体CMAB008を獲得した。該抗体は市販されている同類の薬物に似ている生物活性を有し、且つ本発明の製品CMAB008は、高マンノース型の割合が低く、Gal−α1,3−Galの末端ガラクトース結合形態が見られず、NGNAの末端シアル酸修飾が見られず、使用過程において免疫原性を低減させることができ;本発明において、ウイルスによる汚染のリスクを低下させるように、動物由来成分フリーの無血清培地で培養する。
1.下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する。
5.前記宿主細胞は真核哺乳動物細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−CR−GS-/-であることを特徴とする、前記新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
8.前記新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
10.関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物と併用投与することをさらに含む、前記のいずれかの使用。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する;
ただし、細胞培養のpHは:6.5〜7.0で、最も好ましくはpH6.7である;細胞培養の温度は:34℃〜37℃で、最も好ましくは35℃である;細胞培養の浸透圧は:295mOsm/kg〜360mOsm/kgで、最も好ましい浸透圧は345mOsm/kgである。
14.関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物、例えば非ステロイド性抗炎症薬、病状を緩和する抗リウマチ薬、糖質コルチコイドなどと併用投与することをさらに含む、前記使用。
が開示される。
用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞発現系で、より高効率の発現が得られるように、ハムスターに最適化したコドンを選択して真核生物高効率発現ベクターを構築した。ハムスター最適化コドンは表1に示す。
生物製薬分野において、宿主細胞の選択には、以下のいくつかの重要な方面に注目する必要がある:グリコシル化および他の翻訳後修飾のタイプは免疫原性をもたらすことを避けられること;宿主細胞はバイオリアクターでの大規模培養に適し、且つ動物由来成分フリーの化学成分限定的(chemically defined and animal component free、ACDF)培地中で高密度まで成長できること;ウイルス安全性;ACDF中で行われるクローニングおよびストレススクリーニングに適すること。
リポソーム法でCHO−CR−GS-/-をコトランスフェクトし、GSスクリーニングシステムでストレススクリーニングし、抗TNF−αキメラ抗体を高効率で発現する安定な細胞クローンを得た。複数回のトランスフェクションおよびスクリーニングにより、発現量が30pg/cell.dayを超える細胞クローンを得た。
われわれはCHO−CR−GS-/-細胞株に対する汎用基本培地に基づき、CMAB008を高効率で発現させるための特殊培地を開発した。基本培地のタイプは動物由来成分フリーの化学成分限定的(chemically defined and animal component free、ACDF)培地、即ち細胞成長の需要に応じて一定の比率でアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースと微量元素などを組み合わせてなる基本培地である。基本培地はスクリーニングで得られる工学的細胞の成長の需要を基本的に満たすことができるが、抗体のグリコシル化修飾のタイプと度合いを制御すると共に、工学的細胞の目的抗体の生成量をさらに高めるために、基本培地に対して、ホルモンや遺伝子工学組換え増殖因子の添加、アミノ酸の仕込み比率の調整を含む最適化調整を行ったところ、最終に抗TNF−αモノクローナル抗体工学的細胞の動物由来成分フリーの無血清大規模培養に適切な特殊培地(CHOM−B08)および特殊補足培地(CHOM−S08)の配合を得た。CMAB008工学的細胞株の大規模培養条件について、培養pH、温度および浸透圧などの面で調査したところ、最終に500L発酵体積で高発現発酵条件を以下のように決定した:培養pHは:6.5〜7.0で、最も好ましくはpH6.7である;培養温度は:34℃〜37℃で、最も好ましくは35℃である;浸透圧は:295mOsm/kg〜360mOsm/kgで、最も好ましい浸透圧は345mOsm/kgである。
スクリーニングされた高発現クローンを動物由来成分フリーの無血清培地で増幅培養し、上澄を収集し、9000rpm×20min、4℃で遠心し、沈殿した細胞と破片を捨てた;Millipore社の50KD限外濾過カセットで限外濾過濃縮を行った後、さらに9000rpm×30min、4℃で遠心し、細胞破片を除去した;0.45μm濾過膜で濾過し、rProtein A(組換えタンパク質A)アフィニティークロマトグラフィーで予備精製を行った;同所洗浄緩衝液は6M GuClで、カラム用結合緩衝液は20mM PB+150mM NaCl pH7.0であった;カラム体積の3〜5倍量で平衡化した後、カラム体積の3〜5倍量の溶出緩衝液20mM Citric Acid(クエン酸緩衝液) pH3.0で溶出し、高純度の目的タンパク質CMAB008を収集して獲得し、そのアフィニティークロマトグラフィースペクトルおよびSDS−PAGE結果は図1に示す。
結果から分かるように、該製品の製造に用いられるCHO−CR−GS-/-工学的細胞にはレトロウイルス粒子が見られなかった(図2)が、対照コントロールであるSP2/0細胞にはレトロウイルス粒子が明らかに見られた(図3)。これは、SP2/0細胞で発現されるRemicadeがウイルスによって汚染されるリスクは、CHOで発現されるCMAB008よりも高いことを表す。
CHOで発現されるCMAB008とSP2/0で発現されるRemicadeのグリコシル化修飾後のグリコシル化のタイプ、部位、度合いの相違を比較するために、HPLC/MS方法によりそれらのグリコシル化修飾状態を検出した。具体的な方法は以下の通りであった: pH:8.0、濃度50mMのNH4HCO3で抗体サンプルを溶解させ、且つ分注した組換えグリコシダーゼと混合し、100ulの反応系を設計し、37℃で24時間インキュベートした。
CHOで発現されるCMAB008とSP2/0で発現されるRemicadeの結合活性の相違を比較するために、バイオレイヤー干渉技術(BLI)により、Octet生体分子間相互作用ワークステーション(ForteBio 米国)でCMAB008とRemicadeの親和定数を測定して比較した。TNF−αはR&D Systems社より購入し(カタログ番号:210−T/CF)、タンパク質センサーはサンプル希釈液(0.02%Tween 20、150mM NaCl、1mg/mL BSA、10mMリン酸塩緩衝液、0.05%アジ化ナトリウム)中で少なくとも5分間水和した。全てのサンプルは緩衝液で希釈した:RemicadeおよびCMAB008モノクローナル抗体は10μgに希釈した。TNF−αはサンプル希釈液で所要の濃度に希釈した。
CHOにおいて発現されるCMAB008とSP2/0において発現されるRemicadeのTNF−αに対する中和活性の相違を比較するために、TNF−αによるL929殺傷実験により、異なるTNF−α抗体のTNF−αに対する中和作用を測定した。具体的な方法は以下の通りであった:
(1)対数増殖期のL929細胞を取り、トリプシンで消化し、カウントし、1回の検出につき(1枚の96ウェルプレートにつき)約2×106個の細胞を取り、遠心して上澄を捨て、培養液Bを加えて細胞密度を1.5×105/mlに調整し、0.1ml/ウェルで96ウェルプレートに入れ、一晩(18〜24h)培養した。96ウェルプレートの外周のウェルを使わないように注意するが、これらのウェルには無菌水を入れる(マルチウェルプレートのエッジ効果を防止するため)。
(4)CMAB008を培養液Eで段階的に1000ng/mlに希釈した。
(7)培養液Eと培養液Dをそれぞれ陰性対照と陽性対照とした(培養液Dが入れたウェルでは、細胞がTNFによって殺傷されない;培養液Eが入れたウェルでは、細胞が最大限で殺傷される)。
回帰方程式:Y = (A-B)/[1+(X/C)D] + B
該方程式により、Cの数値は半数効果濃度(ED50)である。
三回のインビトロ中和実験の結果は表4に示す:
結論:インビトロ中和実験の結果から分かるように、Remicade(登録商標)とCMAB008の両者は、TNF−αとダクチノマイシンDのL929細胞に対する殺傷を中和する半数効果濃度がそれぞれ17.32ng/mlと16.57ng/mlであり、統計学的な差はない。
競合法によりCMAB008の相対的な親和力を測定し、文献で報告されているRemicadeの親和定数および親和定数の計算方法に基づき、CMAB008の親和定数を算出し、且つRemicadeと比較した。具体的な実験方法は以下の通りであった。
(2)37℃で2時間コーティングした。
(4)PBSでウシ血清アルブミンを3%に希釈し、満水になるまでELISAプレートに入れた。
(6)ウェル中の液を捨て、PBSTで3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた。
(8)PBSでHRP標記CMAB008を0.34μg/mlに希釈し、PBSでCMAB008を10μg/mlに希釈し、さらに両者を同体積で均一に混合した。
(12)ウェル中の液を捨て、PBSTで3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた。
(14)室温で10分間遮光下で反応させた。
(16)630nmを基準波長として、マイクロプレートリーダーでOD450nmを測定した。
Y = (0.61842 - 0.07665) / [1+(X/0.14889)1.38126] + 0.07665
CMAB008の回帰方程式は、
Y = (0.59358 - 0.07187) / [1+(X/0.1439)1.34198] + 0.07187
である。
[X]-[R] = (1/KX)-(1/KR)
である。
CMAB008およびRemicadeの生体内でヒトTNF−αを中和する作用を比較するために、昆明マウスの体内に両者の抗体をそれぞれ注射し、それらのrh−TNF−αの毒性に対する阻害作用を検出した。
昆明マウス(メスとオスはそれぞれ半分)、4〜6週齢、20±2g/匹。第二軍医大学動物センターより購入された。
CMAB008:上海張江生物技術株式会社より提供された試験サンプルで、100mg/本であった。ロット番号20040601。10ml無菌注射用水で溶解し、濃度を10mg/mlとした。4℃で保管した。
陰性対照:5%ショ糖、0.05mg/mlTween 80を含有する10mmol/lリン酸塩緩衝液であり、pH7.2で、濾過して除菌した後、2〜8℃で保管した。CMAB008およびRemicadeの賦形剤成分はいずれもそれと同様であった。
方法と結果:
rh−TNF−αの毒性投与量の測定
種の違いのため、ヒトTNF−αのマウスに対する毒性投与量はマウス由来のTNF−αよりも遥かに高く、報告によると、ヒトTNF−αのマウスに対するLD50は約4〜8mg/kgであり、凡そ1匹のマウスにつき80〜160μg注射することに該当する[1-4]。1987年、ドイツの学者Lehmannらはマウスの処理にD(+)−ガラクトサミンを使用することで、ヒトTNF−αのマウスに対する毒性作用を1,000倍程度高めることができ、LD50は僅か0.1〜1.0μg/匹であることを初めて報告した[5]。そのため、D(+)−ガラクトサミンをTNF−αの増感剤に用いて構築したマウス毒性モデルは既に研究界で広く使用されている。
Remicadeの臨床使用量は3mg/kgであり、体表面積相当量で計算すると、マウスへの投与量は27mg/kgであるはずなので、平均体重が約20gのマウスの場合、1匹の投与量は約500μgになる(予測投与量の5倍に該当する)。該投与量のCMAB008の中和能を初歩的に調査する必要がある。
Remicade群
A.500μg/匹でRemicadeを静脈内注射し、72時間後、0.1mlのPBSを腹腔内注射した。
A.500μg/匹でCMAB008を静脈内注射し、72時間後、0.1mlのPBSを腹腔内注射した。
Remicade群の実験結果は表9に示す:
第I相単回投与の研究方法:組入れ・除外基準に合致する健康な被験者27名を1群につき9名で、無作為に3群に分けた。低投与量群の被験者には、注射用CMAB008を1mg/kgで単回静脈内点滴し;中投与量群の被験者には、注射用CMAB008を3mg/kgで単回静脈内点滴し;高投与量群の被験者には、注射用CMAB008を10mg/kgで単回静脈内点滴した。輸液時間は2時間とした。静脈内点滴前および静脈内点滴終了後の1、28および56日目に、一般血液検査、一般尿検査、生化学的血液検査、生命兆候検査、心電図、胸部X線写真および一般症状観察を行い、常に有害事象を密接に観察・記録した。1、3、10mg/kgの第I相単回投与において、選択された27名は、研究室における各指標はほとんど正常であり、副作用率が高いほうから順番に目眩、筋肉痛、発熱、腹痛などであるが、いずれの反応も軽微であり、注射関連反応は明らかではなかった。
(1)単回投与:
研究方法:選択基準・除外基準に合致する健全健康な被験者27名を1群につき9名で、無作為に3群に分けた。低投与量群の被験者には、注射用CMAB008を1mg/kgで単回静脈内点滴し;中投与量群の被験者には、注射用CMAB008を3mg/kgで単回静脈内点滴し;高投与量群の被験者には、注射用CMAB008を10mg/kgで単回静脈内点滴した。輸液時間は2時間とした。
血清ADA検出実験は以下の通りであった:
実験ステップ:
1)リン酸塩緩衝液(PBS)でCMAB008抗体を0.5μg/mlに希釈し、100μl/ウェルでELISAプレート(NUNC)に入れた;
2)37℃インキュベーターに2時間置き、若しくは4℃で一晩置いた;
3)ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、0.1%Tween 20含有PBSでプレートを3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた;
4)3%ウシ血清アルブミン(上海生工生物工学株式会社)(PBSで希釈)を満水になるまで(約350μl/ウェルで)ELISAプレートに入れ、37℃インキュベーターに2時間置き、若しくは4℃で一晩置いた;
5)ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、0.1%Tween 20含有PBSでプレートを3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた;
6)PBSでウサギ抗CMAB008ポリクローナル抗体(本研究室の自作品、CMAB008でウサギを免疫し、抗血清を取り、CMAB008アフィニティークロマトグラフィーで精製して得た溶出ピーク)を10μg/mlに希釈し、希釈された陽性対照、陰性対照(健康なボランティアの混合血清、10倍希釈)、空白対照(PBS)および試験サンプル(10倍希釈)を100μl/ウェルでELISAプレートに入れ、重複ウェルを設け、37℃インキュベーターに2時間置いた;
7)ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、0.1%Tween 20含有PBSでプレートを3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた;
8)HRP標識CMAB008(本研究室の自作品、Pierce社のHRP標識キットでCMAB008を標識し、且つゲルパーミエーションクロマトグラフィーで精製して得られたもの)を1:500で希釈し(PBS)、100μl/ウェルでELISAプレートに入れ、置于37℃インキュベーターに45分間置いた;
9)ウェル中の液を捨て、吸水紙の上で叩いて乾燥させ、0.1%Tween 20含有PBSでプレートを3回洗浄し、毎回で吸水紙の上で叩いて乾燥させた;呈色基質AとB(晶美生物工学株式会社)を同体積で均一に混合し、100μl/ウェルでELISAプレートに入れ、室温で5〜20分間遮光下で反応させた(呈色状況に応じて呈色時間を決定した);
10)終了液を50μl/でELISAプレートに入れ、速やかに均一に混合した;マイクロプレートリーダーでOD450nmを読み取り、630nmを基準波長とした。
1回につき、プレートあたりに2つの空白対照、2つの陰性対照、3つの陽性対照を設ける必要がある。
空白対照のO.D.値を引いた後、0≦2つの陰性対照のO.D値≦0.15となるべ必要がある。
2つ以上の陽性対照のO.D.値の差は30%以上になってはならず、そうならない場合には、検出し直す必要がある。
C.O.=2.1×(陰性対照O.D.−空白対照O.D.)
(サンプルO.D.−空白対照O.D.)/C.O.≧1であれば、陽性と判別した。
方法:
1)対数増殖期のL929細胞を取り、培地を加えて細胞密度を1.5×105/mlに調整し、0.1ml/ウェルで96ウェルプレートに入れ、一晩(18〜24h)培養した。
4)希釈液で陽性対照サンプルを1μg/mlに希釈した。
6)上記の試験サンプル、陰性、陽性および空白対照サンプルを0.1mL/ウェルで96ウェルプレートに入れ、重複ウェルを設け、一晩(18〜24h)培養した。
1回につき、プレートあたりに2つの空白対照、2つの陰性対照、3つの陽性対照を設ける必要がある。
2つの陰性対照のO.D.値は≧0.80である必要がある。
3つの陽性対照のうち、少なくとも2つのO.D値は≦0.40とある必要がある。
陽性対照のO.D.平均値と陰性対照のO.D.平均値の差は0.40未満になってはならない。
サンプルO.D./C.O.<1であれば、陽性と判別した。
7#、8#の被験者の血清中における中和抗体の検出結果はいずれも陰性であり、具体的な結果は表15に示し、#7、#8の被験者の血清中におけるCMAB008の血中薬物濃度を解析したところ、他の被験者の血清中における薬物濃度との有意な差は見られなかった。
研究方法:関節リウマチ患者を9名選択し、第II相臨床試験で定められる治療投与量(3mg/
kg)を採用し、0、2、6、10、14週目に静脈内点滴し、輸液時間を2時間とし、毎回の投与前および最終投与後の2、12週目に臨床観察した。被験者がCMAB008抗体を反復投与された後の血清における抗CMAB008抗体(ADA)の生成状況を検出するために、毎回の点滴前および最終の点滴の終了後の1、2、4、6、8、12週目に採血し、血清における抗CMAB008抗体(ADA)の検出を行った。ADA検出および中和抗体検出の具体的な実験ステップおよびスクリーニング基準は単回投与試験と同様であった。
(3)第III相臨床研究:
研究方法:無作為・二重盲検・並行・多施設共同試験。患者は組入れられる前に、少なくとも3ヶ月のMTX治療を受け、且つMTX投与量が7.5〜20mg/週に保持されたが、病状はうまく抑えられなかった。被験者は0、2、6、14週目に、それぞれ3mg/kgのインフリキシマブまたはプラシーボの静脈内点滴を受けると同時に、毎週で同様の所定投与量でMTXを飲んだ。それぞれ試験の0、2、6、14、18週目に被験者の様子を追跡調査し、治療効果および副作用を評価した。
血清における中和抗体の検出(L929細胞によるTNF−α毒性阻害試験):
具体的な実験ステップおよびスクリーニング基準は単回投与と同様であった。
Claims (24)
- 下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する。 - ハムスターに最適化したコドンに基づいて、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖を設計および合成することを特徴とする、請求項1に記載の新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項1に記載の核酸分子と、前記核酸分子の配列に作動可能に連結される発現調節配列とを含むベクターであって、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFRの中の1つであってもよいベクター。
- pcDNA3.1(+)またはpcDNA3.1/ZEO(+)である請求項3に記載のベクター。
- 前記宿主細胞は真核哺乳動物細胞CHO−CR−GS-/-であることを特徴とする、請求項1に記載の新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
- 無血清培養方式により宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項1に記載の新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項1に記載の新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項1に記載の新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項8に記載の組成物の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
- 関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物と併用投与することをさらに含む、請求項8と9のいずれかに記載の使用。
- 下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する;
ただし、細胞培養のpHは:6.5〜7.0で、最も好ましくはpH6.7である。 - 下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する;
ただし、細胞培養の温度は:34℃〜37℃で、最も好ましくは35℃である。 - 下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する;
ただし、細胞培養の浸透圧は:295mOsm/kg〜360mOsm/kgで、最も好ましい浸透圧は345mOsm/kgである。 - 下記工程を備えることを特徴とする、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体の製造方法。
a)新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体に、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖と、配列番号3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖とを含有させる;
b)工程a)で得られるヌクレオチド断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする;
c)培養条件を最適化し、大規模培養し、新規組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体を得、分離精製する;
ただし、細胞培養のpHは:6.5〜7.0で、最も好ましくはpH6.7である;細胞培養の温度は:34℃〜37℃で、最も好ましくは35℃である;細胞培養の浸透圧は:295mOsm/kg〜360mOsm/kgで、最も好ましい浸透圧は345mOsm/kgである。 - 水と、配列番号2に示されるアミノ酸の軽鎖および配列番号4に示されるアミノ酸の重鎖を含有し、Gal−α1,3−Galの末端ガラクトース結合形態を有しない組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体とを含む組成物。
- 水と、配列番号2に示されるアミノ酸の軽鎖および配列番号4に示されるアミノ酸の重鎖を含有し、NGNAの末端シアル酸修飾を有しない組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体とを含む組成物。
- 水と、配列番号2に示されるアミノ酸の軽鎖および配列番号4に示されるアミノ酸の重鎖を含有し、Gal−α1,3−Galの末端ガラクトース結合形態およびNGNAの末端シアル酸修飾を有しない組換え抗TNF−αキメラモノクローナル抗体とを含む組成物。
- 請求項15〜17のいずれかに記載の組成物の、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項15〜17のいずれかに記載の組成物の、関節リウマチを治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項15〜17のいずれかに記載の組成物の、強直性脊椎炎を治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項15〜17のいずれかに記載の組成物の、乾癬性関節炎を治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項15〜17のいずれかに記載の組成物の、斑状乾癬を治療するための薬物の製造における使用。
- 関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬などを治療するための他の薬物、例えば非ステロイド性抗炎症薬、病状を緩和する抗リウマチ薬、糖質コルチコイドなどと併用投与することをさらに含む、請求項18〜22のいずれかに記載の使用。
- 前記併用投与する薬物はメトトレキサートである、請求項23に記載の使用。
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