JP2018201521A - 遺伝子改変されたマウスおよび移植方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子改変された非ヒト動物の分野に関し、特に、RAG遺伝子ノックアウト、Il2rgIl2rg遺伝子ノックアウト、ならびにIL-3およびGM-CSF遺伝子のヒト化、ならびに任意でTPO遺伝子のヒト化を有する、免疫不全マウス;TPO遺伝子のヒト化を有するRAG/Il2rgIl2rgノックアウトマウス;ヒト造血細胞を用いて移植された、遺伝子改変されたマウス;およびヒト病原体、例えばチフス菌(Salmonella typhi)または結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に感染する、移植されたマウスに関するものである。
遺伝子改変されたマウス、改変および移植されたマウス、ならびに、例えば薬物検査の目的のための、ヒト疾患のモデル化におけるそれらの使用は、当技術分野で公知である。ヒト免疫システムをモデル化するために、遺伝子改変されたマウスを使用することが試みられてきた。その分野の概説は、Manz (2007) Human-Hemato-Lympoid-System Mice: Opportunities and Challenges, Immunity, 26:537-541(非特許文献1)に提供されており、それを参照により本明細書に組み入れる。
遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。その非ヒト動物には、1つまたは複数の内在性遺伝子のノックアウトおよび1つまたは複数のヒト化遺伝子(すなわち、内在性遺伝子のヒトの類似体または相同体との、その内在性の遺伝子座での置換)を含むマウスが含まれる。
[本発明1001]
(a) マウスRAG遺伝子ノックアウト;
(b) マウスIl2rg遺伝子ノックアウト;
(c) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換;および
(d) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含む、遺伝子改変されたマウス。
[本発明1002]
ヒトトロンボポエチン遺伝子がマウストロンボポエチン遺伝子座に存在する、マウストロンボポエチン遺伝子の該ヒトトロンボポエチン遺伝子との置換
をさらに含む、本発明1001のマウス。
[本発明1003]
前記RAG遺伝子ノックアウトが、RAG1遺伝子ノックアウト、RAG2遺伝子ノックアウト、およびこれらの組合せから選択される、本発明1001のマウス。
[本発明1004]
ヒト造血細胞の移植をさらに含む、本発明1001のマウス。
[本発明1005]
前記ヒト造血細胞が、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群より選択される、本発明1004のマウス。
[本発明1006]
前記ヒト造血細胞が、CD34+細胞であるヒト臍帯血細胞である、本発明1005のマウス。
[本発明1007]
CD34陽性細胞、造血幹細胞、造血細胞、骨髄前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、またはこれらの組合せであるヒト細胞を含む、本発明1003のマウス。
[本発明1008]
ヒト造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)、ヒト骨髄前駆細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト樹状細胞、ヒト単球、ヒト顆粒球、ヒト好中球、ヒト肥満細胞、ヒト胸腺細胞、ヒトT細胞、ヒトB細胞、ヒト血小板を含む、本発明1003のマウス。
[本発明1009]
チフス菌(Salmonella typhi)感染を含む、本発明1004のマウス。
[本発明1010]
前記チフス菌感染が、全身的なチフス菌感染である、本発明1009のマウス。
[本発明1011]
結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を含む、本発明1004のマウス。
[本発明1012]
ヒト免疫細胞を含む肺肉芽腫を含む、本発明1011のマウス。
[本発明1013]
(a) 遺伝子改変され、移植され、かつヒト病原体に感染したマウスに剤を投与する段階であって、
該マウスが、
(i) RAG1遺伝子ノックアウトもしくはRAG2遺伝子ノックアウト、またはこれらの組合せ、
(ii) Il2rg遺伝子ノックアウト、
(iii) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換、および
(iv) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含み、
該マウスが、CD34陽性ヒト臍帯血細胞またはCD34陽性ヒト胎児肝細胞を用いて移植される、段階;ならびに
(b) 該剤がヒト病原体に感染した該マウスにおいて該ヒト病原体の量を低減するかどうかを判定する段階
を含む、ヒト病原体感染を抑制する剤を同定するための方法。
[本発明1014]
前記マウスが、マウストロンボポエチン遺伝子のヒトトロンボポエチン遺伝子との置換をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記ヒト病原体がチフス菌である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記ヒト病原体がマイコバクテリアであり、かつ該マイコバクテリアが、ヒト免疫細胞を含む肉芽腫を前記マウスにおいて引き起こす、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記マイコバクテリアが結核菌である、本発明1016の方法。
本発明は、記載した特定の態様に限定されるものではなく、認められる特許請求の範囲によって説明されるものである。
ヒト免疫システムの成分を含むマウス(HISマウス)は、インビボでのヒト免疫システムの研究に、ヒトワクチンの試験に、およびヒトの疾患および障害を治療するための薬物の試験と開発にかなり有望である。HISマウスは、重症免疫不全マウス株(例えば、組換え活性化遺伝子2(Rag2)ノックアウト(KO)インターロイキン2受容体γ(Il2rg)KOマウス)にヒト造血幹細胞前駆細胞を移植することによって作製される。非ヒト霊長類に比べて、HISマウスは小型動物モデルの利点を有しており、すなわち、それらはより多目的な実験を可能にし、研究団体にとってよりアクセス可能であり、また、ヒト被験者を用いて実験を行うより倫理的に許容される。最も重要なことは、HISマウスから得られた実験結果がヒトへの関連性が高く、ヒトに応用できる可能性があることである。なぜならば、ヒト特異的病原体を用いた感染、ならびにヒト特異的免疫応答および免疫病理学の研究が今や実現可能になりつつあるからである。
造血幹細胞(HSC)は2つの主な特性によって特徴づけられる:生涯にわたる自己再生能、およびすべての成熟した造血系細胞への分化能。HSCプールの恒常性を確保するために、細胞分裂時に、HSCは一方の機能的HSCを生成するが、他方の子孫細胞は高度に組織化された分化と細胞増殖のプログラムを受け、その間に複数の系列に方向づけされた前駆細胞、および最後には最終分化細胞が生成されると考えられる。
本明細書に記載されるhIL-3/GM-CSFおよびhTPOマウスの子孫は、少なくとも同じ関連する特徴を有し、親系統(すなわち、hIL-3/GM-CSFマウスとhTPOマウス)と少なくとも同じ利点を示すと予想される。例えば、いずれか一方の親系統、または両方、またはその子孫からヒト細胞集団を単離し、かつhTPOマウスまたはhIL-3/GM-CSFおよびhTPOマウスの子孫に連続移植することが可能である。したがって、一局面において、本明細書に記載するhIL-3/GM-CSFマウスとhTPOマウスの子孫(各関連遺伝子に関してホモ接合性に交配させた子孫を含む)である遺伝子改変されたマウスが提供され、かつこの遺伝子改変されたマウスはhIL-3/GM-CSFマウスとhTPOマウスの両方の利点および特徴を示す。一局面においては、除去された免疫システムを含む(例えば、照射されたマウス)、任意の移植されたマウス(例えば、本明細書に記載する移植されたマウス)からの移植および/または連続移植に適している、そのような子孫マウスが提供される。
本発明による遺伝子改変されたマウスは、移植したヒト造血細胞からヒト免疫細胞を発達させることができる、ヒト造血細胞のレシピエントとして使用される。一態様では、ヒト造血細胞またはヒト造血幹細胞前駆細胞(HSPC)が、本発明によって遺伝子改変および照射されたマウスに配置される(移植される)。ヒト造血細胞またはヒト造血幹細胞は、遺伝子改変されたマウスにおいて、以下から選択される細胞を生じさせる:ヒトCD34陽性細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト造血細胞、骨髄前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞、およびヒト血液-リンパシステム(ヒト造血幹細胞前駆細胞、ヒト骨髄前駆細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト樹状細胞、ヒト単球、ヒト顆粒球、ヒト好中球、ヒト肥満細胞、ヒト胸腺細胞、ヒトT細胞、ヒトB細胞、ヒト血小板を含む)、ならびにこれらの組合せ。
ヒト造血細胞を用いて移植された、遺伝子改変されたマウスは、通常はマウスに感染しない病原体を研究するための有用動物である。そのような一例は腸チフスの原因病原体チフス菌である。
トロンボポエチン(TPO)は、巨核球および血小板の発達を促進する成長因子として最初に同定された(Wendling, F. et al. (1994) cMpl ligand is a humoral regulator of megakaryocytopoiesis, Nature 369:571-574; Kaushansky, K. et al. (1994) Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin, Nature 369:568-571; Lok, S. et al. (1994) Cloning and expression of murine thrombopoietin cDNA and stimulation of platelet production in vivo, Nature 369:565-568; de Sauvage, F.J. et al. (1994) Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand, Nature 369:533-538; Bartley, T.D. et al. (1994) Identification and cloning of a megakaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor Mpl, Cell 77:1117-1124; Kaushansky, K. (1998) Thrombopoietin, N Engl J Med 339:746-754; Kaushansky, K. (2005) The molecular mechanisms that control thrombopoiesis, J Clin Invest 115:3339-3347; Kaushansky, K. (2008) Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis, Blood 111:981-986)。
ヒトIL-3/GM-CSFおよびヒトTPOマウスの作製
hIL-3/GM-CSFターゲティング
1回のターゲティング工程でマウスIL-3遺伝子をヒトIL-3遺伝子と置換し、マウスGM-CSF遺伝子をヒトGM-CSF遺伝子と置換するためのターゲティング構築物は、ギャップ修復クローニングを利用するVELOCIGENE(登録商標)技術(例えば、米国特許第6,586,251号およびValenzuela et al. (2003) "High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis," Nat Biot 21(6):652-659を参照されたい。参照により本明細書に組み入れる)を用いて構築した。
ターゲティングベクターを線状化し、これを用いてValenzuelaらに記載される通りにマウスES細胞をエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーション処理を行った、ターゲティングベクターを含むマウスES細胞は、ロキシド薬物選択カセットを除くために、一過性Cre発現ベクターを用いてさらにエレクトロポレーションにかけた。そのターゲティングベクターをRag2 HET Il2rg y/- ES細胞にエレクトロポレーションにより導入した。RAG2遺伝子とIl2rg遺伝子のノックアウトがなされた親ES細胞株は市販のV17 ES細胞(BALB/c×129ヘテロ接合体)であった。hIL-3およびhGM-CSF遺伝子でターゲティングされたES細胞は、マウス胚に導入するために使用した。
ターゲティングされたドナーES細胞を、8細胞期のマウス胚にVELOCIMOUSE(登録商標)法により導入する(例えば、米国特許第7,294,754号およびPoueymirou et al. (2007) "F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses," Nat Biot 25(1):91-99を参照されたい。参照により本明細書に組み入れる)。ヒト化IL-3およびGM-CSF構築物を保持するVELOCIMICE(登録商標)(完全にドナーES細胞に由来するF0マウス)は、対立遺伝子アッセイ法の変法(例えば、Valenzuelaら参照)を用いて、マウス対立遺伝子の喪失とヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を同定することによって同定される。これらのマウスを最初にBALB/cAnNCRと交配させ、次にRag2とIl2rgについてヘテロ接合性で、ヒトIL-3/GM-CSF KIを含むマウスを、移植研究のためにRag2/Il2rg二重KOマウスと交配させる。
ヒト化マウスは、hGM-CSF特異的プライマーを用いるRT-PCRによって、ヒトGM-CSFの産生について試験した。試験した組織のヒトGM-CSFの発現パターンはマウスGM-CSFのそれに一致した(主に肺で発現)。ConAとIL-2で48時間刺激した、ヒト化マウス由来の脾細胞のELISAを実施して、hIL-3とhGM-CSFの存在を検出した。脾細胞はhIL-3とhGM-CSFの両方の発現について陽性であった。
1回のターゲティング工程でマウスTpo(mTpo)遺伝子をヒトTPO(hTPO)遺伝子と置換するためのターゲティング構築物(図11(d))は、ギャップ修復クローニングを利用するVELOCIGENE(登録商標)技術を用いて構築した(Valenzuela et al.)。このベクターは、Tpoのオープンリーディングフレームを含む配列を置換するが、マウス由来のプロモーターと5'UTRを維持するように設計された。マウス配列を細菌人工染色体(BAC) RPCI-23、クローン98H7から得た。ヒト配列をBAC RPCI-11、クローン63m3から得た。p15複製起点を含むギャップ修復ドナーベクターは、mTpo ATGのすぐ上流の5'マウスホモロジーアーム、hTPO ATGから約275ntまでhTPO遺伝子にわたるヒト5'TPOホモロジーアーム、ポリリンカー、hTPO遺伝子のポリA配列の約1.5kb下流で開始する3'hTPOホモロジーアーム、およびロキシド薬物選択カセットと、これに続くmTpoポリA配列の下流(約3.5kb下流)の配列を有するマウス3'ホモロジーアームをクローニングすることによって構築した。このギャップ修復ベクターを線状化し、かつヒトBACクローンRPCI-11、63m3と組換え酵素ベクターを含む大腸菌DH10B株に挿入した。細胞を薬物選択培地で増殖させた。個々のクローンを増殖させて、ギャップ修復ドナーベクターDNAを抽出し、適切なマウス-ヒト接合点について該ベクターの部分を配列決定した。パルスフィールドゲル電気泳動を用いて、挿入物のサイズおよび予想される制限断片長を確認した。hTPO遺伝子に隣接するマウス上流および下流ホモロジーボックスおよびロキシド薬物選択カセットを含む捕捉ドナーを修復ドナーベクターから得て、その捕捉ドナーを線状化し、線状化した捕捉ドナーを、RPCI-23クローン98H7とpABGベクターを含む大腸菌DH10Bに導入した。細胞を薬物選択培地で増殖させた。RPCI-23クローン98H7 DNA中に捕捉ドナーDNAを含む(ターゲティングベクターを形成する)個々のクローンを単離し、ターゲティングベクターDNAを抽出し、かつ適切なマウス-ヒト接合点について該ベクターの部分を配列決定した。パルスフィールドゲル電気泳動を用いて、挿入物のサイズおよび予想される制限断片長を確認した。ターゲティングベクターを線状化し、これを用いてマウス胚性幹(ES)細胞をエレクトロポレーションにかけた。ターゲティングベクターはRAG2+/-γcY/-ES細胞にエレクトロポレーションにより導入した。親RAG2+/-γc Y/-ES細胞株は、市販されているV17 ES細胞株(BALB/c×129ヘテロ接合体)から作られた。正しくターゲティングされたES細胞は、ロキシド薬物選択カセットを除くために、一過性Cre発現ベクターを用いてさらにエレクトロポレーションにかけた。hTPOでターゲティングされた、選択カセットを含まないES細胞を、8細胞期のマウス胚にVELOCIMOUSE(登録商標)法により導入した(Poueymirou et al)。野生型Tpo(TPOm/m)、ヘテロ接合型(TPOh/m)またはホモ接合型(TPOh/h)TPO遺伝子置換をもつRag2-/-γc -/-マウスが得られた。
hIL-3/GM-CSFマウス:移植
ヒト造血幹細胞の単離
ヒト臍帯血および胎児肝臓試料は、それぞれイェールニューヘブン病院(Yale-New Haven Hospital)およびアルバート・アインシュタイン医科大学ニューヨーク(Albert Einstein Medical College New York)から、イェール大学の人権擁護調査委員会(Human Investigation Committee)の承認の下で得られたものである。CD34+細胞は、ヒト臍帯血または胎児肝臓から、密度勾配遠心およびCD34マイクロビーズ(Miltenyi Biotec社)を用いる免疫磁気選別によって単離した。単離されたCD34陽性細胞の純度をフローサイトメトリーにより確認した。精製したヒトCD34陽性細胞は凍結保存され、使用前に液体窒素中で保存した。
移植は以前に記載された通りに行った(Traggiai et al. (2004) Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science 304:104-107)。簡単に説明すると、出生日に、RAG2遺伝子ノックアウト/Il2rg遺伝子ノックアウトの背景(hIL-3/hGM-CSFを含むまたは含まない)からの仔マウスを亜致死的に照射した(4時間間隔で2×200cGy)。照射後、新生仔は30ゲージ針を用いる肝内注射によって1〜2×105個のヒトCD34+細胞(25μLのPBS中に再懸濁したもの)を受け取った。対照にはPBSのみを注射した。マウスは生後3〜4週間で離乳させ、特定病原体フリーの条件下で維持した。日和見感染を防ぐために、マウスに飲料水中の予防的抗生物質(サルファトリム(Sulfatrim))を投与した。すべての動物実験作業はイェール大学の動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)によって承認され、IACUCの規則に従って実施された。
ヒト造血細胞の生着は移植後8〜12週で判定した。血液試料を後眼窩洞(retro-orbital sinus)から採取し、ACK溶解緩衝液(Lonza社)を用いて赤血球の溶解を行った。次に、試料をマウスCD45、ヒトCD45、ヒトCD3、およびヒトCD14に対する蛍光標識モノクローナル抗体(すべてBD Biosciences社から)で染色し、FACScalibur(商標)(BD Biosciences社)でフローサイトメトリーにより解析した。感染実験に用いたマウスは、特に明記しない限り、>4%のhCD45+細胞の血中生着レベルを有していた。適合したマウス、すなわち同じバッチのCD34+細胞を用いて移植されたマウスを、実験に使用した。特に明記しない限り、実験はFL由来のCD34+細胞を用いて移植されたマウスを用いて行った。
hIL-3/GM-CSF研究のため、移植後10〜14週のマウスの肺、BAL、骨髄、胸腺、脾臓および血液から細胞懸濁液を調製した。RBCの溶解はACK溶解緩衝液(Lonza社)を用いて行った。次に、マウスおよびヒト細胞表面抗原に対する蛍光色素標識モノクローナル抗体(mAb)で試料を染色した。次のmAbを使用した:(1)抗ヒト:CD3 (UCHT1)、CD4 (RPA-T4)、CD8 (HIT8a)、CD11c (B-ly6)、CD14 (MoP9)、CD19 (HIB19)、CD33 (WM53)、CD45 (HI30および2D1)、CD56 (NCAM 16.2)、CD66 (B1.1)、CD116 (4H1)、CD123 (9F5)。(2)抗マウス:CD45 (30-F11)、F4/80 (BM8)。CD116、CD45 (30-F11)およびF4/80 mAbはeBioscience社から購入した。他のすべてのmAbはBD Biosciences社から購入した。試料はFACSCalibur(商標)またはLSRII(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences社)で解析した。
hIL-3/GM-CSF研究のため、移植されたマウスからのヒトCD34+骨髄細胞をセルソーティングにより精製した。ソーティングされた細胞(1〜1.5×105個)をイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、GIBCO社)ベースのメチルセルロース培地(Methocult(商標)H4100、StemCell Technologies社)で培養した。該培地には20%FBS、1%BSA、2mM L-グルタミン、55μM 2-メルカプトエタノール、および次のヒトサイトカインを添加した:幹細胞因子(10ng/ml)、FLT3リガンド(10ng/ml)、トロンボポエチン(50ng/ml)、IL-3 (20ng/ml)、IL-6 (10ng/ml)、IL-11 (10ng/ml)、GM-CSF (50ng/ml)、およびエリトロポエチン(4U/ml)(すべてR&D Systems社)。細胞を60mmペトリ皿で37℃/5%C02にてインキュベートした。12〜14日後にコロニーの数を顕微鏡で測定した。
マウスにUltrapure LPS E. coli 0111:B4 (Invivogen社)の2回腹腔内注射を48時間間隔で行った(35および17.5μg)。各注射の2〜3時間後に血清を採取した。ヒトIL-6の血清濃度をELISA (R&D Systems社)で測定した。最初のLPS注射の72時間後にマウスを屠殺し、心穿刺で血液を採取してフローサイトメトリーに使用した。
hIL-3/GM-CSF研究のため、全TB10.4タンパク質(Skjot et al. (2002) Epitope mapping of the immunodominant antigen TB10.4 and the two homologous proteins TB10.3 and TB12.9, which constitute a subfamily of the esat-6 gene family, Infect. Immun. 70:5446-5453)をカバーする重複ペプチドをイェール大学のW.M. Keck Facilityで合成した。BCG感染したマウス由来の脾細胞(2×106個/ウェル)を混合ペプチド(5μg/mlの各ペプチド)と共に、96ウェルのU底マイクロタイタープレート(Becton Dickinson社)において200μl/ウェルの全体積で37℃/5%C02にて5時間インキュベートした。細胞培養のために10%FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1% L-グルタミン、および55μM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640培地(Invitrogen社)を用いた。細胞内サイトカイン染色はCytofix/Cytoperm(商標)キット(BD Biosciences社)を用いてメーカーの指示に従って行った。次のmAbを細胞内染色のために使用した(すべてBD Biosciences社)。抗ヒトIFNγ(B27)、抗マウスIFNγ(XMG1.2)。アイソタイプの適合したmAbを対照として用いた。
hIL-3/GM-CSF研究のため、器官を取り出し、かつ組織学的分析のために10%中性緩衝ホルマリンまたはZinc Fixative (BD Biosciences社)中に固定した。パラフィン包埋組織切片を調製し、H&EもしくはPASで染色するか、またはイェール病理組織サービス(Yale Pathology Tissue Services)で免疫組織化学のために処理した。次の抗ヒト抗体を免疫組織化学のために使用した(すべてDako社から):CD45 (2B11+PD7/26)、CD3 (F7.2.38)、CD68 (PG-M1)。肉芽腫の存在についての組織切片の評価は盲検で行った。
hIL-3/GM-CSF研究のため、ノンパラメトリックなMann-WhitneyのU検定を用いて、2グループ間の統計的有意性(a=0.05)を判定した。多重グループ比較のために、我々は一元配置ANOVAとともにTukeyの多重比較検定(a=0.05)を用いる事後検定(post hoc testing)を採用した。統計的に有意なP値(P<0.05)のみが示される。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:感染
チフス菌ISP2825 (Galan J.E.およびCurtiss, R. (1991) Distribution of the invA, -B, -C, and -D genes of S. thyphimurium among other S. serovars: invA mutants of S. typhi are deficient for entry into mammalian cells, Infect. Immun. 59(9):2901-2908;参照により本明細書に組み入れる)は、腸チフス患者からの臨床分離株であるが、このチフス菌をLBブロスで一晩増殖させた。翌日、40μLの細菌細胞培養物を、0.3M NaClを含む新鮮なLBブロス2mLに移し、かつその培養物が約0.9のOD600に達するまで37℃で約3時間増殖させた。その細菌培養物をスピンダウンし、緩衝生理食塩水に再懸濁させて、感染のために使用した。9〜12週齢のヒト化マウスと対照マウスに1×103または1×104または1×105個のチフス菌を0日目に腹腔内接種した。感染したマウスを念入りに監視し、かつ感染後4週で屠殺した。脾臓、肝臓および胆のうを無菌的に摘出し、0.05%デオキシコール酸ナトリウムを含む無菌PBS 3〜5mL中で機械的にホモジナイズした。組織ホモジネートを連続希釈し、LB寒天プレートにまき、コロニー数の計測のために37℃で一晩インキュベートした。コロニー数を計測し、かつ回収された全コロニー形成単位の数を算出した。マウスのデータは図1〜4に提供される。図1において、「対照」マウスは、移植されていない遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO/hIL-3, hGM-CSF)である。図2〜4において、「対照」マウスは移植されていないRAG KO/Il2rg KOマウスである(すなわち、それらはIL-3とGM-CSFのヒト化を欠くが、代わりに内在性マウスIL-3と内在性マウスGM-CSFをもつ)。「対照」マウスには、ヒトCD34+細胞の代わりにPBSを注射した。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:肺病原体に対するヒト炎症反応のためのマウスモデルの検証
GM-CSF(Csf2)およびIL-3をコードする遺伝子は、ヒトおよびマウスではそれぞれ5番および11番染色体上で密接に連鎖している(<10kb)。これは、hIL-3/GM-CSF KIマウスを作製するために、両遺伝子のマウス遺伝子座とヒト遺伝子座との置換を可能にした(図5(e))。ヒトIL-3 KI対立遺伝子はマウス調節エレメントの制御下にある一方で、ヒトCsf2 KI対立遺伝子はそのヒト調節エレメントの制御下のままである。マウスおよびヒトGM-CSF mRNAの発現は、各マウス遺伝子の一方の対立遺伝子および各ヒト遺伝子の一方の対立遺伝子を発現するhIL-3/GM-CSF KIマウス(IL-3/GM-CSF「ヒト/マウス」(h/m)マウスと呼ばれる)においてRT-PCRにより解析した。IL-3およびGM-CSFのマウス対立遺伝子を唯一持つ野生型マウスは、IL-3/GM-CSF「マウス/マウス」(m/m)マウスと呼ばれる。
全RNAはホモジナイズした組織からTRIzol(商標)試薬(Invitrogen社)を用いてメーカーの指示に従って抽出した。等量のDNase処理RNAをSuperScript(商標)First-Strand Synthesis System(Invitrogen社)によるcDNA合成のために使用した。従来型RT-PCRは、次のプライマーを用いて行った。
定量的RT-PCRは、ABI社から購入したプライマー-プローブセットを用いる7500 FastリアルタイムPCRシステムで行った。発現量は比較閾値サイクル法(comparative threshold cycle method)を用いて計算し、マウスまたはヒトHPRTに対して正規化された。マウスとヒトのIL-3およびGM-CSFタンパク質は、R&D Systems社からの種特異的ELISAキットを用いてメーカーの指示に従って検出した。脾細胞は5μg/mlコンカナバリンA(ConA)と100U/ml IL-2で活性化し、48時間の刺激の後に上清をELISAのために回収した。
ヒトGM-CSF mRNAは、肺で最高の発現を示して、そのマウス対応物と同様のパターンで発現された(図5(a))。IL-3は主に活性化T細胞によって発現され、活性化T細胞はまたGM-CSFをも産生する。したがって、ELISAはh/mマウスから単離された活性化脾細胞からの上清で実施した。ヒトIL-3およびGM-CSFタンパク質の両方を検出することができた(図6(f)f、6(g))。ヒト造血細胞に競合的優位性を付与するために、ヒトIL-3およびGM-CSFの2つの対立遺伝子を発現する、IL-3/GM-CSF「ヒト/ヒト」(h/h)マウスと呼ばれるホモ接合体KIマウスを作製した。肺組織の従来型RT-PCR解析および定量的RT-PCR解析は、h/hマウスがヒトGM-CSF mRNAのみを発現し、マウスGM-CSF mRNAを発現しないことを示した(図5(b)、5(c))。ヒトGM-CSFタンパク質はELISAでh/hマウスの気管支肺胞洗浄(BAL)液中に検出することができた(図5(d))。これらの結果は、hIL-3/GM-CSF KIマウスがヒトGM-CSF(およびIL-3)を忠実に発現することを示している。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:増強されたヒト炎症反応
hIL-3/GM-CSF KIマウスは、Rag2とIl2rgの両方の1つの対立遺伝子がすでに欠失されている胚性幹(ES)細胞から作製された。その後Rag2 KO Il2rg KO背景へと交配させることで、ヒトCD34+造血細胞を移植することが可能になった。全体的なヒトCD45+造血細胞のキメリズム、ならびに骨髄中、胸腺中、脾臓および血液中のT細胞、B細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞の分布は、hIL-3/GM-CSF KIマウスにおいて有意に増加していなかった(データは示さず)。さらに、全ヒトCD33+骨髄細胞、CD66+顆粒球、CD14+単球/マクロファージ、CD14loCD16+非古典的単球、CD11c+樹状細胞(DC)、およびCD123+CD11c-形質細胞様DCの頻度は、hIL-3/GM-CSF KIマウスにおいて有意に増加していなかった(データは示さず)。これは定常状態の条件下のh/mマウスとh/hマウスの両方にあてはまった。最後に、移植したhIL-3/GM-CSF KIマウス由来のヒト骨髄細胞は同様の能力を有して、インビトロでメチルセルロース中に骨髄コロニーを形成した(データは示さず)。これらの知見は、IL-3とGM-CSFの両方が本明細書で解析した器官での定常状態の骨髄造血にほとんど不要であることを示すKOマウス研究からの結果と一致している。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:肺での増強されたヒトマクロファージ生着
BAL解析
hIL-3/GM-CSF研究のための気管支肺胞解析は次の方法で行った。気管に挿入したカテーテルから1mlのPBSを入れて肺を膨らませた。これを2回繰り返し、回収した洗浄液をプールした。遠心分離後、細胞フリーの上清は、ELISAによるGM-CSFタンパク質濃度の測定のために、またはBCA Protein Assay Kit(Pierce社)をメーカーの指示に従って用いる総タンパク質含有量の測定のために保存した。赤血球(RBC)をACK溶解緩衝液(Lonza社)で溶解した後、細胞ペレット数を計測し、フローサイトメトリーのためにまたはサイトスピン標本作成のために使用した。細胞をスライド上にスピンさせ、Diff-Quik(商標)Stain Set (Dade Behring社)でメーカーの指示に従って染色した。
マウスGM-CSFの非存在はマウス肺胞マクロファージ(AM)の機能低下につながり、これはホモ接合体hIL-3/GM-CSF KIマウスにおいてヒトマクロファージによる再構成に有利にはたらくはずである。その裏付けとして、h/hマウスの肺およびBALではヒトGM-CSFが高度に発現しており、一方マウスGM-CSFは欠損している。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:ヒト造血細胞によって軽減されるPAP
h/hマウスのヒトマクロファージ生着の増加が肺における良好なヒト免疫機能につながるかどうかを検討した。最初に、ヒトマクロファージが非移植h/hマウスに見られるPAP症候群をレスキューできるかどうかを検討した。II型肺胞上皮細胞とAMは両方ともGM-CSFに応答し得るが、PAPは骨髄移植によってレスキューすることができる。これは、造血細胞、特にAM、がPAPを改善できる主な細胞型であることを示している。したがって、ヒト造血細胞を用いて移植されたh/hマウスはPAPの重症度が低いはずであると仮定された。予想通り、非移植h/hマウスはPAS陽性物質の肺胞内蓄積を示し(図7(a))、これはPAPの顕著な特徴である。この仮説に一致して、移植したh/hマウスは肺に軽度のタンパク質蓄積を有し、一部のh/hマウスの肺は(非移植または移植)m/m対照マウスに似ていた(図7(a))。さらに、移植h/hマウスは、BAL液中の総タンパク質量が非移植h/hマウスより有意に低かった(図7(b))。これらの結果は、移植されたヒト造血細胞(おそらくAM)がホモ接合体hIL-3/GM-CSF KIマウスにおいてPAPを軽減できることを示している。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:インフルエンザAに対する強いヒトI型IFN応答
インフルエンザA感染
マウス(9〜10週齢)に2×104プラーク形成単位のインフルエンザA/PR8(H1N1)ウイルスを鼻腔内経路で感染させた。感染は、Anafane(商標)(Ivesco社)で深く麻酔しておいたマウスに、PBSで希釈したウイルスストック液50μl(または対照として等量のPBS)を鼻腔内投与することによって行った。感染の24時間後に、上記のRNA抽出および定量的RT-PCR解析のために肺を回収した。
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス:マイコバクテリア感染後のヒト細胞を含む肉芽腫
マクロファージが病原体特異的免疫応答において中心的な役割を果たす肺に向性を有する第2の病原体に対するヒト炎症反応を支持するhIL-3/GM-CSF KIマウスの能力が検討された。マイコバクテリア感染後の肉芽腫の形成が選択された。肉芽腫は、マイコバクテリア感染の特徴である、特殊化した局所炎症反応を表している。それはDTH応答の古典的な例であり、その形成は活性化T細胞とマクロファージとの相互作用に依存している。最適なDTH応答にはIL-3とGM-CSFの両方が必要であり、重要なことは、GM-CSF KOマウスがマイコバクテリアに感染した場合肉芽腫を形成しないことである。
hTPOマウス:生着および解析
TPOマウスへの移植
レシピエントマウスは、Traggiaiらに記載される通りにヒト造血前駆細胞を用いて移植された。臍帯血試料は、イェール大学の人権擁護調査委員会(Department of Labor and Birth, Yale New Haven Hospital, New Haven, CT)からの承認の下で、健康な満期新生児から採取された。胎児肝臓試料は、アルバート・アインシュタイン医科大学(Bronx, NY)のヒト胎児組織リポジトリ(Human Fetal Tissue Repository)から、およびAdvance Biosciences Resources社(Alameda, CA)から取得された。
マウスおよびヒトTPOタンパク質の血清濃度は、種特異的ELISA(RayBiotech社)によりメーカーのプロトコルに従って測定した。TPOをコードするマウスおよびヒトmRNAの発現を測定するために、組織を成体動物から分離し、全RNAを、TRIzol(Invitrogen社)を用いてメーカーの指示に従って精製した。混入しているゲノムDNAをRNase-Free DNase I(Roche社)で処理して除去し、そのRNAを、SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen社)とオリゴdTプライマーを用いて逆転写した。PCR増幅のために次のプライマーを使用した。
TPO研究のため、マウスの大腿骨と脛骨を採取し、かつ骨髄細胞を流し出した。骨を小片に切断し、コラゲナーゼPおよびD(10μg/ml)を用いて37℃で45分間消化した。骨関連細胞を反復ピペッティングによって収集した。刺激用サプリメント(stimulatory supplements)(Stemcell Technologies社)を加えたMSC培地の存在下で細胞を14日間培養した。その培養物から、CD45およびTer119抗体を用いる免疫磁気セルソーティング(MACS、Miltenyi Biotec社)により造血系細胞を除去した。非造血細胞(CD45-Ter119-)をもう5日間培養し、MSC表現型(CD45-Ter119-Sca1+CD90+)をFACSにより確認した(Diminici et al. (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells, The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy 8:315-317)。
移植後8〜12週でマウスを採血した。ACK(Lonza社)を用いて赤血球を3回溶解し、細胞を抗マウスCD45および抗ヒトCD45抗体で染色した。CD45+細胞の少なくとも1%がヒト由来であった動物をさらなる解析のために使用した。移植されたマウスの約80%がこの生着閾値に達しており、TPOm/mおよびTPOh/hグループの間で違いは認められなかった。
3〜7匹の移植されたマウスから得られた骨髄細胞をプールし、ヒトCD34+細胞を、マウスCD45+細胞のMACS枯渇(Miltenyi Biotec社)とその後のFACSAria(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences社)でのヒトCD45+CD34+細胞のFACSソーティングによって精製した。
データは対応のない両側t検定を用いて比較された。2つより多い試料を比較する場合は、一元配置ANOVAと、その後にTukeyの事後検定を行った。二次移植実験において生着を示したマウスの割合はPearsonのカイ二乗検定を用いて比較された。p値が0.05を下回った場合は、差を有意と見なした。
hTPOを移植されたマウス:TPOh/hレシピエントマウスの骨髄における改善されたヒト生着レベル
ヒト化および移植されたマウスの骨髄の表現型分類
ヒト化マウスの骨髄から分離された細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、非ヒト化マウス(すなわち、TPO遺伝子のヒト化を欠くRAGおよびIl2rgノックアウト)の生着と比べて、全ヒト造血細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト骨髄細胞、およびヒト顆粒球の生着の統計的に有意な改善が認められた。図12および14参照。
hTPOを移植されたマウス:マウスおよびヒト血小板に対するTPOヒト化の効果
TPOマウスにおける血小板解析
末梢血中の血小板数はHemavet(商標)950FS装置(Drew Scientific社)を用いて測定した。次に血液試料を抗マウスCD61-PE (2C9.G2)および抗ヒトCD41a-APC (HIP8)で染色し、マウスおよびヒト血小板のパーセンテージを、細胞のサイズ(FSC)または顆粒性(granulosity)(SSC)にいかなるゲートも配置せずに、フローサイトメトリーで測定した。絶対マウスおよびヒト血小板数は、これらの各パーセンテージを絶対血小板数と乗じることによって算出した。
hTPOを移植されたマウス:TPOヒト化マウスにおける多系列の造血
ヒト化および移植されたマウスの血液細胞の表現型分類
ヒト化マウスの血液から分離された細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、非ヒト化マウス(すなわち、TPO遺伝子のヒト化を欠くRAGおよびIl2rgノックアウト)の移植と比べて、ヒト単球および顆粒球の移植において統計的に有意な改善が認められた。図14参照。
hTPOを移植されたマウス:マウスおよびヒト造血幹細胞前駆細胞に対するヒト化効果
HSCならびに前駆細胞それら自体の数および機能に及ぼすヒトTPOの効果が解析された。TPOの遺伝子欠失は成体マウスではHSCの減少につながる。TPOヒト化がマウスHSCを含むと免疫表現型的に定義されるマウス集団に影響を及ぼすことができるかどうかを調べるために、非移植TPOm/m、TPOh/mおよびTPOh/h成体マウスの骨髄中の系列陰性(lineage-negative)Sca1+c-Kit+細胞のパーセンテージを比較した。
Claims (17)
- (a) マウスRAG遺伝子ノックアウト;
(b) マウスIl2rg遺伝子ノックアウト;
(c) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換;および
(d) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含む、遺伝子改変されたマウス。 - ヒトトロンボポエチン遺伝子がマウストロンボポエチン遺伝子座に存在する、マウストロンボポエチン遺伝子の該ヒトトロンボポエチン遺伝子との置換
をさらに含む、請求項1記載のマウス。 - 前記RAG遺伝子ノックアウトが、RAG1遺伝子ノックアウト、RAG2遺伝子ノックアウト、およびこれらの組合せから選択される、請求項1記載のマウス。
- ヒト造血細胞の移植をさらに含む、請求項1記載のマウス。
- 前記ヒト造血細胞が、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群より選択される、請求項4記載のマウス。
- 前記ヒト造血細胞が、CD34+細胞であるヒト臍帯血細胞である、請求項5記載のマウス。
- CD34陽性細胞、造血幹細胞、造血細胞、骨髄前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、またはこれらの組合せであるヒト細胞を含む、請求項3記載のマウス。
- ヒト造血幹細胞前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)、ヒト骨髄前駆細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト樹状細胞、ヒト単球、ヒト顆粒球、ヒト好中球、ヒト肥満細胞、ヒト胸腺細胞、ヒトT細胞、ヒトB細胞、ヒト血小板を含む、請求項3記載のマウス。
- チフス菌(Salmonella typhi)感染を含む、請求項4記載のマウス。
- 前記チフス菌感染が、全身的なチフス菌感染である、請求項9記載のマウス。
- 結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を含む、請求項4記載のマウス。
- ヒト免疫細胞を含む肺肉芽腫を含む、請求項11記載のマウス。
- (a) 遺伝子改変され、移植され、かつヒト病原体に感染したマウスに剤を投与する段階であって、
該マウスが、
(i) RAG1遺伝子ノックアウトもしくはRAG2遺伝子ノックアウト、またはこれらの組合せ、
(ii) Il2rg遺伝子ノックアウト、
(iii) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換、および
(iv) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含み、
該マウスが、CD34陽性ヒト臍帯血細胞またはCD34陽性ヒト胎児肝細胞を用いて移植される、段階;ならびに
(b) 該剤がヒト病原体に感染した該マウスにおいて該ヒト病原体の量を低減するかどうかを判定する段階
を含む、ヒト病原体感染を抑制する剤を同定するための方法。 - 前記マウスが、マウストロンボポエチン遺伝子のヒトトロンボポエチン遺伝子との置換をさらに含む、請求項13記載の方法。
- 前記ヒト病原体がチフス菌である、請求項13記載の方法。
- 前記ヒト病原体がマイコバクテリアであり、かつ該マイコバクテリアが、ヒト免疫細胞を含む肉芽腫を前記マウスにおいて引き起こす、請求項13記載の方法。
- 前記マイコバクテリアが結核菌である、請求項16記載の方法。
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