JP2018194374A5 - - Google Patents
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Description
Ａβはアルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されており、質量分析により生体試料中に含まれるＡβ量を定量する試みがいくつか報告されている。例えば、特許文献１では、Ａβに特異的に結合する抗Ａβ抗体（ＡβのＰｈｅ４−Ｇｌｙ９をエピトープとする６Ｅ１０、およびＡβのＬｅｕ１７−Ｖａｌ２４をエピトープとする４Ｇ８）を用いた免疫沈降（ＩＰ）と、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）とを組み合わせた分析方法により、微量のヒト血漿から２２種類のＡＰＰ切断ペプチドを検出した例が報告されている。特許文献１では、ＡＰＰのプロセッシングにより生成するペプチドとして、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号５）等の、βセレクターゼによる切断部位よりもＮ末端側で切断されたペプチドが検出されたことが報告されている。
しかしながら、非特許文献１に記載の手法では、Ａβの中間配列をサロゲートペプチドとして選択しているため、Ｃ末端の切断部位の異なるＡβ（例えば、Ａβ１−３８（配列番号２）、Ａβ１−４０（配列番号３）、Ａβ１−４２（配列番号４）や、Ｎ末端側がβセクレターゼ切断部位（ＡＰＰのＭｅｔ６７１とＡｓｐ６７２の間）以外で切断されたＡＰＰ切断ペプチド（例えば、前述のＡＰＰ６６９−７１１）を個別に定量することはできない。
Ａβ１−４０のＣ末端をエピトープとする抗体ｂによりＩＰを行った場合、図１に示す３種のペプチドの中で、Ａβ１−４０およびＡＰＰ６６９−７１１の２種が捕捉される。抗体ａを用いたＩＰによりＡβ１−４２を捕捉し、抗体ａに捕捉されずに流出した溶液（洗浄液を含む）に抗体ｂを用いたＩＰを実施して、Ａβ１−４０およびＡＰＰ６６９−７１１を捕捉してもよい。
抗体ｂを用いたＩＰにより捕捉されたペプチドをＬｙｓ−Ｃにより消化した試料からは、Ａβ１−４０の切断位置IIIのＮ末端側の配列「ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ」を有するペプチド、およびＡＰＰ６６９−７１１の切断位置IIIのN末端側の配列（切断位置Iと切断位置IIIの間の配列）「ＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ」を有するペプチドが生成する。これらのペプチドは分子量が異なるため、質量分析により判別可能である。
抗体ｂを用いたＩＰのみでは、Ｃ末端の配列が共通するＡβ１−４０とＡＰＰ６６９−７１１とを識別できないが、Ｃ末端側を抗体識別部位とするとするＩＰによりペプチドを分離し、ＩＰで捕捉回収されたペプチドのＮ末端側のプロテアーゼ消化断片をトランジションとして選択することにより、Ｎ末端側の配列の相違（生体内でのＡＰＰからの切断部位の相違）が識別可能となる。
本発明においては、上述のようにペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれか一方に特異的に結合する抗体を用いたＩＰによりペプチドを分離した後、抗体結合部位と反対側の末端のペプチド断片の分析が行われる。例えば、ＡβのＣ末端側に結合する抗体を用いたＩＰにより分離したペプチドは、プロテアーゼ処理後に、Ｎ末端側のプロテアーゼ消化断片が質量分析による検出対象として選択される。ＡβのＮ末端側に結合する抗体を用いたＩＰにより捕捉されたペプチドは、Ｃ末端側のプロテアーゼ消化断片の質量分析が行われる。図１に示す３種のペプチドは、Ｃ末端側のＩＰによりＡβ１−４２およびＡβ１−４０とＡＰＰ６６９−７１１とが分離され、Ｎ末端側のペプチド断片の質量分析により、Ａβ１−４２とＡβ１−４０とを識別できる。
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