JP2018174774A - 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット - Google Patents
光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018174774A JP2018174774A JP2017077804A JP2017077804A JP2018174774A JP 2018174774 A JP2018174774 A JP 2018174774A JP 2017077804 A JP2017077804 A JP 2017077804A JP 2017077804 A JP2017077804 A JP 2017077804A JP 2018174774 A JP2018174774 A JP 2018174774A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- cre
- protein
- sequence
- terminal fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 181
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 150
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 149
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 116
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 319
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 171
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 115
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 95
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 47
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 38
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 26
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 13
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 102000009899 alpha Karyopherins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010077099 alpha Karyopherins Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 48
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 46
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 33
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 25
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 25
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 22
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 13
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 10
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 9
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 4
- 102220045254 rs374739820 Human genes 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- MSECZMWQBBVGEN-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-4-(1h-imidazol-5-yl)butanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CN=CN1 MSECZMWQBBVGEN-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- RPROHCOBMVQVIV-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydro-1h-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1CCNC2 RPROHCOBMVQVIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102220526128 Dihydrofolate reductase_I74V_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- -1 α-methylalanine) Chemical class 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220544010 60S ribosomal protein L27_I52R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 101100085217 Caenorhabditis elegans ptp-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010042634 F2A4-K-NS peptide Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical class N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 102200157658 rs1555229948 Human genes 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
Abstract
Description
Cre/loxPシステムにおいては、loxP配列と呼ばれるDNA配列に対し組換え酵素であるCreタンパク質が働いて、部位特異的遺伝子組換えが起こる。
Creタンパク質は、バクテリオファージP1に由来する酵素であって、遺伝子工学技術において、幅広く用いられている(非特許文献1)。
具体的には、光依存的制御技術として、Cre/loxPシステムと光スイッチタンパク質の組合せであるCRY2-CreNとCIBN-CreCを用いる技術が開示されている(特許文献1、非特許文献2、3)。
また、薬物存在下で遺伝子組換えを制御する技術として、split-Cre-FRB/FKBPシステムが開示されている(非特許文献4、5)。
本発明者らは、光依存的にホモ二量体を形成するNeurospora crassa由来のVividタンパク質を改変し、光の照射により二量体の形成及び解離を精密に制御することができる光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質のセットを開発した(特許文献2、非特許文献8)。また、ゲノム編集ツールとしてCRISPR-Cas9システムに利用されるCas9を2つに分割したフラグメントと、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドとを融合させた2つのポリペプチドのセットを開発した(特許文献3、非特許文献9)。
〔1〕
配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットであって、
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つのポリペプチドのセット。
〔2〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の68位〜343位の領域を少なくとも有するか、
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の111位〜343位の領域を少なくとも有する、〔1〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔3〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の60位〜343位の領域を少なくとも有する、〔1〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔4〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の106位〜343位の領域を少なくとも有する、〔1〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔5〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むか、少なくとも1つのフラグメントの配列が対応する配列番号:1のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔6〕
光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質において、少なくとも配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、リシン、アルギニン又はヒスチジンで置換され、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の他方のタンパク質において、少なくとも配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシンで置換されている、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔7〕
光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、pMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、の組合せである、〔6〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔8〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、ぞれぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とリンカーを介して結合する、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔9〕
核局在化シグナル配列が、Creタンパク質のN末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のC末端のアミノ酸で、及び/又はCreタンパク質のC末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のN末端のアミノ酸で、リンカーを介して、あるいは、リンカーを介さずに結合する、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔10〕
2Aペプチド配列をさらに有する、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔11〕
2つのポリペプチドのセットにおける1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、Creタンパク質のN末端側フラグメント−光依存的に二量体を形成するタンパク質−核局在化シグナル配列−2Aペプチド配列の一部の順にアミノ酸配列を有し、
もう1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、2Aペプチド配列の一部−核局在化シグナル配列−光依存的に二量体を形成するタンパク質−Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有する、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔12〕
Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合である、〔11〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔13〕
〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセットをコードする核酸。
〔14〕
Creタンパク質のN末端側フラグメント−光依存的に二量体を形成するタンパク質−核局在化シグナル配列−2Aペプチド配列−核局在化シグナル配列−光依存的に二量体を形成するタンパク質−Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする、〔13〕に記載の核酸。
〔15〕
〔13〕又は〔14〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔16〕
〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット、〔13〕若しくは〔14〕に記載の核酸、又は〔15〕に記載の発現ベクター、及びloxP配列又はloxP変異体配列である核酸を含有する、Cre-loxPシステム。
〔17〕
loxP変異体が、lox2722、lox66、lox71、JT15及びJTZ17からなる群から選択される、〔16〕に記載のCre-loxPシステム。
〔18〕
〔1〕〜〔12〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット、〔13〕若しくは〔14〕に記載の核酸、又は〔15〕に記載の発現ベクター、又は〔16〕若しくは〔17〕に記載のCre-loxPシステムを有する動物。
〔19〕
げっ歯類である、〔18〕に記載の動物。
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つの異なるポリペプチドのセットである。
すなわち、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質にCreタンパク質のN末端側フラグメントがC末端のアミノ酸で結合し、光依存的に二量体を形成する2つのマグネットタンパク質のもう一方のタンパク質にCreタンパク質のC末端側フラグメントがN末端のアミノ酸で結合している。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、光照射により二量体を形成することにより、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合するCreタンパク質のN末端側フラグメントと、Creタンパク質のC末端側フラグメントがCreタンパク質として再構成されて、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復する。よって、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、光依存的遺伝子組換えに用いることができる。
すなわち、本発明において、Creタンパク質のN末端側フラグメントにおけるアミノ酸配列と、Creタンパク質のC末端側フラグメントのアミノ酸配列を比較すると、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、Creタンパク質のC末端側フラグメントに比して、配列番号:1において、N末端側の領域のアミノ酸配列を有する。Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸は、配列番号:1の配列において、C末端側フラグメントのN末端のアミノ酸よりもN末端側のアミノ酸である。
配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位は、Creタンパク質のB-α-helixとC-α-helixの間にあたるアミノ酸に相当し、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位は、Creタンパク質のD-α-helixとE-α-helixの間にあたるアミノ酸に相当する。
配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位と、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位は、それぞれ、結晶構造解析の結果(Guo, F., et al., Nature, 389, 40-46 (1997))から,α-helix間のフレキシブルなループ構造であることが明らかになっている領域である。
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるとは、配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位の領域内に切断部位を有していればよいことを意味し、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、少なくとも59位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含有するフラグメントであり、Creタンパク質のC末端側フラグメントは、少なくとも68位のアミノ酸以降のアミノ酸配列を含有するフラグメントである。
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるとは、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位の領域内に切断部位を有していればよいことを意味し、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、少なくとも101位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含有するフラグメントであり、Creタンパク質のC末端側フラグメントは、少なくとも111位のアミノ酸以降のアミノ酸配列を含有するフラグメントである。
Creタンパク質のN末端側フラグメントにおけるN末端のアミノ酸及びCreタンパク質のC末端側フラグメントにおけるC末端のアミノ酸は、N末端側フラグメントとC末端側フラグメントとが、光依存的に遺伝子組換え活性を回復することができるものであれば特に限定されるものではない。
配列番号:1のアミノ酸配列の60位〜67位の領域については、領域内の全てのアミノ酸を、あるいは、一部のアミノ酸をCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントのいずれかのフラグメントが有していてもよい。Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、60位〜67位の領域の一部又は全部を有する場合には、60位〜67位の領域内にアミノ酸配列において変異があってもよい。
配列番号:1のアミノ酸配列の1位〜101位の領域及び111位〜343位の領域を含むよう設計するとは、スプリットCreが二量化した際に、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を保持しているのであれば、特に限定されず、配列番号:1のアミノ酸配列の1位〜101位の領域内及び111位〜343位の領域内の部分配列をそれぞれ、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが有していてもよい。また、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、配列番号:1のアミノ酸配列の1位〜101位の領域内及び111位〜343位の領域内にアミノ酸配列において変異があってもよく、あるいは、変異を有し、かつ、その部分配列であるフラグメントであってもよい。
配列番号:1のアミノ酸配列の102位〜110位の領域については、領域内の全てのアミノ酸を、あるいは、一部のアミノ酸をCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントのいずれかのフラグメントが有していてもよい。Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、102位〜110位の領域の一部又は全部を有する場合には、102位〜110位位の領域内にアミノ酸配列において変異があってもよい。
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の111位〜343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることが好ましい。
本発明においては、Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の60位〜343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることがより好ましく、Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の106位〜343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることがより好ましい。
本明細書において、配列番号:1のアミノ酸配列に対して、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるフラグメント、又は、配列番号:1のアミノ酸配列に対して、80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるフラグメントという場合に同様である。
なお、N末端側フラグメントが配列番号:1の19位のアミノ酸から59位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが60位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合において、例えば、1個〜9個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失がある場合、それぞれ、アラインメントの結果として、324/343(約94%)〜316/343(約92%)が重複する領域となる。N末端側フラグメントが配列番号:1の19位のアミノ酸から104位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが106位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合において、例えば、1個〜9個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失がある場合、それぞれ、アラインメントの結果として、323/343(約94%)〜315/343(約92%)が重複する領域となる。
配列番号:1のアミノ酸配列における19位〜59位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、60位〜343位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組合せ;
配列番号:1のアミノ酸配列における19位〜104位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、106位〜343位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組合せ;
当該組合せにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組合せ;
当該組合せにおいて、2つのフラグメントそれぞれの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組合せ;
当該組合せにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列が上記配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである組合せ;並びに
当該組合せにおいて、2つのフラグメントそれぞれの配列が上記配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである組合せ
であってもよい。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α−二置換アミノ酸(α-メチルアラニンなど)、N−アルキル−α−アミノ酸、D−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸(ノルロイシン、ホモヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(システイン酸など)等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
本明細書において、「光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質」(以下、「マグネット」と記載する場合がある)は、光を照射することによってヘテロ二量体を形成するタンパク質のペアである。マグネットは、光、好ましくは、青色光を照射することによってヘテロ二量体を形成し、光照射を止めることによりヘテロ二量体が迅速に解離することで、本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおける二量体の形成及び解離を精密に制御することができ、光依存的に、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復させる。
本発明においては、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質は、それぞれ配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つの異なるポリペプチドのセットである。
Vividタンパク質の変異体は、例えば、配列番号:2のアミノ酸配列と、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
マグネットは、Vividタンパク質とVividタンパク質のペア、Vividタンパク質とVividタンパク質の変異体のペア、Vividタンパク質の変異体とVividタンパク質の変異体のペアのいずれのペアであってもよく、ペアの少なくとも一方のポリペプチドにおいて、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている。
本明細書において、Vividタンパク質の変異体は、N末端αヘリックス以外の場所において、配列番号:2のアミノ酸配列とは異なる配列を有するポリペプチドである。Vividタンパク質の変異体には、N末端を切断したポリペプチド(配列番号:2のアミノ酸配列のうち、37位から186位のアミノ酸で構成されるポリペプチド)であってもよい。
N末端αヘリックスとしては、配列番号:2における47位〜56位のアミノ酸であることが好ましく、本発明に係る光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質は、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号:2における47位〜56位のアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸が置換されていることが好ましく、2つのタンパク質において、それぞれ配列番号:2における47位〜56位のアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸が置換されていることがより好ましい。
N末端αへリックスにおける変異は、配列番号:2の47位、48位、50位、51位、52位、54位、及び55位のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸における変異であることが好ましい。
側鎖に正電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。側鎖に負電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
配列番号:2の52位と55位のそれぞれに対応するアミノ酸における置換は、同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。
また、マグネットを構成する2つのタンパク質が、アミノ酸置換前に、配列番号:2とは異なるアミノ酸配列を有する場合は、具体的には、Vividタンパク質の変異体である場合は、配列番号:2のX位に対応するアミノ酸を意味する。
変異体において「配列番号:2のX位のアミノ酸」は、配列のアライメント等により適宜決定される。
また、マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号:2の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、所望により、他方のタンパク質において、配列番号:2の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されていることがより好ましく、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されていることがさらに好ましい。
マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号:2の52位及び55位に対応するアミノ酸が、同一又は異なって、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、所望により、他方のタンパク質において、配列番号:2の52位及び55位に対応するアミノ酸が、同一又は異なって、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されていることがより好ましい。マグネットの一方のタンパク質において、配列番号:2の52位及び55位に対応するアミノ酸が側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されている場合、異なって置換されていることが好ましく、一方のアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることがより好ましく、配列番号:2の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換され、配列番号:2の55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることがさらに好ましい。
配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている場合には、同一又は異なって、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されていることが好ましく、アスパラギン酸で置換されれていることがより好ましい。
配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されている場合には、グリシンで置換されれていることがより好ましい。
配列番号:2の52位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されていることが好ましく、アスパラギン酸で置換されれていることがより好ましく、同時に、配列番号:2の55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることが好ましく、グリシンで置換されれていることがより好ましい。
具体的には、マグネットの一方のタンパク質において、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換された配列を有し、マグネットの他方のタンパク質において、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に負電荷を有するアミノ酸及び/又は中性アミノ酸で置換された配列を有するものが挙げられる。
マグネットとしては、特開2015−165776号公報に開示される、Vividタンパク質を基に本発明者らが開発した2つのタンパク質を用いることができる。
52位のIle及び55位のMetが、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換された配列を有するマグネットの一方のタンパク質としては、pMag、pMagHigh1、pMagFast1及びpMagFast2等が挙げられ、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に負電荷を有するアミノ酸及び/又は中性アミノ酸で置換された配列を有するマグネットの他方のタンパク質としては、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2等が挙げられる。
マグネットは、pMag、pMagHigh1、pMagFast1及びpMagFast2から選ばれる1種のタンパク質と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2から選ばれる1種のタンパク質の組合せであることが好ましい。
本明細書においては、pMagは、I52R及びM55Rの変異を有する、配列番号:15のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、pMagHigh1は、pMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を有する、配列番号:16のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。pMagFast1は、pMagのアミノ酸配列において、さらにI85Vの変異を有する配列番号:17のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。pMagFast2は、pMagのアミノ酸配列において、さらにI74VとI85Vの変異を有する、配列番号:18のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本明細書においては、nMagは、I52D及びM55Gの変異を有する、配列番号:19のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、nMagHigh1は、nMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を有する、配列番号:20のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。nMagFast1は、nMagのアミノ酸配列において、さらにI85Vの変異を有する配列番号:21のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。nMagFast2は、nMagのアミノ酸配列において、さらにI74VとI85Vの変異を有する、配列番号:22のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明においては、リンカーを介していてもよいが、マグネットのそれぞれのポリペプチドは、Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸と、C末端フラグメントのN末端のアミノ酸と連結している。
すなわち、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合しているが、ここで、「結合」の意味としては、配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に直接結合しているか、リンカーを介して結合していることを意味する。
言い換えれば、本発明における2つのポリペプチドのセットにおいては、配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸より、リンカーを介して、あるいは、介さずに、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である一方のポリペプチドが配置され、配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸より、リンカーを介して、あるいは、介さずに、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である他方のポリペプチドが配置されている。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、Creタンパク質のN末端側フラグメントがそのC末端のアミノ酸でnMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、リンカーを介して、Creタンパク質のC末端側フラグメントがそのN末端のアミノ酸でpMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、リンカーを介して結合していることがより好ましい。
本発明において、Creタンパク質のN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントと、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質との結合におけるリンカーだけではなく、本発明に係る2つのポリペプチドのセットのそれぞれのポリペプチドを構成するドメインとドメインとが結合している場合、ドメインとドメインとの間に両者の結合を介在させるリンカーが存在していてもよい。
本発明において用いられるリンカーとしては、公知のリンカーであれば特に限定することなく用いることができるが、グリシン及びセリンをその配列中に多く含むアミノ酸配列を有するリンカーが用いられる。グリシンを主成分としているリンカーが一般に用いられるが、親水性アミノ酸であるセリンやトレオニンを含むリンカーであることが好適である。
本発明において、ドメインとドメインをリンカーを介して結合させる場合、その遺伝子工学的手法として、制限酵素認識サイトを利用して結合させることができる。制限酵素認識サイトの多くは、6つの塩基配列からなるため、制限酵素認識サイトを利用してドメインとドメインを結合させる場合、2つのアミノ酸がドメインとドメインの間に導入されることになる。
かかる制限酵素認識サイトを、本発明においては、リンカーとして用いることもできる。
本発明において、リンカーは、特に限定されるものではないが、2〜16のアミノ酸で構成されていてもよい。
本発明において、ドメインとは、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを構成するCreタンパク質のN末端側フラグメント及びC末端側フラグメントと、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とが挙げられ、その他のドメインとしては、例えば、核局在化シグナル配列及び2Aペプチド配列等が挙げられる。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、核局在化シグナル配列を有していてもよい。
核局在化シグナル配列が存在する場合、Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸に結合する光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である一方のポリペプチドのC末端のアミノ酸に、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合していてもよく、Creタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸に結合する光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である他方のポリペプチドのN末端のアミノ酸に、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合していてもよい。
核局在化シグナル配列は、本発明に係る2つのポリペプチドのセットの一方のポリペプチドに存在していてもよく、2つのポリペプチドに存在していてもよい。
核局在化シグナル配列としては、特に限定されるものではなく、VPKKKRKV(配列番号:23)のアミノ酸配列や、KRTADGSEFESPKKKRKVEAS(配列番号:24)のアミノ酸配列が例示できる。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、好適には、自己触媒的に切断され、そのN末アミノ酸及びC末端のアミノ酸を介してそれぞれ結合する前後のタンパク質の量の比を1:1にすることができる2Aペプチドと呼ばれるポリペプチドを用いて発現される。
したがって、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、自己触媒的に切断された2Aペプチドに由来するアミノ酸配列(2Aペプチド配列)をそれぞれ有していることが好ましい。本発明に係る2つのポリペプチドのセットが2Aペプチド配列を有するとは、cotranslationalに切断される2Aペプチドの部分配列を、2つのポリペプチドのセットを構成するそれぞれのポリペプチドが有していることを意味する。
2Aペプチドとしては、特に限定されるものではないが、Kim, J. H., et al., PLoS One. 6(4), e18556 (2011)に記載されるペプチドが挙げられ、例えば、P2Aペプチド、T2Aペプチド、E2Aペプチド、及びF2Aぺプチドなどのポリペプチドが知られている。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、図3bに示すように、ドメインをそれぞれ配置したアミノ酸配列として発現され、P2Aペプチドが自己触媒的に切断されることによって得られる2つのポリペプチドのセットであることが好ましい。P2Aペプチド配列を例示して説明すると、P2Aペプチド配列であるGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号:6)うちC末端のGP配列の間でcotranslationalに切断され、P2Aペプチド配列のN末端のアミノ酸と結合するポリペプチドに対して、「GSGATNFSLLKQAGDVEENPG」が残存し、P2Aペプチド配列のC末端のアミノ酸と結合するポリペプチドに対して、「P」が残存する。
本明細書においてドメインとして認識される「Creタンパク質のN末端側フラグメント」、「Creタンパク質のC末端側フラグメント」「光依存的に二量体を形成するタンパク質」、「核局在化シグナル配列」及び「2Aペプチド配列」は、記載する順にポリペプチド中に配列されていればよく、各ドメイン間には、リンカーとなるアミノ酸配列が存在していてもよい。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、N末端からC末端へとドメインが配置されているが、各ドメイン間において、詳しくは、Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合であってもよい。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号:25のアミノ酸配列を有するポリぺプチド及び配列番号:26のアミノ酸配列を有するポリペプチドのセットであるか、配列番号:27のアミノ酸配列を有するポリぺプチド及び配列番号:28のアミノ酸配列を有するポリペプチドのセットであることが好適である。これらアミノ酸配列を図14及び15に示す。なお、各アミノ酸配列において、下線を付した「MA」配列は、開始コドンとKozak配列に由来する配列を意味し、その他の下線を付したアミノ酸配列は、ドメイン間のリンカーのアミノ酸配列であることを意味する。
本発明は、2つのポリペプチドのセットを構成するポリペプチドをコードする核酸も提供する。
本明細書において用語「核酸」は、特に記載されていない限り、DNA、RNA、DNA/RNAのキメラ、及び、locked nucleic acid(LNA)やペプチド核酸(PNA)などの人工核酸を含む。
また、本発明に係る核酸は、核局在化シグナル配列及び2Aぺプチド配列をあわせてコードする核酸であってもよく、ドメイン間にリンカーが存在するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
発現ベクターには、DNA複製開始点(ori)、選択マーカー(抗生物質抵抗性、栄養要求性等)、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ(FLAG、HA、GST、GFPなど)をコードする核酸等を組み込んでもよい。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法(例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等)で行うことができる。
本発明においては、Creタンパク質がN末端側フラグメントとC末端側フラグメントに分割されている以外は、Cre-loxPシステムと同様にして遺伝子組換えを行うことができる。
本発明に係るCre-loxPシステムは、本発明に係る核酸と、loxP配列及びloxP変異体配列である核酸とを組み合わせたシステムであってもよく、本発明に係る核酸としては、本発明に係る2つのポリペプチドのセットをコードする核酸であることが好ましい。本発明に係るCre-loxPシステムは、本発明に係る発現ベクターと、loxP配列又はloxP変異体配列である核酸とを含有する、Cre-loxPシステムであってもよい。
また、本発明に係る動物は、本発明に係る核酸を有していてもよく、本発明に係る核酸を発現ベクターとして有していてもよく、本発明に係るCre-loxPシステムを有していてもよい。
本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、従来の光依存的に制御されたスプリットCreよりも予想外に優れた遺伝子組換え活性を有するため、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを体内に組み込んだ動物に対して体外から光照射することでも、効率よく遺伝子組換えをコントロールすることができる。
すなわち、本発明に係る2つのポリペプチドのセットによれば、光照射をオン/オフすることでCre/loxPシステムによる遺伝子組換えをin vitroだけでなくin vivoにおいても正確に制御することができる。
本発明に係るCre/loxPシステムを組み込んだ動物としては、哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、実験動物としてのげっ歯類であることが好ましい。
本発明に係るCre/loxPシステムを組み込んだ動物により、特に限定されるものではないが、例えば,光刺激で遺伝子の働きをノックアウトしたり,逆に変異型の遺伝子を光刺激で正常に戻してその影響を評価できるようにしたり,あるいは蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を光刺激で働かせて生体組織やそれを構成する細胞を標識することができる。
Creの分割位置(Step1)、スプリットCreのN末端側フラグメント(CreN)とC末端側フラグメント(CreC)に対するマグネット(pMagおよびnMag)の結合位置(Step2)、リンカーの長さ(Step3)、核局在化シグナル配列(NLS)の結合位置(Step4)、P2Aペプチド配列の結合(Step5)などを検討して、PA-Creとして様々なコンストラクトをルシフェラーゼアッセイで評価した(図1,2)。この目的のために、COS-7細胞を1.5× 104細胞/wellの細胞密度で96-wellマイクロプレート(Corning, Corning, NY, USA)に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。PA-Creの様々なコンストラクトをそれぞれコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたDNAの総量は、0.05 μg/wellとした。このトランスフェクションにはX-tremeGENE 9 reagentを用いた。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。ルシフェラーゼアッセイの直前に、0.2 mM D-luciferin potassium salt(Wako,Japan)を含んだHanks’ balanced salt solution(HBSS, Grand Island Biological, Grand Island, NY, USA)で培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダー(BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany)を用いて10 秒間、室温での測定を行なった(図2)。
PA-Creのコンストラクトを作製するために、スプリットCreのN末端側フラグメント(CreN)とC末端側フラグメント(CreC)をコードするcDNAをCreの改良版(iCre)のcDNAから作製した。なお、iCreのcDNAは哺乳類細胞での発現を高めるためにコドンを最適化するようInvitrogen(Carlsbad, CA, UAS)で合成を行なった。具体的には、開始コドンとKozak配列を実現するためにATGGCC(MAをコード、配列番号:31)をつけた。
CRY2-CIB1-splitCreのコンストラクトを作製するために、CRY2-CreN19-104のplasmid(#26888)とCIB1-CreC106-343のplasmid(#26889)をAddgeneより入手した。CreN19-59、CreC60-343、CreN19-104、CreC106-343、Magnetシステム(pMag及びnMag)、核局在化シグナル配列(NLS)をそれぞれコードするcDNAは一般的なPCRや制限酵素処理、ライゲーションにより作製した。
PA-Creとその関連のコンストラクトは、CMVプロモーターを有するpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)に導入した。なお、ネガティブコントロールのPA-Cre-Y324Fのコンストラクトを作製するために、Multi Site-Directed Mutagenesis(MBL)を用いて、当該キットのマニュアルに従って、324番目のチロシン残基のフェニルアラニンへの置換を行なった。CRY2-CIB1-splitCreはpcDNA3.1ベクターに導入した。
Floxed-STOP-Flucのコンストラクトは、転写停止配列であるポリアデニル化配列(pA)を2つの同じ向きのloxP配列で挟んで作製した。一方、single-floxed-invertedFluc,double-floxed-inverted Fluc,lox66/lox71-floxed invertedFluc,JT15/JTZ17-floxed invertedFlucのコンストラクトは2つもしくは4つのloxP配列やloxP変異体の配列を逆向きにしてホタルルシフェラーゼ(Fluc)のcDNAを挟んで作製した。なお、Floxed-STOP-Flucのコンストラクトの作製には、Addgeneから入手したplasmid(#22797)を利用した。FlucのcDNAはpGL4.31ベクター(Promega)から得た。Floxed-STOP-Fluc,single-floxed-inverted Fluc,double-floxed-invertedFluc,lox66/lox71-floxed invertedFluc,JT15/JTZ17-floxed invertedFlucのそれぞれのコンストラクトはpcDNA3.1ベクターに導入した。なお、蛍光タンパク質のmCherryを用いたレポーターは、上述のFlucを用いたレポーター(floxed-STOP-Fluc,single-floxed-inverted Fluc,double-floxed-inverted Fluc,lox66/lox71-floxed inverted Fluc,JT15/JTZ17-floxed inverted Fluc)のFlucのcDNAをmCherryのcDNAで置き換えて作製した。
COS-7細胞、HEK-293細胞、NIH/3T3細胞、HeLa細胞(いずれもATCC)は10% FBS(GIBCO, Carlsbad, CA, USA)、100 unit/mLpenicillin、100 μg/mL streptomycin(GIBCO)を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Sigma Aldrich)を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。CHO-K1細胞 (ATCC)は10%FBS、100 unit/mL penicillin、100μg/mL streptomycinを添加したHam’s F-12 medium(GIBCO)を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。
PA-Creを発現する細胞やマウスに対する光照射のために、LED光源(470 ± 20 nm;CCS, Kyoto, Japan)を用いた(図6〜10,12,13)。室内光に対するPA-Creの応答性を調べるために、白色蛍光ランプを用いた(図13)。
ルシフェラーゼアッセイを行うために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレート(Corning, Corning, NY, USA)に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った(図6, 9,10)。PA-Cre(又はCRY2-CIB1-split Cre)をコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたDNAの総量は、0.05 μg/wellである。なお、このトランスフェクションにはX-tremeGENE 9 reagent を用いた。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。ルシフェラーゼアッセイの直前に、0.2 mM D-luciferin potassium salt(Wako,Japan)を含んだHanks’ balanced salt solution(HBSS, Grand Island Biological, Grand Island, NY, USA)で培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダー(BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany)を用いて10 秒間、室温での測定を行なった。
コントロール実験のために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った(図6)。PA-Cre-Y324F(iCre又はpcDNA3.1ベクター)をコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。なお、トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施し、生物発光を測定した。iCreの場合、トランスフェクションから48時間、細胞を暗所でインキュベーションして生物発光を測定した。
PA-Creの制御に対する光照射の強度依存性を調べるために、96-well マイクロプレートを40%、33%、25%、10%の透過率のNDフィルター(Fujifilm, Tokyo, Japan)でマスクした(図6)。COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。なお、トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施し、生物発光を測定した。
様々な細胞種においてPA-Creの光応答性を調べるために、HEK-293細胞、NIH/3T3細胞、CHO-K1細胞を1.5× 104細胞/wellの細胞密度で96-wellマイクロプレートに播種した(図6)。HeLa細胞は3.0 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種した。これらの細胞は37 °C、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。HEK-293細胞はPA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。NIH/3T3細胞、HeLa細胞、CHO-K1細胞は、PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.3 μg/wellのDNAを用い、Lipofectamine3000 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施し、生物発光を測定した。
蛍光イメージングに基づいて評価を行うために、COS-7細胞を3.0 × 104細胞/wellの細胞密度でLab-Tek 8-well chamberedcoverglasses(Thermo Scientific, Waltham, USA)に播種し、当該細胞を37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養した(図6, 9)。PA-CreもしくはCRY2-CIB1-split CreをコードするcDNAとそれぞれのレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.15 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して 24 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。蛍光イメージングの直前に培地をHBSSで置換した。蛍光イメージングは63 × oil objective を搭載したLSM 710 confocal laser-scanning microscope(CarlZeiss, Jena, Germany)で行った。mCherryの蛍光イメージングにはHeNe laser(543 nm)を用いた。
COS-7細胞を1.4 × 106細胞/dishの細胞密度で6 cm 培養ディッシュ(Thermo Scientific)に播種し、当該細胞を37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養した(図7,8)。なお、培養ディッシュは、その底面に黒いビニールテープで様々なパターンの光マスク(STRIPE,STAR,SMILEY,MOUNTAIN,LETTERS)を作製して利用した。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。もしくは、PA-CreをコードするcDNAとFloxed-Fluc-hCL1-hPESTのplasmidを1:4の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには2.5 μg/dishのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して48 h、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。生物発光イメージングの前に、1 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光イメージングはEvolve 512 EMCCD camera(Photometrics)を搭載したLumazone bioluminescence imager(NipponRoper, Tokyo, Japan)を用いて5 min行った。データはslidebook 4.2 software(IntelligentInnovations Inc., Denver, CO)とImage-J softwareを用いて解析した。
ルシフェラーゼアッセイを行うために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った(図9)。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して様々な時間(0,1.5,3,6,12,24,48 h)、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。そして、0.2 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダーを用いて10 秒間、室温での測定を行なった。コントロール実験のために、COS-7細胞にpcDNA3.1ベクター(Mock)とFloxed-STOP-Flucのplasmidを上述と同様の条件でトランスフェクションして生物発光計測を行った。
PA-CreによるDNA組換え反応を蛍光で評価するために、COS-7細胞を3.0 × 104細胞/wellの細胞密度で8-well chambered coverglassに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った(図9)。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-mCherryのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには0.15 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して様々な時間(0,1.5,3,6,12,24,48 h)、青色光(1.0 W m-2)での照射を施した。蛍光イメージングの直前に培地をHBSSで置換した。蛍光イメージングは63 × oil objective を搭載したLSM 710 confocal laser-scanning microscope(CarlZeiss, Jena, Germany)で行った。 mCherryの蛍光イメージングには HeNe laser(543 nm)を用いた。 コントロール実験のために、COS-7細胞にpcDNA3.1ベクター(Mock)とFloxed-STOP-mCherryのplasmidを上述と同様の条件でトランスフェクションして蛍光イメージングを行った。
COS-7細胞を2.0 × 105細胞/dishの細胞密度で35 mm culture dish(IWAKI, Tokyo, Japan)に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った(図10)。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには1.0 μg/dishのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して、次のように様々な時間パターンで青色光照射を施した:細胞に対して50 W m-2の青色光で30 s、光照射を施した後に、暗所に24 hインキュベーションし、生物発光計測を行った。また、細胞に対して50 W m-2の青色光で30 s、30 minのインターバルで3回、もしくは6回の光照射を施した後に、暗所でインキュベーションし、生物発光計測を行った。1-shotilluminationの実験については、30 sに加えて、15min、1 h、3 hの青色光照射(50 W m-2)も検討した。コントロール実験として、青色光(1.0W m-2)での24 h照射も行った。生物発光計測の前に、0.2 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光は、GloMax 96 microplate luminometer(Promega)を用いて1.0 秒間、室温での測定を行なった。
実験では5週齢のメスのBALB/cマウス(SankyoLabo Service Corporation, Inc., Tokyo, Japan)を用いた(図12,13)。除毛クリームを用いてマウスの腹部の毛を除き、 24 h、ケージの中で飼育した。そしてPA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでマウスの尾静脈にインジェクションした。このハイドロダイナミックインジェクションにはTransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution(MirusBio LLC, Madison, WI, USA)を用い、マニュアルに従って行った。インジェクションしたDNAの量と溶液の体積はそれぞれ300 μg/mouse weight (g)、0.1 mL/mouse weight(g)である。ハイドロダイナミックインジェクションの後、マウスを8 h、暗所で飼育し、青色LED光源(470 ± 20 nm, 200 W m-2)で16 hもしくは30 s、ケージの中で光照射した。30 s光照射したマウスは、さらに16 h、暗所で飼育した。室内光での光照射については、ハイドロダイナミックインジェクションを施したマウスを白色蛍光(0.05 W m-2)の元で24 h、飼育した。マウスの生物発光イメージングは、ハイドロダイナミックインジェクションの24 h後に行った。生物発光イメージングの前に、100 mM D-luciferinをマウスの尾静脈にインジェクションした。D-luciferin溶液は10 μL/mouse weight (g)である。D-luciferinのインジェクションから3 min後、 Evolve 512 EMCCD camera(Photometrics)を搭載したLumazone bioluminescence imager(Nippon Roper)で5 min、生物発光イメージングを行なった。D-luciferin の尾静脈注射と生物発光イメージングの間、マウスにはisoflurane(AbbVie, Tokyo, Japan)で麻酔を行い、マウスの動きを抑制した。In vivoでのマウスの生物発光イメージングの後、ex vivoでの解析を行うために、当該マウスから肝臓を摘出した。肝臓は1 mM D-luciferinを含んだPBSの中に入れた。なお、実験には6-well culture plate(Thermo Scientific)を利用した。そして、anteriorとposteriorの摘出肝臓のイメージをLumazone bioluminescence imager(Nippon Roper)を用いて5 min、撮影した。データはslidebook 4.2 software(Intelligent Innovations Inc.)で解析した。
配列番号:2 Vividタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号:3〜5 リンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号:6 P2Aペプチドのアミノ酸配列(P2Aペプチド配列)を示す。
配列番号:7〜12 loxPとloxP変異体(lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17)の塩基配列を示す。
配列番号:13、14 DNA組換えによる生成物であるlox72及びJA15-JTZ17の塩基配列を示す。
配列番号:15〜22 pMag、pMagHigh1、pMagFast1、pMagFast2、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2のアミノ酸配列を示す。
配列番号:23、24 例示される核局在化シグナル配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号:25〜28 本発明に係る2つのポリペプチドのセット(PA-Cre)を構成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:29、30 本発明に係る2つのポリペプチドのセット(PA-Cre)のベクターに挿入される塩基配列を示す。
配列番号:31 PA-Creの開始コドンとKozak配列であるMAアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
Claims (19)
- 配列番号:1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットであって、
Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号:1のアミノ酸配列の59位〜68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号:1のアミノ酸配列の101位〜111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つのポリペプチドのセット。 - Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の68位〜343位の領域を少なくとも有するか、
Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の111位〜343位の領域を少なくとも有する、請求項1に記載の2つのポリペプチドのセット。 - Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の60位〜343位の領域を少なくとも有する、請求項1に記載の2つのポリペプチドのセット。
- Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の19位〜104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号:1のアミノ酸配列の106位〜343位の領域を少なくとも有する、請求項1に記載の2つのポリペプチドのセット。
- Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むか、少なくとも1つのフラグメントの配列が対応する配列番号:1のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するフラグメントである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質において、少なくとも配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、リシン、アルギニン又はヒスチジンで置換され、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の他方のタンパク質において、少なくとも配列番号:2の52位及び/又は55位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシンで置換されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、pMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、の組合せである、請求項6に記載の2つのポリペプチドのセット。
- Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、ぞれぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とリンカーを介して結合する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 核局在化シグナル配列が、Creタンパク質のN末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のC末端のアミノ酸で、及び/又はCreタンパク質のC末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のN末端のアミノ酸で、リンカーを介して、あるいは、リンカーを介さずに結合する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 2Aペプチド配列をさらに有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 2つのポリペプチドのセットにおける1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、Creタンパク質のN末端側フラグメント−光依存的に二量体を形成するタンパク質−核局在化シグナル配列−2Aペプチド配列の一部の順にアミノ酸配列を有し、
もう1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、2Aペプチド配列の一部−核局在化シグナル配列−光依存的に二量体を形成するタンパク質−Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット。 - Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合である、請求項11に記載の2つのポリペプチドのセット。
- 請求項1から12のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセットをコードする核酸。
- Creタンパク質のN末端側フラグメント−光依存的に二量体を形成するタンパク質−核局在化シグナル配列−2Aペプチド配列−核局在化シグナル配列−光依存的に二量体を形成するタンパク質−Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする、請求項13に記載の核酸。
- 請求項13又は14に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット、請求項13若しくは14に記載の核酸、又は請求項15に記載の発現ベクター、及びloxP配列又はloxP変異体配列である核酸を含有する、Cre-loxPシステム。
- loxP変異体が、lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17からなる群から選択される、請求項16に記載のCre-loxPシステム。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の2つのポリペプチドのセット、請求項13若しくは14に記載の核酸、請求項15に記載の発現ベクター、又は請求項16若しくは17に記載のCre-loxPシステムを有する動物。
- げっ歯類である、請求項18に記載の動物。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017077804A JP7088520B2 (ja) | 2017-04-10 | 2017-04-10 | 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット |
CA3071610A CA3071610A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-04-10 | Set of polypeptides for use in light-dependent gene recombination |
US16/604,351 US20200157514A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-04-10 | Polypeptide Set to Be Used in Light Dependent Gene Recombination |
PCT/JP2018/015136 WO2018190348A1 (ja) | 2017-04-10 | 2018-04-10 | 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017077804A JP7088520B2 (ja) | 2017-04-10 | 2017-04-10 | 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018174774A true JP2018174774A (ja) | 2018-11-15 |
JP7088520B2 JP7088520B2 (ja) | 2022-06-21 |
Family
ID=63793483
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017077804A Active JP7088520B2 (ja) | 2017-04-10 | 2017-04-10 | 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200157514A1 (ja) |
JP (1) | JP7088520B2 (ja) |
CA (1) | CA3071610A1 (ja) |
WO (1) | WO2018190348A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11965002B2 (en) * | 2018-11-29 | 2024-04-23 | The Bd Of Trustees Of The University Of Illinois | Optogenetic construct for allosteric control of protein activity |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004035628A1 (en) * | 2002-10-21 | 2004-04-29 | Centre National De La Recherche Scientifique | Regulation o-if the cre recombinase using a dissociation/re association system of said recombinase |
JP2015165776A (ja) * | 2014-03-03 | 2015-09-24 | 国立大学法人 東京大学 | 光依存的に二量体を形成するタンパク質のセット |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102643852B (zh) * | 2011-02-28 | 2015-04-08 | 华东理工大学 | 光可控的基因表达系统 |
US20160326219A1 (en) * | 2013-12-13 | 2016-11-10 | Ist Austria (Institute Of Science And Technology Austria) | Optically activated receptors |
US11390860B2 (en) * | 2015-04-13 | 2022-07-19 | The University Of Tokyo | Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene |
-
2017
- 2017-04-10 JP JP2017077804A patent/JP7088520B2/ja active Active
-
2018
- 2018-04-10 US US16/604,351 patent/US20200157514A1/en active Pending
- 2018-04-10 WO PCT/JP2018/015136 patent/WO2018190348A1/ja active Application Filing
- 2018-04-10 CA CA3071610A patent/CA3071610A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004035628A1 (en) * | 2002-10-21 | 2004-04-29 | Centre National De La Recherche Scientifique | Regulation o-if the cre recombinase using a dissociation/re association system of said recombinase |
JP2015165776A (ja) * | 2014-03-03 | 2015-09-24 | 国立大学法人 東京大学 | 光依存的に二量体を形成するタンパク質のセット |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JULLIEN N. ET AL.: "Regulation of Cre recombinase by ligand-induced complementation of inactive fragments", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 2003, VOL.31, NO.21, E131, vol. Fig. 1, JPN6018026067, ISSN: 0004493138 * |
KAWANO F. ET AL.: "Aphotoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering", NATURE CHEMICAL BIOLOGY, EPUB 2016 OCT 10, VOL.12, P.1059-1064, JPN6018026066, ISSN: 0004493137 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7088520B2 (ja) | 2022-06-21 |
CA3071610A1 (en) | 2018-10-18 |
WO2018190348A1 (ja) | 2018-10-18 |
US20200157514A1 (en) | 2020-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10352945B2 (en) | Optogenetic probes for measuring membrane potential | |
JP6892642B2 (ja) | 光依存的に又は薬物存在下でヌクレアーゼ活性若しくはニッカーゼ活性を示す、又は標的遺伝子の発現を抑制若しくは活性化するポリペプチドのセット | |
US9102921B2 (en) | Protein delivery system to generate induced pluripotent stem (iPS) cells or tissue-specific cells | |
Bedbrook et al. | Genetically encoded spy peptide fusion system to detect plasma membrane-localized proteins in vivo | |
CA2947771A1 (en) | Optogenetic probes for measuring membrane potential | |
US20040146889A1 (en) | Inducible regulatory system and use thereof | |
WO2017094885A1 (ja) | リガンド蛍光センサータンパク質とその使用 | |
US20090181458A1 (en) | Tubulo-vesicular structure localization signals | |
WO2019109017A1 (en) | Light-responsive fusion proteins for controlling binding to targets | |
CA2980819C (en) | System for the presentation of peptides on the cell surface | |
Nordin et al. | Transactivator protein: An alternative for delivery of recombinant proteins for safer reprogramming of induced Pluripotent Stem Cell | |
WO2018190348A1 (ja) | 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット | |
CN112813049B (zh) | 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用 | |
JP6051438B2 (ja) | 赤色蛍光蛋白質を用いたカルシウムセンサー蛋白質 | |
CN109748970B (zh) | α-酮戊二酸光学探针及其制备方法和应用 | |
US10030055B2 (en) | Polypeptide exhibiting fluorescent properties, and utilization of the same | |
JP6555677B2 (ja) | 光依存的に二量体を形成するタンパク質のセット | |
US20220333089A1 (en) | Split CPF1 Protein | |
JP5669080B2 (ja) | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 | |
WO2023049826A1 (en) | Genetically encoded voltage indicators and uses thereof | |
JP2012085542A (ja) | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 | |
EP1828236A1 (en) | Fusion proteins and methods for determining protein-protein-interactions in living cells and cell lysates, nucleic acids encoding these fusion proteins, as well as vectors and kits containing these | |
Dübel | Delivery of antibodies to the cytosol | |
Zou | Using Aureochrome to Control Protein-Protein Interactions with Light |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20170502 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200318 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210423 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210621 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210823 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220111 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220314 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220523 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220602 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7088520 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |