JP2018171053A - 皮膚糸状菌症の診断のためのアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚糸状菌症の診断のためのアッセイを提供すること。【解決手段】本発明は、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅するための、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、上記核酸を含むキャリア、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する、配列番号２２を含む核酸配列をサンプル中で検出する工程を包含する方法、疾患の診断のための上記プライマー対、上記核酸または上記キャリアの使用、ならびに疾患の診断のための上記プライマー対、上記核酸および／または上記キャリアを含むキットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅するための、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、上記核酸を含むキャリア、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列をサンプル中で検出する工程を包含する方法、疾患の診断のための上記プライマー対、上記核酸または上記キャリアの使用、ならびに疾患の診断のための、上記プライマー対、上記核酸および／もしくは上記キャリアを含むキットに関する。

ヒト病原性皮膚糸状菌は、３つの属、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、ＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍおよびＥｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎに属し、ヒトの皮膚、爪および毛に感染する真菌である。Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属は、単一の種（Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）によってのみ代表される一方で、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属は、いくつかの異なる種から構成される。近年、以前はＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａに割り当てられていたいくつかの種が、再分類され、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎに割り当てられている（Ｈｏｏｇら， ２０１６）。そしてこの再割り当ては、この特許出願全体を通じて支持される。

欧州各国における皮膚糸状菌の皮膚、毛および爪の感染症の有病率は、３〜２２％の間で変動する。局所治療は、大部分の症例では十分であるが、その感染症が、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の特定の株（例えば、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍおよびＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）によって引き起こされる場合、長期のおよびしばしば高価な全身処置が必要である。

全身の抗真菌薬は、消化管副作用のような種々の副作用と関連し、この副作用は、テルビナフィンで経口処置した患者のうちの３〜５％において起こる。さらに、骨髄抑制および肝臓の副作用が、それほど頻繁ではないものの起こり得る。従って、特定の株による皮膚、毛および爪の感染症の診断は、処置レジメンが考案されかつ治療が開始される前に確認されるべきである。

皮膚糸状菌の現在の診断は、臨床標本中の胞子および菌糸の顕微鏡による同定、続いて、インビトロ培養および真菌の形態の同定に基づく。皮膚、毛および爪材料の直接検鏡はしばしば、真菌感染症の先制診断に関しては十分であるが、それは特定の種の診断をもたらさない。迅速かつ安価ではあるものの、この技術は、比較的感度が低く、全症例のうちの１５％までで偽陰性の結果を示す。

培養の適用は、症例のうちのおよそ９５％において、１０〜１５日間で特定の種の同定を可能にする。しかし、いくつかのゆっくりと増殖する単離物もしくは非定型の単離物に関しては、診断の時間は３〜６週間までである。従って、皮膚糸状菌感染症の診断のための単純で迅速かつ特異的な方法が必要とされる。

ＰＣＲベースの方法は、真菌感染症の診断のために導入されてきた。例えば、ＵＳ２０１０／０３１１０４１は、真菌から核酸を抽出するための方法、患者サンプル中で真菌を検出するためのＰＣＲ方法、ならびに皮膚糸状菌を検出し、３つの属、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、ＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍおよびＥｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎによる感染症を診断するためのＰＣＲキットを開示する。

しかし、当該分野の技術水準で開示される方法は、欠点を有する。特に、それらは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属（これらは、動物好性および非動物好性の種を含む）に由来する密接に関連した株の迅速かつ信頼性の高い区別を可能にしない。

米国特許出願公開第２０１０／０３１１０４１号明細書

従って、本発明の根底にある課題は、皮膚、毛および爪の疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症、より好ましくは真菌による皮膚、毛および爪の感染症の診断のための方法および試薬を提供することである。

本発明の根底にある別の課題は、密接に関連する種から、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原体、特に、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍを同定および区別するための方法および試薬を提供することである。

本発明の根底にある課題は、添付の独立請求項および従属請求項の主題によって解決される。

第１の局面において、本発明の根底にある課題は、配列番号２２、好ましくは、配列番号１を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅し得る、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対によって解決される。

第２の局面において、本発明の根底にある課題は、配列番号２２、好ましくは、配列番号１、もしくはその相補鎖を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、または上記核酸配列を含むベクターもしくは細胞によって解決される。

好ましい実施形態において、上記プライマー対または上記核酸は、検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群からの検出可能な標識を含む。

第３の局面において、本発明の根底にある課題は、本発明に従うプライマー対と、上記正方向プライマーと上記逆方向プライマーとの間にある核酸配列であって、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する上記核酸配列は、上記正方向プライマーの配列と上記逆方向プライマーの配列との間にある上記病原体のゲノムの中に位置し、好ましくは、上記病原体を含むサンプルを、本発明に従うプライマーを使用して増幅することによって得られる、核酸配列とを含む核酸によって解決される。

第４の局面において、本発明の根底にある課題は、本発明に従う核酸を含むキャリアによって解決される。

好ましい実施形態において、上記キャリアは、シラン被覆ガラス、プラスチックまたはシリコン材料のマイクロアレイプレートである。

第５の局面において、本発明の根底にある課題は、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２、好ましくは、配列番号１を含む核酸配列をサンプル中で検出する工程を包含する方法によって解決される。より好ましくは、上記核酸は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９を含む群より選択される配列を含む。

好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、
ａ）患者に由来するサンプル、好ましくは、爪、毛または皮膚／爪材料を提供する工程、
ｂ）上記サンプル中に存在する配列番号２２、好ましくは、配列番号１を含む任意の核酸を、上記プライマー対を使用して増幅し、そのようにして、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２（または配列番号１）を含む核酸配列が上記サンプル中に存在する場合、アンプリコンを生成する工程
をさらに包含する。より好ましくは、上記核酸は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９ならびにこれらの改変体を含む群より選択される配列を含む。

好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、
ｃ）アンプリコンを検出する工程
をさらに包含する。

好ましい実施形態において、上記アンプリコンは、蛍光、放射能、コロイド金または化学発光によって検出される。

第６の局面において、本発明の根底にある課題は、疾患、好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のための、本発明に従うプライマー対、核酸またはキャリアの使用によって解決される。

第７の局面において、本発明の根底にある課題は、本発明に従うプライマー対、核酸および／またはキャリアを含む、好ましくは、疾患、より好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のためのキットによって解決される。

第８の局面において、本発明の根底にある課題は、疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２、好ましくは、配列番号１を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症を伴う病原体の診断のためのキットの製造のための、本発明に従うプライマー対、核酸またはキャリアの使用によって解決される。

第９の局面において、本発明の根底にある課題は、真菌、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の、より好ましくは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の真菌の同定のためのプライマー対、核酸、キャリア、使用またはキットの使用によって解決される。

好ましい実施形態において、上記病原体は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎを含む群に由来する。

好ましい実施形態において、上記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する。

本発明は、皮膚、毛および爪の感染症と関連する種々の病原体が、コンセンサス配列、配列番号２２もしくは配列番号１に関連する、直接関連する株間で僅かではあるが、特徴的な配列相違（これら相違は、皮膚、毛および爪の感染症に罹患している患者に由来する臨床サンプルのようなサンプル中で、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の種々の密接に関連する株を、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属から、およびより好ましくは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉ．を含む群から区別するために使用され得る）を有する相同性のメタロプロテアーゼを共通して有するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。

皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅し得る、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対の好ましい実施形態において、上記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群より選択される。

皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸の好ましい実施形態において、上記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群より選択される。

本発明によれば、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸が、検出される。好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原体、より好ましくはＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の病原体に由来する。好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓに由来し、配列番号２によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍに由来し、配列番号３によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍに由来し、配列番号４によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）に由来し、配列番号５によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）に由来し、配列番号６によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）に由来し、配列番号７によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍに由来し、配列番号８によって表される。別の好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉに由来し、配列番号９によって表される。

本発明は、病原体に由来する上記メタロプロテアーゼをコードする核酸を増幅するための、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対のような種々の試薬を企図する。特異的ハイブリダイゼーションが担保されかつプライマーダイマー化もしくは二次構造形成が回避されるようにプライマーを設計する方法は、当該分野の技術水準で、例えば、Ｄｅｎｎｉｓ， Ｙ． Ｍ．， Ｃｈｉｕｓ， Ｒ． Ｗ． Ｋ．， ａｎｄ Ａｌｌｅｎ Ｃｈａｎ， Ｋ． Ｃ． （２００６） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， 第１８頁に記載されている。好ましい実施形態において、各プライマーは、１０〜４０、より好ましくは、１２〜３５、より好ましくは、１４〜３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態において、用語「正方向プライマー」は、本明細書で使用される場合、上記プライマーが、ＰＣＲ反応において５’→３’方向に伸長され得、配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸の合成を生じるように、病原体のゲノム中で配列番号２２もしくは配列番号１の上流にハイブリダイズするプライマーに関する。

好ましい実施形態において、上記正方向プライマーは、区別される病原体、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の種の中で十分に保存されている配列番号２２もしくは配列番号１の上流にある病原体のゲノムの領域に特異的にハイブリダイズする、上記種の配列番号２２もしくは配列番号１の可変性の部分がたとえ異なるとしても、１より多くの種の配列番号２２もしくは配列番号１を増幅するために使用され得るという趣旨のユニバーサル正方向プライマーである。好ましい実施形態において、上記正方向プライマーは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍおよびＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍによって共有される保存された領域にハイブリダイズし、ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧを含む配列またはその改変体を含む。別の好ましい実施形態において、上記正方向プライマーは、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉによって共有される保存された領域に結合し、ＧＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴを含む配列またはその改変体を含む。

好ましい実施形態において、用語「逆方向プライマー」とは、本明細書で使用される場合、上記プライマーが、ＰＣＲ反応において５’→３’方向に伸長され得、配列番号２２もしくは配列番号１に相補的な配列を含む核酸の合成を生じるように、上記病原体のゲノム中の配列番号２２もしくは配列番号１の下流に特異的にハイブリダイズするプライマーに関する。

好ましい実施形態において、上記逆方向プライマーは、区別される病原体、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の種の中で十分に保存されている配列番号２２もしくは配列番号１の下流にある病原体のゲノムの領域に特異的にハイブリダイズする、上記種の配列番号２２もしくは配列番号１を含む配列または配列番号２２もしくは配列番号１に相補的な配列がたとえ異なるとしても、１より多くの種の配列番号２２もしくは配列番号１に相補的な配列を増幅するために使用され得るという趣旨の、ユニバーサル逆方向プライマーである。好ましい実施形態において、上記逆方向プライマーは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍおよびＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍによって共有される保存された領域にハイブリダイズし、ＡＡＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧを含む配列もしくはその改変体を含む。別の好ましい実施形態において、上記逆方向プライマーは、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉによって共有される保存された領域に結合し、ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧを含む配列またはその改変体を含む。

別の好ましい実施形態において、上記プライマー対は、１より多くのプライマー対、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、２８、３２、３６、４０もしくは４８またはこれより多くのプライマー対を含む組成物中に存在し得る。好ましい実施形態において、上記組成物は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍおよびＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍに由来する配列番号２２もしくは配列番号１をコードする核酸を増幅するために使用され得るプライマー対、ならびに加えて、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉに由来する配列番号２２もしくは配列番号１をコードする核酸を増幅するために使用され得るプライマー対を含む。好ましい実施形態において、上記組成物は、上記プライマー対に、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体を区別するために使用され得る１もしくはこれより多くの配列、好ましくは、βチューブリン（Ｒｅｚａｅｉ−Ｍａｔｅｈｋｏｌａｅｉら （２０１４） Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ４２， ６７４）、転写伸長因子（Ｍｉｒｈｅｎｄｉら （２０１５）， Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １−ａｌｐｈａ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ５３， ２１５）、内部転写スペーサー領域（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）１および２（Ｇｒａｅｓｅｒら （２００８）， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ−ａ Ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ １６６， ２３９）ならびにトポイソメラーゼもしくはその一部として言及される核酸配列を含む群より選択される配列を特異的にハイブリダイズすることによって、増幅または検出するために使用され得るプライマー対を含み得る。このようなプライマー組成物は、本発明に従って使用され得、βチューブリン、転写伸長因子、内部転写スペーサー領域１および２、ならびにトポイソメラーゼもしくはその一部として言及される核酸配列を含む群より選択される配列に特異的にハイブリダイズし得る１種もしくはこれより多くの核酸を含むキャリアを使用して分析され得、任意のこのような配列の存在を検出するために使用され得る。

正方向プライマーの、その５’−３’配向での最後の塩基対と配列番号２２もしくは配列番号１の、その５’−３’配向での最初の塩基対との間の距離は、優先性が増大する順序において、１００００塩基対、８０００塩基対、６０００塩基対、４０００塩基対、２０００塩基対、１０００塩基対、８００塩基対、６００塩基対、４００塩基対、２００塩基対、１００塩基対もしくはこれより少ない塩基対である。

上記逆方向プライマーの、その５’−３’配向での最後の塩基対と、配列番号２２もしくは配列番号１の、その５’−３’配向での最後の塩基対との間の距離は、優先性が増大する順序において、１００００塩基対、８０００塩基対、６０００塩基対、４０００塩基対、２０００塩基対、１０００塩基対、８００塩基対、６００塩基対、４００塩基対、２００塩基対、１００塩基対もしくはこれより少ない塩基対である。

本発明の教示は、本出願で、例えば、機能、名称、配列もしくはアクセッション番号によって明示的にまたは暗示的に言及される正確な配列を有する核酸を使用して行われ得るのみならず、このような核酸の改変体を使用しても行われ得る。好ましい実施形態において、核酸の用語「改変体」は、参照核酸もしくは野生型核酸と少なくとも７０、より好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９もしくは９９，５％の配列同一性を有し、好ましくは、参照核酸もしくは野生型核酸と同じ標的に特異的にハイブリダイズする能力を有する核酸、ならびに核酸の相補鎖が好ましくはストリンジェントな条件下で、上記参照核酸もしくは野生型核酸にハイブリダイズするその核酸を含む。好ましい実施形態において、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、プライマーもしくはプローブのような核酸が、ストリンジェントな条件下でその標的核酸にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プライマーもしくはプローブの長さ、反応温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、プライマーもしくはプローブが長いほど、適切なアニーリングのためのより高い温度に耐える一方で、プライマーもしくはプローブが短いほど、そのようにはならない。ハイブリダイゼーションは、一般に、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡが、それらの融解温度を下回る環境に存在する相補鎖に結合する能力に依存する。そのプローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対的温度は高くなる。結果として、相対的温度が高いほど、反応条件がよりストリンジェントになりかつ非特異的結合に用心する傾向がある一方で、その温度が低いほど、その傾向は低くなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． （１９９５）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃを参照のこと。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列をどのように同定するかに関して、マニュアル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（１９９３） Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ＧｅｒｍａｎｙおよびＬｉｅｂｌ， Ｗ．， Ｅｈｒｍａｎｎ， Ｍ．， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｗ．， ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ， Ｋ． Ｈ． （１９９１） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ４１： ２５５−２６０に示される指示に従い得る。好ましい実施形態において、ストリンジェントな条件は、任意のハイブリダイゼーションに関して適用される。すなわち、ハイブリダイゼーションは、上記プライマーもしくはプローブが、標的配列と７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％またはこれより高く同一である場合にのみ起こる。上記標的配列に関して低い程度の同一性を有する核酸は、ハイブリダイズし得るが、このようなハイブリッドは、不安定であり、ＰＣＲのアニーリング工程またはプローブハイブリダイゼーション後の洗浄工程の間に除去される。ストリンジェントな条件下でのプローブハイブリダイゼーションの洗浄工程において、例えば、塩濃度を２×ＳＳＣに低下させるか、または必要に応じておよびその後、０．２５×ＳＳＣへと低下させ、その一方で温度は、優先性が増大する順序において、およそ３９℃〜６９℃、およそ４１℃〜６７℃、およそ４３℃〜６５℃、およそ４５℃〜６３℃、およそ４７℃〜６１℃、およそ４９℃〜５９℃、およそ５１℃〜５７℃、およそ５３℃〜５７℃である。特に好ましい実施形態において、上記温度は、およそ５１℃〜５７℃またはおよそ５３℃〜５７℃である。好ましい実施形態において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマー対は、検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群からの検出可能な標識を含む。より好ましくは、上記標識は、ｃｙ−３、ｃｙ−５、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡを含む群から好ましくは選択される蛍光標識である。適切な標識、これら標識をプライマーのような核酸に連結し、このような標識を検出する方法は、当該分野の技術水準で記載されている。

好ましい実施形態において、本発明のプライマー対の各プライマーおよび／もしくは本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２、配列番号１に示される配列もしくはその相補的配列を増幅し得るかまたはこれら配列にハイブリダイズし得る配列を含むかまたはその配列からなるが、ただし上記プライマー対および／または上記プローブは、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的配列を増幅できないかまたはその配列にハイブリダイズできない。従って、いくつかの実施形態において、本発明のプローブは、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列にハイブリダイズし得る配列を含むかまたはその配列からなるが、ただし上記プローブは、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的配列にハイブリダイズできない。代替の実施形態において、本発明のプローブは、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列にハイブリダイズし得る配列を含むかまたはその配列からなるが、ただし上記プローブは、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的な配列にハイブリダイズできない。ハイブリダイゼーションに関するストリンジェントな条件は、上記で記載される。ヌクレオチドハイブリダイゼーションを測定するための方法は、当該分野で周知である。本発明のプライマー対および／もしくはプローブが配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的な配列を増幅できないかまたはその配列にハイブリダイズできないという但し書きに関する実施形態において、上記配列は、その全体の長さにわたって、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的な配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。

好ましい実施形態において、本発明のプライマー対の各プライマーおよび／もしくは本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列を増幅し得るかまたはその配列にハイブリダイズし得る配列を含むかまたはその配列からなり、ここで本発明のプライマー対の各プライマーおよび／もしくは本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。従って、いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列と１００％の配列同一性を有する。

好ましい実施形態において、本発明のプローブは、検出可能なシグナル分子に融合される、２５０個以下、２００個以下、１５０個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６５個以下、６０個以下、５５個以下、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、もしくは２０個以下のヌクレオチドの長さを有する。

いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列のフラグメントである配列を含むかまたはその配列からなり、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、もしくは少なくとも２６個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１に示される配列もしくはその相補的な配列と１００％の配列同一性を有する。

本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のプライマー対の各プライマーおよび本発明のプローブの上記の記載される特性は、組み合わされる。すなわち、（１）上記プライマー対および／もしくは上記プローブが、配列番号６、配列番号２９、配列番号３０に示される配列および／もしくはその相補的な配列を増幅できないかまたはその配列にハイブリダイズできないこと、（２）本発明のプローブが、制限された長さを有すること、ならびに（３）本発明のプライマー対の各プライマーおよび本発明のプローブが、配列番号２２もしくはその相補的な配列のフラグメントを含み、ここで上記フラグメントは、少なくとも５個の連続するヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２２に示される配列もしくはその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有することが組み合わされる。

本発明によれば、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸配列またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズし得る核酸が、提供される。上記核酸は、単離された核酸であり得る。この核酸は、病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸を検出するために、およびその配列を他の配列から区別するために、より具体的には、相同な配列を、配列番号２２もしくは配列番号１をも含むこのような感染症と関連する他の病原体から区別するために、プローブとして使用され得る。従って、この核酸は、配列番号２２もしくは配列番号１を含む配列またはその相補的な配列に特異的にハイブリダイズし得る鎖を含む。好ましくは、このような病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４〜２８およびこれらの改変体を含む群より選択される。

配列番号２２もしくは配列番号１を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸は、好ましくは、キャリア上に固定化され得る。このようにして、配列番号２２もしくは配列番号１を含む病原体に由来する核酸にアニールされる場合に、上記核酸を、患者に由来するサンプル中の任意の他の核酸または他の物質から分離することは、より簡単である。上記キャリアは、配列番号２２もしくは配列番号１もしくはその改変体を含む核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸、より好ましくは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４〜２８およびそれらの改変体を含む群より選択される配列を含む核酸でキャリアを被覆することによって作製され得る。好ましい実施形態において、上記キャリアは、マイクロアレイプレートである。適切なマイクロアレイ、これらの調製法および使用法は、当該分野の技術水準において、例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｈ． Ｊ ＆ Ｒｏｅｄｅｒ， Ｔ． （２００４） Ｄｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｏｒ−Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｓｐｅｋｔｒｕｍ， 第３章および第４章において記載される。

本発明によれば、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸を、サンプル中で検出する工程を包含する方法が、提供される。好ましい実施形態において、用語「検出する」とは、本明細書で使用される場合、配列番号２２もしくは配列番号１またはその改変体の存在または非存在を検出することを意味する。より好ましい実施形態において、上記用語は、存在する核酸が、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の、ならびにより好ましくは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉおよびＴ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍを含む群の１種もしくはこれより多くの病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含むか否か、ならびに必要に応じて、これらの病原体の配列のうちのどれが存在するのかを決定することを意味する。最も好ましい実施形態において、上記用語は、サンプル中に存在する核酸が、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）もしくはＴ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍに由来するか否かを決定する、従って、その両方の生物を区別することを意味する。別の好ましい実施形態において、上記検出は、半定量的検出であってもよいし、定量的検出であってもよい。具体的配列を検出するために使用され得る方法は、当該分野の技術水準において、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ． ＆ Ｅｎｇｅｌｓ， Ｊ． Ｗ． （２０１２）， Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ， 第３版に記載される。好ましい実施形態において、上記方法は、マイクロアレイ、核酸配列決定、質量分析法およびＰＣＲ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲを含む群より選択される。別の好ましい実施形態において、皮膚、毛および爪の感染症と関連する上記病原体は、配列番号２２もしくは配列番号１によって部分的にコードされるポリペプチドを同定することによって検出される。当業者は、適切な方法、好ましくはイムノアッセイおよび質量分析法を含む群より選択される適切な方法に精通している。抗体は、配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸配列間の差異を、当該分野の技術水準、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ． ＆ Ｅｎｇｅｌｓ， Ｊ． Ｗ． （２０１２）， Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ， 第６章に記載される標準的方法を使用してタンパク質レベルで区別するために生成され得る。

本発明に従う方法は、サンプル中で、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸に加えて、１種もしくはこれより多くのさらなる核酸配列を検出する工程を必要に応じて包含し得る。このような配列は、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する別の配列番号２２もしくは配列番号１であり得る。例えば、上記方法は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍおよびＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍを含む群の病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む第１の核酸、ならびにＴ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の病原体に由来する別の配列番号２２もしくは配列番号１を含む第２の核酸を検出する工程を包含し得る。このようなさらなる配列は、好ましくは、皮膚、毛および爪の疾患と関連する病原体に由来するメタロプロテアーゼをコードする配列とともに、同時に検出される。好ましい実施形態において、多重ＰＣＲ反応は、検出される配列を増幅するために行われ、そして必要に応じて、これに続いて、マイクロアレイ分析が、好ましくは、メタロプロテアーゼをコードする配列の配列番号２２もしくは配列番号１を含むアンプリコンおよびそのさらなる配列のうちの１つを含む任意のアンプリコンの蛍光検出を使用して、行われ得る。

好ましい実施形態において、上記方法は、ａ）サンプル、好ましくは患者に由来するサンプルを提供する工程を包含し得る。本発明に従う方法もしくは試薬を使用して試験されるサンプルは、皮膚、毛および爪の感染症に罹患していると疑われる患者から得られてもよく、好ましくは、ケラチンを含む患者の身体の部分に由来するサンプルである。より好ましい実施形態において、上記サンプルは、爪、毛もしくは皮膚のサンプルであり、より好ましくは、単離されたサンプルである。上記患者は、好ましくは、哺乳動物患者、より好ましくはヒトである。あるいは、上記サンプルは、環境サンプル、例えば、土壌またはスイミングプールもしくは病院のような潜在的に汚染されている領域の床に由来する環境サンプルであり得る。さらなる分析の前に、上記サンプルは、例えば、存在する任意の核酸を抽出することによって加工処理され得る。好ましい実施形態において、用語「抽出する」とは、本明細書で使用される場合、例えば、増幅および／または検出に干渉し得るいかなる汚染物質をも除去するために、核酸がサンプルから精製されるおよび／または濃縮されることを意味する。好ましい実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくはＤＮＡである。好ましくは病原体を検出するために、より好ましくは真菌病原体を検出するために核酸を抽出するための方法および試薬は、市販されている。検出するために、上記サンプルを直接、または抽出された核酸を使用することは可能であるが、上記方法が、ｂ）配列番号２２もしくは配列番号１を含む任意の核酸、ならびに必要に応じて任意のさらなる配列を増幅し、そのようにして、１種もしくはこれより多くのアンプリコンを生成する工程を包含することは、好ましい。このような増幅は、ＰＣＲによって行われ得る。適切な方法および試薬は、当該分野の技術水準において、例えば、Ｄｅｎｎｉｓ， Ｙ． Ｍ．， Ｃｈｉｕｓ， Ｒ． Ｗ． Ｋ．， ａｎｄ Ａｌｌｅｎ Ｃｈａｎ， Ｋ． Ｃ． （２００６） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， 第１章に記載される。本質的には、上記サンプルまたは上記抽出される核酸は、本発明に従う少なくとも１つのプライマー対、および必要に応じてさらなるプライマー対と接触させられ、続いて、ＰＣＲ緩衝液中のＮＴＰおよび二価カチオンのような必要とされる任意の試薬の存在下で、上記核酸を増幅し得るポリメラーゼが添加される。その得られた反応混合物は、数回の増幅サイクルに供され、各々のサイクルは、上記核酸の２つの相補鎖を分離する工程を包含する変性工程、上記プライマーが上記核酸鎖にハイブリダイズすることが認められるアニーリング工程、および上記核酸の両方の鎖に対する相補鎖の生成を包含する伸長反応を含む。結果として、プライマー対および上記プライマー対の正方向プライマーと逆方向プライマーとの間に位置した病原体のゲノム核酸に由来する配列を含む２本鎖アンプリコンが、生成される。上記アンプリコンは、上記サンプル中の核酸の濃度を超える濃度で、好ましくは、優先性が増大する順序において、１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍もしくは１０^５倍より高い濃度で存在する。ＰＣＲ増幅およびさらなる配列を含むアンプリコンの生成のためのいくつかの反応が、行われ得る。上記正方向プライマーおよび／または逆方向プライマーは、標識され得、標識されたアンプリコンを生じ得る。

好ましい実施形態において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマー対は、検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群の検出可能な標識を含む。より好ましくは、上記標識は、好ましくは、ｃｙ−３、ｃｙ−５、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡを含む群より選択される蛍光標識である。適切な標識、このような標識をプライマーのような核酸に連結し、そして検出する方法は、当該分野の技術水準において記載されている。

その後または工程ｂ）が行われるのと同時に、好ましくは、蛍光、放射能、コロイド金または化学発光によって、任意のアンプリコンが標識され得る。好ましい実施形態において、上記標識は、工程ｂ）を行う前に、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素的に活性な標識、もしくは化学発光標識が、上記プライマー対のうちの一方もしくは両方のプライマーに付着される場合に、上記プライマーに連結され得る。別の好ましい実施形態において、上記アンプリコンは、増幅反応が進行するにつれて、例えば、標識されたＮＴＰの組み込みまたは並行する標識反応によって、標識され得る。別の好ましい実施形態において、上記アンプリコンは、工程ｂ）の後に、例えば、上記アンプリコンに、蛍光標識、放射性標識、酵素的に活性な標識、もしくは化学発光標識を付着させることによって、または上記アンプリコンに、２本鎖ＤＮＡに結合する標識（例えば、臭化エチジウムもしくは臭化プロピジウムのような蛍光性挿入剤）を付加することによって、標識され得る。

その後もしくは工程ｂ）が行われると同時に、上記アンプリコンまたは複数のアンプリコンが検出され得る。例えば、上記ＰＣＲは、反応が進行するにつれて連続蛍光検出を伴うリアルタイムＰＣＲであり得る。上記アンプリコンが後に検出されるべき場合には、上記アンプリコンは、工程ｃ）の前に、ＰＣＲ反応混合物から抽出され得る。その後の検出のために、上記アンプリコンは、抽出されてもされなくても、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、配列番号２２もしくは配列番号１を含む病原体に由来する核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸、好ましくは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４〜２８およびそれらの改変体を含む群の配列を含む核酸と接触させられ得る。配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸は、好ましくは、キャリア上に固定化される。それは、上記検出を行う前に、汚染物質を除去するために洗浄工程に供され得る。このような状況において、上記アンプリコンが標識され、存在する標識されたアンプリコンが配列番号２２もしくは配列番号１を含む核酸に特異的にハイブリダイズされる場合に上記標識が検出されることは、好ましい。

好ましくは、上記検出は、皮膚、毛および爪の疾患と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含むアンプリコンが、皮膚、毛および爪の疾患と関連する別の病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含むアンプリコン、またはさらなるもしくは実際には任意の他の配列を含むアンプリコンから区別され得るように、行われる。

本発明によれば、上記プライマー対、上記核酸および／または上記キャリアを含むキットが、提供され得る。上記プライマー対または上記核酸は、標識され得る。本発明の教示は、キット、好ましくは、疾患を診断するためのキットを提供する。上記キットは、上記キットの使用方法を詳述する指示および病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１に特異的にハイブリダイズし得る核酸と、被験体（好ましくは、ヒト被験体）に由来するサンプルとを、キャリア（例えば、マイクロアレイ）上で接触させるための手段を含み得る。さらに、上記キットは、陽性コントロール、例えば、皮膚、毛および爪の疾患と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む１種もしくはこれより多くの核酸、ならびに陰性コントロール、例えば、配列番号２２もしくは配列番号１を欠いている核酸を含み得る。最後に、このようなキットは、較正曲線を調製するために、皮膚、毛および爪の疾患と関連する病原体に由来する配列番号２２もしくは配列番号１を含む１種もしくはこれより多くの核酸を含む標準溶液を含み得る。好ましい実施形態において、上記配列番号２２もしくは配列番号１は、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原体、より好ましくはＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の病原体に由来する。

本発明によれば、上記プライマー対、キャリア、核酸、細胞、ベクターもしくはキットは、疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の疾患、より好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症、より好ましくは真菌による皮膚、毛および爪の感染症、最も好ましくは、皮膚糸状菌症の診断のために、またはその疾患の診断のためのキットの製造のために、使用され得る。好ましくは、上記疾患は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原体、より好ましくは、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉ（アフリカ）およびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の病原体と関連する感染症である。

好ましい実施形態において、用語「診断」とは、本明細書で使用される場合、患者がある特定の疾患もしくは障害に罹患しているか、または過去に、診断時にもしくは将来的に、罹患する可能性があるか、または平均的被験体もしくは比較上の被験体（この比較上の被験体は、好ましくは、類似の症状を有する）より罹患する可能性があるかの評価の裏付けとなる情報を得ること、上記疾患がどのように進行しつつあるかもしくは将来的に進行していく可能性があるかを発見すること、またはある特定の処置（例えば、アレルギー患者の減感作のための薬物のような適切な薬物の投与）に関して患者の応答性を評価することを目的とした何らかの種の手順をいう。言い換えると、用語「診断」は、診断することのみならず、予後を予測することおよび／または疾患もしくは障害の経過をモニターすることをも包含する。

従って、用語「診断」は、好ましくは、本発明に従う診断法もしくは診断薬剤が、単一の試験、ましてやパラメーターに基づいて最終診断を下すために決定的かつ十分であることを意味するのではなく、「鑑別診断」（すなわち、診断パラメーターのある範囲に基づいて、考えられる条件の範囲の可能性を考慮する体系的診断手順）といわれるものへの寄与に言及し得る。これは、間接的診断（すなわち、陰性の結果は、１つの疾患が除外され得るが、翻って、別の疾患が存在する可能性がより高いことを意味する）を含み得る。用語「診断」はまた、患者にとって最も有望な処置レジメンを選択するために使用される方法または薬剤に言及し得る。言い換えると、上記方法または薬剤は、被験体のための処置レジメンを選択することに関連し得る。用語「診断」は、疾患の原因となる病原体の同定または２種の密接に関連する病原体（好ましくは、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）またはＴ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）の区別にも言及し得る。

本発明は、以下の非限定的な図面、配列、および例示によってさらに例証され、これらから、本発明のさらなる特徴、実施形態、局面および利点が理解され得る。

摘要
本発明は、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅するための、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対、配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、上記核酸を含むキャリア、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する、配列番号２２を含む核酸配列をサンプル中で検出する工程を包含する方法、疾患の診断のための上記プライマー対、上記核酸または上記キャリアの使用、ならびに疾患の診断のための上記プライマー対、上記核酸および／または上記キャリアを含むキットに関する。

本発明の実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目Ａ１）
配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅し得る、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対。
（項目Ａ２）
配列番号２２もしくはその相補鎖を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、または前記核酸配列を含むベクターもしくは細胞。
（項目Ａ３）
項目Ａ１に記載のプライマー対と、正方向プライマーと逆方向プライマーとの間にある核酸配列であって、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する前記核酸配列は、前記正方向プライマーの配列と前記逆方向プライマーの配列との間にある前記病原体のゲノムの中に位置し、好ましくは、前記病原体を含むサンプルを、前記項目のいずれかに記載のプライマーを使用して増幅することによって得られる、核酸配列とを含む核酸。
（項目Ａ４）
検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群からの検出可能な標識を含む、前記項目のいずれかに記載のプライマー対または前記項目のいずれかに記載の核酸。
（項目Ａ５）
前記項目のいずれかに記載の核酸を含むキャリア。
（項目Ａ６）
前記キャリアは、シラン被覆ガラス、プラスチックまたはシリコン材料のマイクロアレイプレートである、前記項目のいずれかに記載のキャリア。
（項目Ａ７）
皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列をサンプル中で検出する工程を包含する方法。
（項目Ａ８）
ａ）患者に由来するサンプル、好ましくは、爪、毛もしくは皮膚材料を提供する工程
ｂ）前記サンプル中に存在する配列番号２２を含む任意の核酸を、項目Ａ１または４のいずれかに記載のプライマー対を使用して増幅し、そのようにして、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列が前記サンプル中に存在する場合に、アンプリコンを生成する工程
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ９）
ｃ）前記アンプリコンを検出する工程
をさらに包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記アンプリコンは、蛍光、放射能、コロイド金、または化学発光によって検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１１）
疾患、好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸、または前記項目のいずれかに記載のキャリアの使用。
（項目Ａ１２）
前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸および／または前記項目のいずれかに記載のキャリアを含むキットであって、好ましくは、疾患、より好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のためのキット。
（項目Ａ１３）
疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の診断のためのキットを製造するための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸または前記項目のいずれかに記載のキャリアの使用。
（項目Ａ１４）
真菌、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の真菌、より好ましくはＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の真菌の同定のための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、キットの使用。
（項目Ａ１５）
前記病原体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に由来する、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、方法、使用またはキット。
（項目Ａ１６）
前記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、方法、使用またはキット。
（項目Ｂ１）
配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅し得る、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対。
（項目Ｂ２）
配列番号２２もしくはその相補鎖を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、または前記核酸配列を含むベクターもしくは細胞。
（項目Ｂ３）
前記項目のいずれかに記載のプライマー対と、正方向プライマーと逆方向プライマーとの間にある核酸配列であって、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する前記核酸配列は、前記正方向プライマーの配列と前記逆方向プライマーの配列との間にある前記病原体のゲノムの中に位置し、好ましくは、前記病原体を含むサンプルを、前記項目のいずれかに記載のプライマーを使用して増幅することによって得られる、核酸配列とを含む核酸。
（項目Ｂ４）
検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群からの検出可能な標識を含む、前記項目のいずれかに記載のプライマー対または前記項目のいずれかに記載の核酸。
（項目Ｂ５）
前記項目のいずれかに記載の核酸を含むキャリア。
（項目Ｂ６）
前記キャリアは、シラン被覆ガラス、プラスチックまたはシリコン材料のマイクロアレイプレートである、前記項目のいずれかに記載のキャリア。
（項目Ｂ７）
皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列を単離されたサンプル中で検出する工程を包含する方法。
（項目Ｂ８）
患者から単離されたサンプル中、好ましくは、爪、毛もしくは皮膚材料中に存在する配列番号２２を含む任意の核酸を、項目Ｂ１または４のいずれかに記載のプライマー対を使用して増幅し、そのようにして、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列が前記サンプル中に存在する場合に、アンプリコンを生成する工程
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｂ９）
前記アンプリコンを検出する工程をさらに包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｂ１０）
前記アンプリコンは、蛍光、放射能、コロイド金、または化学発光によって検出される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｂ１１）
疾患、好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸、または前記項目のいずれかに記載のキャリアを含む組成物。
（項目Ｂ１２）
前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸および／または前記項目のいずれかに記載のキャリアを含むキットであって、好ましくは、疾患、より好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のためのキット。
（項目Ｂ１３）
疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の診断のためのキットを製造するための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸または前記項目のいずれかに記載のキャリアの使用。
（項目Ｂ１４）
疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の診断のための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、前記項目のいずれかに記載の核酸または前記項目のいずれかに記載のキャリアを含むキット。
（項目Ｂ１５）
真菌、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の真菌、より好ましくはＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の真菌の同定のための、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸もしくはキャリアを含む組成物、または前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｂ１６）
前記病原体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に由来する、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、組成物またはキット。
（項目Ｂ１７）
前記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する、前記項目のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、組成物またはキット。
（項目Ｂ１８）
前記病原体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に由来する、前記項目のいずれかのいずれかに記載の方法または使用。
（項目Ｂ１９）
前記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する、前記項目のいずれかに記載の方法または使用。

図１は、メタロプロテアーゼに関連する種々の配列と、共有される核酸配列モチーフおよび導かれるコンセンサス配列とを含む配列アラインメントを示す。

図２は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（動物好性）（Ｂ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（Ｃ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ（Ｄ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓテンプレート（Ｃ）からのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブ（６ａ、６ｂ）にハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。 図２は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（動物好性）（Ｂ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（Ｃ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ（Ｄ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓテンプレート（Ｃ）からのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブ（６ａ、６ｂ）にハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。

図３は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（Ｂ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（Ｃ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ（Ｄ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｙｈｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ａ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ（Ｄ）のテンプレートからのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブにハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。

図４は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ｂ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（Ｃ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色） およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）の特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ｂ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ｃ）のテンプレートからのＰＣＲ生成物が、その特異的プローブにハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。

図５は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（Ｂ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（Ｃ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ（Ａ）のテンプレートからのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブにハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。

図６は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（Ａ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（Ｂ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ（Ｃ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを示す。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍのテンプレートからのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブにハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。

本発明は、以下の核酸配列に関する（５’−３’配向で示される）：

配列番号１：
増幅されるメタロプロテアーゼ関連核酸のコンセンサス配列

配列番号２：
Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓに由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号３：
Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍに由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号４：
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性）、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍに由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号５：
Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）に由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号６：
Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）に由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号７：
Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）に由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号８：
Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍに由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号９：
Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｉに由来するメタロプロテアーゼに関連する標的配列

配列番号１０：
ユニバーサル正方向プライマー（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｅｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性） Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍ）：
ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧ

配列番号１１：
ユニバーサル正方向プライマー（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ）
ＧＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴ

配列番号１２：
ユニバーサル逆方向プライマー（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｅｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性） Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍ）
ＡＡＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧ

配列番号１３：
ユニバーサル逆方向プライマー（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ）
ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧ

配列番号１４：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓプローブ
ＧＡＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡ

配列番号１５：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｅｎ ｅｑｕｉｎｕｍプローブ
ＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＧＴＧＣＧ

配列番号１６：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性＋動物好性） Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ＊、ＩＶ、Ｍプローブ
ＧＡＧＡＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣ

配列番号１７：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）プローブ
ＧＴＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣＴＡＣＡＴ

配列番号１８：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）プローブ
ＴＧＣＡＧＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＴＧＧ

配列番号１９：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）プローブ
ＣＡＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＣ

配列番号２０：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍプローブ
ＡＡＡＧＴＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡ

配列番号２１：
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉプローブ
ＴＴＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧ

配列番号２２：
コンセンサス配列
ｃａｃｎｎｎｎｎｔａａｃｃｎｔａｃｃｃｎｎｎｎｔｃｃｎｎｇｎｎｇｎｎｎｇｇｎｎｎｎｎｎａｎｃｎｎｎｔｇｇａｔｔａｔｇｇｎｎｔｎｎｔｔｃｇｔｇｇａｎｔａｎｇｇｔｎｎｎｎａｎｎｃｇａｔｃｎｔｇｎｎｎａｔｇｇｃａｃｔｎｎｔｎｇｇｔｎｎｎｎｔｇｎｎｎｃａｎｎｔｎｃｃａａａａｇｎｎｇｎｎｇｃａｇｇｇｎｎｎｎａｃｃｎｎｎｔｔｎｎｎｎｎｎｔｇｇｎａｎｇｇｔｇｔａｇｇｃａａｔｎｎｔｔｎｔｇｎｎｎｃｎｎｃａｔｃｇｎｎｇａｎｇｎｎｎａｔｃｇｎｎｇｎａｇｎａ

配列番号２３：
プライマー
ｃｔｇｇｃｃａｔｇｇｃａｃｔｔａｔｔｇｇ

配列番号２４：
プローブ
ｇａｔｇｔａｇｇｃｃｃａａａａｔｃａｔｔｇｃｃｔａｃａｃ

配列番号２５：
プローブ
ｃｔｇｃｃｃｃａａｃｔｔｔｔｇｇｃａａｃｔｇ

配列番号２６：
プローブ
ｔａｇｇｃａａｔｇａｔｔｔｔｇｇｇｃｃｔａ

配列番号２７：
プローブ
ｃａｔｃｇｇｃｇａｇｇａｃｃａｔｃｇｇａ

配列番号２８：
プローブ
ｇｃａａｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇｃｃｔａｃａｔｃ
配列番号２９：
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍに由来する配列
ｃｔｔｔｔｇｔｇａｇａｇａｇｔｃｃａｇｔｔｇｃａｃｇｃｃｔｇｔａａｃｃｇｔａｃｃｃｇａａｇｔｃｃｔｔｇｃａｇｔａｃｇｇｔｔｔｇｇｃｃａｃａｔｔｔｇｇａｔｔａｔｇｇａｇｔｇｃｔｔｃｇｔｇｇａｃｔａｔａｇｔｇｇｔｇａｃａｃｇａｔｃｃｔｇａｃｃａｔｇｇｃａｃｔｔａｔｔｇｇｔｃｃａｇｔｇｇｇｇｔａｇｔｔｇｃｃａａａａｇｇｇｇｃｃｇｃａｇｇｇｇａａｇａｃｃｇｃａｔｔｃｔｇａａｔｔｇｇａａｇａｇｔｇｔａｇｇｃａａｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇｃｃｔａｃａｔｃｇｇｔｇａｔｇｃａｔａｔｃｇｇａｇｃａｇｔｇｃ

配列番号３０：
Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍに由来する配列
ｃｔａｔｔｇｇｇａｇｇｇａｇｔｃｃａｇｔｔｇｃａｃｔｃｃｔｇｔａａｃｃｇｔａｃｃｃａｔｇｇｔｃｃｔｔｇｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇａｃａｔａａｃａｔｔｔｇｇａｔｔａｔｇｇｇｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇｇａｔｔａｃｇｇｔｃｃｃａａｃａｃｇａｔｃｃｔｇａｃｇａｔｇｇｃａｃｔｃｃｔｔｇｔｔｇａｃｇｔｇｇｇｇｃａｇｔｔｇｃｃａａａａｇｇｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａａｇａｃｃｇａａｔｔｃａｔａｇａｔｇｇａａｇｇｇｔｇｔａｇｇｃａａｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇａｃｔｇｃａｔｃｇｇｃｇａｔａｔｔｔａｔｃｇｇａｇｃａｇａａｃ

実施例：以下の実施例は、種々の病原体株が本発明に従う教示を使用して区別され得ることを示す。

実施例１
プライマーおよびプローブの設計
サンプル中のＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓの同定のために、そのメタロプロテアーゼ遺伝子を、有用な標的領域として選択した。オリゴヌクレオチド配列の比較に基づいて、プライマーセット（正方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧ ３´、逆方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＡＡＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧ ３´）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓの検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＧＡＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡ ３´）を設計した。その設計したプローブを、内部反復、二次構造、融解温度およびＧＣ含有量に関してチェックした。

ＤＮＡマイクロアレイ
Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓおよびいくつかのコントロールのために設計されたプローブを、規定された位置に位置づけられた微視的に小さいスポットとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに固体キャリア材料上にスポットした。

皮膚糸状菌培養物からのＤＮＡ抽出
皮膚糸状菌試験培地アガー（ＳＩＦＩＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＴＮ ２１０２）上で培養を行った。培養したＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（ＣＢＳ ４８３．７６）、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅヒト好性／動物好性（２２３５， Ｐｅｌｏ１）およびＴ．ｅｑｕｉｎｕｍ（ＣＢＳ １２７．９７）のＤＮＡを、ＯｍｎｉＰｒｅｐ^ＴＭ ｆｏｒ Ｆｕｎｇｕｓキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ７８６−３９９）を使用して製造業者の説明書に従って抽出し、内部転写スペーサー（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ ｓｐａｃｅｒ）（ＩＴＳ）配列決定によって種レベルで同定した。

ＰＣＲ
各ＰＣＲ反応を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（動物好性）またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍの５μｌ ＤＮＡ抽出物（５ｎｇ／μｌ）の添加によって、容積２０μｌで行った。各反応は、１×Ｇｒｅｅｎ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＢＩＯ−３９０２９）、０．７５ Ｕ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｍ８３０）、０．５μＭ 正方向プライマーおよび０．５μＭ 逆方向プライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。増幅は、ＡＢＩ ２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ４３５９６５９）で行い、９６℃で３分間の予備溶解工程および９６℃で１５秒（融解）、５２℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒（伸長）の３５サイクルからなり、７２℃において１分間保持で終了させた。

ハイブリダイゼーション
ＰＣＲ反応から生じるアンプリコンは、上記正方向プライマーおよび／または逆方向プライマーの５’末端に付着した蛍光色素（これは、ＰＣＲ生成物がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合する場合に、アンプリコンをマイクロアレイスキャナー（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ， ＹＧ ０６０２−０１０１）によって検出されることを可能にする）を含んだ。ハイブリダイゼーション工程のために、２５μｌ ＰＣＲ生成物を、６５μｌ ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ、ＺＭ０１０１−０１０８）と混合した。この混合物のうちの６５μｌを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ技術（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ＋ハイブリダイゼーションステーション， ＺＭ ９９９９−０１０５＋ＹＧ ０６１５−０１０１）を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。５５℃での１時間のインキュベーション後に、そのＥＵＲＯＡｒｒａｙスライドを、製造業者のプロトコルに従って特別な緩衝溶液で洗浄して、非特異的結合配列を除去した（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， 洗浄試薬１＋２， ＺＭ ０１２１−００５０＋ＺＭ０１２２−００１２）。洗浄後に、そのスライドを圧縮空気で乾燥させたところ、強く対形成した鎖のみがハイブリダイズしたまま残った。標識されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生成された。これを、マイクロアレイスキャナーを介して検出した。

読み取りおよび評価
最終データ読み取りおよびその評価を、ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒおよびＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア， ＹＧ ０９０１−０１０１）を使用して行った。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ヒト好性）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（動物好性）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍのテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを、図２に示す。

Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓの特異的プローブは、白丸によって強調され、点線で囲まれたスポットは、グリッドを設定するためにソフトウェアから必要とされるコントロールである。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓテンプレート（Ｃ）からのＰＣＲ生成物のみが、その特異的プローブ（６ａ、６ｂ）にハイブリダイズし、蛍光シグナルを示した。これは、他の株のうちのいずれかに由来するＤＮＡを使用した場合には存在しない。

これは、本発明の方法が、皮膚、毛および爪の疾患と関連するＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ株を区別するために使用され得ることを示す。

実施例２
材料および方法
ＤＮＡマイクロアレイは、それらのＤＮＡ配列によって互いから異なるＤＮＡ分子（プローブ）からなる。生物のＤＮＡがマイクロアレイにおいてこれらの規定されたプローブにマッチするセグメントを含む場合、その相補的なＤＮＡ領域は、一緒に結合する（ハイブリダイズする）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される蛍光標識プライマーに起因して、プローブと増幅された標的配列との間の明確なハイブリダイゼーションは、マイクロアレイスキャナーを介して検出され得る。評価される陽性シグナルは、その標的配列が検出できたことを意味する。この実施例において、ＤＮＡマイクロアレイを介する皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの検出が示される。プローブ特異性の検証のために、最も密接に関連する種Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）も、分析の中に含めた。その使用される方法は、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームに基づいた。

プライマーおよびプローブの設計
サンプル中のＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの同定のために、そのメタロプロテアーゼ遺伝子を、有用な標的領域として選択した。オリゴヌクレオチド配列の比較に基づいて、プライマーセット（正方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＴＧＧ ３´、逆方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧ ３´）ならびにＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）の検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＧＡＴＧＴＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣ ３´）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧ ３´）を設計した。その設計したプローブを、内部反復、二次構造、融解温度（Ｔｍ）およびＧＣ含有量に関してチェックした。

ＤＮＡマイクロアレイ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびいくつかのコントロールのために設計されたプローブを、規定された位置に位置づけられた微視的に小さいスポットとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに固体キャリア材料にスポットした。

皮膚糸状菌培養物からのＤＮＡ抽出
皮膚糸状菌試験培地アガー（ＳＩＦＩＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＴＮ ２１０２）上で培養を行った。培養したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（ＣＢＳ ６２３．６６）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（ＣＢＳ ２８０．８３）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（ＣＢＳ ８０８．７２）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ（ＣＢＳ ５６３．８３）のＤＮＡを、ＯｍｎｉＰｒｅｐ^ＴＭ ｆｏｒ Ｆｕｎｇｕｓキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ７８６−３９９）を使用して製造業者の説明書に従って抽出し、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列決定によって種レベルで同定した。

ＰＣＲ
各ＰＣＲ反応を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの５μｌ ＤＮＡ抽出物（５ｎｇ／μｌ）の添加によって、容積２０μｌで行った。各反応は、１×Ｇｒｅｅｎ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＢＩＯ−３９０２９）、０．７５ Ｕ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｍ８３０）、０，８μＭ 正方向プライマーおよび０，４μＭ 逆方向プライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。増幅は、ＡＢＩ ２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ４３５９６５９）で行い、９６℃で３分間の予備溶解工程および９６℃で１５秒（融解）、５２℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒（伸長）の３５サイクルからなり、７２℃において１分間保持で終了させた。

ハイブリダイゼーション
その生じるＰＣＲ生成物を、蛍光色素（これは、ＰＣＲ生成物がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合する場合に、それら生成物をマイクロアレイスキャナー（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ， ＹＧ ０６０２−０１０１）によって検出されることを可能にする）で標識した。ハイブリダイゼーション工程のために、２５μｌ ＰＣＲ生成物を、６５μｌ ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ、ＺＭ０１０１−０１０８）と混合した。この混合物のうちの６５μｌを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ技術（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ＋ハイブリダイゼーションステーション， ＺＭ ９９９９−０１０５＋ＹＧ ０６１５−０１０１）を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。５５℃での１時間のインキュベーション後に、そのＥＵＲＯＡｒｒａｙスライドを、製造業者のプロトコルに従って特別な緩衝溶液で洗浄して、非特異的結合配列を除去した（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， 洗浄試薬１＋２， ＺＭ ０１２１−００５０＋ＺＭ０１２２−００１２）。洗浄後に、そのスライドを圧縮空気で乾燥させたところ、強く対形成した鎖のみがハイブリダイズしたまま残った。標識されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生成された。これを、マイクロアレイスキャナーを介して検出した。

読み取りおよび評価
最終データ読み取りおよびその評価を、ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒおよびＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア， ＹＧ ０９０１−０１０１）を使用して行った。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍのテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを、図３に示す。マイクロアレイでのｃｙ３標識ＰＣＲ生成物およびコントロールとハイブリダイズしたその特異的プローブ（図３中の白丸）がまた、ハイブリダイゼーション緩衝液中の標識オリゴヌクレオチドとそのアレイの角にあるプローブ配列との間のハイブリダイゼーションに起因して、蛍光シグナルを示した場合に、株を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）またはＴｒｉｃｈｏｐｙｈｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍであると同定した。

実施例３
材料および方法
ＤＮＡマイクロアレイは、それらのＤＮＡ配列によって互いから異なるＤＮＡ分子（プローブ）からなる。生物のＤＮＡがマイクロアレイにおいてこれらの規定されたプローブにマッチするセグメントを含む場合、その相補的なＤＮＡ領域は、一緒に結合する（ハイブリダイズする）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される蛍光標識プライマーに起因して、プローブと増幅された標的配列との間の明確なハイブリダイゼーションは、マイクロアレイスキャナーを介して検出され得る。評価される陽性シグナルは、その標的配列が検出できたことを意味する。この実施例において、ＤＮＡマイクロアレイを介する皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）の検出が示される。その使用される方法は、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームに基づいた。

プライマーおよびプローブの設計
サンプル中のＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）の同定のために、そのメタロプロテアーゼ遺伝子を、有用な標的領域として選択した。オリゴヌクレオチド配列の比較に基づいて、プライマーセット（正方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＴＧＧ ３´、逆方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧ ３´）ならびにＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）の検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣＴＡ ３´）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）の検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＣＡＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＧＡ ３´）を、設計した。その設計したプローブを、内部反復、二次構造、融解温度（Ｔｍ）およびＧＣ含有量に関してチェックした。

ＤＮＡマイクロアレイ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）およびいくつかのコントロールのために設計されたプローブを、規定された位置に位置づけられた微視的に小さいスポットとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに固体キャリア材料にスポットした。

皮膚糸状菌培養物からのＤＮＡ抽出
皮膚糸状菌試験培地アガー（ＳＩＦＩＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＴＮ ２１０２）上で培養を行った。培養したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（ＣＢＳ ６２３．６６）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（ＣＢＳ ２８０．８３）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（ＣＢＳ ８０８．７２）のＤＮＡを、ＯｍｎｉＰｒｅｐ^ＴＭ ｆｏｒ Ｆｕｎｇｕｓキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ７８６−３９９）を使用して製造業者の説明書に従って抽出し、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列決定によって種レベルで同定した。

ＰＣＲ
各ＰＣＲ反応を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）の５μｌ ＤＮＡ抽出物（５ｎｇ／μｌ）の添加によって、容積２０μｌで行った。各反応は、１×Ｇｒｅｅｎ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＢＩＯ−３９０２９）、０．７５ Ｕ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （５ Ｕ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｍ８３０）、０，４μＭ 正方向プライマーおよび１，６μＭ 逆方向プライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。増幅は、ＡＢＩ ２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ４３５９６５９）で行い、９６℃で３分間の予備溶解工程および９６℃で１５秒（融解）、５２℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒（伸長）の３５サイクルからなり、７２℃において１分間保持で終了させた。

ハイブリダイゼーション
その生じるＰＣＲ生成物を、蛍光色素（これは、ＰＣＲ生成物がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合する場合に、それら生成物をマイクロアレイスキャナー（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ， ＹＧ ０６０２−０１０１）によって検出されることを可能にする）で標識した。ハイブリダイゼーション工程のために、２５μｌ ＰＣＲ生成物を、６５μｌ ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ、ＺＭ０１０１−０１０８）と混合した。この混合物のうちの６５μｌを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ技術（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ＋ハイブリダイゼーションステーション， ＺＭ ９９９９−０１０５＋ＹＧ ０６１５−０１０１）を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。５５℃での１時間のインキュベーション後に、そのＥＵＲＯＡｒｒａｙスライドを、製造業者のプロトコルに従って特別な緩衝溶液で洗浄して、非特異的結合配列を除去した（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， 洗浄試薬１＋２， ＺＭ ０１２１−００５０＋ＺＭ０１２２−００１２）。洗浄後に、そのスライドを圧縮空気で乾燥させたところ、強く対形成した鎖のみがハイブリダイズしたまま残った。標識されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生成された。これを、マイクロアレイスキャナーを介して検出した。

読み取りおよび評価
最終データ読み取りおよびその評価を、ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒおよびＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア （ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア， ＹＧ ０９０１−０１０１）を使用して行った。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを、図４に示す。マイクロアレイでのｃｙ３標識ＰＣＲ生成物およびコントロールとハイブリダイズしたその特異的プローブ（図４中の白丸）がまた、ハイブリダイゼーション緩衝液中の標識オリゴヌクレオチドとそのアレイの角にあるプローブ配列との間のハイブリダイゼーションに起因して、蛍光シグナルを示した場合に、株を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）であると同定した。

実施例４
材料および方法
ＤＮＡマイクロアレイは、それらのＤＮＡ配列によって互いから異なるＤＮＡ分子（プローブ）からなる。生物のＤＮＡがマイクロアレイにおいてこれらの規定されたプローブにマッチするセグメントを含む場合、その相補的なＤＮＡ領域は、一緒に結合する（ハイブリダイズする）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される蛍光標識プライマーに起因して、プローブと増幅された標的配列との間の明確なハイブリダイゼーションは、マイクロアレイスキャナーを介して検出され得る。評価される陽性シグナルは、その標的配列が検出できたことを意味する。この実施例において、ＤＮＡマイクロアレイを介する皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉの検出が示される。プローブ特異性の検証のために、最も密接に関連する種Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）も、分析の中に含めた。その使用される方法は、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームに基づいた。

プライマーおよびプローブの設計
サンプル中のＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉの同定のために、そのメタロプロテアーゼ遺伝子を、有用な標的領域として選択した。オリゴヌクレオチド配列の比較に基づいて、プライマーセット（正方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＴＧＧ ３´、逆方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧ ３´）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉの検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー− ＧＡＴＧＴＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣ ３´）を設計した。その設計したプローブを、内部反復、二次構造、融解温度（Ｔｍ）およびＧＣ含有量に関してチェックした。

ＤＮＡマイクロアレイ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉおよびいくつかのコントロールのために設計されたプローブを、規定された位置に位置づけられた微視的に小さいスポットとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに固体キャリア材料にスポットした。

皮膚糸状菌培養物からのＤＮＡ抽出
皮膚糸状菌試験培地アガー（ＳＩＦＩＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＴＮ ２１０２）上で培養を行った。培養したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ（ＣＢＳ ６７７．８６）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）（ＣＢＳ ２８０．８３）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（ＣＢＳ ８０８．７２）のＤＮＡを、ＯｍｎｉＰｒｅｐ^ＴＭ ｆｏｒ Ｆｕｎｇｕｓキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ７８６−３９９）を使用して製造業者の説明書に従って抽出し、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列決定によって種レベルで同定した。

ＰＣＲ
各ＰＣＲ反応を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）の５μｌ ＤＮＡ抽出物（５ｎｇ／μｌ）の添加によって、容積２０μｌで行った。各反応は、１×Ｇｒｅｅｎ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＢＩＯ−３９０２９）、０．７５ Ｕ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （５ Ｕ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｍ８３０）、０，５μＭ 正方向プライマーおよび０，５μＭ 逆方向プライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。増幅は、ＡＢＩ ２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ４３５９６５９）で行い、９６℃で３分間の予備溶解工程および９６℃で１５秒（融解）、５２℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒（伸長）の３５サイクルからなり、７２℃において１分間保持で終了させた。

ハイブリダイゼーション
その生じるＰＣＲ生成物を、蛍光色素（これは、ＰＣＲ生成物がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合する場合に、それら生成物をマイクロアレイスキャナー（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ， ＹＧ ０６０２−０１０１）によって検出されることを可能にする）で標識した。ハイブリダイゼーション工程のために、２５μｌ ＰＣＲ生成物を、６５μｌ ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ、ＺＭ０１０１−０１０８）と混合した。この混合物のうちの６５μｌを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ技術（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ＋ハイブリダイゼーションステーション， ＺＭ ９９９９−０１０５＋ＹＧ ０６１５−０１０１）を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。５５℃での１時間のインキュベーション後に、そのＥＵＲＯＡｒｒａｙスライドを、製造業者のプロトコルに従って特別な緩衝溶液で洗浄して、非特異的結合配列を除去した（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， 洗浄試薬１＋２， ＺＭ ０１２１−００５０＋ＺＭ０１２２−００１２）。洗浄後に、そのスライドを圧縮空気で乾燥させたところ、強く対形成した鎖のみがハイブリダイズしたまま残った。標識されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生成された。これを、マイクロアレイスキャナーを介して検出した。

読み取りおよび評価
最終データ読み取りおよびその評価を、ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒおよびＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア， ＹＧ ０９０１−０１０１）を使用して行った。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）のテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを、図５に示す。マイクロアレイでのｃｙ３標識ＰＣＲ生成物およびコントロールとハイブリダイズしたその特異的プローブ（図５中の白丸）がまた、ハイブリダイゼーション緩衝液中の標識オリゴヌクレオチドとそのアレイの角にあるプローブ配列との間のハイブリダイゼーションに起因して、蛍光シグナルを示した場合に、株を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｉであると同定した。

実施例５
材料および方法
ＤＮＡマイクロアレイは、それらのＤＮＡ配列によって互いから異なるＤＮＡ分子（プローブ）からなる。生物のＤＮＡがマイクロアレイにおいてこれらの規定されたプローブにマッチするセグメントを含む場合、その相補的なＤＮＡ領域は、一緒に結合する（ハイブリダイズする）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される蛍光標識プライマーに起因して、プローブと増幅された標的配列との間の明確なハイブリダイゼーションは、マイクロアレイスキャナーを介して検出され得る。評価される陽性シグナルは、その標的配列が検出できたことを意味する。この実施例において、ＤＮＡマイクロアレイを介する皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの検出が示される。その使用される方法は、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームに基づいた。

プライマーおよびプローブの設計
サンプル中のＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの同定のために、そのメタロプロテアーゼ遺伝子を、有用な標的領域として選択した。オリゴヌクレオチド配列の比較に基づいて、プライマーセット（正方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＧＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴ ３´、逆方向プライマー ５´ ｃｙ３−ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧ ３´）ならびにＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）の検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＣＡＴＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＧＡ ３´）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）の検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣＴＡ ３´）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの検出のための種特異的プローブ（５´ Ｃ６−アミノ−リンカー−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣ ３´）を、設計した。その設計したプローブを、内部反復、二次構造、融解温度（Ｔｍ）およびＧＣ含有量に関してチェックした。

ＤＮＡマイクロアレイ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびいくつかのコントロールのために設計されたプローブを、規定された位置に位置づけられた微視的に小さいスポットとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに固体キャリア材料にスポットした。

皮膚糸状菌培養物からのＤＮＡ抽出
皮膚糸状菌試験培地アガー（ＳＩＦＩＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＴＮ ２１０２）上で培養を行った。培養したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）（ＣＢＳ ８０８．７２）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）（ＣＢＳ ６２３．６６）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ （ＣＢＳ ５６３．８３）のＤＮＡを、ＯｍｎｉＰｒｅｐ^ＴＭ ｆｏｒ Ｆｕｎｇｕｓキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ７８６−３９９）を使用して製造業者の説明書に従って抽出し、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列決定によって種レベルで同定した。

ＰＣＲ
各ＰＣＲ反応を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍの５μｌ ＤＮＡ抽出物（５ｎｇ／μｌ）の添加によって、容積２０μｌで行った。各反応は、１×Ｇｒｅｅｎ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｘ９８０１）、０．４ｍＭ 各ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）（Ｂｉｏｌｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ＢＩＯ−３９０２９）、０．７５ Ｕ ＧｏＴａｑ（登録商標） Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ， Ｍ８３０）、１，０μＭ 正方向プライマーおよび１，０μＭ 逆方向プライマー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだ。増幅は、ＡＢＩ ２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ， ｎｏ． ４３５９６５９）で行い、９６℃で３分間の予備溶解工程および９６℃で１５秒（融解）、５２℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で４０秒（伸長）の３５サイクルからなり、７２℃において１分間保持で終了させた。

ハイブリダイゼーション
その生じるＰＣＲ生成物を、蛍光色素（これは、ＰＣＲ生成物がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合する場合に、それら生成物をマイクロアレイスキャナー（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ， ＹＧ ０６０２−０１０１）によって検出されることを可能にする）で標識した。ハイブリダイゼーション工程のために、２５μｌ ＰＣＲ生成物を、６５μｌ ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、ハイブリダイゼーション緩衝液Ａ、ＺＭ０１０１−０１０８）と混合した。この混合物のうちの６５μｌを、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ技術（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ｔｉｔｅｒｐｌａｎｅ＋ハイブリダイゼーションステーション， ＺＭ ９９９９−０１０５＋ＹＧ ０６１５−０１０１）を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズさせた。５５℃での１時間のインキュベーション後に、そのＥＵＲＯＡｒｒａｙスライドを、製造業者のプロトコルに従って特別な緩衝溶液で洗浄して、非特異的結合配列を除去した（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， 洗浄試薬１＋２， ＺＭ ０１２１−００５０＋ＺＭ０１２２−００１２）。洗浄後に、そのスライドを圧縮空気で乾燥させたところ、強く対形成した鎖のみがハイブリダイズしたまま残った。標識されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生成された。これを、マイクロアレイスキャナーを介して検出した。

読み取りおよび評価
最終データ読み取りおよびその評価を、ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒおよびＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ， ＥＵＲＯＡｒｒａｙＳｃａｎソフトウェア， ＹＧ ０９０１−０１０１）を使用して行った。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍのテンプレートからハイブリダイズしたＰＣＲ生成物での捕捉マイクロアレイを、図６に示す。マイクロアレイでのｃｙ３標識ＰＣＲ生成物およびコントロールとハイブリダイズしたその特異的プローブ（図６中の白丸）がまた、ハイブリダイゼーション緩衝液中の標識オリゴヌクレオチドとそのアレイの角にあるプローブ配列との間のハイブリダイゼーションに起因して、蛍光シグナルを示した場合に、株を、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（白色／アフリカ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍであると同定した。

Claims (19)

1. 配列番号２２を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸を増幅し得る、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対。
2. 配列番号２２もしくはその相補鎖を含む皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸、または前記核酸配列を含むベクターもしくは細胞。
3. 請求項１に記載のプライマー対と、正方向プライマーと逆方向プライマーとの間にある核酸配列であって、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する前記核酸配列は、前記正方向プライマーの配列と前記逆方向プライマーの配列との間にある前記病原体のゲノムの中に位置し、好ましくは、前記病原体を含むサンプルを、請求項１に記載のプライマーを使用して増幅することによって得られる、核酸配列とを含む核酸。
4. 検出可能な標識、好ましくは、蛍光標識、放射性標識、コロイド金標識または酵素的に活性な標識を含む群からの検出可能な標識を含む、請求項１に記載のプライマー対または請求項２もしくは３のいずれか１項に記載の核酸。
5. 請求項２または４のいずれかに記載の核酸を含むキャリア。
6. 前記キャリアは、シラン被覆ガラス、プラスチックまたはシリコン材料のマイクロアレイプレートである、請求項５に記載のキャリア。
7. 皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列を単離されたサンプル中で検出する工程を包含する方法。
8. 患者から単離されたサンプル中、好ましくは、爪、毛もしくは皮膚材料中に存在する配列番号２２を含む任意の核酸を、請求項１または４のいずれかに記載のプライマー対を使用して増幅し、そのようにして、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体に由来する配列番号２２を含む核酸配列が前記サンプル中に存在する場合に、アンプリコンを生成する工程
   を包含する、請求項７に記載の方法。
9. 前記アンプリコンを検出する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
10. 前記アンプリコンは、蛍光、放射能、コロイド金、または化学発光によって検出される、請求項９に記載の方法。
11. 疾患、好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のための、請求項１もしくは４のいずれかに記載のプライマー対、請求項２に記載の核酸、または請求項５〜６のいずれかに記載のキャリアを含む組成物。
12. 請求項１もしくは４のいずれかに記載のプライマー対、請求項２に記載の核酸および／または請求項５〜６のいずれかに記載のキャリアを含むキットであって、好ましくは、疾患、より好ましくは、病原体と関連する皮膚、毛および爪の感染症の診断のためのキット。
13. 疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の診断のためのキットを製造するための、請求項１もしくは４のいずれかに記載のプライマー対、請求項２に記載の核酸または請求項５〜６のいずれかに記載のキャリアの使用。
14. 疾患、好ましくは、皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体、より好ましくは、配列番号２２を含む核酸を有する皮膚、毛および爪の感染症と関連する病原体の診断のための、請求項１もしくは４のいずれかに記載のプライマー対、請求項２に記載の核酸または請求項５〜６のいずれかに記載のキャリアを含むキット。
15. 真菌、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の真菌、より好ましくはＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群の真菌の同定のための、請求項１〜６のいずれかに記載のプライマー対、核酸もしくはキャリアを含む組成物、または請求項１２に記載のキット。
16. 前記病原体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に由来する、請求項１〜６、１１〜１２および１４〜１５のいずれかに記載のプライマー対、核酸、キャリア、組成物またはキット。
17. 前記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する、請求項１６に記載のプライマー対、核酸、キャリア、組成物またはキット。
18. 前記病原体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に由来する、請求項７〜１０および１３のいずれかに記載の方法または使用。
19. 前記病原体は、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（アフリカ）、Ｔ．ｂｅｎｈａｍｉａｅ（黄色）、Ｔ．ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍおよびＴ．ｅｒｉｎａｃｅｉを含む群に由来する、請求項１８に記載の方法または使用。