EP2429564A1 - Pharmazeutische zusammensetzungen, enthaltend antifungale peptide - Google Patents

Pharmazeutische zusammensetzungen, enthaltend antifungale peptide

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EP2429564A1
EP2429564A1 EP10721448A EP10721448A EP2429564A1 EP 2429564 A1 EP2429564 A1 EP 2429564A1 EP 10721448 A EP10721448 A EP 10721448A EP 10721448 A EP10721448 A EP 10721448A EP 2429564 A1 EP2429564 A1 EP 2429564A1
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EP
European Patent Office
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peptide
minutes
medium
furfur
suspension
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10721448A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heike BRÜSER
Daniel HÜMMERICH
Claus Bollschweiler
Carsten Schwalb
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • compositions containing antifungal peptides are provided.
  • the present invention relates to the use of specific peptides in pharmaceutical compositions which find particular use in topical use as antifungal and antibacterial compositions. Furthermore, the invention relates to the preparation of such compositions, their preparation and coding nucleotide sequences for such peptides.
  • Magainin 2 consists of 23 amino acids and is active against bacteria as well as tumor cell lines. Compared to the fusion of cecropin A and melittin, the fusion of cecropin and magainin shows markedly lower hemolytic activity and antimicrobial activity against Escherichia coli and Bacillus subtilis (Shin, SY Kang, JH, Lee, MK, Kim, SY, Kim, Y. , Hahm, KS, 1998, Biochemistry and Molecular Biology International, 44: 119-1121).
  • cecropin A magainin-2 fusion peptide was described by Shin et al. 1999. It was found that the construct P18 (HT2, SEQ ID NO: 3) had a lower hemolytic activity compared to the starting fusion, the antibacterial activity but was not affected by Escherichia coli and Bacillus subtilis (Shin et al 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90).
  • WO-A-00/032220 describes the use of a fungal polypeptide as antifungal agent for the treatment of dandruff. An internal comparison with antifungal agents of the prior art also does not take place here.
  • US 2003/0096745 describes a polypeptide of the sequence KWKKLLKKPPPLLKKLLKKL with antibacterial and antifungal activity against certain microorganisms. Antifungal activity was shown against Candida albicans and Tricosphoron beigelii. Shin et al. describe the efficacy of a peptide having the sequence KWKKLPKKLLKLL-NH 2 against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Efficacy against fungi is not investigated (Shin et al., 2004, Biotechnology Letters, 26: 735-739).
  • antimicrobial substances can lead to intolerance in human use, especially in regular use, or even to health damage. Incompatibilities may be redness, irritation or sensitization. Systemic uptake into the human body can lead to impaired bodily functions. In particular, regular use of some antimicrobial substances can lead to an accumulation.
  • a known example is parabens (Dabre et al., 2004, Journal of Applied Toxicology, 24: 5-13). Depending on the application, it can lead to an accumulation in the human body or in the environment.
  • the object of the present invention was therefore to provide a new, effective, low-side-effect active ingredient for the treatment of mycoses, in particular dermatomycoses, which is also suitable for the treatment of external bacterial infections, for example of the skin, nails, hair and mucous membranes.
  • a "helix breaker” means a portion within a peptide of the invention which inhibits the formation of a helical secondary structure in the region of this portion of the peptide chain However, the formation of a helix structure farther away from the helix breaker is not inhibited
  • the amino acid proline is a peptide building block with the property of a helix breaker. The same applies to proline-containing peptide fragments.
  • Hydrophilic amino acids in the context of the invention are alanine, VaNn, leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine and tryptophan.
  • Hydrophilic amino acids within the meaning of the invention are in particular amino acids with polar side chains such as serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid, and in particular basic amino acids such as lysine, arginine and histidine.
  • the term "formation of an alpha-helical arm” is a sequence that promotes the formation of a helical structure under suitable conditions.
  • Artificial suitable conditions for forming helical structures are, for example, the trifluoroethanol-based, and SDS-based, solvent-producing aphro- helix-forming solvent systems.
  • Percent alpha-helicity means a measured value determined by means of a circular dichroism (CD) analysis, the sample to be measured under standard conditions, in particular 50% (v / v) trifluoroethanol in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, or 30 mM SDS in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, using a measuring cell of 1 mm path length at a peptide concentration of 100 ⁇ g / ml Calculation takes place according to the following formula:
  • [ ⁇ ] ° represents the ellipticity at 222nm and 0% helicity and [ ⁇ ] 100 the ellipticity at 222nm and 100% helicity.
  • a “repetitive sequence motif” is meant the linear arrangement of preferably identical peptide sequences which are linked together directly or indirectly, i.e. via “linker groups” as defined herein.
  • mutants and “variants” are used synonymously. In particular, this refers to “functional” or “functionally equivalent” modifications, as described in more detail below, which furthermore show the desired activity and thus applicability as antimycotic.
  • a “fusion product” refers to the covalent or non-covalent attachment of peptides and proteins ("fusion peptides”) as well as the covalent or non-covalent attachment of peptides and polymers (“fusion polymers”) .
  • the interlinked components are either irreversible or reversible ie biologically, in particular enzymatically, fissile connected.
  • a first subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutical carrier, a peptide having at least one sequence motif of the following general formula I.
  • HB comprises 1 to 5, in particular 1, 2 or 3, contiguous amino acid residues and represents a partial sequence motif with the function of a helix breaker
  • Hell and Hel2 are the same or different subsequence motifs, each of which is 5 to 15, such as 5.
  • contiguous amino acid residues which are selected essentially from hydrophilic, in particular basic, and proline other hydrophobic residues, and each capable of forming an alpha helix arm, wherein at least one of the helical arms has in its axial projection, ie in plan view corresponding to a "helical wheel” diagram, an incomplete separation into a hydrophobic, in particular basic, and hydrophilic helix half Half of one type (hydrophobic or hydrophilic) of amino acid residues of the other type (hydrophilic or hydrophobic) are taken.
  • hydrophobic and hydrophilic helix halves consist exclusively of hydrophobic or hydrophilic amino acid residues as defined above.
  • An example of a completely hydrophilic / hydrophobic separated HeNx is the sequence motif KLKKLLKK.
  • a “half of the helix” is not necessarily to be understood as the numerical half, that is to say half the number of total number of amino acids in a HeNx
  • the numerical size of two halves may differ, for example, from 1 to 3 amino acids.
  • a second aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutical carrier, a peptide having at least one sequence motif of the following general formula I.
  • HB 1 to 5, in particular 1, 2 or 3 comprises contiguous amino acid residues and stands for a partial sequence motif with the function of a helix breaker
  • "Hell” and "Hel2" are identical or different partial sequence motifs, each having 5 to 15, such B. 6 to 12, in particular 8, 9 or 10, contiguous amino acid residues which are selected essentially from hydrophilic, in particular basic, and proline other hydrophobic residues, and each capable of forming an alpha helical arm, wherein the peptide has a percent alpha-helicity (% helicity) of about 7 to 98%, such as 30 to 80% or 30 to 60%, in 50% (v / v) trifluoroethanol, pH 7.0, or a% helicity. Value of about 8 to 60%, or 12 to 55% or 12 to 40%, in 30 mM SDS, pH 7.0, as determined by CD spectrometry
  • a third aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutical carrier, at least one peptide having a sequence or a repetitive sequence motif according to SEQ ID NO: 1:
  • Xio represents a peptide bond or one or two or more basic or hydrophobic amino acid residues or one or two proline residues and
  • Xi to X 9 denote any basic or hydrophobic amino acid residues other than proline; wherein the repetitive sequence motifs may be the same or different; and / or mutants or derivatives thereof.
  • compositions as defined above containing at least one peptide having a sequence or a repetitive sequence motif according to SEQ ID NO: 2:
  • X I for lysine, arginine or phenylalanine
  • X 2 for lysine or tryptophan
  • X 3 for leucine or lysine
  • X 4 for phenylalanine or leucine
  • X 5 for leucine or lysine
  • X 6 for leucine or lysine
  • X 7 for histidine or lysine
  • X 8 for alanine, leucine, VaNn or serine
  • X 9 for leucine or lysine
  • X II is proline or a chemical bond
  • X 12 is proline or a chemical bond
  • repetitive sequence motifs are the same or different; and / or mutants or derivatives thereof.
  • Non-limiting examples of the above sequences or repetitive sequence motifs according to SEQ ID NO: 3 are:
  • KKFP18 FKKLFKKIPKFLHAAKKF (SEQ ID NO: 5)
  • compositions according to the invention may in particular contain peptides having a repetitive sequence motif, a plurality, in particular 2 to 10 or 3 to 5, of peptides of the general formula I or according to SEQ ID NO: 1 to 9 or mutants or derivatives thereof via linker groups are peptidic linked together.
  • linker groups may comprise 1 to 10 contiguous, identical or different amino acid residues, preferably selected from alanine, glycine, threonine and serine, such as GGSGGT, GGSGGS, or poly-alanine linkers and poly-glycine linkers where "poly” stands for 2 to 10; or selected from Asp, Pro, Asn and GIy, as described e.g. Asp-Pro and Asn-Gly.
  • peptides can be used whose C-terminal carboxyl group is amidated.
  • compositions comprising an optionally cleavable fusion polypeptide of at least one pharmaceutical, preferably peptidic auxiliary or active substance and at least one peptide as defined above.
  • agents may be mentioned: hydrophobins, keratin binding domains, albumin, lactoferrin, avidin, antibodies, preferably keratin-binding antibodies, binding peptides for surfaces, preferably keratin-binding peptides, silk proteins, spider silk proteins, preferably C16, collagen, fibronectin, keratin, elastin , other structural proteins, preferably hair and skin structure proteins, binding proteins for skin or hair structure proteins, enamel anabolic proteins, amelogenin, binding proteins of enamel-building proteins, amelogenin binding proteins; these fusions may be permanent or else fissile.
  • the invention also relates to fusion polymers of at least one pharmaceutical polymer and at least one peptide as defined above.
  • polymers include: polyhydroxyalkanoates, hyaluronic acid, glucan, spheroglucan, cellulose, xanthan, polyethylene glycol, polyglycerol, polylysine and silicones which are present as covalent or noncovalent linkages.
  • peptides may also be present as covalent linkage to pharmaceutically active ingredients, such as panthenol, bisabolol, retinol, carotenoids, protein hydrolysates, in the compositions.
  • compositions according to the above definition additionally containing at least one further pharmaceutical active substance, such as. B. at least one anti-inflammatory drug, an antimicrobial agent for inhibiting the growth and / or the pathophysiological activity of unwanted germs, in particular Malasezzia furfur, and / or a sebum regulating active ingredient.
  • at least one further pharmaceutical active substance such as. B. at least one anti-inflammatory drug, an antimicrobial agent for inhibiting the growth and / or the pathophysiological activity of unwanted germs, in particular Malasezzia furfur, and / or a sebum regulating active ingredient.
  • antiinflammatory agents are: corticosteroids (e.g., cortisone), azathioprine, bisabolol, cyclosporin A, acetylsalicylic acid, ibuprofen, panthenol, chamomile extract or aloe extracts, anti-inflammatory drugs, cytostatics, etc.
  • corticosteroids e.g., cortisone
  • azathioprine e.g., cortisone
  • bisabolol e.g., bisabolol
  • cyclosporin A e.g., acetylsalicylic acid
  • ibuprofen e.g., ibuprofen
  • panthenol e.g., chamomile extract or aloe extracts
  • anti-inflammatory drugs cytostatics, etc.
  • antimicrobial agents are: conventional preservatives known to those skilled in the art, such as Aklohole, p-hydroxybenzoic acid ester, imidazolidinyl urea, formaldehyde, sorbic acid, benzoic acid, salicylic acid, etc.
  • deodorizing substances are, for. Zinc ricinoleate, triclosan, undecylenic acid alkylolamides, citric acid triethyl ester, chlorhexidine etc (see also section 3.5 below).
  • these include azo-Ie (ketoconazole, climbazole), zinc pyrithione, selenium sulfides, etc.
  • sebum regulating agents include: azelaic acid, potassium salicyl diglycinate, sebacic acid, 10-hydroxydecanoic acid, 1, 10-decanediol, aluminum salts such as aluminum chlorohydrate.
  • the invention further provides the above-described peptides for use as a medicament, in particular as a medicament for the treatment of mycoses, in particular dermatomycoses, as well as for the treatment of bacterial infections, especially external infections such as infections of the skin, nails, hair or mucous membranes.
  • These drugs may contain, in addition to the antimicrobial peptides, other pharmaceutically active substances, such as antibiotics, which may be co-administered or timed with the antimicrobial peptides.
  • the peptidic active compounds according to the invention have antimicrobial and antifungal effects. They have a very broad antimycotic spectrum of action, especially against dermatophytes and yeasts, as well as biphasic fungi, e.g. against Candida species, such as Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis Candida tropicalis, Epidermophyton species such as Epidermophyton floccosum, Aspergillus species, such as Aspergillus niger , Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus, Trichophyton
  • Trichophyton rubrum such as Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton ajelloi, Trichophyton equinum, Trichophyton erinacei, Trichophyton interdigitale, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton verrucosum, Trichophyton vio- laceum, Microsporon Species such as Microsporon felineum, Microsporum audouinii, Microsporum canis, Microsporum cookei, Microsporum distortum, Microsporum ferrugineum, Microsporum gallinae, Microsporum gypseum, Microsporum nanum and Microsporum racemosum, and Torulopsis species such as Torulopsis glabrata as well as Malassezia species such as Mal
  • Trichosporon ssp. Piedraia hortae, as well as various blackening fungi.
  • the enumeration of these microorganisms is by no means a restriction of combinable germs, but has only an explanatory character.
  • compositions according to the invention are to be assumed against the following diseases associated with the listed fungal pathogens: aspergillosis, bronchopulmonary aspergillosis (ABPA), candida mycid, candidiasis, extrinsic allergic alveolitis (EAA), genital mycosis (vulvagycosis, Vaginal mycosis), microspore, mucositis / thrush, onychia et paronychia candidosa, onychomycosis, piedra pityriasis versicolor, pityriasis folliculitis, tinea capitis, tinea corporis, tinea gladiatorum, tinea ungium, trichophytia, zygomycosis, tinea manuum, tinea pedis.
  • ABPA bronchopulmonary aspergillosis
  • candida mycid candidiasis
  • EAA extrinsic allergic alveolitis
  • the peptidic agents according to the invention have antibacterial activity against staphylococci such as Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus, streptococci such as Streptococcus mutans and Streptococcus pyogenes, Propionibacteria such as Propionibacterium acnes and Propionibacterium granulosum but also Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae such as Escherichia coli, Shigella ssp., Enterococcus ssp and Klebsiella ssp.
  • the enumeration of these microorganisms is by no means a restriction of combinable germs, but has only an explanatory character.
  • the peptidic active compounds according to the invention have a rapid activity.
  • Examples of indications in human medicine are: dermatomycoses and systemic mycoses caused by Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and other trichophyton species, Microsporon species and Epidermophyton floccosum, yeasts and biphasic fungi, and mold fungi.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, comprise one or more inventive contain active substances or consist of one or more novel active ingredients.
  • the present invention also includes pharmaceutical preparations in dosage units.
  • the preparations are in the form of individual parts, e.g. Tablets, dragees, capsules, pills, suppositories and ampoules, the active substance content of which corresponds to a fraction or a multiple of a single dose.
  • the dosage units may be e.g. 1, 2, 3 or 4 single doses or 1/2, 1/3 or 1/4 of a single dose.
  • a single dose preferably contains the amount of active ingredient which is administered in one application and which usually corresponds to a whole, a half or a third or a quarter of a daily dose.
  • Non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients are to be understood as meaning solid, semi-solid or liquid diluents, fillers or formulation auxiliaries of all kinds.
  • Preferred pharmaceutical preparations which may be mentioned are tablets, dragees, capsules, pills, granules, suppositories, solutions, suspensions and emulsions, pastes, ointments, gels, creams, lotions, powders or sprays.
  • Tablets, dragees, capsules, pills and granules may contain the active ingredient (s) in addition to the usual excipients, such as (a) fillers and extenders, e.g. Starches, lactose, cane sugar, glucose, mannitol and silicic acid, (b) binders, e.g. Carboxymethylcellulose, alginates, gelatin, polyvinylpyrrolidone, (c) humectants, e.g. Glycerol, (d) disintegrants e.g. Agar-agar, calcium carbonate and sodium carbonate, (e) solution retarder, e.g. Paraffin and (f) resorption accelerator, e.g.
  • fillers and extenders e.g. Starches, lactose, cane sugar, glucose, mannitol and silicic acid
  • binders e.g. Carboxymethylcellulose, alginates, gelatin, polyvinylpyrrolidone
  • quaternary ammonium compounds (g) wetting agents, e.g. Cetyl alcohol, glycerol monostearate, (h) adsorbents, e.g. Kaolin and bentonite; and (i) lubricants, e.g. Talc, calcium and magnesium stearate and solid polyethylene glycols or mixtures of the substances listed under (a) to (i).
  • wetting agents e.g. Cetyl alcohol, glycerol monostearate
  • adsorbents e.g. Kaolin and bentonite
  • lubricants e.g. Talc, calcium and magnesium stearate and solid polyethylene glycols or mixtures of the substances listed under (a) to (i).
  • the tablets, dragees, capsules, pills and granules may be provided with the usual optionally containing opacifying agents coatings and shells and be composed so that they deliver the active ingredient or only in a certain part of the intestinal tract, optionally delayed, where as embedding masses such as polymer substances and waxes can be used.
  • the active substance (s) may optionally also be present in microencapsulated form with one or more of the excipients specified above.
  • Suppositories may contain, in addition to the active ingredient (s), the usual water-soluble or water-insoluble carrier substances, e.g. Polyethylene glycols, fats, e.g. Cocoa fat and higher esters (e.g., C14 alcohol with C16 fatty acid) or mixtures of these substances.
  • the usual water-soluble or water-insoluble carrier substances e.g. Polyethylene glycols, fats, e.g. Cocoa fat and higher esters (e.g., C14 alcohol with C16 fatty acid) or mixtures of these substances.
  • Ointments, pastes, creams and gels may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients, e.g. animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragant, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silocones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • the active substance e.g. animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragant, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silocones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • Powders and sprays may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients, e.g. Lactose, talc, silicic acid, aluminum hydroxide, calcium silicate and polyamide powder or mixtures of these substances, sprays may additionally contain the usual propellants, e.g. Chlorofluorocarbons included.
  • the usual propellants e.g. Chlorofluorocarbons included.
  • Solutions and emulsions may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients such as solvents, dissolution inhibitors and emulsifiers, e.g. Water, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils, in particular cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol, glycerol formal, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and fatty acid esters of sorbitan or mixtures of these substances.
  • solvents e.g. Water, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-
  • solutions and emulsions may also be present in sterile and blood-tonic form.
  • Suspensions may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients, such as liquid diluents, e.g. Water, ethyl alcohol, propyl alcohol, suspending agent, e.g. ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth or mixtures of these substances.
  • liquid diluents e.g. Water, ethyl alcohol, propyl alcohol, suspending agent, e.g. ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth or mixtures of these substances.
  • the formulation forms mentioned can also contain colorants, preservatives and odor and taste-improving additives, for example peppermint oil and eucalyptus oil, and sweeteners, for example saccharin.
  • the therapeutically active compounds should preferably be present in the abovementioned pharmaceutical preparations in a concentration of about 0.0001 to 99.5, preferably of 0.01 to 95 wt .-% of the total mixture.
  • compositions may, in addition to the active compounds according to the invention, also contain other active pharmaceutical ingredients.
  • Positive effects or even synergisms of the peptidic active compounds according to the invention are to be expected in combination with the following active ingredients: cortisone, dithranol, zinc, vitamin C, folic acid, biotin, cyclosporin, voriconazole, clotrimazole, pentamidine, potassium iodide, essential oils, saturated fatty acids , Capric acid, lauric acid, propolis, tea tree oil, eucalyptus oil, dolastatin 10, auristatin PHE, N-chlorotaurine, prostaglandin inhibitors such as aspirin, indomethacin, amphotericin B, candines, nikkomykines, azoles, allylamines, strobilurins, echinocandin, pneumocandin, pradimicin, Benanomicin, oligopeptides, imidazoles, triazoles, polyethylenes, ciclopiroxolamine, sordarine
  • the preparation of the abovementioned pharmaceutical preparations is carried out in a customary manner by known methods, e.g. by mixing the active substance (s) with the excipient (s).
  • the present invention also includes the use of the active compounds according to the invention. fe, as well as of pharmaceutical preparations containing one or more fiction, according to active ingredients, in human and veterinary medicine for the prevention, amelioration and / or cure of the diseases listed above.
  • the active compounds or the pharmaceutical preparations can be administered locally, orally, parenterally, intraperitoneally, intravenously and / or rectally, preferably topically locally.
  • the active compound (s) according to the invention in total amounts of about 2.5 to about 200, preferably 5 to 150 mg / kg of body weight per 24 hours, optionally in the form several single doses to achieve the desired results.
  • the active compounds according to the invention are administered in total amounts of about 2.5 to about 200, preferably 5 to 150 mg / kg body weight per 24 hours and in parenteral administration in total amounts of about 2.5 to about 50, preferably 1 to 25 mg / kg body weight administered every 24 hours.
  • the pharmaceutical composition contains the peptide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in a concentration of 0.0001 - 50 wt .-%, preferably 0.001 - 25 wt .-%, in particular 0.01 - 5 wt. % and more preferably 0.1-1% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • compositions comprising at least one peptide as defined above, the minimum inhibitory concentration against Malassezia furfur in the range of about 1500 to 0.1 uM, such as 500 to 1 uM, 100 to 5 uM or 50 to 10 ⁇ M, determined under standard conditions.
  • Standard conditions include the determination of the minimal inhibitory concentration of a Malassezia furfur culture, which has an initial optical density of 0.02 at 600 nm, and after incubation with the peptide for 24 hours in this minimal concentration in the culture medium containing less than 1 Colony Forming Unit (CFU) of the microorganism per ⁇ l of culture medium.
  • CFU Colony Forming Unit
  • Another object of the invention relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition as defined above, wherein formulated a peptide as defined above together with at least one conventional pharmaceutical excipient and optionally further cosmetic or pharmaceutical active ingredients for the desired administration form.
  • P18 (SEQ ID NO: 3) is a peptide with a chain length of 18 amino acids, which is derived from a fusion peptide from fragments of cecropin A from Hyalaphora cecropia and magainin from Xenopus laevis.
  • a fungicidal activity has been found in experiments for Candida albicans, Trichosporon beigelii, Aspergillus flavus and Fusarium oxysporum (Lee et al., (2004) Biotechnology Letters, 26: 337-341.). Nevertheless, it is known to those skilled in the art that the effect of fungicidal substances on different organisms can be very different.
  • the effect on the lipophilic fungus Malassezia furfur and the lipophilic species of the genus Malassezia may, for.
  • distinct from the effect on Candida albicans Hazanson et al., (1989) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 33: 1391-1392; Nenhoff et al., (2002) Acta Derm Venereol., 82: 170-173).
  • the observed effect of P18 according to the invention and structurally and functionally related peptides of the type described herein are therefore completely surprising to the person skilled in the art.
  • the secondary structure of the peptides according to the invention is a HeNx, which is divided centrally into two helices by a helix-refractive amino acid.
  • a helix-refractive amino acid In a representation as a "helical wheel" on one side (or half of the helix), hydrophobic amino acids, in particular leucine residues, predominate on the other hand positively charged amino acids, in particular lysine residues.
  • the peptides of the invention are composed in particular of D and / or L-amino acids, in particular L-amino acids.
  • the preparation of peptides and / or derivatives thereof described herein may be accomplished in a manner known per se, such as by solid phase chemical synthesis, liquid synthesis or biotechnologically using recombinant production strains or cell cultures.
  • the peptide according to SEQ ID N0: 3 is extended N- and / or C-terminally by at least one arbitrary amino acid residue.
  • additional residues include Asp, Pro, Asn, Gly.
  • With simultaneous extension of N- and C-terminus is the additional N-terminal radical preferably Pro or Gly and the associated C-terminal radical preferably Asp or Asn
  • “functional equivalents” are understood as meaning, in particular, mutants which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned, but nevertheless possess the proper shank for the prevention, inhibition and treatment of dandruff
  • a "equivalents” thus comprise the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions, wherein said changes can occur in any sequence position as long as they lead to a mutant having the property profile according to the invention. Functional equivalence This is especially true if the patterns of reactivity between the mutant and the unaltered polypeptide are qualitatively consistent
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the peptide molecules according to the invention
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium and ammonium salts. , Iron and zinc salts, as well as salts with organic bases, such as amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts such as salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids, such as Acetic acid and oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “Functional derivatives” (or “derivatives”) of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques.
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N- Acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-
  • N- and / or C-terminal additionally 1 to 5, such as. B. 2, 3 or 4 any D or L amino acid residues be covalently (peptide) bound; or N- and / or C-terminal 1 to 5, e.g. each 1, 2, 3 or 4 residues are missing.
  • Non-limiting examples of additional N- and / or C-terminal residues include Asp, Pro, Asn, Gly. With simultaneous extension of N- and C-terminus, the additional N-terminal residue is preferably Pro or Gly and the associated C-terminal residue is preferably Asp or Asn.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules coding for the peptides and fusion peptide used according to the invention.
  • All nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix , The chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active portions thereof according to the invention, as well as nucleic acid fragments, which, for. B. can be used as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acid molecules of the invention may also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when prepared by recombinant techniques or free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from an appropriate cDNA library by using any of the specifically disclosed complete sequences or a portion thereof as hybridization probes and standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, et al. T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction using the oligonucleotide primers prepared on the basis of this sequence become.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides of the invention may also be prepared by standard synthetic methods, e.g. B. with an automatic DNA synthesizer manufactured.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • Such probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which under stringent conditions is at least about 12, preferably at least about 25, e.g. B. about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or a corresponding antisense strand hybridized.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or are altered according to the codon usage of a specific source or host organism in comparison to a specifically mentioned sequence, as well as naturally occurring variants, such as, for example, For example, splice variants or allelic variants thereof.
  • Articles are also provided by conservative nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived by sequence polymorphisms from the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with or are complementary to the abovementioned coding sequences.
  • These polynucleotides can be found by screening genomic or cDNA libraries and optionally multiply therefrom with suitable primers by means of PCR and subsequently isolated, for example with suitable probes.
  • Another possibility is the transformation of suitable microorganisms with polynucleotides or vectors according to the invention, the multiplication of the microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent Insulation.
  • polynucleotides of the invention can also be chemically synthesized.
  • the ability to "hybridize" to polynucleotides means the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to a nearly complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions nonspecific binding between noncomplementary partners is avoided be complementary to 70-100%, preferably to 90-100%
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southern Blot technique or in the primer binding in PCR or RT PCR.
  • Under stringent conditions means, for example, in the Northern blot technique, using a 50-70 0 C, preferably 60-65 0 C warm wash solution, for example 0.1 x SSC buffer with 0.1% SDS (20 ⁇ SSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0) for elution nonspecifically hybri dissected cDNA probes or oligonucleotides.
  • a 50-70 0 C preferably 60-65 0 C warm wash solution
  • 0.1 x SSC buffer with 0.1% SDS (20 ⁇ SSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0
  • SDS 20 ⁇ SSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0
  • only highly complementary nucleic acids remain bound to each other.
  • the setting of stringent conditions is known in the art and is z. In Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3
  • the invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention, as well as vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • “Operational linkage” is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended Targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals, etc.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, etc. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, US Pat. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA.
  • the natural regulatory sequence may still be present before the actual structural gene. By genetic modification, this natural regulation can optionally be switched off and the expression of the genes increased or decreased.
  • the gene construct can also be constructed more simply, ie no additional regulatory signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences may be contained in one or more copies in the gene construct.
  • promoters examples include cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, 17, 15, 13, gal, trc , ara, SP6, lambda PR or in the lambda PL promoter, which are advantageously used in Gram-negative bacteria; and the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, not or the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as. B. light and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P ⁇ promoter.
  • all natural promoters can be used with their regulatory sequences.
  • synthetic promoters can also be used to advantage.
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable targeted expression of the nucleic acid sequences and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can thereby preferably positively influence the expression and thereby increase or decrease.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the preparation of an expression cassette is carried out by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or Polyade- nyl michssignal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J.
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • Vectors other than plasmids are also to be understood as meaning all other vectors known to the skilled person, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally.
  • fusion expression vectors such as pGEX (Pharmacia Biotech Ine, Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) which glutathione-S-transferase (GST), maltose E binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • Non-fusion protein expression vectors such as pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990 ) 60-89).
  • Yeast expression vector for expression in the yeast S. cerevisiae such as pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 1 13-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ. (1991) "Genes Trans- fer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers, (1989) Virology 170: 31-39).
  • Plant expression vectors such as those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border” , Plant Mol. Biol. 20: 1 195-1 197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 871 1-8721.
  • Mammalian expression vectors such as pCDM ⁇ (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene according to the invention or a coding sequence, wherein optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to modify the sequence according to the invention, e.g.
  • the introduced sequence may, for example, also be a homologue from a relative microorganism or be derived from a mammalian, yeast or insect source
  • the vector used for homologous recombination may alternatively be such be engineered that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered to alter expression of the endogenous protein).
  • the modified portion of the gene according to the invention is in the homologous recombination vector
  • suitable vectors for homologous recombination is described, for example, in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • host organisms are in principle all organisms suitable, which allow expression of the nucleic acids according to the invention, their allelic variants, their functional equivalents or derivatives.
  • Host organisms are understood as meaning, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria, such as those of the genera Escherichia, such. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells.
  • the selection of successfully transformed organisms can be carried out by marker genes, which are also contained in the vector or in the expression cassette.
  • marker genes are antibiotic resistance genes and enzymes that catalyze a coloring reaction that causes staining of the transformed cell. These can then be selected by means of automatic cell sorting.
  • Microorganisms successfully transformed with a vector carrying a corresponding antibiotic resistance gene eg G418 or hygromycin
  • Marker proteins presented on the cell surface can be used for selection by affinity chromatography.
  • the peptides used according to the invention can be produced recombinantly in a manner known per se, wherein a polypeptide-producing microorganism is cultivated, if appropriate, the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted if the polypeptides are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells can optionally by high-frequency ultrasound, by high pressure, such as. B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods are digested.
  • Purification of the polypeptides may be accomplished by known chromatographic techniques such as molecular sieve chromatography (gel filtration) such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional techniques such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • the z. B. serve a simpler cleaning.
  • suitable modifications are, for example, acting as an anchor so-called "tags" such.
  • tags such as hexa-histidine anchors, or epitopes that can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor (NY) Press).
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as.
  • a polymer matrix serve, which may be filled for example in a chromatography column, or may be used on a microtiter plate or other carrier.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to identify the proteins for the derivation of the proteins.
  • the antimicrobial peptide-containing compositions and medicaments of the present invention have a broad field of application in human and veterinary therapy, particularly for the treatment of mycoses, preferably dermatomycoses, as well as for the treatment of bacterial infections, especially external infections such as e.g. Infections of the skin, nails, hair and mucous membranes ..
  • auxiliaries and additives for the production of preparations are familiar to the person skilled in the art.
  • the auxiliaries and additives are preferably cosmetically and / or pharmaceutically acceptable auxiliaries.
  • Pharmaceutically acceptable excipients which are known to be useful in the pharmaceutical, food technology and related fields, in particular those listed in relevant pharmacopoeias (eg DAB, Ph. Eur., BP, NF) and other excipients, have no physiological properties conflict.
  • Suitable adjuvants may include lubricants, wetting agents, emulsifying and suspending agents, preservatives, antioxidants, anti-irritants, chelating agents, emulsion stabilizers, film formers, gelling agents, odor masking agents, hydrocolloids, solvents, solubilizers, neutralizing agents, permeation enhancers, pigments, quaternary ammonium compounds, refatting and superfatting agents , Ointment, cream or oil bases, silicone derivatives, stabilizers, sterilizers, blowing agents, drying agents, opacifiers, thickeners, waxes, plasticizers, white oil.
  • a related embodiment is based on expert knowledge, as shown for example in Fiedler, HP Lexicon of excipients for pharmacy, cosmetics and related fields, 4th ed., Aulendorf: ECV Editio Kantor Verlag, 1996.
  • Preferred non-anionic surfactants can be used.
  • CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
  • Suitable anionic surfactants are, for example, alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfonates, alkylaryl sulfonates, alkyl succinates, alkyl sulfosuccinates, N-alkoylsarcosinates, acyl taurates, acyl isothionates, alkyl phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl ether carboxylates, alpha-olefin sulfonates, especially the alkali and alkaline earth metal salts, e.g. As sodium, KaIi- um, magnesium, calcium, and ammonium and triethanolamine salts.
  • the alkyl ether sulfates, alkyl epi-phosphates and alkyl ether carboxylates can have between 1 to 10 ethylene oxide or propylene oxide units, preferably 1 to 3 ethylene oxide units, in the molecule.
  • Suitable examples are sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl sulfate, sodium lauryl ether sulfate, ammonium lauryl ether sulfate, sodium lauroyl sarcosinate, sodium oleyl succinate, ammonium lauryl sulfosuccinate, sodium dodecylbenzenesulfonate and triethanolamine dodecylbenzenesulfonate.
  • Suitable amphoteric surfactants are, for example, alkylbetaines, alkylamidopropylbetaines, alkylsulfobetaines, alkylglycinates, alkylcarboxyglycinates, alkylamphoacetates or -propionates, alkylamphodiacetates or -dipropionates.
  • cocodimethylsulfopropyl betaine cocodimethylsulfopropyl betaine, lauryl betaine, cocamidopropyl betaine or sodium cocamphopropionate can be used.
  • Suitable nonionic surfactants are, for example, the reaction products of aliphatic alcohols or alkylphenols having 6 to 20 C atoms in the alkyl chain, which may be linear or branched, with ethylene oxide and / or propylene oxide.
  • the amount of alkylene oxide is about 6 to 60 moles per mole of alcohol.
  • alkylamine oxides, mono- or dialkylalkanolamides, fatty acid esters of polyethylene glycols, alkyl polyglycosides or sorbitan nether esters are suitable.
  • a 1 mM P18-Pept ⁇ d solution (P18 sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH 2 ) was stored for 12 weeks at 37 ° C below and the antifungal activity of the stored solution on Malassezia furfur with the activity of a freshly prepared 1mM P18-Pept ⁇ d solution compared this served a growth test, which was carried out as follows
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes
  • the growth test was carried out following a Schuttelkultur with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M furfur and incubated overnight at 3O 0 C and 200 rpm shaking incubators biert
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M furfur suspension of overnight culture.
  • the M furfur suspension was initially of the experiment to an optical density measured at 600 nm of 0.02.
  • the concentrates of the inhibitor solutions were 1 mM in water.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU Colo ⁇ y-Forming-Units
  • the aim of the experiment was to investigate the effect of a basic shampoo formulation with the ingredient P18-Pept ⁇ d (P18 sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH 2 )
  • P18 peptide was added directly to the formulation.
  • the formulations were prepared with the following compositions:
  • Table 3 Composition of the basic shampoo formulation and basic shampoo formulation with P18 as the ingredient
  • Texapon NSO sodium Laureth Sulfate 20% 20%
  • Tego Betaine L7 (Cocamidopropyl Betaine) 20% 20%
  • the components Texapon NSO and Tego Betain L7 were mixed and solved. With NaOH, the pH was adjusted to pH 6-7. The following were a 100 mM aqueous
  • test was performed as follows.
  • the components were sterilized at 121 ⁇ C, 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • the growth test was carried out following a Schuttelkultur with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking incubators biert
  • a 96-well microtiter plate was filled with 170 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with 10 ⁇ l of M furfur suspension of a overnight culture. This corresponded to an optical density of 0.02-0.1 measured at 620 nm. 20 ⁇ l basic shampoo formulation or 20 ⁇ l basic shampoo formulation 31-3 with P18 added as ingredient
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C
  • Colony Forming Units were determined so that 1 ⁇ l each of the suspensions was resuspended in 10 ⁇ l of medium and then streaked. After incubation for 6 days, the colonies were paid on the plate determined to exclude an influence of the biphasic medium as well as the growth form of M furfur on the optical density. The experiments were carried out at least in two independent experiments in duplicate Table 4: Colony Forming Units count after 24 hours incubation period
  • Example 4 Growth inhibition of Malassezia furfur at the same concentrations P18 peptide, zinc pyrithione, climbazole and ketoconazole based on the weight percent (wt / wt)
  • the molar masses of the P18 peptide (P18 peptide sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH 2 ) and the currently commercial ingredients of anti-dandruff shampoos for growth inhibition of the fungus Malassezia furfur differ significantly.
  • the molar mass of the P18 peptide is 2300 g / moi, that of zinc pyrithione 317 g / mol, that of ketoconazole 531 g / mol and climbazole has a molar mass of 292 g / mol. Since the experiments for the growth inhibition of M.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M. furfur suspension of the overnight culture.
  • the M. furfur suspension was adjusted to 0.02 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm.
  • the concentrates of the inhibitor solutions were 1 mM in DMSO for the P18 peptide and 10 mM in DMSO for zinc pyrithione, ketoconazole and climbazole.
  • the final DMSO concentration was kept the same in all experiments. This means that at higher concentrations of the zinc pyrithione, ketoconazole and climbazole concentrates, a corresponding volume of DMSO was used so that comparability with the P18 peptide was achieved.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU colony-forming U ⁇ its
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M. furfur suspension of the overnight culture.
  • the M. furfur suspension was adjusted to 0.1 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm. The following growth was compared:
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 °.
  • CFU colony-forming units
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrospor ⁇ m medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and incubated shaking 200rpm.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M. furfur suspension of the overnight culture.
  • the M. furfur suspension was adjusted to 0.1 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm.
  • the peptide variants were dissolved at a final concentration of 1 mM in dimethylsulfoxide (DMSO). It is also possible to dispense with DMSO and to use a purely aqueous peptide solution. From this solution, 5 ⁇ l were added to 100 ⁇ l of M. furfur suspension (final concentration of the P18 peptide 50 .mu.M). In a control batch, the same amount of DMSO without P18 peptide was added.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 °.
  • CFU Colony Forming Units
  • Table 7 Mean number of Colony Forming Units (CFU) after incubation of M. furfur with 50 ⁇ M of different P18 variants
  • the components were sterilized at 121 ° C, 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M. furfur suspension of the overnight culture.
  • the M. furfur suspension was adjusted to 0.1 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm.
  • To the M. furfur suspension was added 10% (v / v) of the shampoo base formulation 31-3.
  • the P18 peptide was dissolved in water at a concentration of 230 g / L.
  • the active ingredients zinc pyrithione and climbazole were dissolved at a concentration of 230 g / l in DMSO, with part of the active ingredients remaining insoluble.
  • the peptide solutions were used at final concentrations of 2.3 g / l; 1.15 g / l; 0.46 g / L and 0.23 g / L added to the M. furfur suspension with shampoo base formulation.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 °.
  • CFU colony-forming units
  • Texapon NSO and Tego Betain L7 were mixed and dissolved With NaOH, the pH was adjusted to pH 6-7. Subsequently, a 100 mM aqueous solutions of the peptide P18 were prepared. To each of the formulations, the appropriate volume of 10OmM P18 peptide solution was added so that the final concentrations of the peptide P18 listed in Table 15 were obtained.
  • the formulations were stored at 40 ° C.
  • the components were sterilized at 121 ⁇ C, 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking biert incubators.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 100 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with M. furfur suspension of the overnight culture.
  • the M. furfur suspension was adjusted to 0.1 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU Colony Forming Units
  • Example 9 Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Peptide P18 in the Presence of a Basic Shampoo Formulation
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of the peptide P18 (H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH 2 ; carboxyl terminus amidated) in the presence of the shampoo base formulation 31-3 (Table 10) was checked in the following manner: The following basic shampoo formulation was prepared.
  • Tego betaine L7 (cocamidopro- 20% pyl betaine)
  • the components Texapon NSO and Tego Betaine L7 were mixed and dissolved. With NaOH, the pH was adjusted to pH 6-7.
  • the components were sterilized at 121 ° C, 1 bar overpressure for 20 minutes
  • agar plates if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium
  • the proliferation assay was performed as follows: A shake with M472 Pityrosporum medium was inoculated with M. furfur and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 170 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with 10 ⁇ l of M. furfur suspension of an overnight culture. This corresponded to an optical density of 0.02-0.1 measured at 620 nm.
  • To this mixture was added 20 ⁇ l basic shampoo formulation 31-3.
  • the peptide P18 was dissolved in DMSO at a concentration of 10 mM. Appropriate quantities of the P18 solution were added to obtain the final concentrations listed in Table II.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU Colony Forming Units
  • Example 10 Combination of the peptide P18 with conventional fungicidal agents
  • the components Texapon NSO and Tego Betain L7 were mixed and dissolved. With NaOH, the pH was adjusted to pH 6-7
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was carried out as follows: A shaking culture Pityrosporum M472 medium was inoculated with M. f ⁇ rf ⁇ r and incubated overnight at 30 C and incubated ⁇ 200 rpm shaking.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 170 ⁇ l each of M472 Pityrosporum medium and inoculated with 10 ⁇ l of M. furfur suspension of an overnight culture. This corresponded to an optical density of 0.02-0.1 measured at 620 nm.
  • 20 ⁇ l of Shampoo's basic formulation 31-3 or water was added to this mixture.
  • the peptide P18 was dissolved in water at a concentration of 10 mM.
  • the conventional fungicidal active ingredient was dissolved in DMSO at a concentration of 10 mM. From the P18 solution and the solution of the conventional fungicidal active substance, appropriate amounts were added to the batches in order to obtain the final concentrations listed in Table 13.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU Colony Forming Units
  • Example 11 Action P18 in the presence of nonionic and zwitterionic surfactants
  • the aim of the experiment was to investigate the effect of nonionic and zwitterionic surfactants on the activity of the P18 peptide (P18 sequence H-KWKLFKKI PKFLHLAKKF-NH 2 ).
  • the following surfactants were used:
  • Pluracare F 68 (a polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer) Plantacare 818 (a glucoside)
  • agar plates For agar plates, if necessary, 150 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: Shake culture with M472 Pityrospor TM medium was performed with Af. Inoculated furfur and incubated overnight shaking at 30 0 C and 200 rpm.
  • a 96-well microtiter plate was filled with in each case 85 .mu.l of a M. furfur suspension in M472 Pity- rosporum medium, which had an optical density of 0.1 measured at 620 nm.
  • To the culture was added 10 ⁇ l of detergent solution and 5 ⁇ l of peptide solution.
  • the concentrations of the detergent solutions were adjusted so that the final concentration of the respective detergent in the batch was 2%; 4% or 6%.
  • the concentrations of the P18 peptide solutions were adjusted so that the final concentration of the P18 peptide in the O ⁇ M; 50 ⁇ M; 100 ⁇ M; 250 ⁇ M; or 500 ⁇ M.
  • microtiter plate was incubated shaking at 30 ° C.
  • CFU Colony Forming Units
  • Table 14 Mean values of the counted Colony Forming Units (CFU) per ⁇ l after 24 hours of incubation.
  • the concentration data refer to the final concentration in the assay.
  • nd not determined Detergenzienkonzentration
  • the peptide 18 can be used as the sole active ingredient or in combination with other antifungal or antibacterial agents (see description).
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: An agar plate on which the Trichophyton rubrum culture had grown was rinsed with 5 ml MEP medium. From the obtained T. rubrum suspension, 100 .mu.l in 10 ml of medium were added.
  • a 96-well microtiter plate was filled with 190 ⁇ l each of the T. rubrum suspension. Now, a dilution series of the peptide with a final concentration in the wells between 0 and 1000 ppm was added. To this end, 10 ⁇ l of peptide solution with a concentration of 0 ppm to 20,000 ppm were added to the T. rubrum suspension per well, so that final peptide concentrations in the wells in the range between 0 ppm and 1000 ppm were obtained.
  • the incubation of the microtiter plate was carried out at 30 ° C.
  • the fungal growth was assessed by measuring the optical density at 620 nm and observed over 7 days.
  • the experiments were performed at least in duplicate and repeated independently at least once. From a concentration of 125 ppm to 250 ppm and increasing concentrations up to 1000 ppm of the dilution series of the peptide, no growth of T. rubrum was detected, so that no significant turbidity was measured. A sterile control also remained without turbidity, while the suspension had significant turbidity without the addition of peptide.
  • the results of the growth experiments therefore showed an antifungal effect of the peptide P18 on T. rubrum at a minimal inhibitory concentration of 125 ppm-250 ppm.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the suspension was adjusted to an optical density measured at 600 nm of 0.1.
  • a 96-well microtiter plate was filled with in each case 95 ⁇ l of the M. furfur suspension.
  • a dilution series of the peptide with a final concentration in the wells between 0 and 1000 ppm was added.
  • 5 .mu.l of peptide solution were added to the M. furfur suspension per well at a concentration in the range from 0 ppm to 20000 ppm, so that final concentrations of the peptide in the wells in the range between 0 ppm and 1000 ppm were obtained.
  • the incubation of the microtiter plate was carried out at 30 0 C, 600 rpm.
  • the fungal growth was assessed by measuring the optical density at 620 nm and observed over 72 hours.
  • the experiments were performed at least in duplicate and repeated independently at least once.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • Shake culture with TSBY medium was inoculated with K. pneumoniae and incubated overnight shaking at 37 ° C and 200rpm.
  • the suspension was adjusted to an optical density measured at 600 nm of 0.1.
  • a 96-well microtiter plate was filled with each 95 ul of the K. pneumoniae suspension.
  • a dilution series of the peptide with a final concentration in the wells between 0 and 1000 ppm was added.
  • 5 ⁇ l of peptide solution with a concentration in the range from 0 ppm to 20,000 ppm were added to the K. pneumoniae suspension per well, so that final concentrations of the peptide in the wells in the range between 0 ppm and 1000 ppm were obtained.
  • the incubation of the microtiter plate was carried out at 37 ° C., 600 rpm.
  • the bacterial growth was assessed by measuring the optical density at 620 nm and observed over 24 hours.
  • the experiments were performed at least in duplicate and repeated independently at least once.
  • the results of the growth experiments therefore showed an antibacterial effect of the peptide P18 on K. pneumoniae at a minimal inhibitory concentration of 125 ppm.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: 5 ml of YM medium were inoculated with C. albicans and incubated overnight at 30 ° C. and 200 rpm.
  • the 1.5 ml reaction vessels were incubated at room temperature.
  • CFU colony-forming units
  • Mechanism of action of peptide P18 in comparison with ZPT causes for this can be different attack points of both antimicrobial substances. While ZPT may inhibit membrane transport (Chandler et al 1978, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14: 60-68), P18 may interact and dissolve with the fungal membrane as previously described for the action of antimicrobial peptides on bacteria. On the other hand, binding to relevant regions of the DNA or to relevant proteins could also be a possible mode of action of P18, or a combination of the action on several points of attack. In addition, the differential effect can be explained by a detoxification of the ZPT by C. albicans.
  • the aim of this experiment was to investigate the effect of the peptide P18 (P18 sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)) against Trichophyton rubrum (DSM21146) with a short incubation within the first hour and with the effect of ZPT ( Zinc pyrithione).
  • the procedure was as follows.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: An agar plate on which the Trichophyton rubrum culture had grown was rinsed with 5 ml MEP medium.
  • reaction tubes 1, 5 ml reaction tubes were filled with 1 ml of MEP medium and inoculated with 10 .mu.l of T. rubrum suspension.
  • concentration of the peptide solution in water or ZPT solution (Zinc Pyrithione,> 96%, Sigma Aldrich) dissolved in DMSO was 2% (w / w).
  • the 1.5 ml reaction vessels were incubated at room temperature.
  • CFU Colony-Forming Units
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: 10 ml of LB medium were inoculated with E. coli and incubated overnight at 37 ° C. and 200 rpm.
  • the 1.5 ml reaction vessels were incubated at room temperature.
  • CFU colony-forming units
  • P18 may interact with and dissolve the bacterial membrane as previously described for the action of antimicrobial peptides on bacteria.
  • Proteins may be a possible mode of action of P18, or a combination of several mechanisms of action.
  • ZPTs are explained by E. coli.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: 5 ml of TSBY medium were inoculated with S. epidermidis and incubated overnight at 37 ° C. and 200 rpm.
  • 1, 5 ml tubes were filled with 1 ml of TSBY medium and inoculated with the S. epidermidis suspension of the overnight culture.
  • the S. epidermidis suspension was adjusted to 0.1 at the beginning of the experiment to an optical density measured at 600 nm.
  • the concentration of the peptide solution in water or ZPT solution (Zinc Pyrithione,> 96%, Sigma Aldrich) dissolved in DMSO was 2% (w / w).
  • the 1.5 ml reaction vessels were incubated at room temperature. After the specified incubation times, the Colony Forming Units (CFU) were determined. that 1 ⁇ l each of the suspensions was diluted in 20 ⁇ l of TSBY medium and, after incubation for 2 days, the colonies were counted.
  • CFU Colony Forming Unit
  • Example 20 P18 in formulation against Candida albicans.
  • the aim of the experiment was to investigate the effect of a basic pharmaceutical formulation with the ingredient P18 peptide (P18 sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)).
  • the following basic formulation was used for this:
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was carried out as follows: 5 ml of YM medium were inoculated with C albicans and incubated overnight at 30 ° C. and 200 rpm
  • 1 ml of reaction vessel was filled with 1 ml each of YM medium and inoculated with the C albicans suspension of overnight culture so that at the beginning of the experiment an optical density - measured at 600 nm - of 0.1 was obtained.
  • the obtained C albicans suspension was in the ratio 1 9 (formulation C albicans Suspens ⁇ on) m ⁇ t the formulations mixed.
  • 1 ⁇ l of the culture was diluted after 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes and 60 minutes with 20 ⁇ l of YM medium and then plated. After incubation for 24 hours, the colonies were paid on the plates
  • Example 21 P18 in formulation against Escherischia coli.
  • the aim of the experiment was to investigate the effect of a basic pharmaceutical formulation with the ingredient P18 peptide (P18 sequence H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)).
  • the following basic formulation was used for this:
  • formulations with increasing P18 concentrations 500 ppm to 10,000 ppm were prepared from a 20% concentrate solution.
  • the effect of the formulations on E. coli (Stratagene, BLR) was investigated.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • 15 g / L agar-agar was added to the medium
  • the growth test was carried out as follows: 5 ml of LB medium were inoculated with E. coli and incubated overnight at 37 ° C. and 200 rpm
  • 1 5 ml reaction vessel was filled with 1 ml of LB medium and inoculated with the E coli suspension of the overnight culture so that an optical density, measured at 600 nm, of 0.1 was set at the beginning of the experiment 1 l of culture was diluted after 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes and 60 minutes with 20 ⁇ l LB medium and then plated. After incubation for 24 hours, the colonies were transferred to the Plates paid
  • Example 22 P18 in formulation against other fungi and bacteria
  • the aim of the experiment was to investigate the effect of a basic pharmaceutical formulation with the ingredient P18 peptide (P18 sequence H-KWKLFKKI PKFLHLAKKF-NH 2 (Bachern AG, Switzerland)) on other fungi and bacteria.
  • the following basic formulation was used for this:
  • formulations containing 10,000 ppm of P18 peptide were prepared from a 20% concentrate solution.
  • TJSM 1798 S. epidermidis
  • DSM 6170 M. furfur
  • DSM 21146 T. rubrum
  • TSBY growth medium for S. epidermidis TSB (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 17g pancreatically degraded casein 3g pancreatic degraded soy 2.5g dextrose 5g sodium chloride 2.5g dipotassium phosphate 3g Yeast extract (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA ) fill up to 1 liter, adjust to pH 7
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes. Subsequently, 2 ml of olive oil (sterile filtered) were added.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was as follows:
  • the peptide P18 may act on the fungal or bacterial membrane, the DNA or at both sites of action.
  • the effect which can be observed already after a short incubation, indicates a central site of action essential for the survival of the microorganisms, independent of the growth of the microorganisms.
  • the peptide itself is inactivated, possibly by irreversible binding to membrane components or relevant regions of the DNA.
  • Example 23 Comparison of the efficacy of P18 and AFPP on the growth of Malassezia furfur
  • WO 00/32220 describes the effect of the antifungal polypeptide AFPP from Aspergillus giganteus on the growth of Malassezia furfur.
  • AFPP was prepared from the culture supernatant of A. giganteus strain CBS 526.65 (Organobalance, Berlin ). The cleaning was carried out according to Theis et al. (Theis T., Wedde M., Meyer V., Stahl U. (2003) The antifungal protein from Aspergillus giganteus causes membrane permeabilization.) Antimicrob. Agents Chemother. 47: 588-593; Theis T., Marx F., Salvenmoser W., Stahl U., Meyer V. (2005).
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was carried out as follows: A shaking culture Pityrosporum M472 medium was inoculated with M. furfur DSM 6170 (DSMZ), and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking.
  • reaction vessel For each test batch, a 1.5 ml reaction vessel was filled with Pityrosporum medium and inoculated with the M. furfur overnight culture to a starting OD of 0.1, measured at 600 nm.
  • the reaction volume was in each case 600 .mu.l
  • the growth of M. furfur in the test assays was observed over a period of 24 hours.
  • the mixtures were diluted in M472 medium 1 ⁇ 10 and then 10 .mu.l were plated CFU (colony forming units) was determined after 6 days of incubation at 30 0 C by payment
  • the experiments were performed in duplicate and were independently repeated at least once Em significant influence of the phosphate buffer on the growth was not observed
  • Citric Acid 50% solution
  • Sodium Chloride q.s.
  • phase A Adjusts the pH to 6-7. Add phase B and heat to approx. 50 ° C. Cool to room temperature while stirring.
  • malt extract Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA
  • 20g ox gall Merck, Darmstadt, Germany
  • 10g Tween40 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany
  • the components were sterilized at 121 ° C., 1 bar overpressure for 20 minutes.
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the growth test was as follows: Shake culture with M472 Pityrosporum
  • the ratio of the shampoo formulation to the M. furfur culture medium was 1:10 (shampoo formulation: M. furfur culture medium) in all assays.
  • the reaction volume was 1 ml.
  • the growth of M. furfur in the assay was monitored over a period of 20 minutes. For this, the batches were diluted after 10 minutes and 20 minutes in the ratio 1:10 in M472 medium and then 10 .mu.l were plated.
  • the CFU colony forming units
  • the experiments were done in duplicate and were independently repeated at least once. A significant influence of the phosphate buffer on the growth of M. furfur was not observed. The addition of the formulation without active peptide already caused a reduction in CFU.
  • peptide variants with SEQ ID NO. 4726 (sequence: FKKALHLFK-PIKKFLKWK-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)) and SEQ ID NO. 4727 (sequence: KFLHLAKKFPKWKLFKKI-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)).
  • SEQ ID NO. 4726 sequence: FKKALHLFK-PIKKFLKWK-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)
  • SEQ ID NO. 4727 sequence: KFLHLAKKFPKWKLFKKI-NH 2 (Bachem AG, Switzerland)
  • the peptide and AFPP concentrates were as 2% (w / w) solutions in phosphate buffer (10 mM NaPhosphate, pH 7.5, 10 mM NaCl).
  • malt extract Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA
  • 20g ox gall Merck, Darmstadt, Germany
  • 10g Tween40 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany
  • agar plates 15 g / L agar-agar was added to the medium.
  • the proliferation assay was carried out as follows: A shaking culture Pityrospor ⁇ m M472 medium was inoculated with M. furfur DSM 6170 (DSMZ), and incubated overnight at 30 0 C and 200 rpm shaking. For each test batch, a 1.5 ml reaction vessel was filled with Pityrosporum medium and inoculated with the M. furfur overnight culture to a starting OD of 0.1, measured at 600 nm.
  • the reaction volume was in each case 600 ⁇ l. Growth of M. furfur in the test kits was observed over a period of 10 minutes. For this, after incubation for 10 minutes in M472 medium, the batches were diluted 1:10 and then 10 ⁇ l were plated. The CFU (colony forming units) was determined after 6 days of incubation at 30 ⁇ C by counting.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger ein Peptid, das wenigstens ein Sequenzmotiv folgender allgemeiner Formel (I) Hel1 - HB - Hel2 umfasst, sowie die Verwendung und Herstellung dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Description

Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend antifungale Peptide
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung spezieller Peptide in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die insbesondere in topischer Form Verwendung als antifungale und antibakterielle Zusammensetzungen finden. Weiterhin betrifft die Erfindung die Herstellung derartiger Zusammensetzungen, deren Herstellung sowie kodierende Nukleotidsequenzen für derartige Peptide.
Hintergrund der Erfindung
Diverse antimikrobielle Peptide sind in der Literatur bereits beschrieben und in Reviews zu- sammengefasst (Hancock, R.E.W, und Lehrer, R. 1998 in Trends in Biotechnology, 16: 82- 88; Hancock, R.E.W, und Sahl, H.G. 2006 in Nature Biotechnology, 24: 1551-1557).
Fusionspeptide, die zwei wirksame Peptide in sich vereinen, sind in der Literatur ebenfalls beschrieben. Wade et al. berichten über die antibakterielle Wirkung diverser Fusionen aus Cecropin A aus Hyalophora cecropia und dem Bienengift Melittin (Wade, D. et al., 1992, International Journal of Peptide and Protein Research, 40: 429-436). Shin et al. beschreiben die antibakterielle Wirkung eines Fusionspeptids aus Cecropin A aus Hyalophora cecropia und Magainin 2 aus Xenopus laevis, bestehend aus 20 Aminosäuren. Cecropin A besteht aus 37 Aminosäuren und zeigt Aktivität gegen gramnegative Bakterien, aber geringere Aktivität gegen grampositive Bakterien. Magainin 2 besteht aus 23 Aminosäuren und ist aktiv gegen Bakterien aber auch Tumorzelllinien. Im Vergleich zur Fusion aus Cecropin A und Melittin zeigt die Fusion aus Cecropin und Magainin eine deutlich geringere hämolytische Aktivität und eine antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli und Bacillus subtilis (Shin, S.Y. Kang, J. H., Lee, M. K., Kim, S.Y., Kim, Y., Hahm, K.S., 1998, Biochemistry and Molecu- lar Biology International, 44: 1 119-1 126).
US 2003/0096745 A1 und US 6,800,727 B2 beanspruchen diese Fusionspeptide, bestehend aus 20 Aminosäuren und Varianten dieser Fusion, die durch den Austausch von Aminosäuren, insbesondere von positiv geladenen Aminosäuren und hydrophoben Aminosäuren, stärker positiv geladen und hydrophober sind.
Weitere Entwicklungen dieses Cecropin-A-Magainin-2-Fusionspeptids beschreiben Shin et al. 1999. Hierbei zeigte sich, dass das Konstrukt P18 (HT2, SEQ ID NO:3) eine geringere hämolytische Aktivität im Vergleich zur Ausgangsfusion aufwies, die antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli und Bacillus subtilis jedoch nicht beeinträchtigt wurde (Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90).
Weiterhin wiesen Shin et al. 2001 die Aktivität des Konstrukts P18 und analoger Konstrukte auch an Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus und Bacillus megaterium nach (Shin et al., 2001 , Journal of Peptide Research, 58: 504-514).
Erste Versuche auf die Wirksamkeit von P18 gegen Pilze wurde im Januar 2002 von Shin et al. veröffentlicht. Hier wurde eine bessere Wirksamkeit des Peptids P18 gegen Candida albi- cans im Vergleich zu Magainin 2 festgestellt. Außerdem wurde eine antimikrobielle Wirkung von P18 gegen Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium und Stenotrophomonas maltophilia nachgewiesen (Shin et al., 2002, Biochemical and Biophysical Research Communications, 290: 558-562).
Lee et al. berichten 2002 über die Wirkung von P18 und zwei reversen Peptiden gegen Tn- chopsoron beigelii, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum als auch gegen Streptococcus pyogenes und Serratia marcescens (Lee et al., 2002, Protein and Peptide Letters, 9: 395- 402)
Zusätzlich zu Candida albicans wurden die Ascomyceten Aspergillus flavus, Fusarium o- xysporum und der Basidiomycet Trichosporon beigelii mit P18 und Varianten des Peptids inhibiert. Die effektivste Inhibition wurde jedoch mit P18 erreicht (Lee et al., 2004, Biotechno- logy Letters, 26: 337-341 ). Eine Inhibition lipophiler Pilze, insbesondere der Gattung Malas- sezia, wird nicht gelehrt. Weiterhin sind keine Experimente beschrieben, die eine effektivere Wirkung von Cecropin-Magainin-Fusionen im Vergleich zu bekannten, kommerziellen anti- fungalen Substanzen nachweisen.
Die WO-A-00/032220 beschreibt die Verwendung eines pilzlichen Polypeptids als antifunga- len Wirkstoff zur Behandlung von Schuppen. Ein interner Vergleich mit antifungalen Wirkstoffen des Stands der Technik erfolgt auch hier nicht.
Die US 2003/0096745 beschreibt ein Polypeptid der Sequenz KWKKLLKKPPPLLKKLLKKL mit antibakterieller und antifungaler Aktivität gegen bestimmte Mikroorganismen. Antifungale Aktivität wurde gegen Candida albicans und Tricosphoron beigelii gezeigt. Shin et al. beschreiben die Wirksamkeit eines Peptids mit der Sequenz KWKKLPKKLLKLL- NH2 gegen Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis. Eine Wirksamkeit gegen Pilze wird nicht untersucht (Shin et al., 2004, Biotechnology Letters, 26:735-739).
Eine antibakterielle und antifungale Wirkung des Wirkstoffs ZPT (Zinc pyrithione) zur kommerziellen Behandlung von Schuppen ist bekannt (WO 01/00151 , US 3,236,733, Khattar, M. M. et al,. 1988, Journal of Applied Biotechnology, 64:265-272, Carol, J. C. et al., 1978, An- timicrobial Agents and Chemotherapy, 14:60-68). Allerdings tritt die Wirkung erst nach relativ langer Einwirkdauer ein.
Antimikrobielle Substanzen können aber im Gebrauch, besonders im regelmäßigen Gebrauch, beim Menschen zu Unverträglichkeit führen, oder aber sogar zu Gesundheits- schaden. Unverträglichkeiten können Hautrötungen, Reizungen oder Sensibilisierungen sein. Eine systemische Aufnahme in den menschlichen Körper kann zur Beeinträchtigung von Körperfunktionen führen. Besonders ein regelmäßiger Gebrauch mancher antimikrobieller Substanzen kann zu einer Anreicherung führen. Ein bekanntes Beispiel sind Parabene (Dabre et al. ,2004, Journal of Applied Toxicology, 24: 5-13). Abhängig von der Anwendung kann es also zu einer Akkumulation im menschlichen Körper oder in der Umwelt kommen.
Zudem treten durch übermäßige und unsachgemäße Verwendung von antimikrobiellen Substanzen immer wieder Resistenzen der Zielorganismen auf.
Es besteht daher Bedarf, neue pharmazeutische antimikrobielle Zusammensetzungen bereitzustellen, die zum einen eine hohe antifungale Wirksamkeit besitzen und zum anderen eine geringe allgemeine Cytotoxizität, so dass eine sichere therapeutische Verwendung dieser Zusammensetzungen möglich wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, einen neuen, effektiven nebenwirkungsarmen Wirkstoff zur Behandlung von Mykosen, insbesondere Dermatomykosen, bereitzustellen , der sich dabei auch für die Behandlung von äußeren bakteriellen Infektionen z.B. der Haut, Nägel, Haare und der Schleimhäute eignet. Zusammenfassung der Erfindung:
Diese Aufgabe wurde gelöst durch pharmazeutische Zusammensetzungen, gemäß der Definition in den beiliegenden Patentansprüchen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
1. Allgemeine Definitionen
Ein „Helixbrecher" bedeutet einen Abschnitt innerhalb eines erfindungsgemäßen Peptids, welcher im Bereich dieses Abschnitts der Peptidkette die Ausbildung einer helikalen Sekundärstruktur inhibiert. Die Ausbildung einer Helixstruktur in weiterem Abstand zum Helixbrecher wird jedoch nicht unterbunden. Typische Helixbrecher sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere handelt es sich bei der Aminosäure Prolin um einen Peptidbaustein mit der Eigenschaft eines Helixbrechers. Gleiches gilt für Prolin-haltige Peptidfragmente.
„Hydrophobe Aminosäuren" im Sinne der Erfindung sind Alanin, VaNn, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan.
„Hydrophile Aminosäuren" im Sinne der Erfindung sind insbesondere Aminosäuren mit polaren Seitenketten, wie Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; saure Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure; und insbesondere basische Aminosäuren, wie Lysin, Arginin und Histidin.
Zur „Ausbildung eines alpha-Helix-Arms befähigt" ist eine Sequenz, die zur Ausbildung einer helikalen Struktur unter geeigneten Bedingungen fördert. Künstliche geeignete Bedingungen zur Ausbildung von Helixstrukturen sind beispielsweise die alpha-Helixbildung fördernde Lösungsmittelsysteme auf der Basis von Trifluorethanol sowie SDS.
Unter „prozentualer alpha-Helizität" versteht man einen mit Hilfe einer Circulardichroismus (CD)-Analyse ermittelten Messwert, wobei die zu messende Probe unter Standardbedingungen, wie insbesondere 50 % (v/v) Trifluorethanol in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, oder 30 mM SDS in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, unter Verwendung einer Mess- zelle mit 1 mm Pfadlänge bei einer Peptidkonzentration von 100 μg/ml erhalten wird. Die Berechnung erfolgt dabei nach folgender Formel:
% Helizität = 100 ([Θ] - worin [Θ] die experimentell bestimmte Elliptizität bei 222nm ist;
[Θ]° die Elliptizität bei 222nm und 0% Helizität und [Θ]100 die Elliptizität bei 222nm und 100% Helizität darstellt.
Geeignete Messbedingungen sind beispielsweise von Shin et al., 1999, Journal of Peptide Research, 53:82-90 beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Unter einem „repetitiven Sequenzmotiv" versteht man die lineare Anordnung vorzugsweise identischer Peptidsequenzen, welche direkt oder indirekt, d.h. über „Linkergruppen", wie hierin definiert, miteinander verknüpft sind.
Die Begriffe „Mutanten" und „Varianten" werden synonym verwendet. Dabei versteht man insbesondere „funktionale" oder „funktional äquivalente" Abwandlungen, wie später noch genauer beschrieben, welche weiterhin die gewünschte Aktivität und somit Anwendbarkeit als Antimykotikum zeigen.
Unter einem „Fusionsprodukt" versteht man die kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung von Peptiden und Proteinen („Fusionspeptide") sowie die kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung von Peptiden und Polymeren („Fusionspolymere"). Die miteinander verknüpften Bestandteile sind entweder irreversibel oder reversibel, d. h. biologisch, insbesondere enzy- matisch, spaltbar miteinander verbunden.
2. Bevorzugte Ausführungsformen
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger ein Peptid, das wenigstens ein Sequenzmotiv folgender allgemeiner Formel I
Hel1 - HB -Hel2 (I)
umfasst, worin „HB" 1 bis 5, insbesondere 1 , 2 oder 3, zusammenhängende Aminosäurereste umfasst und für ein Teilsequenzmotiv mit der Funktion eines Helixbrechers steht, und „Hell " und „Hel2" gleiche oder verschiedene Teilsequenzmotive sind, die jeweils 5 bis 15, wie z. B. 6 bis 12, insbesondere 8, 9 oder 10, zusammenhängende Aminosäurereste umfassen, die im Wesentlichen aus hydrophilen, insbesondere basischen, und von Prolin verschiedenen hydrophoben Resten ausgewählt sind, und jeweils zur Ausbildung eines alpha- Helix-Arms befähigt sind, wobei wenigstens einer der Helix-Arme in seiner axialen Projektion, d. h. in der Draufsicht entsprechend einem „helical wheel"-Diagramm, eine unvollständige Trennung in eine hydrophobe, insbesondere basische, und hydrophile Helixhälfte aufweist. Dabei können z.B. 1 , 2, 3 oder 4 Positionen einer Hälfte eines Typs (hydrophob oder hydrophil) von Aminosäureresten des anderen Typs (hydrophil bzw. hydrophob) eingenom- men werden.
Vollständig getrennte hydophobe und Hydrophile Helixhälften bestünden dagegen ausschließlich aus hydrophoben bzw. hydrophilen Aminosäureresten gemäß obiger Definition. Als Beispiel für eine vollständig hydrophil/hydrophob getrennte HeNx ist das Sequenzmotiv KLKKLLKK zu nennen.
Eine „Helixhälfte" ist dabei nicht zwingend als die numerische Hälfte, d.h. die halbe Anzahl der Gesamtzahl von Aminosäuren einer HeNx zu verstehen. Die numerische Große zweier Hälften kann sich beispielsweise um 1 bis 3 Aminosäure unterscheiden.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger ein Peptid, das wenigstens ein Sequenzmotiv folgender allgemeiner Formel I
Hel1 - HB -Hel2 (I)
umfasst, worin
„HB" 1 bis 5, insbesondere 1 , 2 oder 3, zusammenhängende Aminosäurereste umfasst und für ein Teilsequenzmotiv mit der Funktion eines Helixbrechers steht, und „Hell " und „Hel2" gleiche oder verschiedene Teilsequenzmotive sind, die jeweils 5 bis 15, wie z. B. 6 bis 12, insbesondere 8, 9 oder 10, zusammenhängende Aminosäurereste umfassen, die im Wesentlichen aus hydrophilen, insbesondere basischen, und von Prolin verschiedenen hydrophoben Resten ausgewählt sind, und jeweils zur Ausbildung eines alpha- Helix-Arms befähigt sind, wobei das Peptid eine prozentuale alpha-Helizität (% Helizität) von etwa 7 bis 98 %, wie z.B. 30 bis 80% oder 30 bis 60%, in 50 % (v/v) Trifluorethanol, pH 7,0; oder einen % Helizität- Wert von etwa 8 bis 60 %, oder 12 bis 55% oder 12 bis 40%, in 30 mM SDS, pH 7.0, jeweils bestimmt durch CD-Spekrometrie, aufweist
Ein dritter Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, ent- haltend in einem pharmazeutischen Träger mindestens ein Peptid mit einer Sequenz oder einem repetitiven Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO: 1 :
X1 X2K X3 X4 X5KIP X10 KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO:1 )
worin
Xio für eine Peptidbindung oder ein oder zwei beliebige basische oder hydrophobe Aminosäurereste oder ein oder zwei Prolinreste steht und
Xi bis X9 beliebige basische oder von Prolin verschiedene hydrophobe Aminosäurereste bedeuten; wobei die repetitiven Sequenzmotive gleich oder verschieden sein können; und/oder Mutanten oder Derivate davon.
Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen nach obiger Definition, enthaltend mindestens ein Peptid mit einer Sequenz oder einem repetitiven Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO: 2:
X1 X2K X3 X4 X5KIP X11 X12 KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO: 2) worin
XI für Lysin, Arginin oder Phenylalanin, X2 für Lysin oder Tryptophan,
X3 für Leucin oder Lysin, X4 für Phenylalanin oder Leucin, X5 für Leucin oder Lysin, X6 für Leucin oder Lysin, X7 für Histidin oder Lysin,
X8 für Alanin, Leucin, VaNn oder Serin, X9 für Leucin oder Lysin,
XI I für Prolin oder eine chemische Bindung, und X12 für Prolin oder eine chemische Bindung steht,
wobei die repetitiven Sequenzmotive gleich oder verschieden sind; und/oder Mutanten oder Derivate davon. Nicht limitierende Beispiele obiger Sequenzen oder repetitiver Sequenzmotive gemäß SEQ ID NO: 3 sind:
P18 KWKLFKKI PKFLHLAKKF-NH2 (SEQ ID NO: 3)
RP18 RWKLFKKIPKFLHLAKKF (SEQ ID NO: 4)
KKFP18 FKKLFKKIPKFLHAAKKF (SEQ ID NO: 5)
KKLP18 KWKLLKKIPKFKKLALKF (SEQ ID NO: 6)
AP18 KWKLFKKIPKFLHAAKKF (SEQ ID NO: 7) KFLP18 KWKKFLKIPKFLHAAKKF (SEQ ID NO: 8)
KLLP18 KWKKLLKIPKFLHAAKKF (SEQ ID NO: 9)
und/oder eine Mutante oder Derivat davon.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können insbesondere Peptide mit einem repetiti- ven Sequenzmotiv enthalten, wobei eine Mehrzahl, wie insbesondere 2 bis 10 oder 3 bis 5, von Peptiden der allgemeinen Formel I oder gemäß SEQ ID NO: 1 bis 9 oder Mutanten oder Derivate davon, über Linkergruppen miteinander peptidisch verknüpft sind.
Dabei können die „Linkergruppen" 1 bis 10 zusammenhängende, gleiche oder verschiedene Aminosäurereste, vorzugsweise ausgewählt unter Alanin, Glycin, Threonin und Serin, umfassen, wie z. B. GGSGGT, GGSGGS, oder Poly-Alanin-Linker und Poly-Glycin-Linker, wo- bei „Poly" für 2 bis 10 steht; oder ausgewählt unter Asp, Pro, Asn und GIy, wie z.B. Asp-Pro und Asn-Gly.
Weiterhin sind Peptide einsetzbar, deren C-terminale Carboxylgruppe amidiert ist.
Gegenstand der Erfindung sind auch Zusammensetzungen, enthaltend ein gegebenenfalls spaltbares Fusionspolypeptid aus mindestens einem pharmazeutischen, bevorzugt peptidischen Hilfs- oder Wirkstoff und mindestens einem Peptid nach obiger Definition. Als Beispiele solcher Wirkstoffe können genannt werden: Hydrophobine, Keratinbindedomänen, Albumin, Lactoferrin, Avidin, Antikörper, bevorzugt Keratin-bindende Antikörper, Bindepeptide für Oberflächen, bevorzugt Keratin-bindende Peptide, Seidenproteine, Spinnenseidenproteine, bevorzugt C16, Kollagen, Fibronektin, Keratin, Elastin, andere Strukturproteine, bevorzugt Haar- und Hautstrukturproteine, Bindeproteine für Haut- bzw. Haarstrukturproteine, Enamel aufbauende Proteine, Amelogenin, Bindeproteine der Enamel aufbauenden Proteine, Bindeproteine des Amelogenin; wobei diese Fusionen permanent oder aber auch spaltbar sein können.
Gegenstand der Erfindung sind auch Fusionspolymere aus mindestens einem pharmazeutischen Polymer und mindestens einem Peptid nach obiger Definition. Als Beispiele solcher Polymere sind zu nennen: Polyhydroxyalkanoate, Hyaluronsäure, Glucan, Spheroglucan, Cellulose, Xanthan, Polyethylenglykol, Polyglycerin, Polylysin und Silikone, welche als kova- lente bzw. nicht kovalente Verknüpfungen vorliegen.
Weiterhin ist denkbar, dass die oben genannten Peptide auch als kovalente Verknüpfung an pharmazeutisch aktive Inhaltsstoffe, wie Panthenol, Bisabolol, Retinol, Carotenoide, Proteinhydrolysate, in den Zusammensetzungen enthalten sein können.
Gegenstand der Erfindung sind auch Zusammensetzungen nach obiger Definition, zusätzlich enthaltend mindestens einen weiteren pharmazeutischen Wirkstoff, wie z. B. wenigstens einen antiinflammatorischen Wirkstoff, einen antimikrobiellen Wirkstoff zur Hemmung des Wachstums und/oder der pathophysiologischen Aktivität unerwünschter Keime, wie insbesondere Malasezzia furfur, und/oder einen Sebum regulierenden Wirkstoff.
Als Beispiele für antiinflammatorische Wirkstoffe sind zu nennen: Cortikoide (z.B. Cortison), Azathioprin, Bisabolol, Cyclosporin A, Acetylsalicylsäure, Ibuprofen, Panthenol, Kamillenextrakt oder Aloe-Extrakte, Antiphlogistika, Zytostatika,, etc.
Als Beispiele für antimikrobielle Mittel sind zu nennen: übliche, dem Fachmann bekannte Konservierungsmittel, wie Aklohole, p-Hydroxybenzoesäureester, Imidazolidinyl-Harnstoff, Formaldehyd, Sorbinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure etc. Derartige desodorierend wirkende Stoffe sind z. B. Zinkricinoleat, Triclosan, Undecylensäurealkylolamide, Citronensäu- retriethylester, Chlorhexidin etc (vgl. auch Abschnitt 3.5 unten). Weiterhin zählen hierzu Azo- Ie (Ketoconazol, Climbazol), Zinc Pyrithion, Selensulfide, etc. .
Als Beispiele für Sebum regulierende Wirkstoffe sind zu nennen: Azelainsäure, Kaliumaleza- oyldiglycinat, Sebacinsäure, 10-Hydroxydecansäure, 1 ,10-Decandiol, Aluminiumsalze, wie z.B.Aluminiumchlorhyd.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die oben beschriebenen Peptide in der Verwendung als Medikament, insbesondere als Medikament zur Behandlung von Mykosen, beson- ders Dermatomykosen, als auch zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, insbesondere äußeren Infektionen wie Infektionen der Haut, Nägel, Haare oder Schleimhäute.
Diese Medikamente können neben den antimikrobiell wirkenden Peptiden noch weitere pharmazeutisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Antibiotika enthalten, die gleichzeitig oder zeitlich abgestuft mit den antimikrobiell wirkenden Peptiden verabreicht werden können.
Die erfindungsgemässen peptidischen Wirkstoffe weisen antimikrobielle und antimykotische Wirkungen auf. Sie besitzen ein sehr breites antimykotisches Wirkungsspektrum, insbesondere gegen Dermatophyten und Sprosspilze sowie biphasische Pilze, z.B. gegen Candida- Arten, wie Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis Candida tropicalis, Epidermophyton-Arten, wie Epidermophyton floccosum, Aspergillus- Arten, wie Aspergillus niger, Aspergillus flavus und Aspergillus fumigatus, Trichophyton-
Arten, wie Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans,,, Trichophyton ajelloi, Trichophyton equinum, Trichophyton erinacei, Trichophyton interdigitale, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton verrucosum, Trichophyton vio- laceum, Microsporon-Arten, wie Microsporon felineum, Microsporum audouinii, Microsporum canis, Microsporum cookei, Microsporum distortum, Microsporum ferrugineum, Microsporum gallinae, Microsporum gypseum, Microsporum nanum und Microsporum racemosum sowie Torulopsis-Arten, wie Torulopsis glabrata als auch gegen Malassezia-Arten, wie Malassezia furfur, Malassezia globosa. Malassezia obtusa, Malassezia pachydermatis, Malassezia restricta, Malassezia slooffiae und Malassezia sympodialis.
Desweiteren sind zu nennen Trichosporon ssp. , Piedraia hortae als auch diverse Schwärzepilze. Die Aufzählung dieser Mikroorganismen stellt keinesfalls eine Beschränkung der bekämpfbaren Keime dar, sondern hat nur erläuternden Charakter.
Folglich ist eine Wirkung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen folgende Krankheiten, die mit den aufgezählten pilzlichen Erregern assoziiert sind, anzunehmen: Aspergillose, bronchopulmonäre Aspergillose (ABPA), Candida-Mykid, Candi- dasis, extrinsische allergische Alveolitis (EAA), Genitalmykose (Vulvamykose, Vaginalmykose), Mikrosporie, Mucositis/Soor, Onychia et Paronychia candidosa, Onychomykose, Piedra Pityriasis versicolor,Pityriasis folliculitis,, Tinea capitis, Tinea corporis, Tinea gladiato- rum, Tinea ungium, Trichophytie, Zygomykose, Tinea manuum, Tinea pedis. Die erfindungsgemässen peptidischen Wirkstoffe besitzen antibakterielle Wirkung gegen Staphylococcen wie Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus, Streptococcen wie Streptococcus mutans und Streptococcus pyogenes, Propionibakterien wie Propionibacterium acnes und Propionibacterium granulosum aber auch Pseudomonas aeruginosa und Enterobacteriaceae, wie Escherichia coli, Shigella ssp., Enterococcus ssp und Klebsiella ssp. Die Aufzählung dieser Mikroorganismen stellt keinesfalls eine Beschränkung der bekämpfbaren Keime dar, sondern hat nur erläuternden Charakter.
Folglich ist eine Wirkung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen folgende Krankheiten, die mit den aufgezählten bakteriellen Erregern assoziiert sind, anzunehmen: Komedonen, Abszesse, Acne vulgaris, eitrige Absonderungen, Furunkel, Pusteln, eiterbildende Infektionen der Haut und Schleimhäute, Dermatitis exfoliativa, Staphylo- coccal Scalded Skin Sydrome, Karies, Wucherungen und Dermatitis.
Desweiteren ist davon auszugehen, das Patienten mit einem Seborrhoisches Ekzem, allergisches Kontaktekzem, Atopische Dermatitis, Psoriasis vulgaris, Cystische Fibrose (Mukoviszidose), offenen Wunden oder chronischen Wunden von einer Behandlung mit den erfindungsgemässen pharamzeutischen Zusammensetzungen profitieren, da diese Erkrankungen oftmals zusätzlich mit Infektionen durch die oben genannten Organismen, zum Beispiel in Biofilmen, verbunden sind.
Die Aufzählung dieser Krankheiten stellt keinesfalls eine Beschränkung dar, sondern hat nur erläuternden Charakter.
Die erfindungsgemässen peptidischen Wirkstoffe weisen eine schnelle Wirksamkeit auf.
Als Indikationsbeispiele in der Humanmedizin können beispielsweise genannt werden: Dermatomykosen und Systemmykosen durch Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes und andere Trichophytonarten, Microsporonarten sowie Epidermophyton floccosum, Sprosspilze und biphasische Pilze sowie Schimmelpilze hervorgerufen.
Als Indikationsgebiet in der Tiermedizin können beispielsweise aufgeführt werden: Alle Dermatomykosen und Systemmykosen, insbesondere solche, die durch die obengenannten Erreger hervorgerufen werden.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen einen oder mehrere erfindungsge- mässe Wirkstoffe enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungsgemässen Wirkstoffen bestehen.
Zur vorliegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen in Dosierungs- einheiten. Dies bedeutet, dass die Zubereitungen in Form einzelner Teile, z.B. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Suppositorien und Ampullen vorliegen, deren Wirkstoffgehalt einen Bruchteil oder einem Vielfachen einer Einzeldosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können z.B. 1 ,2,3 oder 4 Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht.
Unter nicht toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen sind feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe oder Formulierungshilfsmittel jeder Art zu verste- hen.
Als bevorzugte pharmazeutische Zubereitungen seien Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotions, Puder oder Sprays genannt.
Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können den oder die Wirkstoffe neben den üblichen Trägerstoffen enthalten, wie (a) Füll- und Streckmittel, z.B. Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glucose, Mannit und Kieselsäure re, (b) Bindemittel, z.B. Carboxymethyl- cellulose, Alginate, Gelantine, Polyvinylpyrrolidon, (c) Feuchthaltemittel, z.B. Glycerin, (d) Sprengmittel z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat, (e) Lösungsverzögerer, z.B. Paraffin und (f) Resorptionsbeschleuniger, z.B. quarternäre Ammoniumverbindungen, (g) Netzmittel, z.B. Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, (h) Adsorptionsmittel, z.B. Kaolin und Bentonit und (i) Gleitmittel, z.B. Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethy- lenglykole oder Gemische der unter (a) bis (i) aufgeführten Stoffe.
Den Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulaten können mit den üblichen gegebenenfalls Opakisierungsmittel enthaltenen Überzügen und Hüllen versehen sein und so zusammengesetzt sein, dass sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimm- ten Teil des Intestinaltraktes, gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen z.B. Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können. Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Träger Stoffe enthalten, z.B. Polyethylenglykole, Fette, z.B. Kakaofett und höhere Ester (z.B. C14-Alkohol mit C16-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe.
Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tra- gant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silocone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polya- midpulver oder Gemische dieser Stoffe, Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel z.B. Chlorfluorkohlenwasserstoffe enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsverzögerer und Emulgatoren, z.B. Wasser, Ethylalkohol, I- sopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1 ,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Mais- keimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Zur parenteralen Applikation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und bluti- sotonischer Form vorliegen.
Suspensionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe, wie flüssige Verdünnungsmittel, z.B. Wasser, Ethylalkohol, Propylalkohol, Suspendiermittel, z.B. etho- xylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit- und Sorbitanester, mikrokristalline CeIIuIo- se, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbessernde Zusätze, z.B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süssmittel, z.B. Saccharin enthalten. Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben angeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,0001 bis 99,5, vorzugsweise von 0,01 bis 95 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können ausser den erfindungsge- mässen Wirkstoffen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Positive Effekte oder gar Synergismen der erfindungsgemässen peptidischen Wirkstoffe ist in Kombination mit den folgenden Wirkstoffen ist zu erwarten: Kortison, Dithranol, Zink, Vi- tamin C, Folsäure, Biotin, Cyclosporin, Voriconazol, Clotrimazol, Pentamidin, Kaliumjodid, ätherische Öle, gesättigte Fettsäuren, Caprinsäure, Laurinsäure, Propolis, Teebaumöl, Euka- lytusöl, Dolastatin 10, Auristatin PHE, N-Chlorotaurin, Prostaglandinhemmer wie Aspirin, Indomethacin, Amphotericin B, Candine, Nikkomykine, Azole, Allylamine, Strobilurine, Echi- nocandin, Pneumocandin, Pradimicin, Benanomicin, Oligopeptide, Imidazole, Triazole, PoIy- ene, Ciclopiroxolamin, Sordarine, Atovaquon, 5-FC, Griseofulvin, Caspofungin, Flucytosin, Fluconazol, traconazol, Ciclopirox,Terbinafin, Griseofulvin, Nystatin, Harnstoff, Salicylsäure, Hydrocortison, Prednisolon, Fluocortinbutylester, Triamcinolonacetonid, Dexamethason, CIo- cortolonpivalat, Clobetasonbutyrat, Hydrocortisonaceponat, Dexamaethasonsulfobenzoat, Alclomethasondipropionat, Flumethasonpivalat, Triamcinolonacetonid, Fluoprednidenacetat, Fluorandrenolon, Hydrocortison butyrat, Hydrocortisonbuteprat, Betamethasonbenzoat, FIu- orcortolon, Mometasonfuroat, Betamethasonvalerat, Fluticasonpropionat, Halomethason, Betametasondipropionat, Fluocortolonhexanoat, Fluocinolonacetonid, nichtsteroidale Antirheumatika, Antiphlogistika, Zytostatika, Bufexamacum, Beinwellwurzel, Bromelain, Diclofenac, Flurbiprofen, Ibuprofen, Nachtkerzensamenöl, Paracetamol, Phenazon, Piroxicam, Pro- pyphenazon, Salicylsäure, Teufelskrallenwurzel, Kamille, Hamamelis, Ringelblume, Johanniskraut, Gerbstoffe, Zinkoxid, Bismutkomplexverbindungen, Aluminiumsulfat, sulfonierte Schieferöle, Aminoglykoside, Chloramphenicol, Cephalosporine, Diaminobenzyl-Pyrimidine, Fosfomycin, Makrolide, Peneme, Sulfonamide, Tetrazykline, Chinolone, Ethambutol, Fusi- dinsäure, Glykopeptide, Isonicotinamid, Lincomycine, Monobactame, Nitrofurane, Nitroimi- dazole, Oxalactame, Paraaminosalicylsäure, Penicilline, Polypeptide, PolymyxinB, Colistin, Rifamycine,.Sulfone
Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Methoden, z.B. durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder der Trägerstoffen.
Zur vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung der erfindungsgemässen Wirkstof- fe, sowie von pharmazeutischen Zubereitungen, die einen oder mehrere erfindungs gemässe Wirkstoffe enthalten, in der Human- und Veterinärmedizin zur Verhütung, Besserung und/oder Heilung der oben aufgeführten Erkrankungen.
Die Wirkstoffe oder die pharmazeutischen Zubereitungen können lokal, oral, parenteral, intraperitoneal, intravenös und/oder rektal, vorzugsweise topisch lokal appliziert werden.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemässen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 2,5 bis etwa 200, vorzugsweise 5 bis 150 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen.
Bei oralen Applikationen werden die erfindungsgemässen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 2,5 bis etwa 200, vorzugsweise 5 bis 150 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden und bei parenteraler Applikation in Gesamtmengen von etwa 2,5 bis etwa 50, vorzugsweise 1 bis 25 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden verabreicht.
Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objektes, der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der obengenannten Menge Wirkstoff auszukommen, während in anderen Fällen die oben angeführte Wirkstoff menge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierung und Applikationsart der Wirkstoffe kann durch jeden Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.
Vorteilhafterweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung das Peptid der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 in einer Konzentration von 0,0001 - 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,001 - 25 Gew.-%, insbesondere 0,01 - 5 Gew.-% und besonders bevorzugt 0,1 - 1 Gew-% bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Zusammensetzungen, enthaltend wenigstens ein Peptid nach obiger Definition, das eine minimale inhibitorische Konzentration gegenüber Malassezia furfur im Bereich von etwa 1500 bis 0,1 μM, wie z.B. 500 bis 1 μM, 100 bis 5 μM oder 50 bis 10 μM, bestimmt unter Standardbedingungen aufweist. Standardbedingungen betreffen dabei die Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration einer Malasse- zia furfur-Kultur, die eine anfängliche optische Dichte von 0,02 bei 600 nm aufweist, und nach 24-stündiger Inkubation mit dem Peptid, das in dieser minimalen Konzentration im KuI- turmedium enthalten ist, weniger als 1 Colony Forming Unit (CFU)des Mikroorganismus pro μl Kulturmedium aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach obiger Definition, wobei man ein Peptid gemäß obiger Definition zusammen mit mindestens einem üblichen pharmazeutischen Hilfsstoff und gegebenenfalls weiteren kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur gewünschten Verabreichungsform formuliert.
Bei P18 (SEQ ID NO: 3) handelt es sich um ein Peptid mit einer Kettenlänge von 18 Amino- säuren, das sich von einem Fusionspeptid aus Fragmenten des Cecropin A aus Hyalaphora cecropia und Magainin aus Xenopus laevis ableitet. Eine fungizide Aktivität wurde für Candida albicans, Trichosporon beigelii, Aspergillus flavus und Fusarium oxysporum in Experimenten festgestellt (Lee et al., (2004) Biotechnology Letters, 26:337-341.). Dennoch ist dem Fachmann bekannt, dass die Wirkung fungizider Substanzen auf verschiedene Organismen sehr unterschiedlich sein kann. Besonders die Wirkung auf den lipophilen Pilz Malassezia furfur und die lipophilen Arten der Gattung Malassezia kann sich z. B. deutlich von der Wirkung auf Candida albicans unterscheiden (Hanson et al., (1989) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 33:1391-1392; Nenhoff et al., (2002) Acta Derm Venereol., 82:170-173). Die erfindungsgemäß beobachtete Wirkung von P18 und strukturell und funktional verwandten Peptiden des hierin beschriebenen Typs ist daher für den Fachmann völlig überraschend. Gleiches gilt für die antibakterielle Wirkung. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Wirkung antibakterieller Substanzen auf verschiedene Organismen ebenfalls sehr unterschiedlich sein kann.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die Sekundärstruktur der erfindungsgemäßen Peptide eine HeNx, die mittig durch eine helixbrechende Aminosäure in zwei Helices unterteilt ist. In einer Darstellung als „helical wheel" überwiegen auf der einen Seite (bzw. Hälfte der Helix) hydrophobe Aminosäuren, insbesondere Leucin-Reste, auf der anderen Seite positiv geladene Aminosäuren, insbesondere Lysin-Reste.
Die erfindungsgemäßen Peptide setzten sich insbesondere aus D- und/oder L-Aminosäuren, insbesondere L-Aminosäuren, zusammen. Die Herstellung hierin beschriebener Peptide und/oder Derivate davon kann in an sich bekannter Weise, wie durch chemische Festphasensynthese, Flüssigsynthese oder biotechnologisch unter Verwendung rekombinanter Produktionsstämme oder Zellkulturen, erfolgen.
3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung
3.1 Beispiele weiterer geeigneter Sequenzmotive
vaπaπt_243 1 KWKKLLKIPKFLHSAKKF seqιd_4153 vaπant_244 KLKLFLKIPKFLHSAKKF seqιd_4702 varιant_245 i KWKLFLKIPKFLHSAKKF seqιd_4135 vaπaπt_246 I KLKKFLKIPKFLHSAKKF seqιd_4703 vaπant 247 I KWKKFLKIPKFLHSAKKF seqid 4141 varιant_248 KLKLLKKIPKFLHSAKKF seqιd_4704 vaπant 249 KWKLLKKIPKFLHSAKKF seqιd_4171 vaπant_250 KLKKLKKIPKFLHSAKKF seqιd_4705 vaπant_251 KWKKLKKI PKFLHSAKKF seqιd_4177 vanant_252 KLKLFKKIPKFLHSAKKF seqιd_4706 vaπant_253 KWKLFKKIPKFLHSAKKF seqιd_4708 vanant_254 KLKKFKKIPKFLHSAKKF seqιd_4707 varιant_255 KWKKFKKIPKFLHSAKKF seqιd_4165
3.1.2 Sequenzmotiv X1 X,K X, X4 XsKIP Xn X1, KFXBX7 X« AXaKF (SEQ ID NO: 2)
varιant_46i2 RWKLFLKIPPPKFLHVAKKF I seqid 3464 vanant 4613 FWKLFLKIPPPKFLHVAKKF seqιd_3465 vaπant_46i4 , KKKKFLKIPPPKFLHVAKKF | seqιd_3466 vanant.4615 RKKKFLKIPPPKFLHVAKKF seqιd_3467 varιant_4616 FKKKFLKIPPPKFLHVAKKF seqιd_3468 varιanl_4617 KWKKFLKIPPPKFLHVAKKF seqιd_3469 varιant_4618 I RWKKFLKIPPPKFLHVAKKF seqιd_3470 vanant 4619 | FWKKFLKIPPPKFLHVAKKF , seqιd_3471
3.1.3 Sequenzmotiv Hel1-HB-Hel2
Ebenfalls mit umfasst sind obige Sequenzen wobei jedoch das C-terminale Ende nicht ami- diert ist, und somit insbesondere die solche Sequenzen, die durch eine Carboxylgruppe (in Salz- oder Säurefrom) terminiert sind.
3.1.4 Modifikationen von SEQ ID NO:3
Dabei ist das Peptid gemäß SEQ ID N0:3 N-und/oder C-terminal um wenigstens einen beliebigen Aminosäurerest verlängert. Nicht-Iimitiereπde Beispiele von zusätzlichen Resten umfassen Asp, Pro, Asn, GIy. Bei gleichzeitiger Verlängerung von N- und C-Terminus ist der zusätzliche N-termιnale Rest vorzugsweise Pro oder GIy und der zugeordnete C-termιnale Rest vorzugsweise Asp bzw Asn
PKWKLFKKIPKFLHLAKKF- NH2 (SEQ ID NO 4732)
KWKLFKKIPKFLHLAKKFD- NH2 (SEQ ID NO- 4733)
PKWKLFKKIPKFLHLAKKFD- NH2 (SEQ ID NO- 4734)
GKWKLFKKIPKFLHLAKKF- NH2 (SEQ ID NO 4735)
KWKLFKKIPKFLHLAKKFN- NH2 (SEQ lD NO 4736) GKWKLFKKIPKFLHLAKKFN- NH2 (SEQ ID NO 4737)
PKWKLFKKIPKFLHLAKKFN- NH2 (SEQ ID NO- 4738)
Ebenfalls mit umfasst sind obige Sequenzen wobei jedoch das C-termιnale Ende nicht ami- diert ist, und somit insbesondere die solche Sequenzen, die durch eine Carboxylgruppe (in Salz- oder Säurefrom) terminiert sind
3 2 Weitere Abwandlungen erfindunqsqemaßer Peptide
Neben den oben dargestellten Peptidsequenzen sind auch funktionale Äquivalente, funktio- nale Derivate und Salze dieser Sequenz bevorzugt
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemaß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosauresequen- zen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen, aber trotzdem die Eigen- Schaft zur Prävention, Hemmung und Behandlung von Schuppen besitzen. „Funktionale A- quivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhaltlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemaßen Eigenschaftsprofil führen Funktionale Äquivalenz ist ins- besondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitatsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Prakursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide
„Prakursoren" sind dabei naturliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne die gewünschte biologische Aktivität
PAGE INTENTIONALLY LEFT BLANK
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
Ne Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; Ne
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Ne; Leu
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säu- readditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Peptidmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineral- säuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" (oder „Derivate") erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalem Ende mit Hilfe be- kannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N- Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-
Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen. Weiterhin können N- und/oder C-terminal zusätzlich 1 bis 5, wie z. B. 2, 3 oder 4 beliebige D- oder L- Aminosäurereste kovalent (peptidisch) gebunden sein; oder es können N- und/oder C- terminal 1 bis 5, wie z.B. jeweils 1 , 2, 3 oder 4 Reste fehlen.
Nicht-limitierende Beispiele von zusätzlichen N-und oder C-terminalen Resten umfassen Asp, Pro, Asn, GIy. Bei gleichzeitiger Verlängerung von N- und C-Terminus ist der zusätzliche N-terminale Rest vorzugsweise Pro oder GIy und der zugeordnete C-terminale Rest vor- zugsweise Asp bzw. Asn.
Durch Variation der Aminosäuresequenz der beschriebenen antimikrobiellen Peptide bzw. Fusionierung mit zusätzlichen Protein- oder Peptidsequenzen ist es möglich, Strukturen zu generieren, welche bestimmte Oberflächen, z. B. Haut, Nägel, Haar spezifisch erkennen bzw. von diesen Oberflächen oder den enthaltenen Rezeptoren erkannt und gebunden werden.
Dadurch ist es möglich, die beschriebenen antimikrobiellen Peptide effektiver an den ge- wünschten Wirkort zu bringen bzw. ihre Aufnahme zu verbessern. Durch Kopplung bzw. Fusionierung von Bindeproteinen an die beschriebenen antimikrobiellen Peptide würden daraus hervorgehende Protein-Peptid-Fusionsprodukte gezielter an entsprechende Wirkorte, z. B. Mikroorganismen-Oberflächen oder Körperkompartimente gelenkt werden bzw. an diesen Orten länger verweilen, was eine verlängerte und verbesserte Peptidwirkung zur Folge hat. Weiterhin ist es durch Variation der Aminosäuresequenz der beschriebenen antimikrobiellen Peptide bzw. Fusionierung mit zusätzlichen Protein- oder Peptidsequenzen möglich, die Peptide gezielt an gewünschte Wirkorte zu lenken, um damit z. B. eine höhere Peptidspezifität, geringeren Peptidverbrauch oder Peptiddosis sowie eine schnellere oder stärkere Peptidwirkung zu erzielen.
3.3 Nukleinsäuren, Expressionskonstrukte, Vektoren und Mikroorganismen zur Herstellung der antimikrobiellen Peptide
Nukleinsäuren:
Die Erfindung umfasst weiterhin die für die erfindungsgemäß eingesetzten Peptide und Fusi- onspeptide kodierenden Nukleinsäuremoleküle. Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA- Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie all- gemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A labo- ratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nuklein- säurefragmente, die z. B. als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind, und kann überdies im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombi- nante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standardtechniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungs- sonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligo- nukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z. B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Spleißvarianten oder Allelvari- anten davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population auf Grund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend bei- spielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähig- keit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100 %, vorzugsweise zu 90-100 %, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot- Technik die Verwendung einer 50-70 0C, vorzugsweise 60-65 0C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 x SSC-Puffer mit 0,1 % SDS (20 x SSC: 3 M NaCI, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z. B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, beschrieben.
Expressionskonstrukte und Vektoren:
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Po- lypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Kon- strukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'- stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „ope- rativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targetingsequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regula- tive Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationsse- quenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen inser- tiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, 17-, 15-, 13-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gramnegativen Bakterien Anwendung finden; sowie die grampositiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1 , MFa , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1 , B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolinpromotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbare Promotoren, wie der PrPι-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyade- nylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Pro- tocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden:
Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 1 1d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89).
Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:1 13-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, PJ. (1991 ) "Gene trans- fer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of
Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (beii- spielsweise Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers, (1989) Virology 170:31- 39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1 195-1 197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:871 1- 8721.
Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDMδ (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A La- boratory Manual, 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Rekombinante Mikroorganismen:
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sam- brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben. Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure- Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Se- quenz zu verändern, z. B. funktionell zu disrumpieren ("Knockouf-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem Verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funkti- onelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 :503.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.
Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z. B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.
Als alternative Herstellungsverfahren für erfindungsgemäße Sequenzen sei noch auf die an sich bekannten chemische Syntheseverfahren wie Festphasensynthese oder Flüssigpha- sensynthese verwiesen. 3.4 Rekombinante Herstellung der Polypeptide:
Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide sind in an sich bekannter Weise rekombinant herstellbar, wobei man einen Polypeptide produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gege- benenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermen- tiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 0C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989), beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Deter- genzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, beschrieben.
Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern, und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z. B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation, oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, En- zymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen antimikrobielle Peptide enthaltende Zusammensetzungen und Medikamente besitzen ein breites Anwendungsgebiet in der Human- und Veterinärtherapie, insbesondere zur Behandlung von Mykosen, bevorzugt von Dermatomykosen als auch zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, insbesondere äußeren Infektionen wie z.B. Infektionen der Haut, Nägel, Haare und Schleimhäute..
Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe für die Herstellung von Zubereitungen sind dem Fachmann geläufig. Die Hilfs- und Zusatzstoffe sind bevorzugt kosmetisch und/oder pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe. Pharmazeutisch akzeptabel sind die im Bereich der Pharmazie, der Lebensmitteltechnologie und angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Hilfsstoffe, insbesondere die in einschlägigen Arzneibüchern (z. B. DAB, Ph. Eur., BP, NF) gelisteten sowie andere Hilfsstoffe, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
Geeignete Hilfsstoffe können sein: Gleitmittel, Netzmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, konservierende Mittel, Antioxidanzien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Emulsionsstabilisatoren, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Hydrokolloide, Lösemittel, Lösungsvermittler, Neutralisierungsmittel, Permeationsbeschleuniger, Pigmente, quaternäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl- Grundstoffe, Siliconderivate, Stabilisatoren, Sterilanzien, Treibmittel, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weißöl. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie sie beispielsweise in Fiedler, H. P. Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Aufl., Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt sind. Bevorgzugt verwendet werden können nicht-anionische Tenside. Bevorzugt geeigent sind z.B. zwitterionische Tenside wie Cocamidopropylbetain, positiv geladene Tenside wie Hexa- decyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und ungeladene Tenside wie Blockpolymere und Glucoside.
Geeignete anionische Tenside sind beispielsweise Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylsulfonate, Alkylarylsulfonate, Alkylsuccinate, Alkylsulfosuccinate, N-Alkoylsarkosinate, Acyltaurate, Acylisothionate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylethercarboxylate, Alpha-Olefinsulfonate, insbesondere die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, z. B. Natrium, KaIi- um, Magnesium, Calcium, sowie Ammonium- und Triethanolamin-Salze. Die Alkylethersulfate, Alkyletheφhosphate und Alkylethercarboxylate können zwischen 1 bis 10 Ethylenoxid- oder Propylenoxid-Einheiten, bevorzugt 1 bis 3 Ethylenoxid-Einheiten, im Molekül aufweisen.
Geeignet sind zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Ammoniumlaurysulfat, Natriumlaurylethersul- fat, Ammoniumlaurylethersulfat, Natriumlauroylsarkosinat, Natriumoleylsuccinat, Ammonium- laurylsulfosuccinat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Triethanolamindodecylbenzolsulfonat.
Geeignete amphotere Tenside sind zum Beispiel Alkylbetaine, Alkylamidopropylbetaine, Al- kylsulfobetaine, Alkylglycinate, Alkylcarboxyglycinate, Alkylamphoacetate oder -propionate, Alkylamphodiacetate oder -dipropionate.
Beispielsweise können Cocodimethylsulfopropylbetain, Laurylbetain, Cocamidopropylbetain oder Natriumcocamphopropionat eingesetzt werden.
Als nichtionische Tenside sind beispielsweise die Umsetzungsprodukte von aliphatischen Alkoholen oder Alkylphenolen mit 6 bis 20 C-Atomen in der Alkylkette, die linear oder verzweigt sein kann, mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid geeignet. Die Menge Alkylenoxid beträgt ca. 6 bis 60 Mole auf ein Mol Alkohol. Ferner sind Alkylaminoxide, Mono- oder Dial- kylalkanolamide, Fettsäureester von Polyethylenglykolen, Alkylpolyglykoside oder Sorbita- netherester geeignet.
Die Erfindung wird nun anhand folgender nichtlimitierender Beispiele weiter erläutert. Experimenteller Teil
Die im folgenden beschriebenen Untersuchungen wurden an dem Malassezia furfur Stamm DSM 6170 durchgeführt
Beispiel 1: Langzeitstabilität von P18 getestet an Malassezia furfur
Da eine Lagerung über längere Zeit notwendig sein kann, wurde im Folgenden eine 1 mM P18-Peptιd Losung (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH2) über 12 Wochen bei 37°C gelagert und die antifungale Aktivität der gelagerten Losung auf Malassezia furfur mit der Aktivität einer frisch angesetzten 1mM P18-Peptιd Losung verglichen Hierzu diente ein Wachstumstest, der wie folgt durchgeführt wurde
Wachstumsmedium M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert
2 g/L Olivenöl (wurde sten If titriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern
Für Agarplatten wurde ggf 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen Eine Schuttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M furfur beimpft und über Nacht bei 3O0C und 200 rpm schüttelnd inku- biert
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befullt und mit M furfur Suspension der Ubernachtkultur beimpft Die M furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,02 eingestellt. Die Konzentrate der Inhibitorlösungen waren 1 mM in Wasser.
Folgendes Wachstum wurde verglichen:
- M. furfur Suspension ohne Zugabe eines Inhibitors
- M. furfur Suspension und Zugabe einer wässrigen, frischen P18 Lösung mit einer Endkonzentration von 50 μM
- M. furfur Suspension und Zugabe einer wässrigen, frischen P18 Lösung mit einer Endkon- zentration von 25 μM
- M. furfur Suspension und Zugabe einer bei 37°C für 12 Wochen gelagerten P18 Lösung mit einer Endkonzentration von 50 μM
- M. furfur Suspension und Zugabe einer bei 37βC für 12 Wochen gelagerten P18 Lösung mit einer Endkonzentration von 25 μM
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Das Wachstum wurde über 24 Stunden durch Messung der optischen Dichte beobachtet. Anschließend bestimmte man die Coloπy-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensio- nen je 1 μl und 5 μl ausgestrichen wurde und nach einer Inkubation über 6 Tage die Kolonien gezählt wurden. Die CFU wurde bestimmt, um einen Einfluss des zweiphasigen Mediums als auch die Wuchsform von M. furfur auf die optische Dichte auszuschließen. Die Experimente wurden mindestens in Dreifachbestimmungen durchgeführt.
Tabelle 1: Zählung der Colony-Forming Units (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichung)
Inkubationszeit [h] ohne Zugabe von Zugabe von Zugabe von Zugabe von Inhib. wässriger wässriger, wässriger wässriger, geP18 Lösung gelagerter P18 Lösung lagerter P18 [50 μM P18 Lösung [25 μM Lösung [25 μM
Endkonz.] [50 μM Endkonz.] Endkonz.]
Endkonz.]
16 - 18 > 1000 0±0 0±0 5±8 6±7
24 > 1000 1 ±1 1±1 1 ±2 5±5 Die Ergebnisse des Wachstumstests zeigen dass das Wachstum von M furfur gemessen als Colony Forming Unit von der 12 Wochen gelagerten und der frischen P18-Peptιd Losung effektiv inhibiert wurde Das bedeutet, dass die Lagerung der 1 mM P18-Peptιd Losung die Aktivität der Losung nicht beeinflusst hat, die Losung folglich über diesen Zeitraum lagerfähig war
Beispiel 2: Formυlierbarkeit von P18
Die Formulierbarkeit des Peptids P18 wurde in drei verschiedenen Shampoo- Grundformulierungen getestet Hierzu wurden zunächst die Formulierungen mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt
Tabelle 2 Zusammensetzung der Grundformulierungen
Markenname (INCI) Formulierung Formulierung Formulierung
31-1 31-2 31-3
Texapon NSO (Sodium 40 % 30 % 20 %
Laureth Sulfate)
Tego Betain L7 (Cocami- 10 % 10 % 20 % dopropyl
Betaine)
Die Komponenten wurden gemischt und gelost Mit NaOH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt Im Folgenden wurden zwei 100 mM Losungen des Peptids P18 (P18-Sequenz H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH2) hergestellt Für eine Losung war DMSO das Losungsmittel, für die andere Losung war es Wasser Zu den Fomulierungen wurde jeweils das entspre- chende Volumen der 100 mM P18 Peptid-Losung gegeben, so dass die Endkonzeπtration in den Formulierungen 31-1 und 31-2 10 mM betrug, die Endkoπzentration des Peptids P18 in der Formulierung 31-3 war 5 mM Die so erhaltenen Formulierungen waren klar und homogen
Beispiel 3: Wirkung von Shampoo-Grundformulierungen mit P18 als Inhaltstoff
Ziel des Experiments war es, die Wirkung einer Shampoo-Grundformuherung mit dem Inhaltstoff P18-Peptιd (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2) ZU untersuchen Hierzu wurde in diesem Experiment P18-Peptid direkt in die Formulierung gegeben. Zunächst wurden die Formulierungen mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt:
Tabelle 3: Zusammensetzung der Shampoo-Grundformulierung und Shampoo- Grundformulierung mit P18 als Inhaltstoff
Markenname (INCI) Shampoo- GrundShampoo- Grundformulierung 31-3 formulierung 31-3 mit P18 als Inhaltstoff
Texapon NSO (Sodium Laureth Sulfate) 20 % 20 %
Tego Betain L7 (Cocamidopropyl Betaine) 20 % 20 %
P18-Peptid
(H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2) 5 mM (~ 1%)
Die Komponenten Texapon NSO und Tego Betain L7 wurden gemischt und gelöst. Mit Na- OH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt. Im Folgenden wurden eine 100 mM wässrige
Lösungen des Peptids P18 (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH2) hergestellt.
Zu der Fomulierung wurde jeweils das entsprechende Volumen der 100 mM P18 Peptid-
Lösung gegeben, so dass die Endkonzentration des Peptids P18 in der Formulierung 31-3
5mM war. Die so erhaltene Formulierung war wie zuvor bereits beschrieben klar und homo- gen. Die Wirkung der Formulierungen gegen den Pilz Malassezia furfur wurde nun mit der
Shampoo-Grundformulierung, die kein P18-Peptid enthielt, verglichen.
Zusammengefasst wurde der Test folgendermaßen durchgeführt.
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 121 βC, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben) Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern
Für Agarplatten wurde ggf 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen Eine Schuttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inku- biert
Eine 96-WeIl Mikrotiterplatte wurde mit je 170 μl M472 Pityrosporum Medium befullt und mit 10 μl M furfur Suspension einer Ubernachtkultur beimpft Dies entsprach einer optischen Dichte von 0,02 - 0,1 gemessen bei 620 nm Diesem Ansatz wurden 20 μl Shampoo- Grundformulierung bzw 20 μl Shampoo-Grundformulterung 31-3 mit P18 als Inhaltstoff hin- zugegeben
Demnach wurden in diesem Experiment zusammengefasst die folgenden Ansätze miteinander verglichen
- M furfur Suspension - M furfur Suspension und Zugabe von 20 μl Shampoo-Grundformulierung 31-3
- M furfur Suspension und Zugabe von 20 μl Shampoo-Grundformulierung 31-3 mit P18 als Inhaltstoff
Die Mikrotiterplatte wurde bei 30°C schüttelnd inkubiert
Nach 24 Stunden Inkubation bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl in 10 μl Medium resuspendiert und dann ausgestrichen wurde Nach einer Inkubation über 6 Tage erfolgte eine Zahlung der Kolonien auf der Platte Die CFU wurde bestimmt, um einen Einfluss des zweiphasigen Mediums als auch die Wuchs- form von M furfur auf die optische Dichte auszuschließen Die Experimente wurden mindestens in zwei unabhängigen Experimenten jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt Tabelle 4: Zählung der Colony Forming Units nach 24stündiger Inkubationszeit
M. furfυr M. furfυr SuspenM. furfur Suspen¬
Suspension sion und Zugabe sion und Zugabe von Shampoo- von Shampoo-
Grundformulierung Grundformulierung
31-3 31-3 mit P18 als
Inhaltstoff
24 h > 2000 3001199 0±0
Die Ergebnisse zeigen, dass bereits die Shampoo-Grundformulieruπg 31-3 eine messbare, wachstumsinhibierende Wirkung gegen Malassezia furfur aufweist. Allerdings bewirkt die Shampoo-Grundformulierung 31-3 mit P18 als Inhaltstoff, dass kein Wachstum von M. furfur mehr nachweisbar ist. Das zeigt, dass die antifungale Wirkung des P18 Peptids in dieser Formulierung erhalten bleibt. Da kein Wachstum von M. furfυr mehr festgestellt wurde, ist sogar davon auszugehen, dass bereits geringere Konzentrationen des Inhaltstoffs P18 Peptid oder vergleichbarer Peptide als auch andere, vergleichbare Formulierungen zur Wachstumsinhibierung von Malassezia furfur und anderen Malassezia ssp. geeignet sind.
Beispiel 4: Wachstumsinhibierung von Malassezia furfur bei gleichen Konzentrationen P18-Peptid, Zinkpyrithioπe, Climbazol und Ketokonazol bezogen auf die Gewichtspro- zeπte (%(weigth/weight))
Die molaren Massen des P18-Peptids (P18-Peptid Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH2) und der derzeitig kommerziellen Inhaltstoffe von Anti-Schuppen Shampoos zur Wachstumsinhibierung des Pilzes Malassezia furfur unterscheiden sich deutlich. Die molare Masse des P18-Peptids beträgt 2300 g/moi, die von Zinkpyrithione 317 g/mol, die von Ketokonazol 531 g/mol und Climbazol hat eine molare Masse von 292 g/mol. Da die Experimente zur Wachstumsinhibierung von M. furfur in den vorangegangenen Beispielen bisher mit vergleichbaren Molaritäten durchgeführt worden waren, wurde in diesem Beispiele die Wachstumsinhibierung von Malassezia furfur bei Einsatz gleicher Konzentrationen P18- Peptid, Zinkpyrithione, Climbazol und Ketokonazol bezogen auf die Gewichtsprozente (%(weigth/weight)) untersucht. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen: Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit M. furfur Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die M. furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,02 eingestellt. Die Konzentrate der Inhibitorlösungen waren 1 mM in DMSO für das P18-Peptid und 10 mM in DMSO für Zinkpyrithione, Ketoconazol und Climbazol. Die DMSO-Endkonzentration wurde in allen Experimenten gleich gehalten. Das heißt, dass bei höheren Konzentrationen der Konzentrate von Zinkpyrithione, Ketoconazol und Climbazol ein entsprechendes Volumen DMSO zum Ansatz gegeben wurde, so dass eine Vergleichbarkeit zu den Ansätzen mit P18-Peptid gegeben war.
Folgendes Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte verglichen:
- M. furfur Suspension und Zugabe der P18 Lösung mit einer Endkonzentration von 50 μM (entspricht 0,0115 % (w/w)) - M. furfur Suspension und Zugabe der Zinkpyrithione (ZPT) Lösung mit einer Endkonzentration von 362 μM (Vergleich zum Ansatz mit 50 μM P18-Peptid) - M. furfυr Suspension und Zugabe der Ketoconazol Lösung mit einer Endkonzentration von 216 μM (Vergleich zum Ansatz mit 50 μM P18-Peptid)
- M. furfur Suspension und Zugabe der Climbazol Lösung mit einer Endkonzentration von 390 μM (Vergleich zum Ansatz mit 50 μM P18-Peptid)
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bestimmte man die Colony-Forming-Uπits (CFU) so, dass von den Suspensionen je 10 μl Medium auf Agarplatten ausgestrichen wurden. Nach einer Inku- bation über 6 Tage erfolgte eine Zählung der Kolonien auf der Platte. Die CFU wurde bestimmt, um einen Einfluss des zweiphasigen Mediums als auch die Wuchsform von M. furfυr auf die optische Dichte auszuschließen. Die Experimente wurden mindestens in zwei unabhängigen Experimenten jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt.
Tabelle 5: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Inkubationszeit [h] Zugabe von Zugabe von Zugabe von Zugabe von
P18-Peptid Zinkpyrithione Climbazol Ketoconazol
Lösung [50 Lösung [362 Lösung Lösung [216 μM End- μM Endkonz.] [390 μM μM Endkonz.] konz.] Endkonz.]
24 1±1 60±40 137±33 84±76
40 0+0 26±7 35±15 9+5
Es wurde beobachtet, dass über den Versuchszeitraum die Zugabe der P18-Peptid Lösung die CFU und folglich das Wachstum von Malassezia furfur stärker reduzierte als die Ver- gleichssubstanzen Zinkpyrithione (ZPT), Climbazol und Ketoconazol.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das P18-Peptid bei gleichen Konzentrationen bezogen auf die Gewichtsprozente (%(w/w)) zu einer effektiven, mindestens vergleichbaren Wachstum- sinhibierung von Malassezia furfur im Vergleich zu Zinkpyrithione, Climbazol und Ketocona- zol führt. Beispiel 5: Inkubationszeiten mit P18-Peptid zwischen 5 Minuten bis 1 Stunde
Da die Wachtumsinhibierung von M. furfur durch das P18-Peptid (P18-Peptid Sequenz H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF - NH2) zunächst nur über Inkubationszeiten größer einer Stunde untersucht worden war, wurde nun die Wirkung des P18-Peptids innerhalb der ersten Minuten (5 Minuten, 10 Minuten und 20 Minuten) Inkubationszeit bis ersten Stunde nach Zugabe zu einer M. furfur Übernachtkultur geprüft und mit Zinkpyrithione (Sigma Aldrich) als Kontrollsubstanz verglichen. Hierzu wurden die Konzentrationen 100 μM, 200 μM und 500 μM des P18-Peptids und von Zinkpyrithione als Kontrollsubstanz im Experiment eingesetzt. Die Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt:
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit UIt- raschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit M. furfur Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die M. furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt. Folgendes Wachstum wurde verglichen:
- M. furfur Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration von 100 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- M. furfur Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration von 200 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- M. furfur Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration von 500 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- M. furfur Suspension und Zugabe von Zinkpyrithione mit einer Endkonzentration von 100 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- M. furfur Suspension und Zugabe von Zinkpyrithione mit einer Endkonzentration von 200 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- M. furfur Suspension und Zugabe von Zinkpyrithione mit einer Endkonzentration von 500 μM, Plattierung nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 30° schüttelnd inkubiert.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 50 μl ausgestrichen wurden und nach einer Inkubation über 6 Tage die Kolonien gezählt wurden. Die CFU wurde bestimmt, um einen Einfluss des zweiphasigen Mediums als auch die Wuchsform von M. furfur auf die optische Dichte auszuschließen. Die Experimente wurden unabhängig voneinander wiederholt. Gezeigt sind die Colony Forming Units, die in allen Experimenten weniger als 1000 Kolonien, also eine deutliche Wachstums-inhibierende Wirkung zeigten.
Tabelle 6: Zählung der Colony Forming Units nach der angegebenen Inkubationszeit
Die Ergebnisse zeigen, dass die Malassezia fυrfυr Lebendzellzahl bereits in den ersten 10 Minuten der Inkubation mit dem P18-Peptid im Vergleich zur Inkubation mit Zinkpyrithione deutlich reduziert war. Nach 60 Minuten Inkubation waren die Colony Forming Units bereits bei geringeren Konzentrationen P18-Peptid im Vergleich zu kürzeren Inkubationszeiten deutlich reduziert. Das bedeutet, dass sich der Wirkmechanismus des P18-Peptids von dem des Zinkpyrithiones deutlich unterscheidet und das P18-Peptid bereits nach kurzer Inkubationsdauer Wirkung gegen M. furfur zeigt.
Beispiel 6: Wirkung von P18 Varianten
Die inhibitorische Wirkung von folgenden P18-Varianten auf M. furfur wurde untersucht:
H-KWKLFKKI PKFLHLAKKF - NH2 (P18; Carboxylterminus amidiert)
H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF - OH (P18-OH; Carboxylterminus nicht modifiziert)
H-PKWKLFKKIPKFLHLAKKFD - OH (P18AC-OH; Carboxylterminus nicht modifiziert)
H-PKWKLFKKIPKFLHLAKKFN - NH2 (P18AC-NH2; Carboxylterminus amidiert)
Die Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt:
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben) Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporυm Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit M. furfur Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die M. furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt.
Die Peptidvarianten wurden mit einer Endkonzentration von 1 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Es kann auch auf DMSO verzichtet werden und eine rein wässrige Peptidlö- sung verwendet werden. Von dieser Lösung wurden 5μl zu 100μl M. furfur Suspension gegeben (Endkonzentration des P18 Peptids 50μM). In einem Kontrollansatz wurde die gleiche Menge DMSO ohne P18 Peptid gegeben.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 30° schüttelnd inkubiert.
Nach 24h bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 10 μl ausgestrichen wurden und nach einer Inkubation über 6 Tage die Kolonien gezählt wurden. Es wurden zwei unabhängige Experimente mit je drei identischen Ansätzen durch- geführt und die Anzahl der Colony Forming Units gemittelt.
Tabelle 7: Gemittelte Anzahl der Colony Forming Units (CFU) nach Inkubation von M. furfur mit 50μM unterschiedlicher P18-Varianten
Ansätze CFU
M. furfur Suspension ohne Zusätze
1377
Suspension + DMSO 150
Suspension + DMSO + P18 0 Suspension + DMSO + P18-OH ! 3
Suspension + DMSO + P18AC-OH , 37
Das Experiment zeigt, dass bereits das Losemittel DMSO eine Reduktion der CFU bewirkt Darüber hinaus zeigen aber alle P18-Vaπanten eine verstärkte Inhibition von M furfur im Vergleich zur Kontrolle mit DMSO Dabei nimmt die Wirksamkeit mit der Reihenfolge P18AC- OH; P18-OH; P18-NH2 zu In der gleichen Reihenfolge nimmt die Anzahl der negativ geladenen Carboxylgruppen im Peptidmolekul ab. Es kann daher geschlossen werden, dass Peptidvaπanten mit geπnger negativer Ladung die beste Wirkung zeigen.
Beispiel 7: Kinetik der Wirkung von P18-Peptid auf M. furfur in Anwesenheit einer Shampoo-Grundformulierung
Die Wirkung des P18-Peptιds (H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2; Carboxylterminus amidiert) im Vergleich zu Zinkpynthion und Climbazol bei unterschiedlichen Einwirkzeiten wurde in Anwesenheit der Shampoo-Grundformuiierung überprüft Die Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt:
Folgende Shampoo-Grundformulierung wurde angesetzt'
Tabelle 8' Zusammensetzung der Shampoo-Grundformulierung
Markenname (INCI) Shampoo- Grundformulierung 31-3
Texapon NSO (Sodium Laureth 20 %
Sulfate)
Tego Betain L7 (Cocamidopro- 20 % pyl
Betaine)
Die Komponenten Texapon NSO und Tego Betain L7 wurden gemischt und gelost Mit Na- OH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt
Die Wirkung von P 18, ZPT und Climbazol auf M. furfur wurde folgendermaßen untersucht Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 121 "C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit M. furfur Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die M. furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt. Zu der M. furfur Suspension wurde 10% (v/v) der Shampoo-Grundformulierung 31-3 Gegeben.
Das P18-Peptid wurde mit einer Konzentration von 230g/l in Wasser gelöst. Die Wirkstoffe Zinkpyrithion und Climbazol wurden mit einer Konzentration von 230g/l in DMSO gelöst, wobei ein Teil der Wirkstoffe unlöslich suspendiert blieb. Die Peptid- bzw. Wirkstofflösungen wurden mit Endkonzentrationen von 2,3g/l; 1,15g/l; 0,46g/l und 0,23g/l zu der M. furfur Suspension mit Shampoo-Grundformulierung gegeben.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 30° schüttelnd inkubiert.
Nach Inkubation der Ansätze für 5min; 10min; 20min; 60min und 24h bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl ausgestrichen wurden und nach einer Inkubation über 6 Tage die Kolonien gezählt wurden. Es zeigt sich, das P18 in diesem Test bessere Eigenschaften aufweist als Ziπkpyπthion oder Climbazol
Beispiel 8: Langzeitstabilität von P18-Peptid in Shampoo-Grundformulieruπgen getes- tet an M. furfur
Die Langzeitstabihtät von P18-Peptid (H-KWKLFKKIPKFLHL_AKKF-NH2; Carboxylterminus amidiert) in Shampoo-Grundformulierungen wurde überprüft.
Folgende Shampoo-Grundformulierungen wurden angesetzt:
Tabelle 9: Zusammensetzung der Formulierungen
Markenname (INCI) Formulierung Formulierung Formulierung
31-1-10 31-3-5 31-3-2
Texapon NSO (Sodium 40 % 20 % 20 %
Laureth Sulfate)
Tego Betain L7 (Cocami- 10 % 20 % 20 % dopropyl
Betaine)
P18-Peptid 1O mM 5 mM 2 mM
Die Komponenten Texapon NSO und Tego Betain L7 wurden gemischt und gelöst Mit Na- OH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt. Im Folgenden wurden eine 100 mM wässπge Losungen des Peptids P18 hergestellt. Zu den Formulierungen wurde jeweils das entsprechende Volumen der 10OmM P18 Peptid-Losung gegeben, so dass die in Tabelle 15 aufgeführten Endkonzentrationen des Peptids P18 erhalten wurden.
Die Formulierungen wurden bei 400C gelagert.
Nach 0; 12 und 22 Tagen wurde die Wirkung der Formulierungen auf M. furfur untersucht.
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 121 βC, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inku- biert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 100 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit M. furfur Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die M. furfur Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt.
Zu der M. furfur Suspension wurde 10% (v/v) der gelagerten Formulierungen 31-1-10; 31-3- 5; 31-3-2 (Tabelle 9) gegeben.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Nach 24 Stunden wurden die Colony-Forming-Units (CFU) bestimmt. Dazu wurden von den Suspensionen je 1 μl und 10 μl ausgestrichen und nach einer Inkubation über 6 Tage die Kolonien gezählt.
Es zeigt sich, das P18 unter den getesteten Bedingungen stabile Eigenschaften aufweist.
Beispiel 9: Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) des Peptids P18 in Anwesenheit einer Shampoo-Grundformulierung
Die minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) des Peptids P18 (H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2; Carboxylterminus amidiert) in Anwesenheit der Shampoo- Grundformulierung 31-3 (Tabelle 10) wurde auf folgende Weise überprüft: Folgende Shampoo-Grundformulierung wurde angesetzt.
Tabelle 10 Zusammensetzung der Shampoo-Grundformulierung
Markenname (INCI) j Shampoo- Grundformulierung 31-3
[ mιt P18 als lnhalt-
! stoff
Texapon NSO (Sodium Laureth 20 % Sulfate)
Tego Betain L7 (Cocamidopro- 20 % pyl Betaine)
Zur Herstellung der Shampoo-Grundformulierung wurden die Komponenten Texapon NSO und Tego Betain L7 gemischt und gelöst. Mit NaOH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt.
Die Wirkung des Peptids auf M. furfur wurde folgendermaßen untersucht'
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 121°C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 170 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit 10 μl M. furfur Suspension einer Übernachtkultur beimpft. Dies entsprach einer optischen Dichte von 0,02 - 0,1 gemessen bei 620 nm. Diesem Ansatz wurden 20 μl Shampoo- Grundformulierung 31-3 zugesetzt. Das Peptid P18 wurde mit einer Konzentration von 10 mM in DMSO gelöst. Von der P18-Lösung wurden entsprechende Mengen zugegeben um die in Tabelle 11 aufgeführten Endkonzentrationen zu erhalten.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl in 10 μl Medium resuspendiert und dann ausgestrichen wurde. Nach einer Inkubation über 6 Tage erfolgte eine Zählung der Kolonien auf der Platte. Das Experiment wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Tabelle 11 : Zählung der Colony Forming Units (CFU) nach 24stündiger Inkubationszeit
Die Ergebnisse zeigen, dass ab einer Konzentration von 100 μM P18 das Wachstum von M. furfur vollständig inhibiert wird. Die minimale inhibitorische Konzentration in Anwesenheit der Shampoo-Grundformulierung 31-3 liegt damit zwischen 50μM und 100μM. Das zeigt, dass die antifungale Wirkung des P18 Peptids in dieser Formulierung erhalten bleibt, wenngleich die Aktivität durch die verwendete Shampoo-Grundformuiierung etwas verringert wird im Vergleich zu Ansätzen ohne Shampoo-Grundformuiierung (vgl Beispiel 1)
Beispiel 10: Kombination des Peptids P18 mit herkömmlichen fungiziden Wirkstoffen
Die Wirkung von Wirkstoffkombinationen bestehend aus einem Anteil des herkömmlichen fungiziden Wirkstoffes Zinkpyπthion oder Ketoconazol oder Climbazol und des Peptids P18 (H-KWKLFKKIPKFLHL-AKKF-NH2, Carboxylterminus amidiert) wurde in wassπger Losung und in Anwesenheit der Shampoo-Grundformuiierung 31-3 auf folgende Weise überprüft:
Folgende Shampoo-Grundformuiierung wurde angesetzt:
Tabelle 12 Zusammensetzung der Shampoo-Grundformuiierung
Markenname (INCI) Shampoo- Grundformulierung 31-3
Texapon NSO (Sodium Laureth 20 %
Sulfate)
Tego Betain L7 (Cocamidopro- 20 % pyl
Betaine)
Zur Herstellung der Shampoo-Grundformuiierung wurden die Komponenten Texapon NSO und Tego Betain L7 gemischt und gelost. Mit NaOH wurde der pH-Wert auf pH 6-7 eingestellt
Die Wirkung des Peptids P18 und des ZPT auf M. furfur mjrüe folgendermaßen untersucht:
Wachstumsmedium. M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert 2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit UIt- raschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. fυrfυr beimpft und über Nacht bei 30βC und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 170 μl M472 Pityrosporum Medium befüllt und mit 10 μl M. furfur Suspension einer Übernachtkultur beimpft. Dies entsprach einer optischen Dichte von 0,02 - 0,1 gemessen bei 620 nm. Diesem Ansatz wurden wahlweise 20 μl Sham- poo-Grundformulierung 31-3 oder Wasser zugesetzt. Das Peptid P18 wurde mit einer Konzentration von 10 mM in Wasser gelöst. Der herkömmliche fungizide Wirkstoff wurde mit einer Konzentration von 10 mM in DMSO gelöst. Von der P18-Lösung und der Lösung des herkömmlichen fungiziden Wirkstoffes wurden den Ansätzen entsprechende Mengen zuge- geben um die in Tabelle 13 aufgeführten Endkonzentrationen zu erhalten.
Tabelle 13 Konzentrationen der herkömmlichen fungiziden Wirkstoffe und P18
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl in 10 μl Medium resuspendiert und dann ausgestrichen wurde. Nach einer Inkubation über 6 Tage erfolgte eine Zählung der Kolonien auf der Platte.
Dabei zeigt sich, dass Kombinationen von P18 mit herkömmlichen fungiziden Wirkstoffen bessere Eigenschaften aufweisen als die herkömmlichen fungiziden Wirkstoffe allein.
Beispiel 11 : Wirkung P18 in Anwesenheit von nichtionischen und zwitterionischen Tensiden
Ziel des Experiments war es, die Wirkung von nichtionischen und zwitterionischen Tensiden auf die Aktivität des P18-Peptid (P18-Sequenz H-KWKLFKKI PKFLHLAKKF-NH2) ZU untersuchen. Hierzu wurden folgende Tenside verwendet:
Pluracare F 68 (ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Blockcopolymer) Plantacare 818 (ein Glucosid)
Tego Betain L7 (Cocamidopropylbetain)
Der Test wurde folgendermaßen durchgeführt.
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40 g/L Malzextrakt 20 g/L Ochsengalle 10 g/L Tween 40 Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Da es sich um ein zweiphasiges Medium handelte, wurde das vollständige Medium mit Ultraschall behandelt, um die Phasengrenze zu vergrößern.
Für Agarplatten wurde ggf. 150g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporυm Medium wurde mit Af. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 85 μl einer M. furfur Suspension in M472 Pity- rosporum Medium befüllt, die eine optische Dichte von 0,1 gemessen bei 620 nm aufwies. Zu der Kultur wurden 10μl Detergenzienlösung und 5μl Peptidlösung gegeben. Die Konzentrationen der Detergenzienlösungeπ waren so eingestellt, dass die Endkonzentration des jeweiligen Detergenz im Ansatz 2%; 4% oder 6% betrug. Die Konzentrationen der P18- Peptidlösungen waren so eingestellt, dass die Endkonzentration des P18-Peptids im Ansatz OμM; 50 μM; 100 μM; 250 μM; oder 500μM betrug.
Die Mikrotiterplatte wurde bei 300C schüttelnd inkubiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl in 10 μl Medium resuspendiert und dann ausgestrichen wurde. Nach einer Inkubation über 6 Tage erfolgte eine Zählung der Kolonien auf der Platte. Die CFU wurde bestimmt, um einen Einfluss des zweiphasigen Mediums als auch die Wuchsform von M. furfur auf die optische Dichte auszuschließen. Die Experimente wurden mindes- tens in zwei unabhängigen Experimenten jeweils in 3-facrtbestimmung durchgeführt.
Tabelle 14: Mittelwerte der gezählten Colony Forming Units (CFU) pro μl nach 24 stündiger Inkubationszeit. Die Konzentrationsangaben beziehen sich auf die Endkonzentration im As- say. n.d. = nicht bestimmt Detergenzienkonzentration
2% 4% 6%
P18Konz. [μM]
Pluracare F68 0 >1000 >1000 n.d.
50 4 2 n.d.
100 1 0 n.d.
250 0 0 n.d.
500 0 0 n.d.
Plantacare 818 0 >1000 975 706
50 6 39 106
100 0 5 10
250 0 0 0
500 0 0 0
Tego Betain L7 0 748 694 302
50 0 3 0
100 0 0 0
250 0 0 0
500 0 0 0
Die Ergebnisse zeigen, P18 in Anwesenheit von nichtionischen oder zwitterionischen Deter- genzien seine Wirkung gegen Malassezia furfur beibehält .
Formulierungsbeispiel 12
Im Folgenden sind erfindungsgemäße Zubereitungen beschrieben, enthaltend das Peptid P18. Das Peptid P18 wird in den folgenden Beispielen stellvertretend für alle anderen oben beschriebenen Peptide genannt. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass auch alle anderen hierin genannten, erfindungsgemässen Peptide in den unten genannten Zubereitungen verwendet werden können.
In den Zubereitungen kann das Peptid 18 als alleiniger Wirkstoff oder in Kombination mit anderen antifungalen oder antibakteriellen Wirkstoffen (siehe Beschreibung) verwendet werden.
Beispiel: Gel Hydroxyethylcellulose 1 ,0% (w/w) Propyleneglycol 10,0 %(w/w)
Peptid P18 1 ,0 %(w/w) mit destiliertem Wasser auffüllen auf 100,0 %(w/w)
Beispiel:
Salbe
Peptid P18 1 ,0 % (w/w) mit einer Mischung aus Liquid paraffin/White soft paraffin (Verhältnis 1 :4) auffüllen auf 100,0
% (w/w)
Beispiel:
Öl in Wasser Emulsion
Peptid P18 1 ,0 %(w/w)
Liquid paraffin 6,0 %(w/w) Cetostearylalcohol 7,2 % (w/w)
White soft paraffin 15,0 % (w/w)
Glycerol 5,0 % (w/w) mit destiliertem Wasser auffüllen auf 100,0 %(w/w)
Beispiel: Salbe
Peptid P18 1 ,0 % (w/w)
Sorbitan monopalmitate 2,0 % (w/w)
White soft paraffin 97,0 %(w/w)
Beispiel 13: Wirkung von P18 auf Trichophyton rubrum
Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2, (Bachern AG, Schweiz)) auf Trichophyton rubrum (DSM 21 146)
Wachstumsmedium MEP nach DSMZ (Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland):
30g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Sojapepton (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 5,6 einstellen Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Agarplatte, auf der die Trichophyton rubrum Kultur gewachsen war, wurde mit 5 ml MEP Medium abgespült. Von der erhaltenen T. rubrum Suspension wurden 100 μl in 10 ml Medium gegeben.
Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 190 μl der T. rubrum Suspension befüllt. Nun wurde eine Verdünnungsreihe des Peptids mit einer finalen Konzentration in den Wells zwischen 0 und 1000 ppm zugegeben. Dazu wurden zu der T. rubrum Suspension pro Well 10 μl Pep- tidlösung mit einer Konzentration von 0 ppm bis 20000 ppm gegeben, so dass finale Peptid- konzentrationen in den Wells im Bereich zwischen 0 ppm und 1000 ppm erhalten wurden.
Die Inkubation der Mikrotiterplatte erfolgte bei 300C. Das pilzliche Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 620 nm beurteilt und über 7 Tage beobachtet. Die Experimente wurden mindestens in Zweifachbestimmung durchgeführt und unabhängig voneinander mindestens einmal wiederholt. Ab einer Konzentration von 125 ppm bis 250 ppm und steigenden Konzentrationen bis 1000 ppm der Verdünnungsreihen des Peptids wurde kein Wachstum von T. rubrum mehr festgestellt, so dass keine signifikante Trübung gemessen wurde. Eine Sterilkontrolle blieb ebenfalls ohne Trübung, während die Suspension ohne Zugabe von Peptid eine deutliche Trübung aufwies.
Die Ergebnisse der Wachstumsversuche zeigten daher eine antifungale Wirkung des Peptids P18 auf T. rubrum bei einer minimalen inhibitorischen Konzentration von 125 ppm - 250 ppm.
Beispiel 14: Minimal inhibitorische Konzentration von P18 auf Malassezia furfur
Minimal inhibitorische Konzentration des Peptids P18 (P18-Sequenz H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) bezogen auf Malassezia furfur (DSM 6170)
Wachstumsmedium M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ: 40g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA)
20g Ochsengalle (Merck, Darmstadt, Deutschland) 10g Tween40 (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) auffüllen auf 1 Liter,
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Anschließend wurden 2 ml Olivenöl (sterilfiltriert) hinzugegeben.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur beimpft und über Nacht bei 300C und 200rpm schüttelnd inkubiert.
Die Suspension wurde auf eine optische Dichte gemessen bei 600nm von 0,1 eingestellt. Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 95 μl der M. furfur Suspension befüllt. Nun wurde eine Verdünnungsreihe des Peptids mit einer finalen Konzentration in den Wells zwischen 0 und 1000 ppm zugegeben. Dazu wurden zu der M. furfur Suspension pro Well 5 μl Peptidlö- sung mit einer Konzentration im Bereich von 0 ppm bis 20000ppm gegeben, so dass finale Konzentrationen des Peptids in den Wells im Bereich zwischen 0 ppm und 1000 ppm erhalten wurden.
Die Inkubation der Mikrotiterplatte erfolgte bei 300C, 600 rpm. Das pilzliche Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 620 nm beurteilt und über 72 Stunden beobachtet. Die Experimente wurden mindestens in Zweifachbestimmung durchgeführt und unabhängig voneinander mindestens einmal wiederholt.
Ab einer Konzentration von 125 ppm und steigenden Konzentrationen bis 1000 ppm der Verdünnungsreihe wurde kein Wachstum von M. furfur mehr festgestellt, so dass keine signi- fikante Trübung gemessen wurde. Eine Sterilkontrolle blieb ebenfalls ohne Trübung, während die Suspension ohne Zugabe von Peptid eine deutliche Trübung nach 24 Stunden Inkubation aufwies.
Die Ergebnisse der Wachstumsversuche zeigten daher eine antifungale Wirkung des Peptids P18 auf M. furfur bei einer minimalen inhibitorischen Konzentration von 125ppm . Beispiel 15: Wirkung von P18 auf Klebsiella pneumoniae
Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) auf Klebsiella pneumoniae (DSM 681 ) zu untersuchen.
Wachstumsmedium TSBY (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA)
17g pankreatisch abgebautes Casein
3g pankreatisch abgebautes Soja 2,5g Dextrose
5g Natriumchlorid
2,5g Dikaliumphosphat
3g Yeast Extract (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 7 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Eine Schüttelkultur mit TSBY Medium wurde mit K. pneumoniae beimpft und über Nacht bei 37°C und 200rpm schüttelnd inkubiert.
Die Suspension wurde auf eine optische Dichte gemessen bei 600nm von 0,1 eingestellt. Eine 96-WeII Mikrotiterplatte wurde mit je 95 μl der K. pneumoniae Suspension befüllt. Nun wurde eine Verdünnungsreihe des Peptids mit einer finalen Konzentration in den Wells zwischen 0 und 1000 ppm zugegeben. Dazu wurden zu der K. pneumoniae Suspension pro Well 5 μl Peptidlösung mit einer Konzentration im Bereich von 0 ppm bis 20000ppm gegeben, so dass finale Konzentrationen des Peptids in den Wells im Bereich zwischen 0 ppm und 1000 ppm erhalten wurden.
Die Inkubation der Mikrotiterplatte erfolgte bei 37°C, 600 rpm. Das bakterielle Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 620 nm beurteilt und über 24 Stunden beobachtet. Die Experimente wurden mindestens in Zweifachbestimmung durchgeführt und unabhängig voneinander mindestens einmal wiederholt.
Ab einer Konzentration von 125 ppm und steigenden Konzentrationen bis 1000 ppm der Verdünnungsreihe wurde kein Wachstum von K. pneumoniae mehr festgestellt, so dass keine signifikante Trübung gemessen wurde. Eine Sterilkontrolle blieb ebenfalls ohne Trübung, während die K. pneumoniae Suspension ohne Zugabe von Peptid eine deutliche Trübung nach 24 Stunden Inkubation aufwies.
Die Ergebnisse der Wachstumsversuche zeigten daher eine antibakterielle Wirkung des Peptids P18 auf K. pneumoniae bei einer minimalen inhibitorischen Konzentration von 125 ppm .
Beispiel 16: Kurzzeitwirkung von P18 auf Candida albicans
Eine Wirkung von P18 auf Candida albicans nach Inkubation über mehrere Stunden ist bekannt (Lee, D. G., Hahm, K.S., Shin, S.Y. Structure and fungicidal activity of a synthetic anti- microbial peptide, P18, and ist truncated peptides, Biotechnology Letters, 2004, 26: 337-341 ). Ziel dieses Experiments war es, die Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) gegen Candida albicans (DSM 1 1948) bei kurzer Inkubation innerhalb der ersten Stunde zu untersuchen und mit der Wirkung von ZPT (Zinc Pyrithione) zu vergleichen. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium YM (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Hefeextrakt 3g Malzextrakt 5g Pepton 10g Dextrose auffüllen auf 1 Liter, pH 6,2 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: 5 ml YM-Medium wurden mit C. albicans beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm inkubiert.
1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurden mit je 1 ml YM-Medium befüllt und mit der C. albicans Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die erhaltene C. albicans Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt. Die Konzentration der Peptidlösung in Wasser bzw. ZPT-Lösung (Zinc Pyrithione, >96%, Sigma
Aldrich) gelöst in DMSO betrug 2% (w/w).
Folgendes Wachstum wurde verglichen:
- C. albicans Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - C. albicans Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - C. albicans Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- C. albicans Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reakti- onsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
Die 1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl verdünnt in 20 μl YM-Medium ausgestrichen wurde und nach einer Inkubation von 2 Tagen die Kolonien gezählt wurden. Tabelle 15: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigten, dass die C. albicans Lebendzellzahl im untersuchten Konzentrationsbereich bereits in den ersten 20 Minuten durch die Wirkung von P18 drastisch reduziert wurde. Für ZPT wurde über den beobachteten Zeitraum im untersuchten Konzentrationsbe- reich keine signifikante Inhibition beobachtet. Diese Ergebnisse deuten auf einen anderen
Wirkmechanismus des Peptids P18 im Vergleich mit ZPT hin. Ursachen hierfür können unterschiedliche Angriffpunkte beider antimikrobieller Substanzen sein. Während ZPT möglicherweise den Membrantransport inhibiert (Chandler et al. 1978 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14: 60-68), interagiert P18 möglicherweise mit der pilzlichen Membran und löst diese auf, wie es für die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden auf Bakterien bereits beschrieben ist. Andererseits könnte auch eine Bindung an relevante Bereiche der DNA oder an relevante Proteine eine mögliche Wirkweise von P18 sein, oder aber eine Kombination der Wirkung auf mehrere Angriffpunkte. Zudem kann die unterschiedliche Wirkung mit einer Detoxifizierung des ZPTs durch C. albi- cans erklärt werden.
Beispiel 17: Kurzzeitwirkung von P18 auf Trichophyton rubrum
Ziel dieses Experiments war es, die Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H- KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) gegen Trichophyton rubrum (DSM21146) bei kurzer Inkubation innerhalb der ersten Stunde zu untersuchen und mit der Wirkung von ZPT (Zinc pyrithione) zu vergleichen. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium MEP nach DSMZ:
30g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Sojapepton (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 5,6 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Agarplatte, auf der die Trichophyton rubrum Kultur gewachsen war, wurde mit 5 ml MEP Medium abgespült.
1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurde mit je 1 ml MEP-Medium befüllt und mit 10μl der T. rubrum Suspension beimpft. Die Konzentration der Peptidlösung in Wasser bzw. ZPT-Lösung (Zinc Pyrithione, >96%, Sigma Aldrich) gelöst in DMSO betrug 2% (w/w).
Folgendes Wachstum wurde verglichen: - T. rubrum Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T. rubrum Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T. rubrum Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T. rubrum Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - T.rubrum Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T.rubrum Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T.rubrum Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1,5 ml Reakti- onsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T.rubrum Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- T.rubrum Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - T.rubrum Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
Die 1,5 ml Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl verdünnt mit 20 μl MEP-Medium ausgestrichen wurde und nach einer Inkubation von 2 Tagen die Kolonien gezählt wurden. Beispielhaft sind die CFU eines Experiments gezeigt, dass in Doppelbestimmung durchgeführt wurde.
Tabelle 16: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte der Experimente)
Substanz finale Peptid- Colony-formiπg units nach der angegebenen Inkubati-
Konzentration onszeit im Experi- ment
Die Ergebnisse zeigen, dass die T. rubrum Lebendzellzahl im untersuchten Konzentrationsbereich bereits in den ersten 60 Minuten durch die Wirkung von P18 maximal um den Faktor 20 reduziert wird. Bei 10fach höherer Zellzahl wurde die Lebendzellzahl höchstens um den Faktor 2 reduziert (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Peptid P18 eine Wachstumsinhibierung von T. rubrum bewirkt.
Da die Wirkung abhängig von der Zellzahl ist, scheint das Peptid durch seine Wirkung selbst verbraucht zu werden. Diese Ergebnisse deuten auf einen Wirkmechanismus hin, bei dem das Peptid P18 die wachstumsinhibierende Wirkung nicht katalysiert, sondern irreversibel an der Reaktion beteiligt ist. Grund hierfür könnte demnach eine irreversible Wechselwirkung des Peptids mit der pilzlichen Membran oder mit DNA sein. Zudem deuten die Ergebnisse auf unterschiedliche Wirkmechanismen von ZPT und P18 hin, da für ZPT über den beobachteten Zeitraum im untersuchten Konzentrationsbereich keine signifikante Inhibition nachgewiesen wurde. Ursachen können hier dieselben sein, wie im vergleichbaren Beispiel für C. albicans (Beispiel 16) diskutiert.
Beispiel 18: Kurzzeitwirkung von P18 auf Escherichia coli
Eine Wirkung von P18 auf Escherichia coli nach Inkubation über mehrere Stunden ist bekannt (Shin et al. 1999 Journal of Peptide Research, 53: 82-90).). Ziel dieses Experiments war es, die Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF- NH2(Bachem AG, Schweiz)) auf Escherichia coli (Stratagene, BLR) bei kurzer Inkubation innerhalb der ersten Stunde zu untersuchen und mit der Wirkung von ZPT (Zinc pyrithione) zu vergleichen. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium LB (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Hefeextrakt 3g Malzextrakt 5g Pepton 10g Dextrose auffüllen auf 1 Liter, pH 7 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: 10 ml LB-Medium wurden mit E. coli beimpft und über Nacht bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
1 ,5ml Reaktionsgefäße wurden mit je 1 ml LB-Medium befüllt und mit der E. coli Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die E. coli Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt. Die Konzentration der Pep- tidlösung in Wasser bzw. ZPT-Lösung (Zinc Pyrithione, >96%, Sigma Aldrich) gelöst in DMSO betrug 2% (w/w). Folgendes Wachstum wurde verglichen:
- E. coli Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - E. coli Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reak- tionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - E. coli Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsge- faß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- E. coli Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
Die 1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so, dass von den Suspensionen je 1 μl verdünnt in 20 μl LB-Medium ausgestrichen wurde und nach einer Inkubation von 2 Tagen die Kolonien gezählt wurden.
Tabelle 17: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die E. coli Lebendzellzahl im untersuchten Konzentrationsbereich bereits in den ersten 60 Minuten durch die Wirkung von P18 drastisch reduziert wird. Für ZPT wurde über den beobachteten Zeitraum im untersuchten Konzentrationsbereich keine signifikante Inhibition beobachtet.
Ursachen für die unterschiedliche Wirksamkeit von P18 und ZPT können unterschiedliche
Angriffpunkte beider antimikrobieller Substanzen sein. Während ZPT möglicherweise den Membrantransport inhibiert (Chandler et al. 1978 Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
14: 60-68), interagiert P18 möglicherweise mit der bakteriellen Membran und löst diese auf, wie es für die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden auf Bakterien bereits beschrieben ist.
Andererseits könnte auch eine Bindung an relevante Bereiche der DNA oder an relevante
Proteine eine mögliche Wirkweise von P18 sein, oder aber eine Kombination mehrerer Wirkmechanismen. Zudem kann die unterschiedliche Wirkung mit einer Detoxifizierung des
ZPTs durch E. coli erklärt werden.
Beispiel 19: Kurzzeitwirkung von P18 auf Staphylococcus epidermidis
Eine Wirkung von P18 auf Staphylococcus epidermidis nach Inkubation über mehrere Stunden ist bekannt (Shin et al., 2002,Biochemical and Biophysical Research Communications, 290: 558-562). Ziel dieses Experiments war es, die Wirkung des Peptids P18 (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) auf Staphylococcus epidermidis (DSM 1798) bei kurzer Inkubation innerhalb der ersten Stunde zu untersuchen und mit der Wirkung von ZPT (Zinc pyrithione) zu vergleichen. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium TSBY:
Fertigmedium TSB (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA);
17g pankreatisch abgebautes Casein
3g pankreatisch abgebautes Soja
2,5g Dextrose 5g Natriumchlorid
2,5g Dikaliumphosphat
3g Yeast Extract (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 7 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben. Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: 5 ml TSBY-Medium wurden mit S. epidermidis beimpft und über Nacht bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
1 ,5ml Reaktionsgefäße wurden mit je 1 ml TSBY-Medium befüllt und mit der S. epidermidis Suspension der Übernachtkultur beimpft. Die S. epidermidis Suspension wurde zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt. Die Konzentration der Peptidlösung in Wasser bzw. ZPT-Lösung (Zinc Pyrithione, >96%, Sigma Aldrich) gelöst in DMSO betrug 2% (w/w).
Folgendes Wachstum wurde verglichen:
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - S.epidermidis Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von P18-Peptid mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Re- aktionsgefäß von 50 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 100 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 200 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten - S.epidermidis Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 500 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
- S.epidermidis Suspension und Zugabe von ZPT mit einer Endkonzentration im 1 ,5 ml Reaktionsgefäß von 1000 ppm nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten
Die 1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach den angegebenen Inkubationszeiten bestimmte man die Colony-Forming-Units (CFU) so. dass von den Suspensionen je 1 μl verdünnt in 20 μl TSBY-Medium ausgestrichen wurden und nach einer Inkubation von 2 Tagen die Kolonien gezählt wurden.
Tabelle 18: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die S. epidermidis Lebendzellzahl im untersuchten Konzentrationsbereich bereits in den ersten 5 Minuten durch die Wirkung von P18 drastisch reduziert wurde. Für ZPT wurde über den beobachteten Zeitraum im untersuchten Konzentrationsbereich eine geringe Inhibition bei 50 ppm und 100 ppm beobachtet. Für höhere Konzentrationen wurde für ZPT keine signifikante Inhibition beobachtet.
Beispiel 20: P18 in Formulierung gegen Candida albicans.
Ziel des Experiments war es, die Wirkung einer pharmazeutischen Grundformulierung mit dem Inhaltstoff P18-Peptid (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) zu untersuchen. Hierzu wurde folgende Grundformulierung verwendet:
1% Hydroxycellulose 10% Propylenglycol mit Wasser aufgefüllt.
Basierend auf der Grundformulierung wurden Formulierungen mit steigenden P18- Konzentrationen (500ppm bis 10000 ppm) aus einer 20%igen Konzentratlösung hergestellt. Die Wirkung der Formulierungen auf C. albicans (DSM 1 1948) wurde untersucht.
Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium YM (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Hefeextrakt 3g Malzextrakt 5g Pepton 10g Dextrose auffüllen auf 1 Liter, pH 6,2 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben. Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen 5 ml YM-Medιum wurden mit C albicans beimpft und über Nacht bei 30°C und 200 rpm iπkubiert
1 5 ml Reaktionsgefaße wurde mit je 1 ml YM-Medιum befullt und mit der C albicans Suspension der Ubernachtkultur so beimpft, dass zu Beginn des Experiments eine optische Dichte - gemessen bei 600 nm - von 0,1 erhalten wurde Die erhaltene C albicans Suspension wurde im Verhältnis 1 9 (Formulierung C albicans Suspensιon)mιt den Formulierungen gemischt. 1 μl der Kultur wurde nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten mit 20 μl YM-Medιum verdünnt und anschließend plattiert Nach Inkubation über 24 Stunden wurden die Kolonien auf den Platten gezahlt
Tabelle 19 Zahlung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Formulierung an sich (0 ppm) keine wachstumshemmende Wirkung hat. Nach 60 Minuten Inkubation wurde eine signifikante Wachstumsinhibition für eine Formulierung mit 1000 ppm P18 beobachtet. Bereits nach 5 Minuten Behandlungsdauer wurde eine Wirkung mit einer Formulierung erhalten, die 5000 ppm P18-Peptid enthielt.
Beispiel 21 : P18 in Formulierung gegen Escherischia coli.
Ziel des Experiments war es, die Wirkung einer pharmazeutischen Grundformulierung mit dem Inhaltstoff P18-Peptid (P18-Sequenz H-KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) zu untersuchen. Hierzu wurde folgende Grundformulierung verwendet:
1% Hydroxycellulose 10% Propylenglycol mit Wasser aufgefüllt.
Basierend auf der Grundformulierung wurden Formulierungen mit steigenden P18- Konzentrationen (500ppm bis 10000 ppm) aus einer 20%igen Konzentratlösung hergestellt. Die Wirkung der Formulierungen auf E. coli (Stratagene, BLR) wurde untersucht.
Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium LB (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA)
3g Hefeextrakt 3g Malzextrakt 5g Pepton 10g Dextrose auffüllen auf 1 Liter, pH 7 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert. Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen 5 ml LB-Medιum wurden mit E coli beimpft und über Nacht bei 37°C und 200 rpm inkubiert
1 5 ml Reaktionsgefaße wurde mit je 1 ml LB-Medιum befullt und mit der E coli Suspension der Ubernachtkultur so beimpft dass zu Beginn des Experiments eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0, 1 eingestellt wurde Die erhaltene E coli Suspension wurde im Verhältnis 1 9 (Formulierung E coli Suspension) mit den Formulierungen gemischt 1 μl der Kultur wurde nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 60 Minuten mit 20 μl LB-Medιum verdünnt und anschließend plattiert Nach Inkubation über 24 Stunden wurden die Kolonien auf den Platten gezahlt
Tabelle 20 Zahlung der Colony Formmg Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Formulierung an sich (0 ppm) keine wachstumshemmende Wirkung hat. Nach 60 Minuten Inkubation wird eine signifikante Wachstumsinhibition für eine Formulierung mit 10000 ppm P18 beobachtet.
Beispiel 22: P18 in Formulierung gegen weitere Pilze und Bakterien
Ziel des Experiments war es, die Wirkung einer pharmazeutischen Grundformulierung mit dem Inhaltstoff P18-Peptid (P18-Sequenz H-KWKLFKKI PKFLHLAKKF-NH2 (Bachern AG, Schweiz)) auf weitere Pilze und Bakterien zu untersuchen. Hierzu wurde folgende Grundformulierung verwendet:
1% Hydroxycellulose 10% Propylenglycol mit Wasser aufgefüllt.
Basierend auf der Grundformulierung wurden Formulierungen mit 10000 ppm P18-Peptid aus einer 20%igen Konzentratlösung hergestellt.
Die Wirkung der Formulierungen auf S. epidermidis (TJSM 1798), M. furfur (DSM 6170) und T. rubrum (DSM 21146) wurde untersucht.
Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen.
Wachstumsmedium TSBY für S. epidermidis Fertigmedium TSB (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 17g pankreatisch abgebautes Casein 3g pankreatisch abgebautes Soja 2,5g Dextrose 5g Natriumchlorid 2,5g Dikaliumphosphat 3g Yeast Extract (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 7 einstellen
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Wachstumsmedium M472 nach DSMZ für M. furfur 40g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 20g Ochsengalle (Merck, Darmstadt, Deutschland) 10g Tween40 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) auffüllen auf 1 Liter,
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert. Anschließend wurden 2 ml Olivenöl (sterilfiltriert) hinzugegeben.
Wachstumsmedium MEP nach DSMZ für T. rubrum 30g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 3g Sojapepton (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) auffüllen auf 1 Liter, pH 5,6 einstellen Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen:
Für S. aureus und S. epidermidis wurden 5 ml Medium mit dem Mikroorganismus beimpft und über Nacht bei 37°C und 200 rpm inkubiert.
Für M. furfur wurden 5 ml Medium wurden mit dem Mikroorganismus beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm inkubiert
Für T. rubrum wurde eine bewachsene Agarplatte mit 5 ml Medium abgespült. Von der erhaltenen Suspension wurden 10 μl auf 1 ml MEP-Medium gegeben und direkt in das Experiment eingesetzt. 1 ,5 ml Reaktionsgefäße wurde mit je 1 ml Medium befüllt und mit der pilzlichen bzw. bakteri- eilen Suspension der Übernachtkultur so beimpft, dass die erhaltene Suspensionen zu Beginn des Experiments auf eine optische Dichte, gemessen bei 600 nm, von 0,1 eingestellt war. Die erhaltene Suspension wurde im Verhältnis 1 :9 (Formulierung: mikrobielle Suspension) mit den Formulierungen gemischt. 1 μl der Kultur wurde nach 5 Minuten und 60 Minuten mit 20 μl Medium verdünnt und anschließend plattiert. Nach Inkubation über 24 Stunden wurden die Kolonien auf den Platten gezählt. Tabelle 21 : Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Formulierung an sich (Oppm) hatte keine wachstumshemmende Wirkung (Daten nicht gezeigt).
Die Ergebnisse zeigen eine wachstumsinhibierende Wirkung der Formulierung mit P18. Für die untersuchten Pilze wurde eine bessere Wirkung beobachtet als für das getestete Bakte- rieum S. epidermidis.
Zusammengefasst bewirkte eine Behandlung mit einer Formulierung, die P18 enthielt, eine bis >300fache Reduktion der Zellzahl. Folglich zeigen die Ergebnisse eine breite antimikrobielle Wirkung des Peptids P18. Es werden Unterschiede für verschiedene Mikroorganismen beobachtet. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Wirkmechanismus von P18 und ZPT deutlich unterscheidet, insbesondere da keine signifikante Wirkung von ZPT über einen nur kurzen Inkubationszeitraum nachgewiesen wurde.
Das Peptid P18 wirkt möglicherweise an der pilzlichen oder bakteriellen Membran, der DNA oder an beiden Wirkorten. Die Wirkung, die bereits nach kurzer Inkubation beobachtet werden kann, deutet auf einen zentralen und für das Überleben der Mikroorganismen essentiellen Wirkort hin, unabhängig vom Wachstum der Mikroorganismen. Während der Wirkung wird das Peptid selbst inaktiviert, möglicherweise durch irreversible Bindung an Membranbestandteile oder relevante Bereiche der DNA.
Beispiel 23: Vergleich der Wirksamkeit von P18 und AFPP auf das Wachstum von Ma- lassezia furfur
WO 00/32220 beschreibt die Wirkung des antifungalen Polypeptids AFPP aus Aspergillus giganteus auf das Wachstum von Malassezia furfur.
Um die Wirkung des P18 (SEQ ID NO. 3; Sequenz: KWKLFKKIPKFLHLAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) mit der Wirkung von AFPP zu vergleichen, wurde AFPP aus dem Kulturüberstand des A. giganteus Stamms CBS 526.65 bereitgestellt (Organobalance, Berlin). Die Rei- nigung erfolgte nach Theis et al. (Theis T., Wedde M., Meyer V., Stahl U. (2003) The anti- fungal protein from Aspergillus giganteus causes membrane permeabilization. Antimicrob. Agents Chemother. 47:588-593; Theis T., Marx F., Salvenmoser W., Stahl U., Meyer V. (2005) New insights into the target site and mode of action of the antifungal protein (AFP) of Aspergillus giganteus. Res Microbiol. 156:47-56.) Nach Umpufferung und Konzentrierung wurde eine 2%ige (w/w) AFPP Lösung in Phosphatpuffer (10 mM NaPhosphat, pH 7,5, 100 mM NaCI) erhalten. Die Reinigung wurde durch eine N-terminale Sequenzierung bestätigt, eine HPLC-Analyse ergab eine Reinheit der AFPP- Lösung von größer 99 %. Auch das P18 Konzentrat lag als 2%ige (w/w) Lösung in Phosphatpuffer vor. Die Experimente zum Vergleich beider Peptide wurden folgendermaßen durchgeführt: Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland)
40g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 20g Ochsengalle (Merck, Darmstadt, Deutschland)
10g Tween40 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland)
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum Medium wurde mit M. furfur DSM 6170 (DSMZ) beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert.
Pro Testansatz wurde ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß mit Pityrosporum Medium befüllt und mit der M. furfur Übernachtkultur zu einer Start-OD von 0,1 , gemessen bei 600 nm, beimpft.
Das Wachstum der folgenden Testansätze wurde kontrolliert:
M. furfur Suspension und Zugabe von 30 μl Phosphatpuffer (um einen Einfluss des Phosphatpuffers auf die Wirkung der aktiven Peptide bei einer finalen Konzentration von 0,1 % auszuschließen) - M. furfur Suspension und Zugabe von 60 μl Phosphatpuffer (um einen Einfluss des
Phosphatpuffers auf die Wirkung der aktiven Peptide bei einer finalen Konzentration von 0,2 % auszuschließen)
M. furfur Suspension und Zugabe von 90 μl Phosphatpuffer (um einen Einfluss des Phosphatpuffers auf die Wirkung der aktiven Peptide bei einer finalen Konzentration von 0,3 % auszuschließen)
M. furfur Suspension mit einer finalen P18 Konzentration von 0,1 % im Reaktionsvolumen
M. furfur Suspension mit einer finalen P18 Konzentration von 0,2 % im Reaktionsvolumen M furfur Suspension mit einer finalen P18 Konzentration von 0 3 % im Reaktionsvolumen
M furfur Suspension mit einer finalen AFPP Konzentration von 0,1 % im Reaktionsvolumen - M furfur Suspension mit einer finalen AFPP Konzentration von 0,2 % im Reaktionsvolumen
M furfur Suspension mit einer finalen AFPP Konzentration von 0,3 % im Reaktionsvolumen
Das Reaktionsvolumen betrug jeweils 600 μl Das Wachstum von M furfur in den Testan- satzen wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden beobachtet Dazu wurden die Ansätze nach 5 Minuten 20 Minuten und 24 Stunden in M472 Medium 1 10 verdünnt, und anschließend wurden 10 μl plattiert Die CFU (colony forming units) wurde nach 6 Tagen Inkubation bei 300C durch Auszahlung bestimmt Die Experimente erfolgten in Doppelbestimmung und wurden unabhängig mindestens einmal wiederholt Em signifikanter Einfluss des Phosphatpuffers auf das Wachstum wurde nicht beobachtet
Tabelle 22 Zahlung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Stan- dardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von P18 im beobachteten Zeitraum die CFU deutlich stärker reduzierte als vergleichbare Konzentrationen von AFPP. Das zeigt, dass durch die Zugabe von P18 eine bessere Wachstumsinhibition von M. fυrfur im Vergleich zu AFPP erreicht wird und P18 daher wirksamer ist.
Beispiel 24: Vergleich der Wirksamkeit von P18 und AFPP auf das Wachstum von Ma- lassezia fυrfur in einer Shampooformulierung Um die Wirksamkeit von AFPP im Vergleich zu P18 (SEQ ID NO. 3; Sequenz: KWKLFKKI PKFLH LAKKF-NH2(Bachem AG, Schweiz)) in einer Shampooformulierung zu untersuchen, wurde das in Beispiel 24 beschriebene Experiment mit einer Shampooformulierung wiederholt. Es wurde folgendermaßen vorgegangen: Beide Peptide lagen als 2%ige (w/w) Lösungen in Phosphatpuffer (10 mM NaPhosphat, pH 7,5, 100 mM NaCI) vor. Es wurde folgende Formulierung verwendet:
Tabelle 23: Zusammensetzung der verwendeten Shampooformulierung
Handelsname INCI %
Phase A
I Plantacare 818 UP Coco Glucoside 15,00 I
Tween 20 Polysorbate 20 5,00
Plantacare 2000 Decyl Glucoside 5,00
Genapol L3 Laureth-3 2,00
Millipore-Wasser Aqua 69,50
Citronensäure (50%ige Lösung) Sodium Chloride q.s.
Phase B
Stepan PEG 6000 DS PEG-150 3,00
Distearate flüssig Herstellung :
Die Komponenten der Phase A einwiegen und lösen. Den pH-Wert auf 6-7 einstellen. Phase B zugeben und auf ca. 500C erwärmen. Unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen.
Zu der Shampooformulierung wurde Peptidlösung mit einer Endkonzentration von 0,1 % und 0,2 % gegeben. Die erhaltenen Formulierungen wurden über 16 Stunden gerührt, um homogene Lösungen zu erhalten. Ebenso wurde mit äquivalenten Volumina des Phosphatpuffers vorgegangen, um einen Einfluss des Phosphatpuffers auf das Testergebnis auszuschließen.
Anschließend wurde folgendermaßen vorgegangen: Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ:
40g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 20g Ochsengalle (Merck, Darmstadt, Deutschland) 10g Tween40 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland)
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert.
2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporum
Medium wurde mit M. furfur DSM 6170 (DSMZ) beimpft und über Nacht bei 300C und
200 rpm schüttelnd inkubiert.
Pro Testansatz wurde ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß Pityrosporum Medium befüllt und mit der M. furfur Übernachtkultur zu einer Start-OD von 0,1 , gemessen bei 600 nm, beimpft.
Das Wachstum der folgenden Testansätze wurde kontrolliert:
M. furfur Suspension und Zugabe von Phosphatpuffer in Shampooformulierung äquivalent zu den Volumina, die mit Peptid-Shampoolösung hinzugegeben wurden (um einen Einfluss des Phosphatpuffers auf die Wirkung der aktiven Peptide bei Konzentration in der Shampooformulierung von 0,1 % bzw. 0,2 % auszuschließen) M. furfur Suspension und Shampooformulierung mit einer P18 Konzentration von 0,1%
M. furfur Suspension und Shampooformulierung mit einer P18 Konzentration von 0,2
% - M. furfur Suspension und Shampooformulierung mit einer AFPP Konzentration von
0,1 %
- M. furfur Suspension und Shampooformulierung mit einer finalen AFPP Konzentration von 0,2 %
Das Verhältnis der Shampooformulierung zum M. furfur Kulturmedium war in allen Testansätzen 1:10 (Shampooformulierung: M. furfur Kulturmedium). Das Reaktionsvolumen betrug 1 ml.
Das Wachstum von M. furfur in den Testansätzen wurde über einen Zeitraum von 20 Minuten beobachtet. Dazu wurden die Ansätze nach 10 Minuten und 20 Minuten im Verhältnis 1:10 in M472 Medium verdünnt und anschließend wurden 10 μl plattiert. Die CFU (colony forming units) wurde nach 6 Tagen Inkubation bei 300C durch Auszählung bestimmt. Die Experimente erfolgten in Doppelbestimmung und wurden unabhängig mindestens einmal wiederholt. Ein signifikanter Einfluss des Phosphatpuffers auf das Wachstum von M. furfur wurde nicht beobachtet. Die Zugabe der Formulierung ohne aktives Peptid bewirkte bereits eine Reduzierung der CFU.
Tabelle 24: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass die Zugabe von Shampooformulierungen, die steigende Konzentrationen P18 enthielten, im beobachteten Zeitraum die CFU deutlich stärker reduzierte als vergleichbare Formulierungen mit steigenden AFPP-Konzentrationen. Das zeigt, dass durch die Zugabe von P18 eine bessere Wachstumsinhibition von M. furfur im Vergleich zu AFPP erreicht wird und P18 daher wirksamer ist.
Beispiel 25: Vergleich der Wirksamkeit von weiteren erfindungsgemäßen Peptiden und
AFPP auf das Wachstum von Malassezia furfur
Um die Wirkung anderer erfindungsgemäßer Peptide mit der Wirkung des antifungalen Polypeptids AFPP aus Aspergillus giganteus auf das Wachstum von Malassezia furfur zu ver- gleichen, wurde folgendermaßen vorgegangen:
Als Vergleich wurden die Peptidvarianten mit SEQ ID NO. 4726 (Sequenz: FKKALHLFK- PIKKFLKWK-NH2(Bachem AG, Schweiz)) und SEQ ID NO. 4727 (Sequenz: KFLHLAKKFPKWKLFKKI-NH2(Bachem AG, Schweiz)) gewählt. Die Peptid- und AFPP- Konzentrate lagen als 2%ige (w/w) Lösungen in Phosphatpuffer (10 mM NaPhosphat, pH 7,5, 10O mM NaCI) vor.
Die Experimente zum Vergleich der Peptide wurden folgendermaßen durchgeführt:
Wachstumsmedium: M472 Pityrosporum Medium nach DSMZ
40g Malzextrakt (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) 20g Ochsengalle (Merck, Darmstadt, Deutschland) 10g Tween40 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland)
Die Komponenten wurden bei 1210C, 1 bar Überdruck für 20 Minuten sterilisiert. 2 g/L Olivenöl (wurde sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren der anderen Komponenten dazugegeben)
Für Agarplatten wurde 15 g/L Agar-Agar zum Medium gegeben.
Der Wachstumstest erfolgte folgendermaßen: Eine Schüttelkultur mit M472 Pityrosporυm Medium wurde mit M. furfur DSM 6170 (DSMZ) beimpft und über Nacht bei 300C und 200 rpm schüttelnd inkubiert. Pro Testansatz wurde ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß mit Pityrosporum Medium befüllt und mit der M. furfur Übernachtkultur zu einer Start-OD von 0,1 , gemessen bei 600 nm, beimpft.
Das Wachstum der folgenden Testansätze wurde kontrolliert:
- M. furfur Suspension und Zugabe von 90 μl Phosphatpuffer (um einen Einfluss des Phosphatpuffers auf die Wirkung der aktiven Peptide bei einer finalen Konzentration von 0,3 % auszuschließen)
M. furfur Suspension mit einer finalen Konzentration der erfindungsgemäßen Peptid- variante mit der SEQ ID NO. 4726 von 0,3 % im Reaktionsvolumen
M. furfur Suspension mit einer finalen Konzentration der erfindungsgemäßen Peptid- Variante mit der SEQ ID NO. 4727 von 0,3 % im Reaktionsvolumen
M. furfur Suspension mit einer finalen AFPP Konzentration von 0,3 % im Reaktionsvolumen.
Das Reaktionsvolumen betrug jeweils 600 μl. Das Wachstum von M. furfur in den Testan- Sätzen wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten beobachtet. Dazu wurden die Ansätze nach 10minütiger Inkubation in M472 Medium 1 :10 verdünnt, und anschließend wurden 10 μl plattiert. Die CFU (colony forming units) wurde nach 6 Tagen Inkubation bei 30βC durch Auszählung bestimmt.
Die Experimente erfolgten in Doppelbestimmung und wurden unabhängig wiederholt. Ein signifikanter Einfluss des Phosphatpuffers auf das Wachstum wurde nicht beobachtet. Tabelle 25: Zählung der Colony Forming Units (CFU) (gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Experimente)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe der erfindungsgemäßen Peptidvarianten im beobachteten Zeitraum die CFU deutlich stärker reduzierte als vergleichbare Konzentrationen von AFPP. Das zeigt, dass durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Peptidvarianten eine bessere Wachstumsinhibition von M. furfur im Vergleich zu AFPP erreicht wird und die erfindungsgemäßen Peptidvarianten daher wirksamer ist.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger ein Peptid, das wenigstens ein Sequenzmotiv folgender allgemeiner For- mel I
HeM - HB -Heß (I)
umfasst, worin HB 1 bis 5 zusammenhängende Aminosäurereste umfasst und für ein Teilsequenzmotiv mit der Funktion eines Helixbrechers steht, und HeM und Hel2 gleiche oder verschiedene Teilsequenzmotive sind, die jeweils 5 bis 15 zusammenhängende Aminosäurereste umfassen, die im Wesentlichen aus hydrophilen und von Prolin verschiedenen hydrophoben Resten ausgewählt sind, und jeweils zur Ausbildung eines alpha-Helix-Arms befähigt sind, wobei wenigstens einer der Helix-Arme in seiner axialen Projektion eine unvollständige Trennung in eine hydrophobe und hydrophile Helixhälfte aufweist.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger ein Peptid, das wenigstens ein Sequenzmotiv folgender allgemeiner Formel I
HeM - HB -Heß (I)
umfasst, worin
HB 1 bis 5 zusammenhängende Aminosäurereste umfasst und für ein Teilsequenzmotiv mit der Funktion eines Helixbrechers steht, und HeM und Hel2 gleiche oder verschiedene Teilsequenzmotive sind, die jeweils 5 bis 15 zusammenhängende Aminosäurereste umfassen, die im Wesentlichen aus hydrophilen, und von Prolin verschiedenen hydrophoben Resten ausgewählt sind, und jeweils zur Ausbildung eines alpha-Helix-Arms befähigt sind, wobei das Peptid einen prozentualen alpha-Helizitätswert von etwa 7 bis 98%, in 50% (v/v) Trifluorethanol, pH 7,0, oder etwa 8 bis 60 % in 3OmM SDS, ph 7.0, jeweils bestimmt durch CD-Spekrometrie aufweist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in einem pharmazeutischen Träger mindestens ein Peptid mit einer Sequenz oder einem repetitiven Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO: 1 :
Xi X2K X3 X4 X5KIP Xio KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO:1 )
worin
X-io für eine Peptidbindung oder ein oder zwei beliebige basische oder hydrophobe Aminosäurereste oder ein oder zwei Prolinreste steht und Xi bis X9 beliebige basische oder von Prolin verschiedene hydrophobe Aminosäureresten bedeuten; wobei die repetitiven Sequenzmotive gleich oder verschieden sein können; und/oder Mutanten oder Derivate davon.
4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend mindestens ein Peptid mit einer Sequenz oder einem repetitiven Sequenzmotiv gemäß SEQ-ID NO: 2:
X1 X2K X3 X4 X5KIP Xn Xi2 KFX6X7 X8 AX9KF (SEQ ID NO: 2) worin
X1 für Lysin, Arginin oder Phenylalanin,
X2 für Lysin oder Tryptophan,
X3 für Leucin oder Lysin,
X4 für Phenylalanin oder Leucin, X5 für Leucin oder Lysin,
X6 für Leucin oder Lysin,
X7 für Histidin oder Lysin,
Xs für Alanin, Leucin, Valin oder Serin,
X9 für Leucin oder Lysin, Xn für Prolin oder eine chemische Bindung, und
X12 für Prolin oder eine chemische Bindung steht,
wobei die repetitiven Sequenzmotive gleich oder verschieden sind; und/oder Mutanten oder Derivate davon .
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, enthaltend ein Peptid mit einer Sequenz oder einem repetitiven Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO: 3 KWKLFKKIPKFLHLAKKF (SEQ ID NO: 3)
und/oder eine Mutante oder Derivat davon.
6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend ein Peptid mit einem repetitiven Sequenzmotiv, wobei eine Mehrzahl von Peptiden der allgemeine Formel I oder gemäß SEQ ID NO: 1 , 2 oder 3 oder Varianten o- der Derivate davon über Linkergruppen miteinender peptidisch verknüpft sind.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Linker 1 bis 10 zusammenhängende gleiche oder verschieden Aminosäurereste, vorzugsweise ausgewählt un- ter Alanin, Glycin, Threonin und Serin, umfassen.
8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die C- terminale Carboxylgruppe des Peptids amidiert ist.
9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend wenigstens ein Peptid nach obiger Definition, das eine minimale inhibitorische Konzentration gegenüber Malassezia furfur im Bereich von etwa 1500 bis 0,1 μM, bestimmt unter Standardbedingungen aufweist.
10. Zusammensetzung, enthaltend ein Fusionsprodukt aus mindestens einem pharmazeutischen Hilfs- oder Wirkstoff und mindestens einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
1 1 . Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich ent- haltend mindestens einen weiteren pharmazeutischen Wirkstoff.
12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend wenigstens einen antiinflammatorischen Wirkstoff.
13. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend einen antimikrobiellen Wirkstoff zur Hemmung des Wachstums und/oder der Aktivität unerwünschter Keime.
14. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend einen Sebum-regulierenden Wirkstoff.
15. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptid in einem Anteil von 0,0001 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der fertigen Zusammensetzung, enthalten ist.
16. Peptid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Fusionspoly- peptid nach Anspruch 10, gegebenenfalls in Kombination mit wenigstens einem weiteren antifungalen oder antibakteriellen Wirkstoff, zur Verwendung als Medikament.
17. Peptid oder Fusionspeptid nach Anspruch 16 zur Behandlung von Mykosen.
18. Peptid oder Fusionspeptid nach Anspruch 16 zur Behandlung von Dermatomykosen.
19. Peptid oder Fusionspeptid nach Anspruch 16 zur Behandlung von bakteriellen Infektionen der Haut, Nägel, Haare oder der Schleimhäute
20. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei man ein Peptid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 10 zusammen mit mindestens einem üblichen pharma- zeutischen Hilfsstoff und gegebenenfalls weiteren pharmazeutischen Wirkstoffen zur gewünschten Verabreichungsform formuliert.
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