JP2018148798A - コプティス・ジャポニカの水耕栽培方法及び水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法 - Google Patents
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Abstract
Description
セリバオウレンの不定胚培養物の塩基配列解析:
セリバオウレンのベルベリンの生合成経路における鍵酵素の一つであるCj4'OMTをコードする遺伝子のゲノムDNA(Cj4'OMTg)の種間多型を、以下のようにして調べた。
セリバオウレンの由来の全て異なる不定胚培養物4クローン(クローン1、2、3、4)をサンプルとした。
セリバオウレンの4’OMT遺伝子間で保存されている領域について設計したプライマー、Cj4’OMT-668S(センスプライマー、sense primer)及びCj4’OMT-801A(アンチセンスプライマー、antisense primer)のセット(配列番号4および5)を用い、ゲノムDNAを鋳型に、Cj4’OMTg遺伝子の増幅を行った。PCR条件は表1に示す。各プライマーの最終濃度は、1 μMとした。
塩基配列の解析にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI)を用いたサイクルシーケンシング法を適用し、 ABI PRISM 3130-Avant DNA sequencer、80 cm キャピラリー、POP-7ポリマー(ABI)により解析を行った。得られた塩基配列データは、DNASIS V3.7 (Hitachi software)、FinchTV (Geospiza Inc.)、BioEdit ver. 7.1.11を用い解析し、分子系統樹解析にはTreeView (1.6.6)を使用した。
全てのセリバオウレン不定胚培養物でCj4'OMTgが増幅された。Cj4'OMTg塩基配列解析の結果、Cj4'OMTgの多型はType I、Type IIa、Type IIb、Type IIIa、Type IIIb、Type IIIc、Type IIIdの7種であった。これらの出現頻度はクローン1でType I : Type IIIb (5 : 2)、クローン2では、Type IIa : Type IIIa : Type IIIc : Type IIId (3 : 3 : 1 : 1)、クローン3では、Type IIIa : Type IIIc (6 : 1)、クローン4では、Type IIa : Type IIb : Type IIIb (3 : 2 : 3)であった。
セリバオウレンの水耕栽培:
由来の異なるセリバオウレン(A株:14株、B株:6株、C株:16株)の苗(2〜5g程度)を定植し、7か月間、水耕栽培した。水耕栽培の条件は以下の通りである。
栽培条件:非閉鎖温室 設定温度20℃、16時間明期、湿度60%
栽培装置:底面潅水方式水耕栽培装置
栽培支持体:パミス 特小粒 粒度2.4〜5.0 mm(大江化学工業製)
養液:OATハウス1号(OATアグリオ製)0.1875g/l+OATハウス2号(OATアグリオ製)0.125/l、pH5.7、EC 0.37mS/cm
Type I遺伝子用プライマーの設計:
実施例1の結果から、Type I遺伝子を有するセリバオウレンが、水耕栽培に適していることが判明した。このType I遺伝子を有するセリバオウレンを鑑別できるように、Type I遺伝子に特有のプライマーを設計した(配列番号2および3)。これらのプライマーと、GoTaq Green Master Mix(Promega製)を用い、各サンプルのType I遺伝子の増幅を行った。PCR条件は表3に示す。各プライマーの最終濃度は、0.42 μMとした。結果を図1に示した。
Type I遺伝子を有さないセリバオウレン2種、Type I遺伝子を有さないセリバオウレン2種、Type I遺伝子を有さないコセリバオウレン、Type I遺伝子を有さないキクバオウレン、Type I遺伝子を有さないC.chinensis、Type I遺伝子を有するセリバオウレンを用いた。
Type I遺伝子を有するセリバオウレンの栽培:
参考例1においてType I遺伝子を有するオウレン株の葉柄から誘導した不定胚培養由来のType I遺伝子を有するセリバオウレンの苗(平均生質量1.93g)を、以下の条件で土耕栽培または水耕栽培し、栽培189日後に生薬の原料となる根茎の質量を凍結乾燥機で乾燥後、測定した。その結果を表4に示した。また、土耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を図2に、水耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を図3に示した。
3寸鉢:赤玉土:培養土(クレハ製):堆肥=3:1:1
肥料:ハイポネックス6-10-5(ハイポネックスジャパン製) 500倍液を週1回散布
栽培条件:閉鎖温室 20℃、16時間明、湿度60%
栽培装置:フィールド水耕栽培装置(エスペックミック製)
栽培ベッド:ココピート(エスペックミック製)
養液:111日まで:マツザキ1号(マツザキアグリビジネス製)0.38g/l+マツザキ2号(マツザキアグリビジネス製)0.25/l、pH6.0、EC 0.73mS/cm
112日以降:マツザキ1号(マツザキアグリビジネス製)0.19g/l+マツザキ2号(マツザキアグリビジネス製)0.13/l、pH5.6、EC 0.32mS/cm
Claims (7)
- 配列番号1で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカ(Coptis japonica)を、水耕栽培することを特徴とするコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法。
- コプティス・ジャポニカが、セリバオウレンである請求項1に記載のコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法。
- コプティス・ジャポニカから、配列番号1で示されるType I遺伝子を検出することを特徴とする水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法。
- 配列番号1で示されるType I遺伝子の検出にあたり、配列番号2および3に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅プライマーを用いるものである、請求項3に記載のコプティス・ジャポニカの選抜方法。
- コプティス・ジャポニカが、セリバオウレンである請求項3または4に記載の水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法。
- 配列番号1で示されることを特徴とするType I遺伝子。
- 配列番号2または3に記載のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするType I遺伝子増幅用プライマー。
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