JP2018134027A

JP2018134027A - 蛍光物質の製造方法

Info

Publication number: JP2018134027A
Application number: JP2017030189A
Authority: JP
Inventors: 範之岩淵; Noriyuki Iwabuchi; 寛松藤; Hiroshi Matsufuji; 道夫砂入; Michio Sunairi; 優稀坂野; Yuki Sakano; 実夏遠藤; Mika Endo
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-08-30
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: JP6813885B2

Abstract

【課題】固体状態でも蛍光を発する新規有機蛍光物質を製造する技術を提供する。【解決手段】シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する培地で培養する工程を含む、蛍光物質の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光物質の製造方法、蛍光物質を生産する微生物、及び蛍光物質に関する。

有機蛍光材料は、多彩で鮮やかな発色性、優れた加工性に加え、検出感度が高く、分子設計により種々の機能付加が可能であることから優れた化学素材として期待されている。その用途は幅広く、照明、発光素子、蛍光塗料、トレーサー、診断薬、試薬等、種々の分野への利用が見込まれる。

有機蛍光材料は、溶液状態で蛍光を発する化合物は多く知られているが、固体状態で蛍光を発する化合物は限られている。そのため、照明や有機ＥＬ等の固体状態で蛍光を発することが求められる分野への応用は進んでいない。

一方、本発明者らは、低分子リグニンの一種であるシリングアルデヒド（Ｓｙｒｉｎｇａｌｄｅｈｙｄｅ：ＳＹＡＬ）を有機緑色蛍光物質に変換する微生物として、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−ＳＡ−１株を単離している（特許文献１、非特許文献１）。ＩＴＨ−ＳＡ−１株により生産される蛍光物質は、芳香環を有さないという特徴を有するが、固体状態では蛍光を発しない。

特開２０１４−１６６１４３号公報

Iwabuchi N., et al., "Transformation of Lignin-Derived Aromatics into Nonaromatic Polymeric Substances with Fluorescent Activities (NAPSFA) by Pseudomonas sp. ITH-SA-1", ACS Sustainable Chem. Eng., vol.3, p2678-2685, 2015.

固体状態で蛍光を発する有機発光材料は限られており、固体状態でも蛍光を発する新規有機蛍光物質の開発が求められる。

本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、固体状態でも蛍光を発する新規有機蛍光物質を製造する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
［１］シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する培地で培養する工程を含む、蛍光物質の製造方法。
［２］前記培地が、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩以外の有機物をさらに含有する、［１］に記載の蛍光物質の製造方法。
［３］前記培養する工程の後に、前記培養後の培地から蛍光物質を抽出する工程を、さらに含む［１］又は［２］に記載の蛍光物質の製造方法。
［４］前記蛍光物質が芳香環を有しない、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の蛍光物質の製造方法。
［５］前記蛍光物質が、固体状態及び液体状態のいずれの状態でも蛍光を発生する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の蛍光物質の製造方法。
［６］シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）。
［７］シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する培地で培養することによって生成される、蛍光物質。

本発明によれば、固体状態でも蛍光を発する新規有機蛍光物質を製造する技術が提供される。

シュードモナス・エスピーＩＴＨ−Ｂ５２株（ＩＴＨ−Ｂ５２株）の電子顕微鏡写真である。ＩＴＨ−Ｂ５２株をシリングアルデヒド（ＳＹＡＬ）を含む培地で培養することにより得られた蛍光物質（本蛍光物質）のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルデータである。本蛍光物質の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ（上図）及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータ（下図）である。本蛍光物質の液体状態での蛍光強度を、シュードモナス・エスピーＩＴＨ−ＳＡ−１株により生産された蛍光物質（ＳＡ−１蛍光物質）と比較した写真である。図中、「ＳＡ−１」はＳＡ−１蛍光物質を示し、「Ｂ５２」は本蛍光物質を示す。本蛍光物質の固体状態での蛍光強度を、ＳＡ−１蛍光物質と比較した写真である。図中、「ＳＡ−１」はＳＡ−１蛍光物質を示し、「Ｂ５２」は本蛍光物質を示す。ＩＴＨ−Ｂ５２株をＳＹＡＬを含有する培地で培養した培養上清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析スペクトルデータである（Ｂ）。Ａは、無菌コントロールのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析スペクトルデータである。

［蛍光物質の製造方法］
１実施形態において、本発明は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する培地で培養する工程を含む、蛍光物質の製造方法を提供する。

（シュードモナス・エスピーＩＴＨ−Ｂ５２株）
本実施形態の蛍光物質の製造方法では、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）（以下、「ＩＴＨ−Ｂ５２株」という。）を用いることができる。なお、１実施形態において、本発明は、ＩＴＨ−Ｂ５２株もまた提供する。

ＩＴＨ−Ｂ５２株は、日本国岩手県釜石市平田湾で採取された海水から単離された微生物である。ＩＴＨ−Ｂ５２株は、２０１７年２月１７日付で、受託番号ＮＩＴＥＰ−０２４１２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。

ＩＴＨ−Ｂ５２株は、好気性の桿菌であり、鞭毛は確認されていない（図１参照）。ＩＴＨ−Ｂ５２株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析の結果より、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に分類された。ＩＴＨ−Ｂ５２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を配列番号１に示す。

ＩＴＨ−Ｂ５２株は、シリングアルデヒド（Ｓｙｒｉｎｇａｌｄｅｈｙｄｅ：ＳＹＡＬ）又はシリンガ酸（ＳｙｒｉｎｇｒｉｃＡｃｉｄ：ＳＹＡＣ）を含有する培地で培養することにより、後述する蛍光物質（以下、「本蛍光物質」という。）を生成するという特徴を有する。

（ＩＴＨ−Ｂ５２株の変異株）
本実施形態の蛍光物質の製造方法では、ＩＴＨ−Ｂ５２株に替えて、又はＩＴＨ−Ｂ５２株と共に、ＩＴＨ−Ｂ５２株の変異株を用いてもよい。ここで「変異株」とは、自然発生的又は人為的に、元の菌株の遺伝子に変異が生じた菌株を意味する。遺伝子変異を生じさせる人為的手法は、特に限定されず、紫外線照射、放射線照射、亜硝酸などによる化学的処理、遺伝子導入などの遺伝子工学的手法等を例示することができる。なお、本明細書において、「ＩＴＨ−Ｂ５２株の変異株」とは、ＩＴＨ−Ｂ５２株の遺伝子に変異が生じた菌株であって、ＩＴＨ−Ｂ５２株の蛍光物質生成能を維持した菌株（本蛍光物質の生成能を有する菌株）を指す。ここで、「ＩＴＨ−Ｂ５２株の蛍光物質生成能」とは、ＳＹＡＬ又はＳＹＡＣを含有する培地で培養したときに、本蛍光物質を生成する能力を意味する。

（培地）
本実施形態の蛍光物質の製造方法で用いる培地（以下、「本培地」という。）は、ＳＹＡＬ、ＳＹＡＣ、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物（以下、「ＳＹＡＬ等」と略記することがある。）を含有する培地である。

ＳＹＡＬ及びＳＹＡＣは、いずれも公知の物質であり、市販品を入手可能である。また、ＳＹＡＬ及びＳＹＡＣは、公知の化学合成法により合成してもよい。例えば、ＳＹＡＬは、ジメトキシフェノールからダフ反応等によって合成してもよく、ＳＹＡＣは、ＳＹＡＬから酸化反応等によって合成してもよい。

ＳＹＡＬの塩は、ＳＹＡＬを塩基と反応させることによって得ることができる。同様に、ＳＹＡＣの塩は、ＳＹＡＣを塩基と反応させることによって得ることができる。ＳＹＡＬの塩及びＳＹＡＣの塩は、特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；トリエチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩等の第一級、第二級又は第三級アミン塩等を例示することができる。

ＳＹＡＬ等は、それぞれ単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なお、ＳＹＡＬ及び／又はＳＹＡＣの塩を用いる場合には、１種の塩を単独で用いてもよく、２種以上の塩を併用してもよい。

また、ＳＹＡＬ等は、精製物を用いてもよいが、精製物でなくてもよく、不純物を含むものであってもよい。例えば、ＳＹＡＬ等を含有する混合物を、本培地に含有させることもできる。例えば、ＳＹＡＬ及びＳＹＡＣは、リグニン由来芳香族化合物の分解産物に多く含まれている。そのため、リグニン又はリグニンを含む木質材料等の化学分解産物又は生物分解産物等を、ＳＹＡＬ等の供給源として用いてもよい。

本培地における、ＳＹＡＬ等の濃度は、ＩＴＨ−Ｂ５２株又はその変異株が生存できる濃度であれば、特に限定されない。例えば、バッチ培養とする場合、ＳＹＡＬ等の初期濃度（培養開始時の濃度）としては、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬを挙げることができる。また、本蛍光物質の生成効率が良好なＳＹＡＬ等の初期濃度としては、１〜３０ｍｇ／ｍＬを例示することができる。また、流加培養又は連続培養とする場合、ＳＹＡＬ等の維持濃度として、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜３０ｍｇ／ｍＬを例示することができる。

本培地は、ＳＹＡＬ等に加えて、ＳＹＡＬ等以外の成分（以下、「他の培地成分」という。）を含有していてもよい。他の培地成分は、特に限定されず、一般的な好気性細菌の培地に用いられる成分を用いることができる。他の培地成分としては、ＳＹＡＬ等以外の有機物、無機塩類、水等を例示することができるが、これらに限定されない。

本培地は、他の培地成分として、ＳＹＡＬ等以外の有機物をさらに含有していることが好ましい。本培地が、他の有機物を含有することにより、本蛍光物質の生成効率を上げることができる。ＳＹＡＬ等以外の有機物は、特に限定されず、一般的な好気性細菌の培地に用いられる有機物を用いることができる。他の有機物としては、アミノ酸、アミノ酸誘導体などのアミノ酸類；ペプチド、ペプチド誘導体などのペプチド類；ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、核酸、核酸誘導体などの核酸類；クエン酸などの有機酸；モノアミン、ジアミンなどのアミン類；単糖、オリゴ糖、多糖などの糖類；ペプトン、トリプトン、カザミノ酸などのタンパク質分解物；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキスなどのエキス類等を挙げることができるが、これらに限定されない。ＳＹＡＬ等以外の有機物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

ＳＹＡＬ等以外の有機物を用いる場合、本培地におけるＳＹＡＬ等以外の有機物の濃度は、特に限定されず、一般的な好気性従属栄養細菌の培地に用いられる有機物濃度を用いることができる。例えば、バッチ培養とする場合、ＳＹＡＬ等以外の有機物の初期濃度として、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍＬ等を挙げることができる。また、流加培養又は連続培養とする場合、ＳＹＡＬ等以外の有機物の維持濃度として、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍＬ等を挙げることができる。
なお、グルコース等の糖類（単糖、オリゴ糖）の濃度が高いと、本蛍光物質の生成が抑制される傾向にあることから、本培地中の糖類濃度は、３．５ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。

本培地は、液体培地であっても、寒天培地やゼラチン培地等の固体培地であってもよいが、培養後に本蛍光物質を回収しやすいことから、液体培地であることが好ましい。

本培地は、例えば、水にＳＹＡＬ等を溶解し、適宜他の培地成分を添加することにより、作製することができる。また、本培地は、市販の細菌培養用培地に、ＳＹＡＬ等を添加することによっても、作製することができる。市販の細菌培養用培地の例としては、マリンブロス培地、ＬＢ培地、マリンアガー培地等を挙げることができるが、これらに限定されない。

（培養工程）
本実施形態の蛍光物質の製造方法は、ＩＴＨ−Ｂ５２株又はその変異株（以下、まとめて「ＩＴＨ−Ｂ５２株等」と略記する場合がある。）を、本培地で培養する工程（以下、「本培養工程」という。）を含む。

本培養工程における培養方法は、特に限定されず、好気性細菌の培養に一般的に用いられる方法を用いることができる。ＩＴＨ−Ｂ５２株は、好気性細菌であるため、本培養工程は好気的条件化で行うことが好ましい。本培養工程は、静置培養、振とう培養のいずれで行ってもよいが、培地への空気供給の観点から、振とう培養であることが好ましい。なお、静置培養とする場合には、ポンプ等を使用して、適時培地に空気を供給してもよい。

本培養工程は、バッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法で行ってもよい。また、本培養工程において、ＩＴＨ−Ｂ５２株等は、フリーの菌体を用いてもよいが、適切な担体に固定化したものを用いてもよい。ＩＴＨ−Ｂ５２株等を担体に固定化する場合、担体は、特に限定されず、バイオリアクタ等で利用されている公知の担体を使用することができる。担体の例としては、セルロース、デキストラン、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、寒天などの多糖類；コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質類；イオン交換樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、エポキシ樹脂、光硬化性樹脂、ポリエステル、ポリスチレン、ポリウレタンなどの合成樹脂；セラミクス、多孔性硝子などの無機物等を挙げることができるが、これらに限定されない。ＩＴＨ−Ｂ５２株等の担体への固定化方法は、バイオリアクタ等で一般的に用いられる微生物固定化方法を用いることができる。

本培養工程における培養温度は、ＩＴＨ−Ｂ５２株等が増殖可能な温度であれば、特に限定されない。培養温度としては、例えば、４〜３７℃を例示することができる。また、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の増殖が良好な温度条件として、１６〜２８℃を例示することができる。

本培養工程における培養時間は、ＳＹＡＬ等の初期濃度、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の初期接種量、培養方法等に応じて、適宜選択すればよい。例えば、ＳＹＡＬ等の初期濃度を１０ｍｇ／ｍＬとしてバッチ培養する場合、培養時間を４８〜１２０時間とすることができる。また、バッチ培養の場合には、培養液中のＳＹＡＬ等の濃度をモニタリングし、ＳＹＡＬ等が消失するまで培養を行うようにしてもよい。

本培養工程を行うことにより、本培地に含有されるＳＹＡＬ等がＩＴＨ−Ｂ５２株等によって代謝され、本蛍光物質が生成される。このようにして、本実施形態の方法により、本蛍光物質を製造することができる。

（任意工程）
本実施形態の蛍光物質の製造方法は、本培養工程に加えて、本培養工程以外の工程（任意工程）をさらに含んでいてもよい。任意工程は、特に限定されないが、本培養工程の後に、培養後培養物からＩＴＨ−Ｂ５２株等を除去する工程（菌体除去工程）、培養後培地から本蛍光物質を抽出する工程（抽出工程）、本蛍光物質を精製する工程（精製工程）等を例示することができる。なお、「培養後培養物」とは、本培養工程を行った後の、ＩＴＨ−Ｂ５２株等及び本培地の混合物を指す。また、「培養後培地」とは、本培養工程を行った後の本培地を指す。

本培養工程の間、ＩＴＨ−Ｂ５２株等によって生成された本蛍光物質は、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の菌体内から本培地中に分泌される。したがって、培養後培地は、本蛍光物質を含有している。そのため、菌体除去工程を行って、培養後培養物から、不純物としてのＩＴＨ−Ｂ５２株等を除去して培養後培地を取得することにより、より純度の高い本蛍光物質を得ることができる。

菌体除去工程を行う場合、培養後培養物からＩＴＨ−Ｂ５２株等を除去する方法は、本培養工程における培養方法によって、適宜選択すればよい。例えば、液体培養であれば、培養後培養物の遠心分離を行い、遠心上清を採取することによって、培養後培養物からＩＴＨ−Ｂ５２株等を除去することができる。また、フィルター等で培養物をろ過することにより、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の除去を行ってもよい。ろ過によりＩＴＨ−Ｂ５２株等の除去を行う場合、ろ過フィルタ等の孔径は、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の菌体が通過しないサイズであれば特に限定されず、例えば０．０１〜０．５μｍ、好ましくは０．１〜０．３μｍ等を挙げることができる。
また、本培養工程において、担体に固定化したＩＴＨ−Ｂ５２株等を用いた場合には、担体を培養後培養物から物理的に除去することにより、ＩＴＨ−Ｂ５２株等の除去を行うことができる。

菌体除去工程の後は、抽出工程を行って、培養後培地から本蛍光物質を抽出してもよい。抽出工程を行うことにより、より純度の高い本蛍光物質を得ることができる。なお、菌体除去工程を行わず、培養後培養物から直接本蛍光物質を抽出してもよい。

抽出工程を行う場合、培養後培地から本蛍光物質を抽出する方法は、特に限定されず、有機化合物の分離・精製において一般的に用いられる抽出方法を用いることができる。抽出溶媒としては、アルコール、アセトン、エーテル等の有機溶媒を用いることができ、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜５のアルキルアルコール等を用いることが好ましい。

また、抽出工程は、抽出操作の前処理として、培養後培地の脱塩処理、濃縮処理等を含んでいてもよい。培養後培地の脱塩処理は、例えば、透析等により行うことができる。また、培養後培地の濃縮処理は、例えば、常圧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。これらの処理は単独で行ってもよく、２種以上の処理を組み合わせて行ってもよい。また、同じ処理を２回以上行ってもよい。

また、抽出工程は、抽出操作の後処理として、抽出物から抽出溶媒を除去する処理を含んでいてもよい。抽出溶媒の除去は、例えば、常圧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。

抽出工程の具体例としては、培養後培地の透析処理及び減圧乾燥処理の後、メタノールなどのアルコールで抽出を行い、その後、減圧乾燥によりアルコールを除去する方法等を挙げることができる。

抽出工程によって得られた抽出物は、さらに精製工程を行って、本蛍光物質を精製してもよい。精製工程を行うことにより、より純度の高い本蛍光物質を得ることができる。

精製工程を行う場合、本蛍光物質の精製方法は、特に限定されず、有機化合物の分離・精製において一般的に用いられる精製方法を用いることができる。精製方法としては、例えば、洗浄、再結晶、再沈殿、抽出、濃縮、ろ過、ゲルろ過、クロマトグラフィ（薄層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィなど）等を挙げることができるが、これらに限定されない。精製工程では、前記のような精製操作を単独で行ってもよく、２種以上の操作を組み合わせて行ってもよい。また、同じ操作を２回以上行ってもよい。

［本蛍光物質］
１実施形態において、本発明は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する培地で培養することによって生成される、蛍光物質（本蛍光物質）を提供する。

本蛍光物質は、ＩＴＨ−Ｂ５２株等を、本培地で培養することによって生成される蛍光物質であり、上記実施形態の蛍光物質の製造方法により製造することができる。

本蛍光物質は、ＡＴＲ（ＡｔｅｎｕａｔｅｄＴｏｔａｌＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）−フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）及び核磁気共鳴分光法（^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ）により、有機化合物であるものの、芳香環を有しないことが確認されている（図２、図３参照）。従来の有機蛍光物質のほとんどは芳香環を有するものであることから、本蛍光物質は、芳香環を有しないという特徴を有するといえる。なお、本明細書において、「芳香環」とは、芳香族炭化水素環及び芳香族複素環の両方を含む概念である。

ゲルろ過分析により算出された本蛍光物質の数平均分子量は、約７．０ｋＤａである。また、蛍光スペクトル分析により確認された本蛍光物質の励起極大波長及び蛍光極大波長は、励起極大波長が約３５０〜３５５ｎｍ、蛍光極大波長が約５１０ｎｍである。

上記のような本蛍光物質の特性は、本発明者らが以前に単離した蛍光物質生産菌シュードモナス・エスピーＩＴＨ−ＳＡ−１株（以下、「ＩＴＨ−ＳＡ−１株」という。）が生産する蛍光物質（以下、「ＳＡ−１蛍光物質」という。特開２０１４−１６６１４３号公報参照）と類似している。
しかしながら、本蛍光物質は、固体状態でも蛍光を発生し、液体状態ではＳＡ−１蛍光物質よりも強い蛍光を発生するという特徴をする。特に、固体状態で蛍光を発生するという点は、ＳＡ−１蛍光物質には見られない特徴である。したがって、本蛍光物質は、ＳＡ−１蛍光物質とは異なる蛍光物質である。

上記のような本蛍光物質の特徴から、本蛍光物質は、芳香環を有しない蛍光物質であり、かつ、固体状態及び液体状態のいずれの状態でも蛍光を発生する蛍光物質である、ということができる。

本蛍光物質は、照明、発光素子、蛍光塗料、トレーサー、診断薬、試薬等、種々の分野で使用することができる。特に、本蛍光物質は、固体状態でも蛍光を発生することから、固体状態での使用が想定される、照明、発光素子、蛍光塗料、トレーサー等の分野においても幅広く利用することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、本実施例における「数平均分子量」は、特に断りの無い限り、ＨＰＬＣ分析でのピーク面積値のデータを用いて算出したものである。

［実施例１］ＩＴＨ−Ｂ５２株の単離・同定
ＳＹＡＬ含有マリンアガーに海水を塗抹し、色素生産、蛍光生産、脱色等を指標として微生物を単離した。前記海水には、２０１１年５月に日本国岩手県釜石市平田湾で採取したものを用いた。その結果、蛍光物質生産菌としてＩＴＨ−Ｂ５２株を見出した。電子顕微鏡（ＪＳＭ−６３２０Ｆ、日本電子）観察の結果、ＩＴＨ−Ｂ５２株は桿菌であった。また、鞭毛等は観察されなかった。ＩＴＨ−Ｂ５２株の電子顕微鏡写真を図１に示す。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行った結果、ＩＴＨ−Ｂ５２株は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に分類された。ＩＴＨ−Ｂ５２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を配列番号１に示す。

［実施例２］本蛍光物質の製造
マリンブロスに、初期濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＳＹＡＬを添加した培地を作製し、ＩＴＨ−Ｂ５２株をこの培地に添加して、２５℃で９６時間振とう培養を行った。
上記培養によって得られた培養物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）し、遠心上清を取得した。得られた遠心上清を透析（分画分子量３５００、サンプル量の約５倍のミリＱ水に対し、２０℃以下で５〜１０回）し、透析物を４０℃で減圧乾固して、黒色の固形状の濃縮物を得た。
次いで、この濃縮物５ｇに、メタノール４５０ｇを添加し、２５℃で１分間撹拌することにより、黒色の不溶物を含み、液相部分が薄青緑色に蛍光発色する液体を得た。遠心分離（２，０００ｒｐｍ，１５分）後、上澄みを回収し、残った不溶物に対して、メタノールを添加してから上澄みを回収するまでの上記操作をさらに３回繰り返し、回収した上澄みをすべてあわせた。この抽出液を再度減圧乾固し、少量の水に溶解後、凍結乾燥を行い、本蛍光物質の粉末を得た（１．５ｇ）。

また、マリンブロスに替えてＬＢ培地にＳＹＡＬを添加した培地を用いた場合も、同様に、ＩＴＨ−Ｂ５２株による本蛍光物質の生成が確認された。

［実施例３］本蛍光物質の構造解析
（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ解析）
ＡＴＲ−ＦＴＩＲでの構造解析は、フーリエ変換赤外分光光度計（日本分光社製「ＦＴ／ＩＲ−４６００型」、ＡＴＲＰＲＯｏｎｅ（プリズム：ダイアモンド））及び検出器（ＴＧＳ）を用いて、一回反射型ＡＴＲ（ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＴｏｔａｌＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）法で行った。得られたスペクトルは、ＡＴＲ補正を行って得られたものである。分析は、分解４ｃｍ^−１、積算１２８回の条件で行った。また、ＦＴＩＲでは、試料の屈折率を１．５、プリズムの屈折率を２．４とし、入射光の入射角度を４５°に設定して解析を行った。

ＡＴＲ−ＦＴＩＲ解析による本蛍光物質のスペクトルデータを図２に示す。Ｃ＝Ｏに由来するシグナル（１６５０ｃｍ^−１付近）と、Ｏ−Ｈ及びＮ−Ｈに由来するシグナル（３３００ｃｍ^−１付近）が見られ、それ以外のシグナル（ピーク）はブロードであった。また、芳香環に由来するシグナル（９００〜６５０ｃｍ^−１、芳香環のＣ−Ｈ面外変角振動）は検出されなかった。

（^１Ｈ−ＮＭＲ解析、^１３Ｃ−ＮＭＲ解析）
^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析は、日本電子社製「ＥＣＡ−５００」を用いて行った。溶媒として重水（Ｄ２Ｏ）を用い、積算回数を^１Ｈ−ＮＭＲでは３２回、^１３Ｃ−ＮＭＲでは１５０００回とした。

^１Ｈ−ＮＭＲ解析及び^１３Ｃ−ＮＭＲ解析による本蛍光物質のスペクトルデータを図３に示す。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（上図）において、芳香環に由来するシグナルと解される６〜８ｐｐｍ付近の領域に、シグナルはほとんど検出されなかった。また、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（下図）においても、芳香環に由来するシグナルと解される１１０〜１３０ｐｐｍ付近の領域に、シグナルはほとんど検出されなかった。

上記ＡＴＲ−ＦＴＩＲ、^１Ｈ−ＮＭＲ、及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析の結果から、本蛍光物質は、芳香環を含まないことが確認された。

（数平均分子量の測定）
下記条件でゲルろ過を行うことにより、本蛍光物質の数平均分子量を測定した。
その結果、本蛍光物質の数平均分子量は７．０ｋＤａであった。

＜ゲルろ過の条件＞
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍｉ．ｄ．×３００ｍｍ、東ソー社製）
移動相：０．２モル／Ｌ塩化ナトリウム含有０．１モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
流速：１．２ｍＬ／分
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ、蛍光検出器検出波長：Ｅｘ／Ｅｍ＝３５０／５１０ｎｍ

［実施例４］蛍光特性の評価
（蛍光スペクトル測定）
本蛍光物質の蛍光スペクトルを、分光蛍光光度計（ＦＰ−６５００、ＪＡＳＣＯ社製）を用いて測定した。その結果、本蛍光物質は、励起光極大波長が約３５５ｎｍ、蛍光極大波長が約５１０ｎｍであった。

（溶液状態での蛍光活性の評価）
本蛍光物質の蛍光活性を評価するために、本発明者らが、以前に蛍光物質生産菌として単離したＩＴＨ−ＳＡ−１株が生産する蛍光物質（ＳＡ−１蛍光物質）との比較を行った。ＳＡ−１蛍光物質の製造は、ＩＴＨ−Ｂ５２株に替えてＩＴＨ−ＳＡ−１株を用いて、実施例２に記載の本蛍光物質の製造方法と同様に行った。

本蛍光物質又はＳＡ−１蛍光物質を、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でミリＱ水に溶解し、３６５ｎｍの紫外線を照射したときの蛍光強度を観察した。その結果を図４に示す。
本蛍光物質は、いずれの濃度においても、ＳＡ−１蛍光物質よりも強い蛍光強度が観察された。この結果から、本蛍光物質は、溶液状態において、ＳＡ−１蛍光物質よりも強い蛍光を発生することが確認された。

（固体状態での蛍光活性の評価）
本蛍光物質又はＳＡ−１蛍光物質（数１０ｍｇ）に、３６５ｎｍの紫外線を照射したときの蛍光強度を観察した。その結果を図５に示す。
図５に示すように、固体状態での蛍光は、本蛍光物質でのみ観察された。この結果から、本蛍光物質は、ＳＡ−１蛍光物質とは異なり、固体状態でも蛍光を発生することが確認された。

［実施例５］ＳＹＡＣを用いた本蛍光物質の製造
実施例２に記載の方法において、ＳＹＡＬに替えてＳＹＡＣを用いた場合でも、同様に、ＩＴＨ−Ｂ５２株による本蛍光物質の生成が確認された。得られた本蛍光物質の励起光極大波長は約３５０ｎｍ、蛍光極大波長は約５１０ｎｍであった。
この結果から、本蛍光物質は、ＳＹＡＣを含有する培地でＩＴＨ−Ｂ５２株を培養することによっても製造できることが示された。

なお、マリンブロスに替えてＬＢ培地にＳＹＡＣを添加した培地を用いた場合でも、同様に、ＩＴＨ−Ｂ５２株による本蛍光物質の生成が確認された。

［実施例６］ＩＴＨ−Ｂ５２株のＳＹＡＬ代謝系の検討
初期濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＳＹＡＬを添加したマリンブロス培地で、２５℃で９６時間、ＩＴＨ−Ｂ５２株を振とう培養した後の培養上清を用いて、ＳＹＡＬ中間代謝物の検出を試みた。中間代謝物の検出は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により行った。また、ＩＴＨ−Ｂ５２株を添加することなく、２５℃で９６時間振とうしたものを、無菌コントロールとして使用した。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析には、ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＱｕａｔｔｒｏｐｒｅｍｉｅｒＸＥ、日本ウォーターズ）を用い、カラムは、ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨＣ１８１．７μｍ２．１×５０ｍｍＣｏｌｕｍｎを使用した。ＬＣ分析条件は、解析スタート時は、０．１％ギ酸−Ｈ_２Ｏと０．１％ギ酸−メタノールが５％と９５％になるように設定し、徐々にグラジエントを変化させ、最終的に０．１％ギ酸−Ｈ_２Ｏと０．１％ギ酸−メタノールが８０％と２０％になるように流した。流出速度０．３ｍL／分、注入量１μＬ、２μＬまたは５μＬ、分析時間１０分間の条件で測定し、全ての波長の数値を測定した。質量分析機ではＳｏｕｒｅｃｅ温度を１２０℃、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度を４００℃に設定し、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ電圧等々の数値を変化させ、検出されるプロダクトイオンを調べ、検出する質量電荷比の設定を行った。その後、最適な条件を用いてサンプルの解析を行った。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析の結果を図６に示す。なお、ＳＹＡＬ、ＳＹＡＣ、及び３−Ｏ−メチルガリック酸（３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇａｌｌａｔｅ：３−ＭＧＡ）のリテンションタイム（ＲＴ）はそれぞれ３．８１分、３．５３分、及び２．６４分である。

無菌コントロール（図６Ａ）では、ＳＹＡＬのピークのみが検出された。また、ピーク面積より、培地中のＳＹＡＬ濃度は１０４９．４２μｇ／ｍＬと算出された。この結果から、ＳＹＡＬの無菌的分解は起こっていないことが確認された。

一方、ＩＴＨ−Ｂ５２株の培養上清（図６Ｂ）では、ＳＹＡＬのピークがほぼ消失し、ＳＹＡＣのピークが検出された。ピーク面積より、培養上清中のＳＹＡＬ濃度及びＳＹＡＣ濃度は、それぞれ０．８μｇ／ｍＬ及び４１５．１μｇ／ｍＬと算出された。この結果から、ＩＴＨ−Ｂ５２株は、ＳＹＡＬをＳＹＡＣに変換し、ＳＹＡＣを代謝して本蛍光物質を生成することが示された（代謝経路（Ｉ））。

なお、本発明者らは、以前に、ＩＴＨ−ＳＡ−１株が、ＳＹＡＬをＳＹＡＣに変換し、さらにＳＹＡＣを３−ＭＧＡに変換し、３−ＭＧＡを代謝してＳＡ−１蛍光物質を生成することを確認している（代謝経路（ＩＩ）；特開２０１４−１６６１４３号、Iwabuchi N., et al., ACS Sustainable Chem. Eng., vol.3, p2678-2685, 2015）。

しかし、上記ＩＴＨ−Ｂ５２株培養上清のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析結果では、３−ＭＧＡのピークは検出されなかった。この結果から、ＩＴＨ−Ｂ５２株は、ＳＹＡＣを３−ＭＧＡに変換する経路とは異なる経路で、本蛍光物質を生成することが示唆された。そのため、ＩＴＨ−Ｂ５２株は、ＩＴＨ−ＳＡ−１株がＳＡ−１蛍光物質を生成する経路（代謝経路（ＩＩ））とは異なる経路で、本蛍光物質を生成するものと考えられる。

本発明によれば、固体状態でも蛍光を発する新規有機蛍光物質を製造する技術が提供される。本発明により製造される蛍光物質は、固体状態でも蛍光を発生するため、照明、発光素子、蛍光塗料、トレーサー、診断薬、試薬等の幅広い用途に利用することができる。

Claims

シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）又はその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含有する培地で培養する工程を含む、蛍光物質の製造方法。
前記培地が、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩以外の有機物をさらに含有する、請求項１に記載の蛍光物質の製造方法。
前記培養する工程の後に、前記培養後の培地から蛍光物質を抽出する工程を、さらに含む請求項１又は２に記載の蛍光物質の製造方法。
前記蛍光物質が芳香環を有しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光物質の製造方法。
前記蛍光物質が、固体状態及び液体状態のいずれの状態でも蛍光を発生する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光物質の製造方法。
シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）。
シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＩＴＨ−Ｂ５２株（ＮＩＴＥＰ−０２４１２）及びその変異株を、シリングアルデヒド、シリンガ酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する培地で培養することによって生成される、蛍光物質。