JP2018131461A - 単純ヘルペスウイルス２型感染を処置するための治療用ワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】単純ヘルペスウイルス２型感染を処置するための治療用ワクチンを提供すること。【解決手段】本発明は、単純ヘルペスウイルス２型を含む、ウイルス抗原に対して動物（例えば、哺乳動物）において治療的免疫を誘導するための方法およびキットを提供する。特に、本発明は、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸のプライミング用量、リポソームに封入された抗原のタンパク質形態を含む初回または第１ブースティング用量、ならびにＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソーム封入タンパク質抗原の両方を含む１以上の後続ブースティング用量を含む治療用ワクチンを投与することにより、ＨＳＶ−２感染が確立された動物を処置する方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年１月７日に出願された米国仮出願第６１／７４９，６８２号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９９，５５２号（これらの両方は、その全体が参考として援用される）への優先権を主張する。

政府の支援についての声明
本発明は、ＮＩＡＩＤによって付与された助成金番号Ｒ４３／ＡＩ０６３８２０およびＲ４４／ＡＩ０６３８２０の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

（電子的に提出されたテキストファイルの記載）
本願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容については、その全体が参考として本明細書に援用される：配列リストのコンピュータ読取可能なフォーマットコピー（ファイル名：ＢＭＲＩ＿００６＿００ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１４年１月２日、ファイルサイズ２２キロバイト）。

本発明は、免疫学、ウイルス学およびワクチン開発の分野に関するものである。特に、本発明は、抗原をコードするＤＮＡワクチンから成る筋肉内プライミング用量、リポソームに封入された抗原のタンパク質形態から成る鼻腔内ブースティング用量、およびＤＮＡワクチンおよびリポソーム封入タンパク質抗原の両方から成る第２ブースティング用量を含む異種免疫化プロトコルに関するものである。このプロトコルは、感染した被験体におけるウイルス再活性化に随伴する臨床症状を低減させる単純ヘルペスウイルスに対する治療的免疫応答の誘導において特に有効である。

単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）は、ヒト集団に特有のものであり、世界中で流行している。世界保健機関は、３億人を超える女性および２億人を超える男性がＨＳＶ−２に感染していると２００３年に推定した（Ｃｏｈｅｎ（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３３０巻：３０４）。アメリカ疾病対策予防センター（ＣＤＣ）によると、合衆国成人集団のおよそ２０％がＨＳＶ−２に感染しており（１）、その結果、重大な病的状態および心理学的苦痛がもたらされ得る。上皮細胞での最初の複製後、ウイルスは感染部位の神経支配を担うニューロンに侵入し、潜伏期に入る。定期的に、ＨＳＶ−２は、再活性化し、複製し、新たなウイルス粒子を形成し、そして元々の感染部位への軸索を下り、そこで粘膜上皮における別のラウンドの溶解的複製が行われることになる。陰部潰瘍の再発は、典型的には年に４回起こる（２）。また、小胞形成が存在しない場合におけるウイルスの無症候排出もよくあることである。ＨＳＶ−２の新たな症例のうち７０％もの症例が、無症候排出状態のパートナーから獲得されたものであると報告されており（３）、ＨＳＶ−２に感染した女性が合計１５〜２０％の日数で生殖管からウイルスを排出すると推定される（４）。ＨＳＶ−２は一般に粘膜病変を起こすが、他の器官および表面を巻き込むＨＳＶ−２感染は珍しくない（５）。例えば、ＨＳＶ−２感染は、中枢神経系を巻き込み得、そこで突発的発熱および局所神経学的症状を引き起こす。さらに、母親から乳児へのウイルスの垂直伝染および免疫無防備状態の個体における感染は、ウイルス性脳炎および／または体全体に及ぶウイルスの伝播の原因となり得る（６）。ヌクレオシド類似体での処置が存在しない場合、これらの乳児についての死亡率は５０％である（６）。単独で原発性疾患を誘発することに加えて、ＨＳＶ−２はまた、ＨＩＶ−１伝染についての正の補因子であり、２〜４倍のＨＩＶ−１獲得リスクに関連している（７）。

ＨＳＶ−２に対する防御的免疫の開発は当然実行可能であるが、成功裏のＨＳＶ−２ワクチンは依然として見つけるのが困難である。これは、主として、ＨＳＶ−２がその複雑な複製周期を通じて宿主免疫系と相互作用する際の様々な様式に起因している。全不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、生複製欠損ウイルス、サブユニットワクチンおよびＤＮＡワクチンの使用を含め、多くの異なるＨＳＶ−２免疫化戦略が開発されてきた（ＢｅｒｎｓｔｅｉｎおよびＳｔａｎｂｅｒｒｙ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ、１７（１３−１４）巻：１６８１−１６８９；ＫｒａｕｓｅおよびＳｔｒａｕｓ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、１３（１）巻：６１−８１；ＭｃＫｅｎｚｉｅおよびＳｔｒａｕｓ（１９９６）Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．、６巻：８５−９６）。現在までのところ、ヒトにおいて何らかの有効性を実証する唯一のワクチン候補は、ＨＳＶ−２に対する制限された防御をもたらすに過ぎず、それも単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）について血清反応陰性である女性患者においてのみであった（８）。追跡試験から最近公表された結果は、このサブユニットワクチンが、初期の試験の結果と相反してあまり有効ではないことを報告した（Ｃｏｈｅｎ（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３０巻：３０４）。したがって、ＨＳＶ−２についての安全かつ有効なワクチンは依然として欠如している。

臨床試験および動物試験は、成功裏のＨＳＶ−２ワクチン候補はいずれも、複数の形態で防御を開始しなければならないことを示していた。体液性免疫は、最初の曝露中、母親から子供へのウイルスの垂直伝播中および細胞外粒子がニューロンから上皮細胞へ伝播されるときのウイルスの再活性化中における細胞外ビリオン粒子からの防御に重要である（９、１０）。Ｂ細胞欠損マウスにおける感染は、ＨＳＶ−特異的抗体が感染を制限する一方で、免疫系の他のアームが感染の阻止に要求されることを示す（１１）。細胞性免疫は、一次感染および反復性感染中におけるウイルス感染上皮細胞のクリアランス、知覚神経節における溶解感染の消散にとって、および恐らくは再活性化の阻止において必要である（１２〜１８）。枯渇試験は、ＨＳＶ−２再感染に対する防御が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞または抗体ではなく主としてＣＤ４^＋Ｔ細胞により制御されることを実証している（１９〜２１）。さらに、長期免疫は、全身免疫化より粘膜免疫化に依存的であると思われることから、局所粘膜免疫応答の重要性が強調される（２２）。

疾患に対して防御することができるＨＳＶ−２ワクチン候補が、ウイルス感染および複製を完全には封じ込め得ないことは周知である。したがって、成功裏のＨＳＶ−２ワクチンにとってＨＳＶ−２感染によって引き起こされる一次急性疾患および後続の潜伏および再発の発生の両方に対する防御を提供することは真の努力目標であった。動物試験において、以前のＨＳＶ−２ワクチン候補の中には生殖管においてウイルス複製を実質的に低下させ、一次感染から生じる疾患の症状を著しく阻止するものもあった。しかしながら、これらのワクチンにより誘発された免疫は、潜伏感染および再発性疾患に対して部分的に防御できるに過ぎない可能性がある（３〜１０）。ワクチンに誘導される宿主免疫応答は、１つ以上の重要な段階で作用することにより、生殖器ＨＳＶ感染を阻止または制限し得る。急性疾患および潜伏期の確立の両方を阻止するため、理想的にはＨＳＶ−２ワクチンにより誘発される免疫応答は、生殖器粘膜でのＨＳＶ−２ウイルス複製を有効に封じ込め、知覚神経終末へのウイルス伝播をうまく阻止することができる。最初のウイルス複製に対し最大の防御を達成するために、ワクチンは、広範かつ強力な防御的免疫、特に生殖器部位での強固な粘膜免疫応答を誘導することが必要であると思われる。既にＨＳＶ−２に感染した患者らを処置するための治療用ワクチンは、理想的にはウイルス排出を封じ込め、臨床的再発を制御することができる免疫応答を誘発する。最低でも、治療用ワクチンであれば、臨床的再発およびウイルス排出の頻度、持続時間および重症度を低減させるべきである。

Ｈａｎｄｓｆｉｅｌｄ ＨＨら、Ｓｅｘ Ｔｒａｎｓｍ Ｄｉｓ（１９９９）２６（４）：２２８〜３１ Ｌａｆｆｅｒｔｙ ＷＥら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９８７）３１６（２３）：１４４４〜９ Ｍｅｒｔｚ ＧＪら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ（１９９２）１１６（３）：１９７〜２０２

したがって、公衆衛生問題が重大であり、抗ウイルス薬ではその拡散を阻止できないため、ＨＳＶ−２についての安全かつ有効な治療用および予防用ワクチンの開発が依然として当該分野では明らかに要望されている。

（発明の要旨）
本発明は、一つには、ＨＳＶ−２に対する治療的免疫を誘導し、ＨＳＶ−２感染が確立された被験体を有効に処置する新規異種免疫化レジメンの発見に基づいている。この治療用ワクチンは、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸のプライミング用量、リポソームに封入された抗原のタンパク質形態を含む初回または第１ブースティング用量、およびＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソーム封入タンパク質抗原の両方を含む１回以上の後続ブースティング用量を含む。この免疫化プロトコルは、高力価の粘膜抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体および有効なＴ細胞応答を誘導するもので、感染被験体において生殖管からのウイルス排出を低減させ、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発を著しく低減させる。したがって、本発明は、動物（例えば、哺乳動物）、特にヒトにおけるＨＳＶ−２感染を処置する方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸を含むプライミング調製物、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第１ブースティング調製物、およびＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソーム封入ＨＳＶ−２抗原を含む第２ブースティング調製物を動物に投与することを含む。ある種の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸は筋肉内投与され、リポソーム封入抗原は鼻腔内投与される。第１ブースティング調製物は、プライミング調製物投与の約２〜４週間後、例えば７〜１８日後に投与され得る。同様の実施形態において、第２ブースティング調製物は、第１ブースティング調製物投与の約２〜４週間後、例えば７〜１８日後に投与され得る。

ＨＳＶ−２感染の１つ以上の症状は、第２ブースティング調製物投与後の動物において改善され得る。例えば、一実施形態では、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発が、未処置動物または非粘膜ワクチンで免疫化された動物と比べて該動物では低減および／または阻止される。別の実施形態では、生殖管からのウイルス排出が、未処置動物または非粘膜ワクチンで免疫化された動物と比べて該動物では低減されている。ある種の実施形態では、本方法は、さらにＨＳＶ−２抗原をコードする核酸とリポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原の組み合わせをヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発の徴候の際に、動物に投与することを含む。かかる実施形態では、該核酸は、好ましくは筋肉内投与され、該リポソーム封入抗原は鼻腔内投与される。

本発明はまた、ウイルス感染に先行して、動物（例えば、哺乳動物）、特にヒトにおいてＨＳＶ−２に対する防御的免疫応答を誘発する方法を含む。一実施形態では、本方法は、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸を含むプライミング調製物、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第１ブースティング調製物、ならびにＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソーム封入ＨＳＶ−２抗原を含む第２ブースティング調製物を動物に投与することを含む。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸は筋肉内投与され、リポソーム封入ＨＳＶ−２抗原は鼻腔内投与される。防御免疫応答は、Ｔｈ１型免疫応答に向かって偏向され得、血清および膣分泌物中の中和抗体、粘膜ＩｇＡおよび／または粘膜ＩｇＧ応答、およびウイルスクリアランスの増大を含み得る。

本発明の特定の局面では、プライミング調製物および第２ブースティング調製物における核酸は、サイトメガロウイルスプロモーターなどのプロモーターの制御下でＨＳＶ−２抗原をコードするベクターである。一実施形態では、該ベクターによりコードされるＨＳＶ−２抗原はｇＤ糖タンパク質である。ｇＤ糖タンパク質は、完全長タンパク質または免疫原性フラグメントまたはドメインを含む短縮型タンパク質であり得る。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原（例えば、ｇＤ糖タンパク質）をコードする配列は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。

本発明の別の局面では、第１および第２ブースティング調製物におけるＨＳＶ−２抗原は、陰イオン性リポソームに封入されている。前記リポソームは、約０．５〜５μｍの平均直径を有し得る。ある種の実施形態では、ブースティング調製物におけるリポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原はｇＤ糖タンパク質であり、これは完全長タンパク質またはその免疫原性フラグメントであり得る。一特定実施形態では、ＨＳＶ−２抗原は、ｇＤ糖タンパク質の細胞外ドメイン（例えば、ｇＤ糖タンパク質のアミノ酸１〜３１４）である。一実施形態では、ブースト調製物で使用されるリポソームは脂質から成り、すなわち、前記リポソームはさらなるタンパク質、リガンドまたはアジュバントを含まない。別の実施形態では、リポソームは非融合誘導性リポソームである（すなわち、リポソーム膜に組み込まれたウイルスタンパク質を一切含まない）。

本発明はまた、動物（例えば、ヒト）においてＨＳＶ−２に対する治療的または防御的免疫応答を誘発するためのキットを含む。一実施形態では、該キットは、ＨＳＶ−２抗原（例えば、ｇＤ糖タンパク質）をコードする核酸配列を含む第１免疫化成分、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第２免疫化成分、および使用者が動物に第１免疫化成分を投与し、次いで第２免疫化成分を投与し、次いで第１および第２免疫化成分の組み合わせを投与することにより、動物において治療的免疫応答を誘発させるための指示書を含む。一部の実施形態では、第１免疫化成分を筋肉内投与用に処方し、第２免疫化成分を鼻腔内投与用に処方する。一部の実施形態では、該動物はヒトである。一特定実施形態では、ヒトはＨＳＶ−２に感染している。別の実施形態では、ヒトはＨＳＶ−２感染のリスクに直面している。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物においてＨＳＶ−２感染を処置するための方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）プロモーターの制御下でＨＳＶ−２抗原をコードするベクターを含むプライミング調製物；
（ｂ）リポソームに封入された前記ＨＳＶ−２抗原を含む第１ブースティング調製物；および
（ｃ）前記ＨＳＶ−２抗原をコードする前記ベクターおよびリポソームに封入された前記ＨＳＶ−２抗原を含む第２ブースティング調製物
を前記哺乳動物に投与することを含み、
前記ベクターが筋肉内投与され、そして前記リポソーム封入抗原が鼻腔内投与される、方法。
（項目２）
前記プライミング調製物が１回または２回の投与で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１ブースティング調製物が、前記プライミング調製物の約２〜４週間後に前記哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１ブースティング調製物が、前記プライミング調製物の約７〜１８日後に前記哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１ブースティング調製物が、前記プライミング調製物の約１０〜１６日後に前記哺乳動物に投与される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第２ブースティング調製物が、前記第１ブースティング調製物の約２〜４週間後に前記哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第２ブースティング調製物が、前記第１ブースティング調製物の約７〜１８日後に前記哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２ブースティング調製物が、前記第１ブースティング調製物の約１０〜１６日後に前記哺乳動物に投与される、項目７に記載の方法。
（項目９）
さらに、前記ＨＳＶ−２抗原をコードする前記ベクターおよびリポソームに封入された前記ＨＳＶ−２抗原の組み合わせを、前記哺乳動物にヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発の徴候の際に投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ＨＳＶ−２感染の１つ以上の症状が、前記第２ブースティング調製物の投与後の前記哺乳動物において改善されている、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発が、未処置哺乳動物または非粘膜ワクチンがワクチン接種された哺乳動物と比べて前記哺乳動物では低減および／または完全に阻止されている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ウイルス排出が、未処置哺乳動物または非粘膜ワクチンがワクチン接種された哺乳動物と比べて前記哺乳動物において低減されている、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
抗原特異的ＩｇＡおよびＩｇＧが、未処置哺乳動物または非粘膜ワクチンがワクチン接種された哺乳動物と比べて前記哺乳動物の膣分泌物において増大している、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記非粘膜ワクチンが、皮下投与用に処方された短縮型ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質を含む、項目１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
（項目１５）
前記プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターである、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記サイトメガロウイルスプロモーターが、前初期プロモーターである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ベクターによりコードされる前記ＨＳＶ−２抗原が、哺乳動物細胞での発現用にコドン最適化されている、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ベクターによりコードされる前記ＨＳＶ−２抗原が、ヒト細胞での発現用にコドン最適化されている、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＨＳＶ−２抗原が、ｇＤ糖タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ベクターが完全長ｇＤ糖タンパク質配列をコードする、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記完全長ｇＤ糖タンパク質配列が配列番号１の配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１ブースティング調製物および第２ブースティング調製物中の前記リポソーム封入抗原が、ｇＤ糖タンパク質の細胞外ドメインである、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記抗原が配列番号２の配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リポソームが陰イオン性リポソームである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記リポソームが約０．５〜５μｍの平均直径を有する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。

図１は、処置前におけるＨＳＶ−２感染の１５〜２８日後のモルモットでの臨床スコアの累積的再発を示す。ＨＳＶ−２感染動物を無作為に３処置群（ＢＲＭワクチン、ビヒクル対照および参照ワクチン）に分けた。処置前の再発率の点で３群間に有意な差は無かった（ｐ＝０．９５；１５日目〜２８日目の勾配：ＢＲＭワクチン＝０．０８６４６±０．００８１４２；ビヒクル対照＝０．０８９８９±０．００９９６４；参照ワクチン＝０．０８９９２±０．００８４８０）。Ｙ軸：１動物（各群における）当たりの再発ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の累積数；Ｘ軸：感染後の日数。 図２は、ＨＳＶ−２感染モルモットの３処置群（ＢＲＭワクチン、ビヒクル対照、ＨＳＶ−２サブユニットワクチン）における免疫化プロトコルおよび同収集スケジュールを示す概略図である。ＨＳＶ−２による膣内感染４週間後、ｇＤ−ＤＮＡベクタープライム（ＢＲＭワクチン群）またはベクター対照（対照群）を２日間（２８日目および３０日目）にわたって筋肉内注射した。２週間後、鼻腔内ｇＤ−リポソームブースト（ＢＲＭワクチン群）または空のリポソーム（対照群）を投与した。第１ブーストの２週間後、筋肉内ｇＤ−ＤＮＡおよび鼻腔内ｇＤ−リポソーム（ＢＲＭワクチン群）またはベクターおよび空のリポソーム（対照群）の第２ブーストを投与した。ＨＳＶ−２サブユニットワクチン群では、ＨＳＶ−２ｇＤワクチンを、ＨＳＶ−２感染後２９日目（プライム）、４４日目（第１ブースト）、および５８日目（第２ブースト）に皮下投与した。血清試料を２１、４２、５６、７７および８３日目に収集し、膣スワブ試料を、２、４、２１、４２、５６、７７および８３日目に収集し、試験の最後に後根神経節を採取することにより、潜伏的ＨＳＶ−２ ＤＮＡコピー数を求めた。 図３のＡは、非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（対照ワクチン）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおける抗原特異的（ＨＳＶ−２ｇＤ）血清ＩｇＧである。矢印は、免疫化を受けたときの日数を示す。アステリスク＝ｐ＜０．０５。Ｂは、非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照；ｎ＝９）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン；ｎ＝１１）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（参照ワクチン；ｎ＝１２）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおけるＨＳＶ−２感染８３日後における抗原特異的（ＨＳＶ−２ｇＤ）膣ＩｇＧである。 図４は、非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（対照ワクチン）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおける抗原特異的（ＨＳＶ−２ｇＤ）膣ＩｇＡである。アステリスク＝ｐ＜０．０５。 図５は、非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照；ｎ＝９）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン；ｎ＝１１）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（参照ワクチン；ｎ＝１２）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおける感染８３日後における実時間ｑＰＣＲによる膣ＨＳＶ−２ＤＮＡコピーの検出を示す。５コピーを超えるＨＳＶ−２ＤＮＡを含んでいれば、それらの試料を陽性とみなした。 図６は、ＨＳＶ−２感染の１５日後から４２日後までの非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（参照ワクチン）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおける１群１動物当たりの累積的再発を示す。自然発症再発ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の証拠について動物を観察し、再発エピソードを、再発が観察された日数について調節した、各群についての１モルモット当たりの累積再発（病変の出現）として数え上げた。矢印は、ワクチン群でプライミング用量を投与したときの日を示す。 図７は、ＨＳＶ−２感染の２８日後から８３日後までの非ワクチン接種モルモット（ビヒクル対照）または粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）またはＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（参照ワクチン）のいずれかをワクチン接種したモルモットにおける１群１動物当たりの累積的再発を示す。自然発症再発ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の証拠について動物を観察し、再発エピソードを、再発が観察された日数について調節した、各群について１モルモット当たりの累積再発（病変の出現）として数え上げた。表は、各処置群についての感染後の選択された日数の期間における線形回帰の傾きを列挙している。

（発明の詳細な記載）
全不活化ウイルス、生弱毒化ウイルス、生複製欠損ウイルス、サブユニットワクチンおよびＤＮＡワクチンの使用を含め、多くの異なるＨＳＶ−２免疫化戦略が、開発され、そして評価されている。しかしながら、ＨＳＶ−２の安全かつ有効なワクチンは依然として利用できないままである。本発明は、一つには、ＨＳＶ−２に対する防御的および治療的免疫を誘発する新たなＨＳＶ−２ワクチンの発見に基づいている。本明細書で詳細に記載しているように、本発明者らは、ＨＳＶ−２抗原をコードするＤＮＡベクターの筋肉内プライミング用量、次いで粘膜（例えば、鼻腔内）送達される抗原のリポソーム封入タンパク質形態の初回ブースト、次いでＤＮＡベクターおよびリポソーム封入抗原の両方による１回以上の後続ブーストから成る異種免疫化プロトコルを開発した。このプロトコルは、既にＨＳＶ−２に感染している被験体を処置するため治療的免疫応答を誘導するのに特に有効である。この治療用ワクチンは、体液性免疫、Ｔ細胞免疫、および粘膜免疫から成る相乗的免疫応答を誘導する。具体的には、このワクチンは、高力価の膣抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体、Ｔｈ１偏向型免疫応答、および高力価の血清抗原特異的ＩｇＧを刺激する。さらに、この治療用ワクチンは、それがヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発を阻止または低減することおよびウイルス排出を低減することができるという点でＨＳＶ−２ｇＤ抗原を含む皮下投与されるワクチンよりも優れている。

したがって、本発明は、哺乳動物などの動物においてＨＳＶ−２に対する治療的免疫応答を誘発する方法を提供する。治療的ワクチン接種の目標は、感染個体における免疫応答を標的として、ウイルスに既に感染した細胞を根絶するか、または潜伏ウイルスが再活性化し、元の感染部位に戻るのを予防することである。本明細書で使用される場合、「治療的免疫（性）」または「治療的免疫応答」は、感染を改善または排除するかまたはその少なくとも１つの症状を低減させる免疫または感染性因子に対する免疫応答を誘発することをいう。具体的には、ワクチン投与からの治療的免疫応答の誘導は、感染性因子により誘導される疾患の１つ以上の症状の存在の排除または低減またはかかる症状の持続時間または重症度の低減により明らかとなる。例えば、一実施形態では、ＨＳＶ−２に対する治療的免疫は、ＨＳＶ−２感染の重症度または持続時間を低減する免疫をいう。治療的免疫は、一部の実施形態において、ＨＳＶ−２誘導疾患の１つ以上の症状の存在の排除または低減により証明される。ＨＳＶ−２誘導疾患の臨床症状としては、生殖器および／または直腸領域の周囲の水疱様ただれまたは潰瘍（例えば、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変）、生殖器および／または直腸領域の皮膚での発疹または小隆起、有痛性の排尿、帯下（ｖｉｒｇｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）、およびインフルエンザ様症状（例えば、熱および鼠蹊リンパ腺の腫れ）がある。一部の実施形態において、有効な治療的免疫応答は、生殖器粘膜からのウイルス排出の量を低減させる。

一実施形態では、本発明は、動物（例えば、哺乳動物、ヒト）においてＨＳＶ−２感染を処置する方法であって、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸（例えば、ベクター）を含むプライミング調製物、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第１ブースティング調製物、およびＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第２ブースティング調製物を該動物に投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、核酸（例えば、ベクター）は筋肉内投与され、リポソーム封入タンパク質抗原は粘膜投与される。粘膜投与経路としては、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、口腔内経路、または肺への吸入によるものがあるが、これらに限定される訳ではない。一特定実施形態では、リポソーム封入タンパク質抗原は鼻腔内投与される。一部の実施形態では、該処置方法で使用されるＨＳＶ−２抗原は、ｇＤ糖タンパク質である。

好ましくは、異種プライムおよびブーストＨＳＶ−２ワクチンの投与後、特に第２ブースティング調製物の投与後に、ＨＳＶ−２感染の１つ以上の症状が、軽減、改善もしくは低減されるかまたは治癒される。例えば、生殖器病変（すなわち、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変）の数、重症度または頻度は、未処置動物または非粘膜ワクチンをワクチン接種された動物と比較して免疫化動物では著しく低減される。一実施形態では、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発が、未処置動物または非粘膜ワクチンをワクチン接種された動物と比較して免疫化動物では低減または完全に阻止される。別の実施形態では、生殖管からのウイルス排出が、未処置動物または非粘膜ワクチンをワクチン接種された動物と比較して免疫化動物では低減される。本明細書で使用される場合、「非粘膜ワクチン」は、粘膜経路以外の経路により被験体に投与されるＨＳＶ−２に対するワクチンを全て指す。一部の実施形態では、非粘膜ワクチンは、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内または皮下投与されるＨＳＶ−２タンパク質抗原またはＨＳＶ−２抗原をコードする核酸を含む。一実施形態では、非粘膜ワクチンは、皮下投与用に処方された短縮型ＨＳＶ−２ｇＤタンパク質（例えば、ｇＤ細胞外ドメイン）を含む。

本発明の方法およびキットで処置することができる、長期感染を確立する他のウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がある。ウイルスについての治療用ワクチンの開発は、感染した細胞を認識および破壊するためのＣＴＬの活性化および／またはウイルス拡散の制御に焦点を絞ってきた。本発明の方法は、細胞性免疫応答を増強し、それらを治療用ワクチン接種の提供に適したものとするのに有効である。本方法の有効性は、抗癌ワクチンの開発において特に有望であることが示されているサイトカインアジュバントおよびＣｐＧモチーフを含有させることによりさらに増強され得る（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：６８２７−６８３０（２００４））。

本発明はまた、動物（例えば、哺乳動物）においてＨＳＶ−２に対する治療的免疫応答を誘発するためのキットを提供する。一実施形態では、該キットは、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸配列を含む第１免疫化成分、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第２免疫化成分、および使用者が動物に第１免疫化成分を投与し、次いで第２免疫化成分を投与し、次いで第１および第２免疫化成分の組み合わせを投与することにより、動物において治療的免疫応答を誘発させるための指示書を含む。一部の実施形態では、第１免疫化成分を筋肉内投与用に処方し、第２免疫化成分を、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下、口腔内経路または吸入による粘膜投与用に処方する。ある種の実施形態では、第２免疫化成分を鼻腔内投与用に処方する。別の実施形態では、該キットは、第１免疫化成分、第２免疫化成分またはその両方を投与するための送達装置をさらに含む。送達装置は、下記送達装置、例えば点滴器、スワブ、エアゾール噴霧器、注入器、ネブライザー、吸入器、針を備えた注射器または自動注入装置を含む送達装置のいずれであってもよい。

本発明の方法およびキットはまた、予防ワクチン接種（すなわち、動物における防御的免疫応答の誘導）に有用である。本発明は、哺乳動物などの動物においてＨＳＶ−２に対する防御的免疫応答を誘発する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸（例えば、ベクター）を含むプライミング調製物、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第１ブースティング調製物、およびＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む第２ブースティング調製物を哺乳動物に投与することを含む。ある種の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸（例えば、ベクター）は筋肉内投与され、リポソーム封入ＨＳＶ−２タンパク質抗原は、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下、口腔内経路または吸入により粘膜投与される。一特定実施形態では、リポソーム封入ＨＳＶ−２タンパク質抗原は、鼻腔内投与される。かかる実施形態において、本方法は、高い中和活性、Ｔｈ１型偏向応答、およびＨＳＶ−２ウイルスの侵入部位である膣腔での強力な防御的免疫を伴う高力価の血清および膣抗体を誘導する。

本明細書で使用される場合、「防御的免疫応答」または「防御的免疫」は、感染を阻止するか感染に対して防御する、脊椎動物（例えば、ヒト）が呈する免疫または感染性因子に対する免疫応答の誘導をいう。疾患の症状の出現を阻止するかまたはそれに対して防御する防御的免疫応答は、ウイルス排出を低減させることにより集団におけるＨＳＶ−２の拡散を低減または停止させることになる。一部の実施形態では、本発明のワクチンにより誘導される防御的免疫は、完全排除免疫（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）である。「完全排除免疫」は、検出可能な痕跡を全く残さずに、感染を完全に排除または阻止するかまたは急速に取り除かれる免疫応答である。

さらに本発明は、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）応答に向かって偏向された望ましい免疫応答が動物において誘発され得るように免疫応答を調節する方法を提供する。この方法は、ＨＳＶ−２抗原などの抗原をコードする核酸配列を含むプライミング調製物を動物に投与し、リポソームに封入された抗原を含む第１ブースティング調製物を動物に投与し、それに続いて抗原をコードする核酸およびリポソーム封入タンパク質抗原の組み合わせを含む第２ブースティング調製物を投与することを含む。ある種の実施形態では、抗原をコードする核酸は筋肉内投与され、リポソーム封入タンパク質抗原は粘膜（例えば、鼻腔内）投与される。「〜に向かって偏向された」とは、観察された免疫応答が、免疫化前の応答と比べてＴｈ１またはＴヘルパー２型（Ｔｈ２）応答に近くなった状況をいう。ある種の実施形態では、免疫化は、完全にＴｈ２応答をＴｈ１応答に切り替えることになる。他の実施形態では、免疫化は、Ｔｈ２応答をＴｈ１応答に完全には切り替え得ないが、代わりに混合または平衡状態の応答またはさらに弱いＴｈ２応答をもたらす。

ほとんどの免疫応答は、応答を開始させ、その性質を形作るＴリンパ球により調節される。免疫応答が成熟すると、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球は、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２型（Ｔｈ２）免疫応答に向かって分極されることになり得る。Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答の顕著な特徴は、存在するサイトカインの支配的パターンである。Ｔｈ１応答は、高レベルのＩＦＮ−γおよび低レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を特徴とし、Ｔｈ２応答は、低レベルのＩＦＮ−γおよび高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を特徴とする。これらのサイトカインは、Ｔ細胞の機能的能力の決定においてある重要な役割を演じる。Ｔｈ２型応答は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体の好ましい産生を招くが、ＣＴＬはほとんどまたは全く生成されない。Ｔｈ１型応答は、ＩｇＧ２ａサブクラスの抗体の好ましい産生およびウイルスまたは他の生物に感染した細胞を有効に殺すことができるＣＴＬの誘導を招く。

下表１は、Ｔｈ１およびＴｈ２分極化免疫応答の免疫学的特徴を要約している。Ｔｈ１分極化応答は、典型的にはウイルスまたは細菌による感染中に生成される。対照的に、Ｔｈ２分極化応答は、寄生虫感染、アレルギー反応において、およびヒトで使用される慣用的なミョウバンベースの筋肉内送達式タンパク質ワクチンにより観察されることが多い。また、遺伝学により、発せられた免疫応答の型を決定することができる。例えば、Ｔｈ１応答は、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスにおいて優勢であり、Ｔｈ２応答は、Ｂａｌｂ／ｃ系統のマウスにおいて優勢である。免疫応答はまた、Ｔｈ１成分およびＴｈ２成分の両方により構成され得、免疫応答の体液性アームおよび細胞媒介性アームの両方による防御を与え得る。サイトカイン産生細胞の頻度の直接的決定は、ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合イムノソルベントＳＰＯＴアッセイ）の使用または細胞内サイトカイン産生を明らかにするための免疫蛍光染色により達成される。また、血清ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率は、Ｔヘルパー型を決定するために広く許容され、準拠された基準である（表１）。平衡状態のＴｈ１およびＴｈ２応答についてのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率は、０．５と２．０の間となる。

本明細書で使用される場合、「Ｔヘルパー１型応答」および「Ｔｈ１応答」は、上表１の中央の縦列に列挙した１つ以上、普通は全部の特徴を含むある一定範囲の宿主動物応答をいうのに互換的に使用される。これらの特徴としては、０．５以下のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率；Ｔヘルパー１細胞により増大したＩＦＮ−γ（および他のＴｈ１サイトカイン）分泌およびＴヘルパー２細胞により減少したＩＬ−１０およびＩＬ−４（および他のＴｈ２サイトカイン）分泌；および高いＣＴＬ活性がある。

同様に、本明細書で使用される場合、「Ｔヘルパー２型応答」および「Ｔｈ２応答」は、上表１の右側縦列に列挙した１つ以上、普通は全部の特徴を含むある一定範囲の宿主動物応答をいうのに互換的に使用される。これらの特徴としては、２．０以上のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率；Ｔヘルパー１細胞により減少したＩＦＮ−γ（および他のＴｈ１サイトカイン）分泌およびＴヘルパー２細胞により増大したＩＬ−１０およびＩＬ−４（および他のＴｈ２サイトカイン）分泌；および低いかまたは欠如したＣＴＬ活性がある。

さらに本発明は、微生物の最も一般的な侵入部位である、身体の粘膜表面を特異的に標的とするのに有効なワクチンおよびワクチン接種プロトコルの開発方法を提供する。本発明は、ワクチンを規定の組成／サイズをもつリポソームに封入することにより、そしてワクチンを直接粘膜表面へ送達することによりワクチンをさらに効果的なものにすることができるようにする。リポソーム封入ワクチンを適切な免疫化レジメンと組み合わせることにより、より有効かつ特異的なワクチンを提供するように免疫応答を調整することができる。ある種の実施形態では、理想的なワクチンは、強固な抗体応答、ＣＴＬ生成およびＴｈ１型サイトカイン産生も含む、均衡した、またはＴヘルパー１（Ｔｈ１）偏向型の免疫応答、および粘膜部位での局所免疫を生じさせる。他の実施形態では、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）偏向型の免疫応答を生じさせるように免疫応答を調整することが可能であり得、このことは移植片宿主における拒絶の阻止およびある種の寄生虫感染に対する防御において有益であり得る。

一実施態様において、本発明は、ウイルス抗原（例えば、ＨＳＶ−２抗原）などのある種の抗原に対し、動物、特に哺乳動物（例えば、ヒト）において防御的免疫応答および治療的免疫応答などの免疫応答を効果的に誘発するための方法、試薬およびキットを提供する。本発明の１つの著しい特徴は、宿主動物に粘膜的（例えば、鼻腔内的（ＩＮ））または筋肉内的（ＩＭ）に送達されるリポソーム封入タンパク質抗原の使用に関するものである。

本発明の方法およびキットの１つの構成要素は、同一抗原の後続投与のための調製物における、動物、特にヒト患者への１つ以上の抗原の最初の投与を含む、「プライミング」免疫化の使用である。具体的には、本明細書で使用される場合、「プライミング」の語は、抗原を用いる最初の免疫化であって、所望の抗原に対して免疫応答を誘導し、同一または異なるワクチン送達系の状況で投与されたときの同一抗原による後続の再免疫化時に所望の抗原に対しさらに高レベルの免疫応答を呼び戻す最初の免疫化をいう。

本発明の方法およびキットの別の構成要素は、プライミング免疫化でコードされたのと同じ抗原を送達する組成物の投与を意味する、「ブースティング免疫化」または「ブースト」の使用である。ブーストは、既往応答、すなわち、以前に感作された動物における免疫応答と称されることもある。各ブーストについて同一または異なる量を用いて、複数のブーストを施与することができる。プライミングとは異なる抗原送達系を用いるブースティングは、「異種ブースト」と称され得、プライミングと同じ抗原送達系を用いるブースティングは「同種ブースト」と称され得る。

上記逐次投与に代わるものとして、プライミング調製物およびブースティング調製物は、同時に、すなわち実質的に同じ時間に投与され得る。本発明の方法は、本方法が動物において誘発することができる免疫応答に関してプライミング免疫化とブースティング免疫化（複数も可）の間に強力な相乗効果を引き起こす。結果として、本発明の方法により望ましいレベルの免疫応答を誘発することができるが、プライミング調製物およびブースティング調製物（複数も可）をそれぞれ動物に単独で投与した場合、望ましいレベルの免疫応答を達成するのには不十分である。一部の実施形態において、本発明の異種免疫化方法は、未処置／非免疫化動物または非粘膜ワクチンをワクチン接種した動物と比較した場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増大および膣分泌物における抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの増大を特徴とする治療的免疫応答を生じさせる。他の実施形態において、本明細書に記載される異種免疫化方法は、未処置／非免疫化動物または非粘膜ワクチンをワクチン接種した動物での観察結果と比較して、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発を低減させるかまたは完全に阻止し、および／または生殖管からのウイルス排出を低減させる。

体液性免疫応答および細胞性免疫応答を含む、宿主動物における免疫応答の効果は、当該分野で公知の様々なアッセイにより評価され得る。体液性免疫応答には、血清中または粘膜表面での総抗原特異的抗体（免疫グロブリン、すなわちＩｇ）力価；血清中または粘膜表面でのＨＳＶ−２抗原特異的抗体の力価；ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａを含む特異的抗体アイソタイプおよび／またはサブタイプの力価；ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの比率が含まれる。抗原特異的抗体力価は、ＥＬＩＳＡアッセイなど、当該分野で公知の慣用的方法により測定され得る。細胞性免疫応答には、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）表現型および活性が含まれる。また、細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γを含むＴｈ１応答に特有のサイトカインの分泌、およびＩＬ−１０およびＩＬ−４を含むＴｈ２応答に特有のサイトカインの分泌が含まれる。これらのサイトカインは、サイトカインＥＬＩＳＰＯＴおよび／またはＥＬＩＳＡアッセイにより直接検出され（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４）、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率から推測される（例えば、Ｔｈ１応答対Ｔｈ２応答）。血清および粘膜抗体の中和活性は、実施例に記載されている補体依存的中和アッセイを含む様々な方法により測定され得る。神経系におけるＨＳＶ−２ウイルスの潜伏度は、例えば、後根神経節細胞の定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析により評価され得る。検出されるウイルスコピーの数は、宿主、ニューロン細胞におけるＨＳＶ−２ウイルス組み込みと相関している。

抗原（例えば、ＨＳＶ−２抗原）をコードする核酸およびタンパク質抗原（例えば、リポソーム封入抗原）は、電子的／機械的装置および／または電気穿孔などの方法の使用を含め、以下の経路：皮下、筋肉内、皮内および粘膜経路のいずれか１つにより投与され得る。粘膜投与経路の例としては、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、口腔内経路または吸入によるものがあるが、これらに限定される訳ではない。抗原をコードする核酸およびタンパク質抗原は、同じ経路により、または異なる経路により投与され得る。ある種の好ましい実施形態では、抗原をコードする核酸（例えば、ベクター）は筋肉内投与され、タンパク質抗原（例えば、リポソーム封入タンパク質抗原）は鼻腔内投与され、その結果、ＣＴＬ応答だけでなく、強固な粘膜免疫応答も誘導される。ある種の実施形態では、抗原をコードする核酸は、プライミング調製物中に存在する。抗原をコードする核酸はまた、典型的にはタンパク質抗原（例えば、リポソーム封入タンパク質抗原）のみを含む、初回または第１ブースティング調製物後の１つ以上のブースティング調製物中に存在してもよい。特定実施形態では、初回または第１ブースティング調製物に続くブースティング調製物は、２成分：（１）ベクターなどの抗原をコードする核酸、および（２）リポソームに封入されたタンパク質抗原などの抗原のタンパク質形態を含む。好ましくは、これら２成分を別々の経路により投与できるように、２成分は別々の処方物中に入れられる。例えば、一部の実施形態では、第２ブースティング調製物の核酸成分は筋肉内投与され、一方第２ブースティング調製物のタンパク質成分は鼻腔内投与される。

本発明はまた、本発明の方法およびキットで使用するための本明細書に記載されるプライミング調製物およびブースティング調製物を分配する装置を検討している。例えば、ブースティング調製物またはブースティング調製物のタンパク質成分が鼻腔内送達される実施形態については、鼻腔内処方物用分配装置は、例えば、エアロゾル送達系の形態を取り得、単用量のみ、または多用量を分配するように配置され得る。かかる装置は、定量のブースティング調製物を鼻孔に送達する。適切な装置の他の例としては、点滴器、スワブ、エアゾール噴霧器（例えば、ＶａｘＩＮａｔｏｒ（登録商標））、注入器（例えば、Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ、単用量Ｂｅｓｐａｋ ＵｎｉＤｏｓｅ ＤＰ乾燥粉末鼻腔内送達装置）、ネブライザーおよび吸入器があるが、これらに限定される訳ではない。これらの装置は、被験体が処方物を鼻腔中へ吸入するのを必要とする受動的手段によりブースティング調製物またはブースティング調製物のタンパク質成分を送達し得る。別法として、該装置は、鼻腔中へ用量を注ぎ込むかまたは噴霧することによりブースティング調製物またはブースティング調製物のタンパク質成分を能動的に送達し得る。ブースティング調製物またはブースティング調製物のタンパク質成分は、１つ以上のかかる装置により片方または両方の外鼻孔中に送達され得る。投与は、１被験体当たり２装置（１外鼻孔当たり１装置）を含み得る。プライミング調製物またはブースティング調製物の核酸成分が筋肉内投与される実施形態では、自動注入装置またはペン型注入装置などの装置が注射液の送達に使用され得る。

プライミング調製物および第１ブースティング調製物間では異なる間隔が使用され得る。第１ブースティング調製物は、一次調製物の投与後２〜８週間、好ましくは４〜６週間、さらに好ましくは約２〜４週間で投与され得る。一実施形態では、第１ブースティング調製物は、プライミング調製物の約７〜約１８日後に投与される。別の実施形態では、第１ブースティング調製物は、プライミング調製物の約１０〜約１６日後に投与される。

また、ブースティング調製物（例えば、第１ブースティング調製物および第２ブースティング調製物）間でも異なる間隔が使用され得、それらはプライミング調製物および第１ブースティング調製物の投与間の間隔と同一または異なり得る。例えば、第２ブースティング調製物（または後続のブースティング調製物）は、第１ブースティング調製物または前のブースティング調製物の投与後２〜８週間、好ましくは４〜６週間、または好ましくは約２〜４週間で投与され得る。一実施形態では、第２ブースティング調製物は、第１ブースティング調製物（または前のブースティング調製物）の約７〜約１８日後に投与される。別の実施形態では、第２ブースティング調製物は、第１ブースティング調製物（または前のブースティング調製物）の約１０〜約１６日後に投与される。多ブースティング調製物は、プライミング調製物および第１ブースティング調製物の投与後に動物（例えば、哺乳動物、ヒト）に投与され得る。好ましい実施形態では、後続のブースティング調製物は、核酸抗原成分（すなわち、抗原をコードする核酸）およびタンパク質抗原成分（例えば、リポソーム封入タンパク質抗原）の両方を含む。一部の実施形態では、これら２成分を含む後続のブースティング調製物が、ウイルス感染の１つ以上の症状の徴候の際に動物に投与される。例えば、ウイルス感染がＨＳＶ−２である実施形態では、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸およびリポソーム封入ＨＳＶ−２タンパク質抗原を含む後続ブースティング調製物は、生殖器病変（すなわち、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変）の再発の徴候の際に動物に投与される。

本発明は、プライミング調製物またはブースティング調製物、またはその両方における抗原の総用量が１回以上の投与で動物に投与され得ることを検討している。例えば、プライミング調製物は、２または３日間の過程にわたって投与され得る。一実施形態では、プライミングは、約３〜６週間あけた１または２回の投与を含み、第１ブースティング調製物は、最後のプライミング投与後約３〜１０週間で投与され、そして第２ブースティング調製物は、第１ブースティング後約３〜１０週間で投与される。別の実施形態では、プライミングは、３日間あけた１または２回の投与を含み、第１ブースティング調製物は、最後のプライミング投与後３週間で投与され、第２ブースティング調製物は、第１ブースティング後約３週間で投与される。ある種の実施形態では、プライミングは、１日あけた２回の投与を含み（例えば、プライム調製物は、１日目および３日目に投与）、第１ブースティング調製物は、最後のプライミング投与後２〜３週間で投与され、そして第２ブースティング調製物は、第１ブースティング後２〜３週間で投与される。

初回ブースト投与および後続ブースティング投与は、同量または異なる量のタンパク質抗原（例えば、リポソーム封入タンパク質抗原）を使用し得、後続のブースト投与および初回ブースト投与は、同一または異なる経路により実施され得る。最初のプライミング投与およびブースト投与（複数も可）は、同一または異なるスケジュールにしたがって送達される同量または異なる量の核酸抗原（例えば、ベクターコード化抗原）を使用し得る。一部の実施形態では、プライミング調製物中の核酸抗原の用量は、１回以上の投与（例えば、３日間経過するうちに、２回投与）にわたって送達され、ブースティング調製物中の核酸抗原の用量は、１回の投与（例えば、１日で全部）で送達される。核酸抗原の量は、ブースティング調製物で送達されるタンパク質抗原の量と同一または異なり得る。

本明細書で使用される場合、「抗原」または「免疫原」の語は互換的に使用され、関係している動物内で免疫応答を誘導することができる全てのペプチドまたはタンパク質配列を包含することが意図される。「抗原」または「免疫原」の語は、既知または野生型抗原のペプチドまたはタンパク質類似体を包含し、該類似体は野生型抗原より可溶性または安定性が高いものであり得、また抗原をより高い免疫活性を示すものにし、またはある種の細胞型での発現に最適なものとする（すなわち、ヒト化コドン使用）変異または修飾を含み得るものとする。抗原はまた、タンパク質構造を改変する特定アミノ酸置換が天然に存在する抗原に加えられたペプチド、既知防御性エピトープ（すなわち、ＣＴＬエピトープ）を含む天然に存在する抗原の一部分、または１つの病原体に限定されていても、またはされていなくてもよい（多価ワクチン）既知エピトープの合成的に誘導されたストリングであり得る。

また、所望の抗原のアミノ酸配列と相同性である配列を有するさらなるペプチドまたはタンパク質も、相同性抗原がそれぞれの病原体に対して免疫応答を誘導する場合には有用である。所望の抗原コード化配列と相同性である遺伝子は、それらが所望の抗原の生物活性と実質的に類似した生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするならば、本発明に包含されるものと考えるべきである。

本明細書に記載される抗原の類似体は、保存的アミノ酸、配列差異により、または配列に影響を及ぼさない修飾を通して、またはそれら両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なり得る。例えば、保存的アミノ酸変化を行ってもよく、その場合それらがタンパク質またはペプチドの一次配列を改変するにせよ、通常その機能を改変することはない。修飾（通常一次配列を改変することはない）には、ポリペプチドのインビボまたはインビトロ化学的誘導体化、例えばアセチル化、またはカルボキシル化が含まれる。また、グリコシル化により修飾されたタンパク質、例えばその合成およびプロセッシング中またはさらなるプロセッシング段階中にポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより、例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することにより作製されたものも抗原として包含される。また、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンなど、リン酸化されたアミノ酸残基を有する配列も、本発明による抗原として包含される。また、ポリペプチドのタンパク質分解に対する抵抗性を改善するため、または溶解度特性を最適化するために通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドも抗原として包含される。上記ポリペプチドの類似体には、天然に存在するＬ−アミノ酸以外、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸の残基を含むものがある。本発明の抗原は、本明細書で列挙されている具体例としてのプロセスのいずれかの生成物に限定されない。

抗原は、完全長抗原もしくは短縮型抗原、その免疫原性フラグメント、または該抗原から誘導されたエピトープであり得る。ある種の実施形態では、ブースティング調製物中の病原体特異的抗原は、弱毒化または死滅病原体の形態であり得る。また、有効な抗原には、これらの病原体の表面抗原が含まれる。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」の語は、少なくとも約３〜５、好ましくは約５〜１０または１５、かつ約１０００以下（またはその間の任意の整数）のアミノ酸の配列であって、それ自体またはさらに大きな配列の一部として、かかる配列に応答して産生された抗体に結合するか、または細胞性免疫応答を刺激する配列として定義されるものをいう。「エピトープ」の語は、天然配列と同一である配列、ならびに天然配列に欠失、付加および置換などの修飾（一般的に性質について保存的）を加えたものを包含する。本発明で使用される抗原は、例えば、単一ＣＴＬエピトープなど、単一エピトープのみを含んでいてもよい。

プライミング調製物またはブースティング調製物中の核酸によりコードされる抗原およびブースティング調製物中のタンパク質抗原は、好ましくは重複するエピトープを有する。ある種の実施形態では、２つの抗原は互いに同一であってもよい。別法として、２つの抗原は、重複するが、異なるセットのエピトープを有していてもよい。説明的な例を挙げると、ＨＳＶ−２についてのワクチン接種プロトコルでは、ＨＳＶ−２糖タンパク質をコードするＤＮＡは、プライミング調製物で使用され得、ブースティング調製物は不活化ＨＳＶ−２であり得る。別の説明的な例を挙げると、プライミング調製物はＨＳＶ−２抗原をコードするベクターであり得、ブースティング調製物は、抗原のタンパク質形態を含み得、逆もまた可能である。

ある種の実施形態では、抗原はＨＳＶ−２抗原である。適切なＨＳＶ−２抗原としては、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥ、またはｇＤ糖タンパク質またはその誘導体またはＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ３６などの前初期タンパク質があるが、これらに限定される訳ではない。一実施形態ではＨＳＶ−２抗原はｇＤ糖タンパク質である。ｇＤ糖タンパク質は、タンパク質の完全長形態（例えば、配列番号３）またはｇＤの細胞外ドメインなどの短縮形態、またはその免疫原性フラグメントであり得る。ＨＳＶ−２糖タンパク質（例えば、ｇＤ糖タンパク質）の短縮形態は、該糖タンパク質を発現する細胞により分泌される短縮形態を含み得る。例えば、一部の実施形態では、抗原は、ｇＤタンパク質のアミノ酸１〜３１４から成るｇＤの細胞外ドメインである。他の実施形態では、抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含むｇＤの細胞外ドメインである。ｇＤの完全長または短縮形態の改変体も使用され得る。例えば、一実施形態において、ｇＤ糖タンパク質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の配列を含む。ＨＳＶ−２糖タンパク質（例えば、ｇＤ糖タンパク質）の完全長または短縮形態は、シグナルペプチドおよび／または精製タグ（例えば、ヒスチジンまたはｃ−ｍｙｃタグ）を含み得る。ある種の実施形態では、抗原をコードする配列は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞での発現用に最適化される。例えば、ヒト細胞での最適化のため、内部ＴＡＴＡ−ボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、高ＡＴまたは高ＧＣ配列伸長部、ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライスドナーおよびアクセプター部位、および分岐点などのシス作用性モチーフが、抗原をコードする配列から排除または数の上で低減される。一実施形態では、適切なヒトコドン最適化ｇＤ配列は、配列番号１の配列を含む。

以下は、本発明の方法を用いて他の病原体に対して防御的または治療的免疫を誘導するために本発明の方法で使用され得る追加的抗原を説明する例である。

前記抗原は、ＨＩＶ−１、（例えばｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖなど）、ヒト単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）（例えばｇＨ、ｇＬ ｇＭ ｇＢ ｇＣ ｇＫ ｇＥまたはｇＤまたはその誘導体またはＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６などの前初期タンパク質）、サイトメガロウイルス、特にヒト、（ｇＢまたはその誘導体など）、エプスタイン・バールウイルス（ｇｐ３５０またはその誘導体など）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３など）から、または肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原またはｐｏｌ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原およびＥ型肝炎ウイルス抗原などから、または他のウイルス性病原体、例えばパラミクソウイルス類：ＲＳ（呼吸器多核体）ウイルス（ＦおよびＧタンパク質またはその誘導体）、またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばＨＰＶ６、１１、１６、１８；例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７タンパク質）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞（ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭタンパク質、またはその組合せなど）に由来する抗原、または細菌性病原体、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ［Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、トランスフェリン結合性タンパク質、ラクトフェリン結合性タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含む］；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えばＭタンパク質またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ［Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、別名Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば高分子量および低分子量アドヘシンおよびインバシン）を含む］；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ［百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（例えばパータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、繊維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含む］；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．［結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（例えばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、ヨーネ菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含む］；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ［Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含む］；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ［腸管毒性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えばコロニー形成因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含む］；Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ［コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ）（例えばコレラ毒素またはその誘導体）を含む］；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ［Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉを含む］；Ｙｅｒｓｉｎｉａ
ｓｐｐ［Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（例えばＹｏｐタンパク質）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む］；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ［Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（例えば毒素、アドヘシンおよびインバシン）およびＣ．ｃｏｌｉを含む］；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ［Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含む］；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．［Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む］；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ［ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含む］；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ［Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む］；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．［Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含む］；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．［Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍを含む］；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．［破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（例えばクロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）を含む］；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．［Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む］；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．［ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）を含む］；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．［Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉを含む］；Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．［Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球エーリキア症の因子を含む］；Ｒｉｃｋｅｔｓｉａ ｓｐｐ［Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉを含む］；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．［Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉを含む］；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．［Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含む］；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．［Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ（例えば希外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含む］；またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．［Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含む］；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．［Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（例えばＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含む］；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｓｐｐ．［Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａを含む］；Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．［Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉを含む］；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．［Ｔ．ｃｒｕｚｉを含む］；Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．［Ｇ．ｌａｍｂｌｉａを含む］；Ｌｅｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．［Ｌ．ｍａｊｏｒを含む］；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．［Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを含む］；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．［Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを含む］；Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．［Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉを含む］などの寄生虫に由来するか、またはＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．［Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを含む］；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．［Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む］などの酵母に由来する抗原などから誘導され得る。

一部の実施形態では、２以上の抗原が、本発明の免疫化方法およびキットにおいて使用され得る。プライミング調製物および核酸成分を有するブースティング調製物では、それら２以上の抗原は融合タンパク質であり得、完全長抗原性タンパク質またはその免疫原性フラグメントのいずれかが単一読み取り枠から発現される（例えば、単一転写物として発現される）。他の実施形態では、それら２以上の抗原は、単一プロモーターまたは種々のプロモーターの制御下、異なる読み取り枠から発現され（例えば、別々の転写物として発現され）得る。ブースティング調製物では、それら２以上の抗原は、抗原の混合物として、または１以上の融合タンパク質として存在し得る。それら２以上の抗原は、単一病原体または複数の病原体に由来し得る。

結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）についての他の好ましい特異的抗原は、例えばＲｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦｓ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１、（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ １６ｋＤａｌ．、Ｔｂ Ｒａ１２、Ｔｂ Ｈ９、Ｔｂ Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１である（国際公開第９９／５１７４８号）。また、結核菌についてのタンパク質には、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の少なくとも２、好ましくは３ポリペプチドがより大きなタンパク質に融合されている融合タンパク質およびその改変体が含まれる。好ましい融合体には、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩがある（国際公開第９９／５１７４８号）。クラミジアについての最も好ましい抗原には、例えば高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（国際公開第９９／１７７４１号）、ＯＲＦ３（欧州特許第３６６４１２号）、および推定的膜タンパク質（Ｐｍｐ）がある。ワクチン処方物の他のクラミジア抗原は、国際公開第９９／２８４７５号記載の群から選択され得る。

好ましい細菌性ワクチンは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合性タンパク質）を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ由来の抗原およびタンパク質抗原ニューモリシン（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１９８９、６７、１００７；Ｒｕｂｉｎｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２５、３３７−３４２）、およびその変異無毒化誘導体（国際公開第９０／０６９５１号；国際公開第９９／０３８８４号）を含む。他の好ましい細菌性ワクチンは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（例えばＰＲＰおよびそのコンジュゲート）、分類不可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、例えばＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、およびフィンブリンおよびフィンブリン由来のペプチド（米国特許第５，８４３，４６４号）またはその多コピー改変体もしくは融合タンパク質を含む、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐに由来する抗原を含む。

本発明で使用され得る抗原は、マラリアを誘発する寄生虫に由来する抗原をさらに含み得る。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来の好ましい抗原には、ＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰがある。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原にＢ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４アミノ酸を介して結合されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全てのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質である。その完全構造は、英国特許出願９１２４３９０．７号からの優先権を主張している国際公開第９３／１０１５２号のもとで公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号に開示されている。ＲＴＳは、酵母で発現されたとき、リポタンパク質粒子として生成され、またＲＴＳは、ＨＢＶからのＳ抗原と共に発現されたとき、ＲＴＳ，Ｓとして知られている混合粒子を生成する。ＴＲＡＰ抗原は、国際公開第９０／０１４９６号のもとで公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号に記載されている。本発明の好ましい実施形態はマラリアワクチンであり、その抗原性調製物はＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含む。多段階マラリアワクチンの成分であると思われる候補である他のマラリア原虫抗原は、Ｐ．ｆａｃｉｐａｒｕｍ ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セケストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐにおけるそれらの類似体である。

本発明のワクチンはまた、アレルギーまたは感染性疾患に加えて慢性障害の予防または治療にも使用され得る。かかる慢性障害は、喘息、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病などの疾患ならびに他の自己免疫障害である。避妊薬として使用されるワクチンも考えられる。

アルツハイマー型神経変性疾患に罹りやすいか、または罹患している患者の予防および治療に関連している抗原は、特に、Ｎ末端３９〜４３アミノ酸フラグメント（Ａβ）、アミロイド前駆体タンパク質およびより小さいフラグメントである。この抗原は、国際特許出願第ＷＯ９９／２７９４４号−−（Ａｔｈｅｎａ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に開示されている。

自己免疫障害用ワクチンとして、または避妊薬ワクチンとして含まれ得る潜在的自己抗原としては、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子または細胞外タンパク質、より好ましくは４−へリックス型サイトカイン、最も好ましくはＩＬ１３がある。サイトカイン類には、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦおよびＯＳＭがある。４−へリックス型サイトカイン類には、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭＣＳＦおよびＭＣＳＦがある。ホルモン類には、例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ＶＧＦ、グレリン、アグーチ、アグーチ関連タンパク質およびニューロペプチドＹがある。成長因子には、例えば、ＶＥＧＦがある。

プライミング調製物またはブースティング調製物で使用される核酸は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列、最も好ましくは、ｃＤＮＡ配列である。哺乳動物細胞内における抗原性ペプチドの発現を取得するためには、抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクター系に提供されることが必要である。本明細書で使用される場合、「適切なベクター」によって、免疫応答を誘発するのに十分な量で哺乳動物内において抗原性ペプチドを発現させることができるあらゆるベクターが意味される。

例えば、選択されたベクターは、プラスミド、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）またはウイルスベクターであり得る。ベクターは、抗原性ペプチドの発現を取得するため正確な順序で配置されたプロモーターおよびポリアデニル化／転写終結配列を含み得る。一実施形態では、ベクターは、プラスミド（例えば、ｐＤＮＡＶＡＣＣ）である。これらの成分およびエンハンサー、制限酵素部位および選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子などの必要に応じた他の成分を含むベクターの構築は、当業者には周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ、１−３巻，第２版、１９８９において詳細に説明されている。

ある種の実施形態では、プライミング調製物または核酸成分を伴うブースティング調製物中の核酸は、プロモーターの制御下でＨＳＶ−２抗原をコードするベクターである。本明細書で使用される場合、「〜の制御下で」または「機能し得るように結合された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写およびポリヌクレオチドの発現の開始を制御すべく抗原をコードするポリヌクレオチドに関して正確な位置および配向であることを意味する。該ベクターでの使用に適したプロモーターには、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、およびｐｏｌ ＩＩＩプロモーターがあるが、これらに限定される訳ではない。ある種の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、好ましくはＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターである。ＨＳＶ−２抗原をコードする配列は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化され得る。ある種の実施形態では、ベクターは、完全長のヒトコドン最適化ｇＤ糖タンパク質をコードする。一実施形態では、完全長ｇＤ糖タンパク質ヒトコドン最適化配列は、配列番号１の配列を含む。

抗原性ペプチドをコードする核酸を運ぶベクターは、様々な方法で投与され得る。ベクターを、裸の形態（すなわち、リポソーム処方物とも、ウイルスベクターまたはトランスフェクション促進性タンパク質とも結合されていない裸のヌクレオチド配列として）で適切な媒質、例えば、ＰＢＳなどの緩衝食塩水溶液に懸濁し、次いで筋肉内、皮下、皮内または粘膜に注射するか、または遺伝子銃または他の電気的（すなわち、エレクトロポーテーション）装置を用いて投与することが可能である。さらに、ベクターを、鼻もしくは肺経路で投与するために、例えば、リポソームにより、またはポリラクチド・コ−グリコリド（ＰＬＧ）粒子内に封入することも可能である。好ましい実施形態では、ＨＳＶ−２抗原をコードする核酸を運ぶベクターは、筋肉内経路により裸の形態で投与される。

また、本発明の一実施形態によると、好ましくは遺伝子銃（特に粒子衝撃）投与技術の使用によるベクターの皮内投与も可能である。かかる技術は、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：３７−４２（１９９６）に記載されたように、金ビーズにベクターをコーティングし、次いで高圧下で表皮に投与することを含み得る。

組換えウイルスベクターはまた、ＤＮＡ抗原を送達するのに使用され得る。このアプローチによる利点としては、多くの細胞型におけるＤＮＡコード化タンパク質の豊富な発現、ＣＴＬ応答の強い促進およびウイルスが多くの遺伝子をコードできることが挙げられる。ワクシニアウイルス（修飾ウイルスＡｎｋａｒａを含む）およびアデノウイルス（非複製性）は、ワクチン開発に使用される２つの人気の高いウイルスである（ＩｍおよびＨａｎｋｅ、Ｅｘｐｅｒｔ，Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ３：Ｓ８９−Ｓ９７（２００４）；Ｂａｓａｋら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１８２−１９６（２００４））。

ＤＮＡワクチンの最近の改良には、単ＣＴＬエピトープをコードするミニ遺伝子の開発、ＭＨＣ経路によるエピトープのより効率的な提示を可能にする遺伝子コード化標的化シグナルの使用およびＭＨＣクラスＩＩ経路を標的とするための分泌タンパク質の生成がある（Ｄｏｒｉａ−ＲｏｓｅおよびＨａｉｇｗｏｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１：２０７−２１６（２００３）；Ｌｅｉｆｅｒｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：４０−５３（２００４））。

ある種の実施形態では、ブースティング調製物は、リポソームに封入されたタンパク質抗原を含む。ブースティング調製物中の抗原は、一部の実施形態では、プライミング調製物および核酸成分を有するブースティング調製物中の核酸によりコードされる抗原と同じ抗原である。一実施形態では、ブースティング調製物は、リポソームに封入されたＨＳＶ−２抗原を含む。別の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原はｇＤ糖タンパク質である。このｇＤ糖タンパク質は、完全長糖タンパク質またはその免疫原性フラグメントであり得る。例えば、ある種の実施形態では、ブースト調製物（例えば、第１および第２ブースティング調製物）中のリポソームに封入された抗原は、ｇＤタンパク質のアミノ酸１〜３１４を含むｇＤの細胞外ドメインである。他の実施形態では、抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含むｇＤの細胞外ドメインである。

リポソームは、ワクチン用送達プラットホームとして幾つかの潜在的利点を有する。リポソーム内における抗原の封入はこれらの抗原を隔離するもので、したがって、リポソームは、持続的抗原放出が可能な抗原デポーとしての役割を果たす。さらに、リポソームは生体適合性および生物分解性であり、かつ低毒性および低免疫原性である。適切なサイズ（例えば、＞０．２μｍかつ５μｍ以下）であるとき、リポソームは、体内の抗原提示細胞により選択的に取り込まれるため、体液性抗体応答およびＣＴＬ応答の両方を誘導する可能性を有する。リポソームは、抗原担体／ビヒクルとしての役割を果たし、また毒性または免疫原性を伴わない反復投与することができるアジュバントでもある。

リポソームは、通常球形状をした、生物起源または合成起源のリン脂質で構成される膜２分子層から成る構造物である。リン脂質または脂質が水と接触したとき、リポソームは自然に形成される。リポソームの構造は、熱、音波エネルギー形態でのエネルギーの投入、凍結解凍サイクル、またはせん断力を含む、実験室でリポソームを形成させる方法により操作され得る。リポソームのリン脂質二分子膜は、内部水性コア中に捕捉された材料を外部から隔離し、保護する。水溶性および水不溶性物質は両方とも異なる区画、同じリポソームの水性コアおよび二分子膜にそれぞれ捕捉され得る。前記物質はこれらの異なる区画中にあるため、これらの物質の化学的および物理的相互作用を排除することができる。

本発明の方法およびキットで使用されるリポソームは、当該分野で公知の任意の方法を用いて調製され得る。これらのリポソームは、約０．５〜５ミクロン、約２〜４ミクロン、または約１〜４ミクロンの平均直径を有し得る。また、場合によっては、約０．２〜８ミクロンのリポソームが有用なこともある。ある種の実施形態において、本発明の方法およびキットで使用され得るリポソームは、（例えば、負に荷電された）陰イオン性リポソームである。リポソームの電荷は、イオン性脂質を組み込むことにより操作され得る。例えば、米国特許第５，２９０，５６３号参照、これは本明細書に参考として組み込まれる。例えば、リン酸ジセチルを組み込むことにより、リポソームに負の電荷を付与する。一実施形態において、ブースト調製物で使用されるリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含む陰イオン性リポソームである。別の実施形態では、リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびリン酸ジセチルを、７：３：０．５モル％の比率で含む。一部の実施形態では、ブースト調製物で使用されるリポソームは脂質から成り、すなわち、リポソームが、さらなるタンパク質、リガンドまたはアジュバントを含むことはない。例えば、一実施形態において、リポソームは、非融合誘導性リポソームである（すなわち、リポソーム膜に組み込まれたウイルスタンパク質などのタンパク質を一切含まない）。

例を挙げると、本発明の方法およびキットにおけるブースティング調製物で使用され得るリポソームの一製造方法は、以下のごとく報告されている。対象発明のリポソームは、以下の脂質濃度で調製される：ホスファチジルコリン／コレステロール／リン酸ジセチル７／３／０．５モル％。リン酸ジセチルをクロロホルム＋５％のエタノールに溶解し、音波処理し、次いでホスファチジルコリンおよびコレステロールを加える。脂質をＬａｂｃｏｎｃｏロータリーエバポレータで１時間乾燥し、一晩Ｆｒｅｅｚｏｎｅ４．５Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙ Ｓｙｓｔｅｍでの凍結乾燥により、クロロホルムの痕跡を除去する。脂質薄膜を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ）中１２５〜３００μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＳＶ−２からのｇＤ糖タンパク質（ｇＤ）などの抗原と水和し、０．２μｍナイロンフィルターで濾過する。混合物を徹底的にボルテックスし、１時間放置し、次いで再びボルテックスすることにより、多重ラメラ小胞の形成を確実にする。次いで、生成したリポソームを、３回の凍結および解凍サイクル（１サイクル＝１時間冷凍および１時間室温で解凍）にかける。リポソームのサイズを、Ｎ４ ＭＤ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）で測定する。５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１．０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中でＺｅｔａ−Ｐｕｌｓゼータ電位分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ゼータ電位を測定した。２ミクロン未満の特定平均直径を有するリポソームを得るため、３回目の凍結解凍サイクルの後、リポソームを水浴中で５０℃に温め、孔サイズが１．０μｍのポリカーボネートフィルターに通して押し出すことにより、平均直径が約１．０μｍのリポソームを得ることができる。前記リポソームをさらに押し出すことにより小さなサイズのリポソームを得ることができ、例えば、手持ち式Ａｖａｎｔｉマイクロ押し出し成形機を用いてリポソームを、孔サイズが０．４μｍおよび最後には０．２μｍのポリカーボネートフィルターに通してさらに押し出すことにより、平均直径が約０．２μｍのリポソームを得ることができる。

ある種の実施形態において、本発明の方法およびキットで使用され得るリポソームは、「長期循環リポソーム」（別名「立体安定化リポソーム」）であり、これらは１つ以上の特殊化した脂質を含むリポソームであって、前記脂質がリポソームに組み込まれたとき、かかる特殊化脂質を欠くリポソームに比べて長い循環寿命が得られる。当該分野で公知の長期循環リポソームの例としては、リポソームが、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など、１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された１つ以上の脂質を含むものがある。理論に縛られるのは望むところではないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ−誘導体化脂質を含む長期循環リポソームの場合、これらのリポソームの向上した循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの低減によるものである（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５）。

１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該分野では知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸エステルおよびホスファチジルイノシトールが呈するリポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８、８５、６９４９）に基づいて説明された。米国特許第４，８３７，０２８号および公開されたＰＣＴ出願国際公開第８８／０４９２４号（両方ともＡｌｌｅｎら）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。

１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該分野では公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗浄剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８４、１６７、７９）は、ポリマー性グリコールでポリスチレン粒子を親水性コーティングすることにより、血中半減期が著しく向上することに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質およびかかるリン脂質を含むリポソームは、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．、１９９０、２６８、２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血中循環半減期の著しい増大を示すことを実証する実験について報告した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１）は、上記の観察報告を、ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）へのＰＥＧの化学結合から形成される他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧまで拡大した。

外部表面に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号および公開されたＰＣＴ出願国際公開第９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。１〜２０モルパーセント（ｍｏｌ％）のＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号）により記載されている。幾つかの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願国際公開第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎら）および公開されたＰＣＴ出願国際公開第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、公開されたＰＣＴ出願国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面が官能性部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載している。

ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含む様々なリポソームが、記載されている。しがしながら、一般的に、かかるリポソームは、約１０％以上のｍｏｌ％でＤＭＰＧを含有する（例えば、Ａｋｈｔａｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９１、１９、５５５１；Ｙａｃｈｉら（Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．、１９９６、１７、６９９；およびＦａｒｍｅｒら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１９８７、１４９、１８４参照）。３ｍｏｌ％のＤＭＰＧを有するリポソームも記載されているが、かかるリポソームは、本発明のリポソーム組成物では見い出されない成分（特に、ホスファチジルコリン誘導体）を含んでいた。このホスファチジルコリン誘導体成分には、例えば、１０ｍｏｌ％のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（Ｂｒｏｄｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９８９、２８、５４）または７ｍｏｌ％のジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．、１９８５、２６、７４３；Ｗａｓａｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９３、３７、２４６；およびＬｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓ．、１９９５、７、６１１）が含まれる。

リポソーム調製物は、新たに調製してもよいし、または長期貯蔵用に凍結乾燥してもよい。両調製物とも、同等の有効性で使用され得る。本発明の方法で使用されるリポソームは、全て同じ（例えば、同じ組成または同じサイズ）であり得るか、または複数タイプのリポソームを含み得る。

ある種の実施形態では、市販されているリポソームを使用することができる。例えば、リポソームは、脂質に基づくリポソーム処方物の開発を専門とする医薬品開発業務受託機関である、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（バンクーバー、ブリティッシュ・コロンビア）による契約のもとで作製され得る。ある種の他の実施形態では、様々なサイズのリポソームを、以下に記載する方法を用いて調製することができる。具体的な調製プロトコルしだいで、生成されるリポソームは、調製物をマイクロフルイダイザーに通すことにより、典型的には約０．５μｍと５μｍの間、例えば、４μｍ、１μｍまたは０．２μｍのサイズにされる。簡単に述べると、負に荷電したリポソームは、次の脂質濃度で調製され得る：ホスファチジルコリン／コレステロール／リン酸ジセチル７／３／０．５ｍｏｌｅ％。ＨＳＶ−２抗原などの抗原（例えば、ＨＳＶ−２のｇＤ糖タンパク質）は、免疫応答の試験のために幾つかの濃度で多重薄層リポソームに組み込まれる。リポソームサイズは、Ｎ４ ＭＣ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）で測定され得る。ある種の実施形態では、抗原調製物を、貯蔵のために凍結乾燥し、次いで使用前に再構成することができる。サイズおよびζ−電位（ゼータ、電荷の尺度）は両方とも、使用前に測定してもよい。ζ−電位は、Ｚｅｔａ−Ｐｕｌｓζ−電位分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定され得る。脂質：抗原タンパク質比率は、特異的抗原（例えば、ＨＳＶ−２のｇＤ）に対する免疫応答に対するこの比率の重要性を決定するために一部の調製物において変えられ得る。

プライミング調製物およびブースティング調製物は、予防的または治療的に有効となる量で投与される。正確な量は、免疫化されている動物の種および体重、投与経路、プライミング調製物およびブースティング調製物の効力および用量、処置されているかまたは防御の対象となっている疾患状態の性質、被験体の免疫系が免疫応答を生じる能力および所望の防御または治療有効性の程度によってかなり変動し得る。これらの変数に基づき、開業医または獣医であれば、容易に適切な投薬レベルを決定することができる。以下の例では、プライミング調製物および第２ブースティング調製物で使用されるＨＳＶ−２からのｇＤ糖タンパク質をコードするＤＮＡベクターの適切な用量は、モルモットについては約５０μｇ〜１００μｇであることが決定された。当業者であれば、過度の実験を行わずとも、これらの用量をヒトでの使用に適した用量に応じて換算することができる。例えば、ヒトで使用するためのＨＳＶ−２ｇＤタンパク質をコードするＤＮＡベクターの適切な用量は、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、または約１ｍｇ〜約５ｍｇであり得る。正確な投薬量は、使用されるベクターのタイプ、プロモーター、抗原の発現レベル、投与方法、ならびに抗原ヌクレオチド配列のコドン最適化のタイプおよびレベルにより異なる。以下の実施例において、ブースティング調製物で使用されるリポソーム封入ＨＳＶ−２ｇＤ糖タンパク質の適切な用量は、モルモットの場合約３０μｇ／１００μｌであることが決定された。ＤＮＡベクターの用量と同様、ブースティング調製物についてのこれらの用量は、ヒトでの使用に向けて適切に調整され得る。リポソーム封入ｇＤ抗原についての適切なヒト用量は、約３〜６μｇ／１００〜４００μｌ、例えば約３μｇ／１００μｌ〜約６μｇ／１００μｌであり得る。

本発明による方法およびキットは、例えば、家畜、実験動物、農場動物、捕獲野生動物、および最も好ましくはヒトを含め、全ての動物の予防手順または処置手順に関して使用され得る。

本発明の方法およびキットはまた、当該分野で公知の１種以上のアジュバントを加えて実施され得るものと考えられる。しかしながら、一部の実施形態では、ブースティング調製物に追加的アジュバントは含まれない。本発明者らは、本明細書で提供されている新規方法が、リポソーム以外にアジュバントを必要とすることなく、したがって多くのアジュバント、特にコレラ毒素（ＣＴ）およびＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）などの細菌性毒素に付随する危険性および合併症を回避しながら、所望の免疫応答を達成することを発見した。

アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することにより抗原に対する特異的免疫応答を増大させる物質または手順である。アジュバントの例としては、ミョウバン塩類などの塩に基づくアジュバント、リポ多糖類および細菌性毒素など細菌に由来するアジュバント、抗原のゆっくりした放出を可能にするアジュバントエマルジョン、共刺激分子に対するアゴニスト（ａｇｏｎｓｉｔｉｃ）抗体、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、および組換え／合成アジュバントがある。一特定実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、特にＴＬＲ−４、例えばモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、またはＲ８３７などのＴＬＲ−７リガンドである。最近では、ＴＬＲ−４およびＴＬＲ−７リガンドをナノ粒子処方物と組み合わせると、免疫化後に抗原と投与したとき、抗体応答が増強および延長されることが報告されている（Ｋａｓｔｕｒｉら、（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ、第４７０巻：５４３−５６０）。したがって、ＴＬＲ−４リガンドおよび／またはＴＬＲ−７リガンドは、本発明のプライミング調製物および／またはブースティング調製物に含まれ得る。ミョウバンは、タンパク質ワクチンに対する免疫応答を刺激するのに使用される最も一般的な塩に基づくアジュバントであり、合衆国においてヒト使用について認可された唯一のアジュバントである（Ａｌｖｉｎｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０（３）：Ｓ５６−Ｓ６４（２００２）；Ｈｕｎｔｅｒ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０（３）：Ｓ７−１２（２００２））。しかしながら、ミョウバンは、Ｔｈ２偏向応答に有利であり、細胞媒介性免疫を刺激することはない。粘膜免疫は、コレラ毒素（ＣＴ）およびＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）などの細菌性毒素の使用を通して誘導され得るが、これらのアジュバントの安全性は疑わしい（Ａｌｖｉｎｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ
２０（３）：Ｓ５６−Ｓ６４（２００２）；Ｈｕｎｔｅｒ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０（３）：Ｓ７−１２（２００２））。より新しく、より安全なアジュバントの開発は、最近では特定の免疫応答経路を刺激することに焦点を絞っている。インターフェロン−γおよび顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインの共投与は、細胞性免疫応答の刺激において有望であることが示されている（ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８２：４８８−４９６（２００４）で検討されている）。しかしながら、高レベルのサイトカインは毒性を誘発し得るため、投薬レジメンを注意深く調節しなければならない。サイトカインの投与はＤＮＡワクチン接種について特に有望であり、この場合サイトカインおよび抗原の両方をコードする遺伝子を、同一ベクターにより同時に発現させることができる。調査されているさらなるアジュバントには、ｔｏｌｌシグナル伝達経路を標的とするものがある。細菌性ＤＮＡで通常見い出されるＣｐＧ ＤＮＡモチーフは、細胞性免疫応答の強力な活性化因子であり、さらに新しい世代のＤＮＡに基づくワクチンは、複数のＣｐＧモチーフをコードすることが多い（ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．８２：４８８−４９６（２００４）で検討されている）。

以下のさらなる実施例により、本発明についてさらに説明するが、それらの実施例は限定的なものとしてみなされるべきではない。当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示されている具体的な実施形態に加えられ得、それでもなお同様または類似した結果が得られることを認めるはずである。

実施例１．ウイルス感染モルモットにおける粘膜単純ヘルペスウイルス２型ワクチンの有効性
以前、本発明者らは、粘膜ＨＳＶ−２ワクチンが、ＨＳＶ−２ウイルス感染モルモットにおける陰部ヘルペスの再発を著しく低減することを示し、それによってワクチンの治療有効性を実証した。米国特許公開第２０１２／００２７８４１Ａ１号参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。この実施例において、本発明者らは、確立されたＨＳＶ−２感染後４週間のモルモットにおいて、ミョウバンおよびＭＰＬを含むＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチンと、筋肉内投与されたＨＳＶ−２ｇＤ抗原をコードするＤＮＡベクターおよび鼻腔内投与されたリポソーム封入ｇＤタンパク質抗原から成る粘膜ＨＳＶ−２ワクチン（すなわち、ＢＲＭワクチン）の治療有効性を比較した。モルモットモデルは、陰部ヘルペスを研究するために最も汎用されている動物モデルの一つである（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら（１９８５）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２４（４）巻：２２６−２３１；Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら（１９８２）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、第１４６（３）巻：３９７−４０４）。ヒトと同様、モルモットモデルは、重篤な生殖器病変を伴う初期急性感染症、その後の自然発生的再発事象を特徴とし、予防用および治療用の両ワクチンを評価するため広く使用されてきた。

以前、本発明者らは、実験に使われたことがないＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットにおいて３つの異なる感染用量（１×１０^６、２×１０^５および２×１０^４ｐｆｕ／動物）でＭＳ株を投与することによりＨＳＶ−２感染の潜伏性を確立するのに成功した。２×１０^５ｐｆｕ ＨＳＶ−２／動物の用量により死に至った動物はより少なく、この試験用の動物においてＨＳＶ−２感染を確立するのにこの感染用量を選択した。モルモットに２×１０^５ｐｆｕ ＨＳＶ−２／動物（ＭＳ株）の用量で膣内接種を行った。疾患の臨床徴候および病的状態を感染後毎日モニターした。臨床徴候を以下の尺度にしたがってスコア付けした：０＝疾患の臨床徴候無し（目に見える赤みまたは病変無し）、１＝膣紅斑（赤みまたは軽度の腫脹）、２＝１または数カ所の軽度のヘルペス病変（びらん、小水疱または中等度の腫脹）、３＝幾つかの大きいかまたは融合した水疱、４＝重篤な浸軟および／または尿閉および／または後肢麻痺を伴う大きな潰瘍、５＝死体で発見。臨床スコア４に達した動物は即座に安楽死させた。感染後２日目、４日目および２１日目に集めた膣スワブをプラークアッセイにより分析して、ウイルス感染および複製が膣腔において成功裏に行われているか否かを確認した。成功裏に感染したモルモットは、急性期中２〜３の臨床スコア範囲の疾患の臨床徴候を示し、これらを感染後２８日目に３処置群に無作為に分けた（ｎ＝１０〜１２／群）。処置前の再発（病変の出現）率の点で３群間に有意な差は無かった（図１）。

３処置群のそれぞれについて、以下のうちの１つで免疫化を行った：下表および図２の概略図で示されているところの粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）、ＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン（参照ワクチン）、またはビヒクル対照。

粘膜ワクチンにおけるプライム（ｇＤ−ＤＮＡ）は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下でコドン最適化完全長ｇＤ糖タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドベクターであり、ＢＲＭワクチン群において感染後２８日目と３０日目に筋肉内投与された（１モルモット当たり合計１００μｇのＤＮＡ；１日当たり動物当たり５０μｇ）。ｇＤ−ＤＮＡベクターは、第２ブースト調製物の一部として感染後５８日目に再び筋肉内投与された（２×５０μｇ／２００ｕｌ／足；１モルモット当たり合計１００μｇのＤＮＡ）。ｇＤ遺伝子を伴わないプラスミド（ＤＮＡベクター）は、ｇＤ−ＤＮＡベクターと同じ用量、頻度および経路でビヒクル対照群中の動物に投与された。

粘膜ワクチンにおけるブースト調製物（ｇＤ−ｌｉｐ）は、ｇＤ糖タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜３１４）を封入する負に荷電されたリポソームの調製物であり、ＢＲＭワクチン群において感染後４４日目と５８日目に鼻腔内投与された（３０μｇ／１００μｌ／動物、５０μｇ／鼻孔）。負に荷電された空のリポソームの調製物（Ｌｉｐビヒクル）は、ｇＤ−ｌｉｐ調製物と同じ用量、頻度および経路でビヒクル対照群の動物に投与された。

参照ワクチン（ＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチン）の各用量は、５μｇのｇＤ糖タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜３０６）、１２５μｇのミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、および１２．５μｇのモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含んでいた。ＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチンは、参照ワクチン群の動物に感染後２９日目、４４日目および５８日目に皮下投与された。

血清および膣スワブ試料を、感染後３週間の２１日目（プライムの７日前）、４２日目（第１ブーストの直前）、５６日目（第２ブーストの直前）、および８３日目（試験の最後）にモルモットのワクチン接種群および非ワクチン接種群から集めた。試料をＥＬＩＳＡで分析して、血清および膣抗体応答を評価した。３処置群のそれぞれについての抗原特異的（ＨＳＶ−２ｇＤ）ＩｇＧ抗体血清応答を図３Ａに示す。結果は、参照ＨＳＶ−２サブユニットワクチンが血清中抗原特異的ＩｇＧの急速な増大を誘導した一方、粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）が血清中抗原特異的ＩｇＧレベルのより緩徐な増大を生じさせたことを示す。しかしながら、粘膜ワクチンは、感染後８３日目にビヒクル対照群と比較して抗ＨＳＶ−２ｇＤ膣ＩｇＧ抗体のおよそ１０倍増大を誘導した一方、ＨＳＶ−２サブユニットワクチンはより中等度の増大を誘導した（図３Ｂ）。重要なことに、粘膜ワクチンのみ、抗原特異的膣ＩｇＡ抗体の著しい増大を誘導した（図４）。非ワクチン接種動物またはサブユニットワクチンをワクチン接種された動物では、膣ＩｇＡの増大は全く観察されなかった。

膣スワブ試料のＨＳＶ−２ ＤＮＡコピーについてＲＴ−ＰＣＲによりウイルス排出を評価した。図５は、感染後８３日目でＨＳＶ−２ ＤＮＡについて陽性であった（５コピーより多いＨＳＶ−２ＤＮＡ）各処置群からの試料のパーセンテージを示す。粘膜ワクチン（ＢＲＭワクチン）を受けた動物では、非ワクチン接種動物またはサブユニット参照ワクチンを受けた動物の場合と比べて、ウイルスについて陽性であった膣試料のパーセンテージが著しく低かったことから、粘膜ワクチンは膣ウイルス排出の量を実質上低減させることが示された。ＢＲＭワクチンにより誘導される強い粘膜抗体応答は、このワクチンで観察されるウイルス排出の低減に貢献し得る。

一次感染後、ＨＳＶ−２は、仙骨神経節で潜伏的感染を引き起こし、ウイルスの再活性化が個体の生涯にわたって定期的に起こり、その結果、再発性疾患または初期ウイルス感染に対する免疫応答の存在下でさえ起こる明白でないウイルス排出が誘発され得る（ＷｈｉｔｌｅｙおよびＲｏｉｚｍａｎ（２００１）Ｌａｎｃｅｔ、第３５７巻（９２６７）：１５１３−１５１８）。成功裏の治療用ワクチンとは、定期的な再発を予防するかまたは著しく低減させるものでなければならない。感染モルモットの免疫化後、自然発生的な再発性ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の証拠について動物を２５日間観察した。再発エピソードを、各群について１モルモット当たりの累積的再発（病変の出現）として数え、再発が観察された日数について調整した。図６は、プライミング用量投与後および第１ブーストの直前の一定期間（感染後１５日目〜４２日目）の各処置群における再発の数を示す。データは、粘膜ワクチン群におけるｇＤ−ＤＮＡベクターのプライミング用量の投与が、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発数の低減において急速な治療効果を有したことを示す。ｇＤ−ＤＮＡベクターのプライミング用量の投与により誘導されたＴ細胞応答（データは示さず）は、２８日目から４２日目までに観察されたこの急速かつ顕著な治療有効性と相関すると思われる。対照的に、ＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチンを受けた動物について、この参照ワクチンはこの期間の間抗ＨＳＶ−２ｇＤ血清ＩｇＧの顕著な増大を誘導したという事実にもかかわらず、再発数に対する効果は全く観察されなかった（図３Ａおよび図６を比較）。

図７は、プライミング用量の投与後から試験の最後までの一定期間（感染後２８日目〜８３日目）における各処置群での再発数を示している。これらのデータは、感染前モルモットへの粘膜ワクチンの投与により、非ワクチン接種動物およびＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチンを受けた動物と比較してＨＳＶ−２臨床疾患の再発数が著しく低減されたことを示す。図７の表は、ワクチン接種後、粘膜ワクチン群と他の２処置群との間の差異が高度に有意であることを示す（Ｐ＜０．０００１）。

要約すると、この実施例で記載した一連の実験の結果は、ＤＮＡおよびタンパク質抗原成分の両方を含む粘膜ワクチンが、感染動物において強い膣ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答を誘導し、膣ウイルス排出を低減させ、ヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発数を顕著かつ急速に低減させることを示している。対照的に、ミョウバンおよびＭＰＬアジュバントを含む皮下投与されたＨＳＶ−２ｇＤサブユニットワクチンは、強くて急速な血清ＩｇＧ抗体応答を誘導するが、顕著な粘膜抗体応答を誘導することはできない。サブユニットワクチンはまた、ウイルス排出を低減させず、粘膜ワクチンよりヘルペス（ｈｅｒｐａｔｉｃ）病変の再発数低減について有効性は劣っている。

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当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的実施形態と均等物である多くのものを認めるはずであり、または単なる慣用的実験を用いて確かめることができるはずである。かかる均等物のものは、後記請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。