JP2018081130A - 顕微鏡システムおよび標本観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標本の画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させる。
【解決手段】所定の距離間隔の第１ピッチで標本Ｓの深さ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得するとともに、第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで標本Ｓの深さ方向に異なる複数の解析用画像を取得するカメラ２１と、カメラ２１による解析用画像の取得と並行して、カメラ２１により取得されたレジストレーション用画像を標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施す画像処理部２７とを備える顕微鏡システム１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡システムおよび標本観察方法に関するものである。

従来、脳や肝臓等の臓器の全体を撮像し、サンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う研究が行われている。サンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行うために、画像処理（レジストレーション処理）により、取得した画像をサンプルもしくは臓器アトラスの位置や形状に合わせ込む画像処理装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。

例えば、顕微鏡によりマウスの脳の深さ方向に複数枚のスライス像を取得して脳全体の画像を生成し、生成した脳全体の画像にレジストレーション処理を施した後、サンプル間で比較および脳領域ごとに計測・解析するという流れで実験が行われる。

特開２０１５−０９１５２号公報 特開２０１５−９３１９２号公報

しかしながら、解析に適当な解像度で臓器全体の画像を取得するには長い時間を要し、また、レジストレーション処理も臓器全体の画像を取得する場合と同程度もしくはそれ以上に長い時間を要するため、作業全体の所要時間が長くなるという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本の画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させることができる顕微鏡システムおよび標本観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、所定の距離間隔の第１ピッチで標本の深さ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得するとともに、前記第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで前記標本の深さ方向に異なる複数の解析用画像を取得する画像取得部と、該画像取得部による前記解析用画像の取得と並行して、前記画像取得部により取得された前記レジストレーション用画像を前記標本に対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施す画像処理部とを備える顕微鏡システムである。

本態様によれば、画像取得部により、同一の標本に対して、第１ピッチで複数のレジストレーション用画像が取得されるとともに、第１ピッチよりも距離間隔が細かい第２ピッチで複数の解析用画像が取得される。また、画像取得部により取得された標本の複数のレジストレーション用画像が、画像処理部によりレジストレーション処理されて変換パラメータが算出される。したがって、画像取得部により取得された標本の複数の解析用画像に画像処理部により算出された変換パラメータを適用すれば、解析用画像を精度よく解析することができる。

この場合において、レジストレーション処理では、組織全体の位置・方向・形状等が分かればよく、比較的粗い距離間隔で取得された画像を用いても十分な精度の変換パラメータを算出することができる。したがって、処理時間が掛かるレジストレーション処理による変換パラメータの算出は、粗い距離間隔の第１ピッチで時間を掛けずに取得できるレジストレーション用画像を用いて行い、時間が掛かる細かい距離間隔の第２ピッチでの標本の複数の解析用画像の取得とレジストレーション処理とを並行して行うことで、従来のように、時間が掛かる細かい距離間隔で標本の深さ方向に異なる複数の観察画像を取得して、その観察画像に処理時間が掛かるレジストレーション処理を施していく場合と比較して、作業全体の所要時間を短縮することができる。これにより、標本の画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させることができる。

上記態様においては、前記画像取得部が、前記標本の種類と該標本の種類に応じた前記第１ピッチの前記距離間隔とが対応付けられたテーブルに基づいて、前記レジストレーション用画像を取得することとしてもよい。
このように構成することで、テーブルを参照するだけ簡易な作業により、観察対象の標本に適した第１ピッチでレジストレーション用画像を取得することができる。

上記態様においては、前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合に所定の第１蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射し、前記解析用画像を取得する場合に前記所定の第１蛍光色素とは異なる所定の第２蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射することとしてもよい。

このように構成することで、所定の第１蛍光色素と所定の第２蛍光色素とで標本を多重染色しておけば、レジストレーション用画像を取得する場合と解析用画像を取得する場合とで無駄な励起光を標本に照射せずに済み、蛍光の褪色を抑えることができる。また、励起光の波長を切り替えてレジストレーション用画像と解析用画像とを順次取得する場合に、画像取得の時間を削減することができる。

上記態様においては、前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像が取得されている深さ位置の前記解析用画像の取得を省略し、省略した前記深さ位置の前記解析用画像の代わりにその深さ位置の前記レジストレーション用画像を用いることとしてもよい。
このように構成することで、標本における同じ深さ位置の画像が重複して取得される無駄を省き、画像取得の所要時間を削減することができる。

上記態様においては、前記標本に照射される励起光の光路上に択一的に配置可能に設けられた倍率が異なる複数の対物レンズと、前記標本が載置され、かつ、前記対物レンズの対物光軸に交差する方向に移動可能な可動ステージとを備え、前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記解析用画像を取得する場合よりも低倍率の前記対物レンズを使用し、前記解析用画像を取得する場合は、前記標本における同一の深さ位置で前記第２ピッチごとに前記可動ステージを移動させて、前記対物光軸に交差する方向に異なる複数の前記解析用画像を取得することとしてもよい。

このように構成することで、高倍率の対物レンズを使って取得した対物光軸に交差する方向に異なる複数の解析用画像を貼り合わせることにより、解析用に対物光軸に交差する方向に分解能が高い画像を生成することができる。この場合において、レジストレーション用画像は低倍率の対物レンズを使用することで、レジストレーション用の画像取得の所要時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記標本上で励起光を走査させる走査部を備え、前記画像取得部が、前記解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数で前記レジストレーション用画像を取得することとしてもよい。
画像の画素数により、走査部によって１フレームを走査するのに掛かる時間が決まるので、このように構成することで、画素数を減らす分だけレジストレーション用画像の取得に要する時間を削減して、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記走査部により１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築することとしてもよい。
このように構成することで、走査ラインを間引く分だけレジストレーション用画像の取得に要する時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記標本上で励起光を走査させる走査部を備え、前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記走査部により１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築することとしてもよい。
このように構成することで、走査ラインを間引く分だけレジストレーション用画像の取得に要する時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

本発明の第２態様は、所定の距離間隔の第１ピッチで標本の深さ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得する第１取得ステップと、前記第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで前記標本の深さ方向に異なる複数の解析用画像を取得する第２取得ステップと、該第２取得ステップによる前記解析用画像の取得と並行して、前記第１取得ステップにより取得された前記レジストレーション用画像を前記標本に対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施すレジストレーション処理ステップとを含む標本観察方法である。

本態様によれば、第１取得ステップにより、第１ピッチで標本の複数のレジストレーション用画像が取得され、第２取得ステップにより第１ピッチよりも距離間隔が細かい第２ピッチで標本の複数の解析用画像が取得される。そして、第１ピッチで取得された標本の複数のレジストレーション用画像が、レジストレーション処理ステップによりレジストレーション処理されて変換パラメータが算出される。したがって、第２取得ステップにより取得された解析用画像にレジストレーション処理ステップにより算出された変換パラメータを適用すれば、解析用画像を精度よく解析することができる。

この場合において、処理時間が掛かるレジストレーション処理による変換パラメータの算出は、粗い距離間隔の第１ピッチで時間を掛けずに取得できるレジストレーション用画像を用いて行い、時間が掛かる細かい距離間隔の第２ピッチでの標本の複数の解析用画像の取得とレジストレーション処理とを並行して行うことで、従来と比較して、作業全体の所要時間を短縮することができる。これにより、標本の画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させることができる。

上記態様においては、前記第１取得ステップが、前記標本の種類と該標本の種類に応じた前記第１ピッチの前記距離間隔とが対応付けられたテーブルに基づいて、前記レジストレーション用画像を取得することとしてもよい。
このように構成することで、テーブルを参照するだけの簡易な作業により、観察対象の標本に適した第１ピッチでレジストレーション用画像を取得することができる。

上記態様においては、前記第１取得ステップが、所定の第１蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射し、前記第２取得ステップが、前記所定の第１蛍光色素とは異なる所定の第２蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射することとしてもよい。

このように構成することで、所定の第１蛍光色素と所定の第２蛍光色素とで標本を多重染色しておけば、第１取得ステップと第２取得ステップとで無駄な励起光を標本に照射せずに済み、蛍光の褪色を抑えることができる。

上記態様においては、前記第２取得ステップが、前記第１取得ステップにより前記レジストレーション用画像が取得されている深さ位置の前記解析用画像の取得を省略し、省略した前記深さ位置の前記解析用画像の代わりにその深さ位置の前記レジストレーション用画像を用いることとしてもよい。
このように構成することで、標本における同じ深さ位置の画像が重複して取得される無駄を省き、画像取得の所要時間を削減することができる。

上記態様においては、前記第１取得ステップが、前記第２取得ステップよりも低倍率の対物レンズを用いて前記レジストレーション用画像を取得し、前記第２取得ステップが、前記標本における同一の深さ位置で前記第２ピッチごとに前記対物レンズの光軸に交差する方向に異なる複数の前記解析用画像を取得することとしてもよい。

このように構成することで、高倍率の対物レンズを使って取得した対物レンズの光軸に交差する方向に異なる複数の解析用画像を貼り合わせることにより、解析用に対物レンズの光軸に交差する方向に分解能が高い画像を生成することができる。この場合において、レジストレーション用画像は低倍率の対物レンズを使用することで、レジストレーション用画像の取得に要する時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記第１取得ステップが、前記標本上で励起光を走査させて、前記第２取得ステップにより前記解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数で前記レジストレーション用画像を取得することとしてもよい。

画像の画素数により、１フレームを走査するのに掛かる時間が決まるので、このように構成することで、画素数を減らす分だけレジストレーション用の画像取得の所要時間を削減して、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記第１取得ステップが、前記標本上で励起光を１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築することとしてもよい。
このように構成することで、走査ラインを間引く分だけレジストレーション用の画像取得の所要時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

上記態様においては、前記レジストレーション処理ステップにより算出された前記変換パラメータに基づいて、前記第２取得ステップにより取得された前記解析用画像を変換して解析する画像解析ステップを含むこととしてもよい。
このように構成することで、レジストレーション処理ステップにより、基準となる比較対象物の情報に解析用画像が位置合わせされるので、解析用画像を精度よく解析することができる。

本発明によれば、標本の画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させることができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。 （ａ）は第１ピッチの距離間隔の一例を示し、（ｂ）は第２ピッチの距離間隔の一例を示す図である。 標本の種類と第１ピッチの距離間隔とを対応付けたテーブルの一例を示す図である。 標本に対する基準となる比較対象物の情報としてのサンプルの画像の一例を示す図である。 （ａ)はレジストレーション用画像の移動を説明する図であり、（ｂ)はレジストレーション用画像の回転を説明する図であり、（ｃ)はレジストレーション用画像の縮小または拡大を説明する図であり、（ｄ）はレジストレーション用画像のせん断を説明する図である。 レジストレーション用画像の非線形的な複雑な変換を説明する図である。 本発明の第１実施形態に係る標本観察方法を説明するフローチャートである。 図３のテーブルの作成方法を説明するフローチャートである。 第１実施形態と従来との処理時間の差の一例を示す図である。 組織全体をＰＩ染色した標本の一例を示す図である。 解析対象をＡｒｃ−ｄＶｅｎｕｓにより染色した標本の一例を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムおよび標本観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、標本Ｓの画像を取得する蛍光顕微鏡３と、蛍光顕微鏡３を制御したり蛍光顕微鏡３により取得された画像を処理したりするＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）５とを備えている。

蛍光顕微鏡３は、例えば、共焦点レーザ顕微鏡、多光子励起顕微鏡またはシート照明顕微鏡等であり、標本Ｓの深さ方向に交差する２次元的なスライス像を取得することができるようになっている。
標本Ｓは、例えば、組織全体が蛍光色素により染色されている。

この蛍光顕微鏡３は、標本Ｓを載置する可動ステージ７と、励起光を発生する光源９と、光源９から発せられた所定の波長域の励起光を通過させる励起フィルタ１１と、励起フィルタ１１を通過した励起光を可動ステージ７上の標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１３と、倍率が異なる複数の対物レンズ１３を切り替え可能に保持するレボルバ１５と、対物レンズ１３により集光された標本Ｓからの蛍光を励起光の光路から分岐させるダイクロイックミラー１７と、ダイクロイックミラー１７により分岐された蛍光のみを通過させる蛍光フィルタ１９と、蛍光フィルタ１９を通過した蛍光を撮影するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）等のカメラ（画像取得部）２１とを備えている。

可動ステージ７は、対物レンズ１３の対物光軸に沿う方向（Ｚ方向）および対物光軸に交差する方向（Ｘ方向およびＹ方向）に移動することができるようになっている。
レボルバ１５は、対物レンズ１３をレーザ光の光路上に択一的に配置することができるようになっている。

ダイクロイックミラー１７は、光源９から発せられた励起光を対物レンズ１３に向けて反射する一方、対物レンズ１３により集光された蛍光を蛍光フィルタ１９に向けて透過させるようになっている。
蛍光フィルタ１９は、蛍光と共に入射する励起光等を除去するようになっている。

ＰＣ５は、蛍光顕微鏡３を制御する画像取得制御部（画像取得部）２３と、カメラ２１により取得された画像を保持する画像保持部２５と、画像保持部２５により保持されている画像を処理する画像処理部２７とを備えている。
これら画像取得制御部２３、画像保持部２５および画像処理部２７は、それぞれソフトウェアで実現されるようになっている。

画像取得制御部２３は、可動ステージ７を所定のピッチでＺ方向に移動させて、カメラ２１により、標本Ｓの深さ方向（Ｚ方向）に異なる複数のＺスタック画像（スライス像）を取得させるようになっている。具体的には、画像取得制御部２３は、カメラ２１により、図２（ａ)に示すような粗い距離間隔の第１ピッチで複数のＺスタック画像（以下、「レジストレーション用画像」という。）と、第１ピッチよりも細かい距離間隔の図２（ｂ）に示すような第２ピッチで複数のＺスタック画像（以下、「解析用画像」という。）とを取得させるようになっている。

また、画像取得制御部２３は、例えば、図３に示すように、標本Ｓの種類とその種類に応じた第１ピッチの距離間隔とが対応付けられたテーブルＴを有している。この画像取得制御部２３は、レジストレーション用画像を取得する場合に、テーブルＴを参照して、観察対象の標本Ｓに対応した距離間隔の第１ピッチで可動ステージ７をＺ方向に移動させるようになっている。

画像処理部２７は、標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報に対して、カメラ２１により取得されたレジストレーション用画像を位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を実行するようになっている。また、画像処理部２７は、このレジストレーション処理をカメラ２１による解析用画像の取得と並行して行うようになっている。レジストレーション処理では、組織全体の位置・方向・形状等が分かればよく、比較的粗い距離間隔で取得されたＺスタック画像を用いても十分な精度の変換パラメータを算出することができる。

標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報としては、例えば、図４に示すような異なる条件下で飼育したサンプルの画像や、脳アトラス等が用いられる。脳アトラスは、一般に公開されているアトラスデータを用いることとしてもよいし、ユーザ自身で構築したアトラスデータを用いることとしてもよい。

変換パラメータとしては、図５（ａ)に示すようにレジストレーション用画像を移動したり、図５（ｂ)に示すようにレジストレーション用画像を回転したりする剛体変換のパラメータ、図５（ｃ)に示すようにレジストレーション用画像を縮小または拡大したり、図５（ｄ）に示すようにレジストレーション用画像をせん断したりするアフィン変換のパラメータ、図６に示すようにレジストレーション用画像を非線形的に複雑に変換する非線形変換のパラメータ等が挙げられる。

この画像処理部２７は、上記いずれかの変換パラメータによりレジストレーション用画像を変換して、変換後のレジストレーション用画像と標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報とを比較し、例えば正規化相互相関を用いて、変換後のレジストレーション用画像と標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報との類似度を算出するようになっている。

そして、画像処理部２７は、変換パラメータを変更して、変換パラメータごとにレジストレーション用画像の変換および変換後のレジストレーション用画像と標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報との類似度の算出を行い、例えば最急降下法により、類似度が最大となる変換パラメータを算出するようになっている。なお、レジストレーション処理を施す場合は、例えば、レジストレーション用画像をグレースケール１ｃｈのデータ（目的の臓器の例えば脳と、脳以外とが区別されるデータ等）または１ｂｉｔデータに変換しておくことが好ましい。

また、画像処理部２７は、算出した変換パラメータをユーザが指定した解析用画像に適用して、解析用画像を標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報の座標系に合わせ込むようになっている。

次に、本実施形態に係る標本観察方法について、図７のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る標本観察方法は、所定の距離間隔の第１ピッチで標本ＳのＺ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得する第１取得ステップＳＡ１と、第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで標本ＳのＺ方向に異なる複数の解析用画像を取得する第２取得ステップＳＡ２と、第２取得ステップＳＡ２による解析用画像の取得と並行して、第１取得ステップＳＡ１により取得されたレジストレーション用画像を標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施すレジストレーション処理ステップＳＡ３と、レジストレーション処理ステップＳＡ３により算出された変換パラメータに基づいて、第２取得ステップＳＡ２により取得された解析用画像を変換して解析する画像解析ステップＳＡ４とを含んでいる。

第１取得ステップＳＡ１は、標本Ｓの種類と標本Ｓの種類に応じた第１ピッチの距離間隔とが対応付けられた図３に示すようなテーブルＴに基づいて、レジストレーション用画像を取得するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１および標本観察方法の作用について説明する。
最初に、テーブルＴの作成方法について、図８のフローチャートを参照して説明する。
まず、観察対象の標本Ｓについて、カメラ２１により、できる限り細かい距離間隔で標本ＳのＺ方向に異なる複数の仮Ｚスタック画像を取得する（ステップＳＢ１）。これとは別に、同じ種類の標本Ｓの基準となる基準Ｚスタック画像を予め用意しておく。

次いで、画像処理部２７により、仮Ｚスタック画像を基準Ｚスタック画像に位置合わせするレジストレーション処理を施し、変換パラメータを算出する（ステップＳＢ２）。

次に、仮Ｚスタック画像を任意の量だけＺ方向に間引きし（ステップＳＢ３）、残りの仮Ｚスタック画像を基準Ｚスタック画像に位置合わせるレジストレーション処理を施して、変換パラメータを算出する（ステップＳＢ４）。

次に、間引く量を変えながら、ステップＳＢ３およびステップＳＢ４を繰り返す（ステップＳＢ５）。例えば、間引く量を仮Ｚスタック画像の全枚数の１／２、１／４、１／８、１／１６のように変更する。

続いて、ステップＳＢ２で算出された間引きしていない場合の変換パラメータと、ステップＳＢ４で算出された間引きした場合の変換パラメータとの誤差が所定の閾値内になる最大の間引き量を算出し、得られた最大の間引き量をその標本Ｓに対する第１ピッチの距離間隔値とする（ステップＳＢ６）。

次いで、標本Ｓの種類ごとにステップＳＢ１〜ステップＳＢ６を繰り返し（ステップＳＢ７）、標本Ｓの種類ごとに対応する第１ピッチの距離間隔値を関連付けてテーブルＴを完成する。

次に、本観察について、図７のフローチャートを参照して説明する。
まず、ユーザは、標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報として、あらかじめ用意してある比較対象のＺスタック画像を指定し、画像保持部２５によりこれを保持させる。比較対象のＺスタック画像としては、例えば、異なる条件下で飼育したサンプルや、脳アトラス等を用いることができる。

次いで、ユーザは、例えば、マウスの脳等、観察対象の標本Ｓの種類を指定する。ユーザが観察対象の標本Ｓの種類を指定すると、画像取得制御部２３により、テーブルＴが参照されて、観察対象の標本Ｓの種類に対応付けられた距離間隔の第１ピッチが読み出される。

次いで、画像取得制御部２３により蛍光顕微鏡３が制御され、テーブルＴから読み出された所定の距離間隔の第１ピッチで標本ＳのＺ方向に異なる複数のレジストレーション用画像がカメラ２１により取得される（第１取得ステップＳＡ１）。

続いて、画像取得制御部２３により蛍光顕微鏡３が制御され、第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで標本ＳのＺ方向に異なる複数の解析用画像がカメラ２１により取得される（第２取得ステップＳＡ２）。

また、この第２取得ステップＳＡ２と並行して、画像処理部２７により、画像保持部２５によって保持されている比較対象のＺスタック画像に対して、第１取得ステップＳＡ１でカメラ２１によって取得されたレジストレーション用画像を位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理が施される（レジストレーション処理ステップＳＡ３）。

次に、画像処理部２７により、第２取得ステップＳＡ２でカメラ２１によって取得された解析用画像に対して、レジストレーション処理ステップＳＡ３で算出された変換パラメータが適用され、解析用画像が比較対象のＺスタック画像の座標系に合わせ込まれる。ユーザは、位置合わせされたこれら解析用画像と比較対象のＺスタック画像について、比較閲覧や解析を行う（画像解析ステップＳＡ４）。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システム１および標本観察方法によれば、処理時間が掛かるレジストレーション処理による変換パラメータの算出は、粗い距離間隔の第１ピッチで時間を掛けずに取得できるレジストレーション用画像を用いて行い、時間が掛かる細かい距離間隔の第２ピッチでの標本Ｓの複数の解析用画像の取得とレジストレーション処理とを並行して行うことで、時間が掛かる解析用画像の取得後にレジストレーション処理を行う従来と比較して、作業全体の所要時間を短縮することができる。

これにより、標本Ｓの画像を生成してサンプル間の比較や解剖学的領域ごとの解析を行う実験の処理能力を向上させることができる。また、画像処理部２７により、比較対象のＺスタック画像（基準となる比較対象物の情報）に解析用画像が位置合わせされるので、画像解析ステップＳＡ４において、解析用画像を精度よく解析することができる。

ここで、本実施形態と従来との処理時間の差の一例を説明する。
例えば、標本ＳのＺ方向の大きさを１０ｍｍ、レジストレーション用画像を取得する第１ピッチの距離間隔を１００μｍ、解析用画像を取得する第２ピッチの距離間隔を１０μｍとする。また、Ｚスタック画像を１枚取得するのに要する時間を３秒、レジストレーション処理に要する時間を６０分、解析に要する時間を１０分とする。この場合、レジストレーション用画像の取得には、３（秒）×（１０（ｍｍ）／１００（μｍ））／６０（分）で５分要し、解析用画像の取得には、３（秒）×（１０（ｍｍ）／１０（μｍ））／６０（分）で５０分要することになる。

解析用画像の取得後にレジストレーション処理を行う従来の画像処理システムおよび標本観察方法では、図９に示すように、解析用画像の取得に掛かる５０分と、レジストレーション処理に掛かる６０分と、解析に掛かる１０分で、合計１２０分要する。

これに対し、解析用画像の取得とレジストレーション処理とを並行して行う本実施形態に係る顕微鏡システム１および標本観察方法では、図９に示すように、レジストレーション用画像の取得に掛かる５分と、解析用画像の取得に掛かる時間とレジストレーション処理に掛かる時間の長い方である６０分と、解析に掛かる１０分で、合計７５分で済む。
したがって、この一例では、従来と比較して４５分の短縮となる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、組織全体を染色する第１蛍光色素と、解析対象を染色する他の第２蛍光色素とで、標本Ｓを多重染色しておくこととしてもよい。そして、画像取得制御部２３により蛍光顕微鏡３を制御し、第１取得ステップＳＡ１でレジストレーション用画像を取得する場合は、第１蛍光色素を励起させる波長の励起光を標本Ｓに照射し、第２取得ステップＳＡ２で解析用画像を取得する場合は、第２蛍光色素を励起させる波長の励起光を標本Ｓに照射させることとしてもよい。

標本Ｓの組織全体を染色する蛍光色素としては、例えば、図１０に示すようなＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）染色を用いることとし、標本Ｓの解析対象を染色する蛍光色素としては、例えば、図１１に示すような神経活動に紐付かせたＡｒｃ−ｄＶｅｎｕｓを用いることとしてもよい。

また、レジストレーション用画像を取得する場合は、励起フィルタ１１として、ＰＩ染色の蛍光色素を励起させる励起光を通過させる特性のものを設定し、ダイクロイックミラー１７として、ＰＩ染色の蛍光色素を励起させる励起光を反射する一方、ＰＩ染色の波長を透過させる特性のものを設定し、蛍光フィルタ１９として、ＰＩ染色の波長を通過させる特性のものを設定することとすればよい。そして、画像取得制御部２３により、光源９からＰＩ染色の蛍光色素を励起させる励起光を発生させて、標本ＳからのＰＩ染色の波長に基づいてレジストレーション用画像を取得することとすればよい。

また、レジストレーション用画像を取得する場合は、励起フィルタ１１として、Ａｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの蛍光色素を励起させる励起光を通過させる特性のものを設定し、ダイクロイックミラー１７として、Ａｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの蛍光色素を励起させる励起光を反射する一方、Ａｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの波長を透過させる特性のものを設定し、蛍光フィルタ１９として、Ａｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの波長を通過させる特性のものを設定することとすればよい。そして、画像取得制御部２３により、光源９からＡｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの蛍光色素を励起させる励起光を発生させて、標本ＳからのＡｒｃ−ｄＶｅｎｕｓの波長に基づいて解析用画像を取得することとすればよい。

このようにすることで、レジストレーション用画像を取得する場合と解析用画像を取得する場合とで無駄な励起光を標本Ｓに照射せずに済み、蛍光の褪色を抑えることができる。

第２変形例としては、画像取得制御部２３により蛍光顕微鏡３を制御し、第２取得ステップＳＡ２において、第１取得ステップＳＡ１でレジストレーション用画像が既に取得されている標本Ｓの深さ位置の解析用画像の取得を省略することとしてもよい。そして、画像取得制御部２３により、省略した深さ位置の解析用画像の代わりに、第１取得ステップＳＡ１で取得した標本Ｓのその深さ位置のレジストレーション用画像を用いることとしてもよい。

このようにすることで、標本Ｓにおける同じ深さ位置の画像が重複して取得される無駄を省き、画像取得の所要時間を削減することができる。

第３変形例としては、画像取得制御部２３によりレボルバ１５を制御し、第１取得ステップＳＡ１でレジストレーション用画像を取得する場合は低倍率の対物レンズ１３を使用し、第２取得ステップＳＡ２で解析用画像を取得する場合は、第１取得ステップＳＡ１よりも高倍率の対物レンズ１３を使用することとしてもよい。

また、第２取得ステップＳＡ２で解析用画像を取得する場合は、画像取得制御部２３により、標本Ｓにおける同一の深さ位置で第２ピッチごとに可動ステージ７をＸ方向およびＹ方向に移動させて、カメラ２１によりＸ方向およびＹ方向に異なる複数の仮解析用画像を取得することとしてもよい。そして、画像処理部２７により、高倍率の対物レンズ１３を使って取得したＸ方向およびＹ方向に異なる複数の仮解析用画像を貼り合わせて、１枚の解析用画像を生成することとしてもよい。

このようにすることで、解析用にＸ方向およびＹ方向に分解能が高い解析用画像を生成することができる。この場合において、レジストレーション用画像は低倍率の対物レンズ１３を使用することで、１度に広範囲が撮影されるので、仮解析用画像のように張り合わせる必要がない。したがって、レジストレーション用の画像取得の所要時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。

なお、レジストレーション用画像を取得する場合も、例えば、標本Ｓが大きい場合などは、可動ステージ７をＸ方向およびＹ方向に移動させながら、Ｘ方向およびＹ方向に異なる複数の仮解析用画像を取得し、これらを貼り合わせて１枚のレジストレーション用画像を生成することとしてもよい。この場合、低倍率の対物レンズ１３を使用することで、高倍率の対物レンズ１３を使用して解析用画像を取得する場合よりも、１枚のレジストレーション用画像を生成するための画像の枚数が少なくて済む。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムおよび標本観察方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム３１は、図１２に示すように、蛍光顕微鏡３に代えて、標本Ｓ上で励起光を走査させるガルバノスキャナ等のスキャナ（画像取得部、走査部）３３を備えるレーザ走査型顕微鏡３５を採用し、画像取得制御部（画像取得部）２３が、解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数でレジストレーション用画像を取得するようにレーザ走査型顕微鏡３５を制御する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

レーザ走査型顕微鏡３５は、光源９に代えてレーザ光を発生するレーザ光源３７と、カメラ２１に代えて光電子増倍管等の検出器（画像取得部）３９とを備えている。検出器３９とスキャナ３３は、標本Ｓの２次元的な走査画像を生成する画像取得部を構成するようになっている。

画像取得制御部２３は、第１実施形態と同様に、検出部３９により、図２（ａ)に示すような粗い距離間隔の第１ピッチで複数のレジストレーション用画像を取得させるとともに、第１ピッチよりも細かい距離間隔の図２（ｂ）に示すような第２ピッチで複数の解析用画像を取得させるようになっている。

また、画像取得制御部２３は、スキャナ３３と検出器３９を制御し、例えば、第１取得ステップＳＡ１ではレジストレーション用画像を２５６×２５６の画像サイズで取得し、第２取得ステップＳＡ２では解析用画像を１０２４×１０２４の画像サイズで取得するようになっている。

画像の画素数により、スキャナ３３によって１フレームを走査するのに掛かる時間が決まるので、本実施形態に係る顕微鏡システム３１および標本観察方法によれば、解析用画像と比較して、画素数を減らす分だけレジストレーション用画像の取得に要する時間を削減して、全体の所要時間を短縮することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、第１取得ステップＳＡ１でレジストレーション用画像を取得する場合において、画像取得制御部２３がスキャナ３３と検出器３９を制御して、１走査ライン以上間引いてレーザ光を走査させることとしてもよい。また、画像取得制御部２３が、走査ラインを間引いた分の輝度情報を補間してレジストレーション用画像を構築することとしてもよい。

この場合、例えば、１，３，５，７・・・というように、奇数の走査ラインだけレーザ光を走査させ、偶数の走査ラインは奇数の走査ラインの輝度情報を使用してレジストレーション用画像を構築することとしてもよい。
また、画像取得制御部２３は、解析用画像を取得する場合は間引かずに全走査ラインを走査させ、全走査ラインの輝度情報を使用して解析用画像を構築することとすればよい。

このようにすることで、第１取得ステップＳＡ１において走査ラインを間引く分だけレジストレーション用画像の取得に要する時間を削減し、全体の所要時間を短縮することができる。
なお、奇数の走査ラインに代えて偶数の走査ラインのみを走査させることとしてもよいし、２走査ライン以上間引いて走査させることとしてもよい。

本変形例においては、画像取得制御部２３が、解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数でレジストレーション用画像を取得することとしてもよいし、これら解析用画像とレジストレーション用画像とを互いに同じ画素数で取得することとしてもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、標本Ｓに対する基準となる比較対象物の情報として、３次元的なモデルを採用することとしてもよい。この場合、レジストレーション処理では、３次元的なモデルから複数の２次元的なＺスタック画像を抽出して、これらに２次元的なレジストレーション用画像を位置合わせするための変換パラメータを算出することとしてもよい。また、複数の２次元的なレジストレーション用画像により３次元的なレジストレーション用画像を生成して、３次元的なレジストレーション用画像を３次元的なモデルに位置合わせするための変換パラメータを算出することとしてもよい。

１，３１ 顕微鏡システム
７ 可動ステージ
１３ 対物レンズ
２３ 画像取得制御部（画像取得部）
２１ カメラ（画像取得部）
２７ 画像処理部
３３ スキャナ（画像取得部、走査部）
３９ 検出器（画像取得部）
Ｓ 標本
ＳＡ１ 第１取得ステップ
ＳＡ２ 第２取得ステップ
ＳＡ３ レジストレーション処理ステップ
ＳＡ４ 画像解析ステップ

Claims (16)

1. 所定の距離間隔の第１ピッチで標本の深さ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得するとともに、前記第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで前記標本の深さ方向に異なる複数の解析用画像を取得する画像取得部と、
   該画像取得部による前記解析用画像の取得と並行して、前記画像取得部により取得された前記レジストレーション用画像を前記標本に対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施す画像処理部とを備える顕微鏡システム。
2. 前記画像取得部が、前記標本の種類と該標本の種類に応じた前記第１ピッチの前記距離間隔とが対応付けられたテーブルに基づいて、前記レジストレーション用画像を取得する請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合に所定の第１蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射し、前記解析用画像を取得する場合に前記所定の第１蛍光色素とは異なる所定の第２蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像が取得されている深さ位置の前記解析用画像の取得を省略し、省略した前記深さ位置の前記解析用画像の代わりにその深さ位置の前記レジストレーション用画像を用いる請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
5. 前記標本に照射される励起光の光路上に択一的に配置可能に設けられた倍率が異なる複数の対物レンズと、
   前記標本が載置され、かつ、前記対物レンズの対物光軸に交差する方向に移動可能な可動ステージとを備え、
   前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記解析用画像を取得する場合よりも低倍率の前記対物レンズを使用し、前記解析用画像を取得する場合は、前記標本における同一の深さ位置で前記第２ピッチごとに前記可動ステージを移動させて、前記対物光軸に交差する方向に異なる複数の前記解析用画像を取得する請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
6. 前記標本上で励起光を走査させる走査部を備え、
   前記画像取得部が、前記解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数で前記レジストレーション用画像を取得する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。
7. 前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記走査部により１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築する請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
8. 前記標本上で励起光を走査させる走査部を備え、
   前記画像取得部が、前記レジストレーション用画像を取得する場合は、前記走査部により１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。
9. 所定の距離間隔の第１ピッチで標本の深さ方向に異なる複数のレジストレーション用画像を取得する第１取得ステップと、
   前記第１ピッチよりも細かい距離間隔の第２ピッチで前記標本の深さ方向に異なる複数の解析用画像を取得する第２取得ステップと、
   該第２取得ステップによる前記解析用画像の取得と並行して、前記第１取得ステップにより取得された前記レジストレーション用画像を前記標本に対する基準となる比較対象物の情報に位置合わせするための変換パラメータを算出するレジストレーション処理を施すレジストレーション処理ステップとを含む標本観察方法。
10. 前記第１取得ステップが、前記標本の種類と該標本の種類に応じた前記第１ピッチの前記距離間隔とが対応付けられたテーブルに基づいて、前記レジストレーション用画像を取得する請求項９に記載の標本観察方法。
11. 前記第１取得ステップが、所定の第１蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射し、
    前記第２取得ステップが、前記所定の第１蛍光色素とは異なる所定の第２蛍光色素を励起させる波長の励起光を前記標本に照射する請求項９または請求項１０に記載の標本観察方法。
12. 前記第２取得ステップが、前記第１取得ステップにより前記レジストレーション用画像が取得されている深さ位置の前記解析用画像の取得を省略し、省略した前記深さ位置の前記解析用画像の代わりにその深さ位置の前記レジストレーション用画像を用いる請求項９から請求項１１のいずれかに記載の標本観察方法。
13. 前記第１取得ステップが、前記第２取得ステップよりも低倍率の対物レンズを用いて前記レジストレーション用画像を取得し、
    前記第２取得ステップが、前記標本における同一の深さ位置で前記第２ピッチごとに前記対物レンズの光軸に交差する方向に異なる複数の前記解析用画像を取得する請求項９から請求項１２のいずれかに記載の標本観察方法。
14. 前記第１取得ステップが、前記標本上で励起光を走査させて、前記第２取得ステップにより前記解析用画像を取得する場合よりも少ない画素数で前記レジストレーション用画像を取得する請求項９から請求項１３のいずれかに記載の標本観察方法。
15. 前記第１取得ステップが、前記標本上で励起光を１走査ライン以上間引いて走査し、補間して前記レジストレーション用画像を構築する請求項９から請求項１４のいずれかに記載の標本観察方法。
16. 前記レジストレーション処理ステップにより算出された前記変換パラメータに基づいて、前記第２取得ステップにより取得された前記解析用画像を変換して解析する画像解析ステップを含む請求項９から請求項１５のいずれかに記載の標本観察方法。