JP2018075000A - 細胞癌株、およびそれを用いた原発性肝癌の発症動物モデル - Google Patents
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Abstract
Description
通常の食餌をさせた血小板由来成長因子遺伝子導入トランスジェニックマウス(以下、PDGFC Tgとも称する)群と、通常の食餌をさせたC型肝炎ウィルス遺伝子導入トランスジェニックマウス(以下、HCV Tgとも称する)群と、動脈硬化性高コレステロール食(Ath)と高中性脂肪食(HF)の食餌をさせたHCV遺伝子導入トランスジェニックマウス(以下、HCV Tg/Ath+HFとも称する)群とから、肝癌細胞を成長させ、それらから肝細胞癌株(受託番号がNITE P−02353の細胞癌株。以下、これのシングルクローンをMHCF1とも称する)を樹立した。その具体的手法を以下に示す。
PDGFC導入トランスジェニックマウス及びHCV導入トランスジェニックマウスに、製品名CRF−1(日本クレア社製)を通常の食餌として、一日125g/kgずつ食べさせながら68週間飼育し、それぞれPDGFC Tg群と、HCV Tg群とした。一方、通常の食餌にコレステロールを1.269質量%含有させた高コレステロール食と中性脂肪を34質量%含有させた高中性脂肪食の混合食餌を、別なHCV導入トランスジェニックマウスに一日125g/kgずつ食べさせながら68週間飼育し、HCV Tg/Ath+HF群とした。飼育期間経過後、各群のマウスの肝臓を摘出したところ、PDGFC Tg群から5例中3例の肝臓に腫瘍が生じ、HCV Tg群から7例中3例の肝臓に腫瘍が生じ、HCV Tg/Ath+HF群から11例中3例の肝臓に腫瘍が生じていた。その結果を、図2に示す。同図中、矢印で肝臓の腫瘍組織を指している。各群の肝臓の腫瘍が癌細胞であるか否かは病理組織の顕微鏡検査で調べた。
PDGFC Tg群、HCV Tg群、HCV Tg/Ath+HF群の各群の肝臓の腫瘍から、全肝組織をメスを用いて1mm3の角状に切り、Gentle MACS Dissociation Kit(Miltenyi Biotec社の商品名)を用いて組織を分離後、dish上でDMEM培養液中で培養することによって、肝細胞癌株を樹立した。なお、HCV Tg/Ath+HF群から樹立した肝細胞癌株は、受託番号NITE P−02353の動物細胞であり、HCV Tg/Ath+HF細胞と称することとし、このHCV Tg/Ath+HF細胞から樹立したシングルクローンをMHCF1と称することにする。
得られた肝細胞癌株における遺伝子導入の適否について確認した。図3は、Hepa1−6、HCV Tg/Ath+HF群由来の肝細胞癌株、PDGFC Tg群由来の肝細胞癌株、HCV Tg群由来の肝細胞癌株について、それぞれの遺伝子導入ゲノムDNAであるPDGFC及びHCV core(N)について、細胞のtotal DNAをQIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN1社製)を用いて抽出後、GoTaq Green Master Mix(Promega社製)を用いたPCR反応によりPDGFC及びHCV遺伝子の特異的増幅を行った。図3は、増幅産物を電気泳動で検出した結果を示す図である。なお、プライマーは図1に記載のものである。図3から明らかな通り、Hepa1−6の肝細胞癌株はこれら遺伝子を有しておらず、HCV Tg/Ath+HF由来の肝細胞癌株及びHCV Tg由来の肝細胞癌株はHCVが導入されており、PDGFC Tg由来の肝細胞癌株にはPDGFCが導入されていることが、示された。従って、HCV Tg群由来及びHCV Tg/Ath+HF群由来の肝細胞癌株は、HCVが少なくともアレルがホモ(HCV/HCV)又はヘテロ(HCV/-)として導入されていることが示された。
それら樹立肝細胞癌株、及び比較のためHepa1−6の細胞株について、顕微鏡観察によるin vitro(dish上)での200倍率の細胞形態を図4に示す。図4から明らかな通り、樹立肝細胞癌株、Hepa1−6細胞株の何れも肝細胞様の形態となっていることから、肝細胞癌株であることが示された。
PDGFC Tg群由来、HCV Tg群由来、HCV Tg/Ath+HF群由来のそれら樹立肝細胞癌株、Hepa1−6の細胞株について、MMT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロミド)が培養細胞によってホルマザン色素へ還元されることと利用して、96穴プレートに1×104個/wellで細胞を撒き、24、48、72時間と経時的に増殖能をモニターし、培養細胞の増殖能の指標として生存率を比色定量するMTTアッセイの結果を図5に示す。図5から明らかな通り、樹立肝細胞癌株、Hepa1−6細胞株の何れも時間と共に24、48、72時間の経過と共に、細胞生存率が高くなっており、in vitroで細胞増殖能を有することが分かった。
それらPDGFC Tg群由来、HCV Tg群由来、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株について、in vitroにて6穴の低粘着性表面プレート(IWAKI社製;商品名EZ-BindShutII マイクロプレート;EZ-BindShutは登録商標)により、All Fee Medium(gibco社製;商品名DMEM, High Glucose (11965-092))3ml/穴を用いて細胞5×103個/穴を播種し2週間培養し、スフェアと呼ばれるコロニー数を計測して、腫瘍形成能(スフェロイド形成能)を評価するSphereアッセイを行った。その結果を、図6に示す。低粘着性表面プレートでスフェアを形成できるということは、足場非依存的に増殖可能で、生体内で腫瘍を形成し得る能力を有し、in vivoでの腫瘍形成・腫瘍増殖を反映する重要な指標である。図6(a)から明らかな通り、PDGFC Tg群由来、HCV Tg群由来、HCV Tg/Ath+HF群由来の何れの肝細胞癌株からも細胞塊のスフェアを形成していた。しかし、同図(b)に示すように、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株は、腫瘍形成・腫瘍増殖し得るスフェロイド形成能を有していたが、PDGFC Tg群、HCV Tg群の樹立肝細胞癌株は、スフェロイド形成能を有していなかった。
8週齢の重度複合免疫不全マウスNOD−SCIDマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J;日本チャールス・リバー社製)4匹に、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株1×105個の細胞をPBSに懸濁し、それぞれ皮下投与し、約2ヶ月間飼育し、生着の有無を確認した。その後、肝臓を摘出したところ、全例で、肝細胞癌株に由来し腫瘍が生着していることを確認した。さらに病理組織片を取り出し、ヘマトキシリン−エオシン(HE)染色をした後、顕微鏡観察を行って癌発現性について評価した。その結果を図7に示す。同図中、bはaの枠部の拡大写真、cはbの枠部の拡大写真である。同図から明らかな通り、生着により、ネクローシスと思われるNCで示される組織の間に、TTで示す肝臓細胞癌組織と、BDで示す胆管細胞癌組織とが、認められた。これら肝細胞癌組織と胆管細胞癌組織とは、同じ肝細胞癌株に由来していると考えられる。
8週齢のC57BL/6(日本チャールス・リバー社製)である野生型(WT)マウス10匹にPDGFC Tg群由来とHCV Tg/Ath+HF群由来との樹立肝細胞癌株の1×105個の細胞をPBSに懸濁し、それぞれ脾臓投与し、64日間飼育し、肝臓に肝細胞癌を誘発させた。その時の生存率を図8に示す。PDGFC Tg群由来の樹立肝細胞癌株を投与しても全例死亡しなかったが、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株を投与すると約2ヶ月後に生存率が約10%にまで低下した。細胞投与から64日目の時に肝臓・脾臓を摘出したところ、PDGFC Tg群由来の樹立肝細胞癌株の投与では、肝臓、脾臓ともに肉眼的所見で異常が認められず全く正常であったことから樹立肝細胞株が生着していなかった。一方、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株の投与では、細胞投与から64日目の時に肝臓・脾臓を摘出したところ、肝臓に白い結節様の瘢痕が複数個所で観察され、加えて脾腫も観察された。解剖所見から、HCV Tg/Ath+HF群由来の樹立肝細胞癌株が、脾臓で増殖し一部肝臓に転移し、血栓を生じた結果、多数のマウスが死亡したのであり、脾臓投与によるダメージで死亡したのではないことが、分かった。
Claims (11)
- C型肝炎ウィルスを遺伝子導入した動物に、動脈硬化性高コレステロール食と高中性脂肪食とを摂取させる工程、
前記動物の肝臓に肝癌を発生させる工程、
発生した肝癌組織から肝癌細胞を採取する工程、
採取した前記肝癌細胞を培養する工程
によって、肝細胞癌株及び/又は胆管細胞癌株として、樹立したものであることを特徴とする細胞癌株。 - 前記採取する工程の後、それで得られた前記肝癌細胞を動物に投与して腫瘍生着させてから腫瘍細胞から再度、癌細胞を採取して悪性化させる工程を行ってから、それを前記培養する工程を行うによって、樹立したものであることを特徴とする請求項1に記載の細胞癌株。
- 前記動物が、マウスであることを特徴とする請求項1に記載の細胞癌株。
- 前記マウスが、C57BL/6系統マウスであることを特徴とする請求項3に記載の細胞癌株。
- 前記動脈硬化性高コレステロール食が、コレステロールを0.1〜10質量%含んでおり、前記高中性脂肪食が、動物性脂肪及び/又は植物性脂肪を含む中性脂肪を15〜80質量%含んでいることを特徴とする請求項1に記載の細胞癌株。
- 受託番号がNITE P−02353、又は受託番号がNITE P−02558のものであることを特徴とする請求項1に記載の細胞癌株。
- C型肝炎ウィルスを遺伝子導入した動物に、動脈硬化性高コレステロール食と高中性脂肪食とを摂取させる工程、
前記動物の肝臓に肝癌を発生させる工程、
発生した肝癌組織から肝癌細胞を採取する工程、
採取した前記肝癌細胞を培養する工程
を有し、それによって、肝細胞癌株及び/又は胆管細胞癌株として、細胞癌株を樹立することを特徴とする細胞癌株の樹立方法。 - 前記採取する工程の後、それで得られた前記肝癌細胞を動物に投与して腫瘍生着させてから腫瘍細胞から再度、癌細胞を採取して悪性化させる工程を行ってから、それを前記培養する工程を行うことを特徴とする請求項7に記載の細胞癌株の樹立方法。
- C型肝炎ウィルスを遺伝子導入した癌細胞発生用の動物に、動脈硬化性高コレステロール食と高中性脂肪食とを摂取させる工程;前記動物の肝臓に肝癌を発生させる工程;発生した肝癌組織から肝癌細胞を採取する工程;採取した前記肝癌細胞を培養する工程によって、肝細胞癌株及び/又は胆管細胞癌株として細胞癌株を樹立した後、
同系統又は異系統若しくは異種で癌細胞生着用の動物の肝臓に、前記細胞癌株を生着させて、腫瘍を形成させることによって、得られた、肝細胞癌及び/又は胆管細胞癌である原発性肝癌の発症動物モデル。 - 前記癌細胞発生用の動物がC57BL/6系統マウスであり、前記癌細胞生着用の動物が野生型マウス、遺伝子改変マウス、及び/又は免疫不全マウスであることを特徴とする請求項9に記載の原発性肝癌の発症動物モデル。
- 被スクリーニング試料を投与し、前記腫瘍の形成の促進又は抑制を指標にしてスクリーニングし、及び/又は
前記腫瘍の形成を観察することを特徴とする請求項9に記載の原発性肝癌の発症動物モデル。
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