JP2018066733A - 腎疾患のためのマーカー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の代謝産物,完全長タンパク質およびタンパク質フラグメント,特に患者腎臓サンプル中のイノシンヌクレオシドおよび以下のタンパク質:アポリポタンパク質C−I,アポリポタンパク質C−II,フィブリノーゲンα鎖,もしくはフィブリノーゲンA−α鎖,キニノゲン,ケラチン10,シスタチンA,シスタチンB,インターαインヒビターH4,またはSEQ ID NO:1−59のうちの1つもしくはそれ以上のレベルの検出に関する。完全長タンパク質およびタンパク質フラグメントの相対レベルが腎臓/腎性疾患の診断のためのバイオマーカーとなる。
【選択図】なし
Description
本出願は米国特許仮出願第61/351,183号(2010年6月3日出願)および米国特許仮出願第61/411,280号(2010年11月8日)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に基
づく優先権を主張する。
腎疾患は、水分摂取量の増加、頻尿、食欲減退、体重低下、および筋萎縮に関係する。一般に、腎疾患の臨床症状が現れた時には、回復不能な腎障害が起こっている。早期発見により、より早期に治療を行うことができ、それによって疾病の進行が遅延される。現行の治療には、透析、そして低リン・低タンパク質食事療法がある。残念ながら、慢性腎疾患を治癒させる方法はなく、最終的には腎不全が起こる。このため、寿命を延長し、クオリティオブライフを向上するためには、早期発見が極めて重要である。
本発明は、腎疾患患者を同定するための試薬および方法を提供する。本発明の試薬および方法は、特定の代謝産物、完全長タンパク質およびタンパク質フラグメント、特に患者腎臓サンプル中のイノシンヌクレオシドおよび以下のタンパク質:アポリポタンパク質C-I、アポリポタンパク質C-II、フィブリノーゲンα鎖、もしくはフィブリノーゲンA-α鎖
、キニノゲン、ケラチン10(keratin Type I cytoskeletol 10)、シスタチンA、シスタ
チンB、インターαインヒビターH4(ITIH4)、および/またはSEQ ID NO:1-59のうちの1つもしくはそれ以上のレベルの検出に関するものである。完全長タンパク質およびタンパク質フラグメントの相対レベルが、腎臓/腎性疾患の診断のためのバイオマーカーとなる。本発明の試薬および方法は、更に、腎臓/腎性疾患のバイオマーカーとして、イノシン濃度を測定することに関する。本発明に記載する試薬および方法の特定の態様は、腎疾患に特異的なタンパク質バイオマーカーの検出に適合する。ある態様では、SEQ ID NO:3、7、13、または20に特異的な抗体を用いて、腎疾患患者において生成されるタンパク質およびタンパク質フラグメントに結合させる;本明細書で同定されたそれらのタンパク質の非制限的な例として、アポリポタンパク質C-I、アポリポタンパク質C-II、フィブリノーゲ
ンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖がある。更なる態様では、抗体はCysB1、CysA、
キニノゲン、インターαインヒビターH4(ITIH4)、またはケラチン10がある。ある特定
の態様では、イノシンの示差的レベルを測定する方法により、腎疾患のバイオマーカーが提供される。イノシンレベルは、例えばLC/MSまたはイノシン特異的抗体によって測定し
てもよい。更なる態様では、本明細書に記載する試薬および方法は、血液、血清、血漿、または尿中のタンパク質レベルの変化を検出することを目的とする。腎疾患で起こる、多数のタンパク質およびタンパク質フラグメントの変化を本明細書に開示するが、それらの非制限的な例として、下記に詳述するアミノ酸配列がある(表1参照)。本発明のある態
様では、腎疾患患者サンプル中でレベルの変化を示す、本明細書に開示する1つまたは複数のポリペプチド配列を提供する。更なる態様では、本発明は、SEQ ID NO:1-59からなるポリペプチドの1つまたは複数に特異的な抗体を用いて腎疾患を同定するための診断法を提供する。
ポリポタンパク質C-II、フィブリノーゲンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖に特異的に結合する抗体を提供する。本発明は更に、イヌ・CysB1、CysA、キニノゲン、インター
αインヒビターH4(ITIH4)、またはケラチン10に特異的に結合する抗体を提供する。該
抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の抗原結合フラグメント、または1本鎖抗体であってもよい。
パク質C-II、フィブリノーゲンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖に特異的に結合する。本発明は更に、イヌ・シスタチンB、シスタチンA、キニノゲン、インターαインヒビターH4(ITIH4)、またはケラチン10に特異的に結合する抗体を提供する。
フィブリノーゲンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖に特異的に結合する。更に別の態様では、該抗体は、それぞれの配列番号を含有する完全長タンパク質、トランケート型タンパク質、またはタンパク質フラグメントに特異的に結合する。
用し、それによって同定されるバイオマーカーは、現行の検出法より有意に優れている。固形組織サンプルを分析する代わりに、患者の体液または血清サンプル中の細胞生産物またはタンパク質を同定する。このタイプの試験では、患者の苦痛を低減することができ、
反復測定が可能となり、より時宜にかなった評価を行うことが可能となる。
ポタンパク質C-Iアミノ酸から成る);SEQ ID NO:4-7(該ポリペプチドは約40個未満の連続する天然型フィブリノーゲンA-α鎖アミノ酸から成る);SEQ ID NO:8-13(該ポリペプチドは約40個未満の連続する天然型アポリポタンパク質C-IIアミノ酸から成る);または、SEQ ID NO:14-20(該ポリペプチドは約20個未満の連続する天然型フィブリノーゲンα
鎖アミノ酸から成る);SEQ ID NO:21-24(該ポリペプチドは約20個未満の連続する天然
型キニノゲン鎖アミノ酸から成る);SEQ ID NO:25-28(該ポリペプチドは約30個未満の
連続する天然型インターαインヒビターH4(ITIH4)鎖アミノ酸から成る);SEQ ID NO:29-31(該ポリペプチドは約20個未満の連続する天然型CysA鎖アミノ酸から成る);SEQ ID
NO:32-38(該ポリペプチドは約20個未満の連続する天然型CysB1鎖アミノ酸から成る);SEQ ID NO:39-59(該ポリペプチドは約30個未満の連続する天然型ケラチン10鎖アミノ酸
から成る)。本発明はまた、本発明の精製ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
本発明について以下に更に具体的に記載するが、本明細書に記載する実施例は単に例証を意図するものであり、多くの改変および変更が当業者には明白である。本明細書および別添の特許請求の範囲における使用では、特に記載しない限り、単数形の記載は複数形も包含する。本明細書で使用する用語は、一般に、本発明の文脈において、また、それぞれの用語が使用される特定の文脈において、当業界での通常の意味を有する。いくつかの用語については、実務者に本発明の説明に関する更なる手引きとなるよう、以下に、より具体的に定義する。
ポタンパク質C-II、フィブリノーゲンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖、CysB1、CysA、キニノゲン、インターαインヒビターH4(ITIH4)、またはケラチン10の完全長タンパク質およびポリペプチドフラグメントの発現レベルの同定によって行われ、ここで、コントロールと比較したタンパク質の示差的発現レベルが、腎疾患の指標となる。別の態様では、腎生検(kidney biopsy)で、免疫組織化学(IHC)法を用いて腎疾患を検出する。
ノシンレベルおよび/またはタンパク質レベルは、特異的抗体を用いて測定してもよい。抗イノシン抗体については、Inouye, H.ら, Biochim Biophys Acta 1971, 240:594-603;Bonavida, B.ら, Immunochemistry 1972, 9:443-49;Inouye, H.ら, J Biol Chem 1973, 23:8125-29を参照されたい。イノシンレベルの低下は、腎臓病/腎疾患を示す。
(一組のポリペプチド)を意味する。「ポリペプチド」はまた、2つまたはそれ以上の異なるタイプのポリペプチドの混合物(すなわち、限定される訳ではないが、完全長タンパク質、トランケート型タンパク質、またはタンパク質フラグメントを含むポリペプチドの混合物)も意味する。「ポリペプチド(複数)」または「ポリペプチド(単数)」という用語は、それぞれ、「1つまたはそれ以上のポリペプチド」も意味する。
加、アポリポタンパク質C-IIポリペプチドフラグメントの増加、フィブリノーゲンA-α鎖ポリペプチドフラグメントの低下、またはフィブリノーゲンα鎖ポリペプチドフラグメントの低下(特に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体によって検出されるもの)がある。ある態様では、更なるポリペプチドおよびタンパク質の異常レベルが含まれ、それらに
は、特に、イノシン代謝産物および以下のタンパク質がある:アポリポタンパク質C-I、
アポリポタンパク質C-II、フィブリノーゲンα鎖、またはフィブリノーゲンA-α鎖、キニノゲン、およびインターαインヒビターH4(ITIH4)。ある態様では、タンパク質は血液
、血清、血漿、または尿中で観察される。特定のポリペプチドの相対レベルは、腎不全の進行度および重篤度を示す。
ゲンA-α鎖のポリペプチドフラグメントに特異的であってもよく、例えば、SEQ ID NO:3
、7、13、または20の1つまたは複数に特異的な抗体であってもよい。本発明の抗体は、好ましくは、複数のタンパク質産物を認識する。例えば、SEQ ID NO:3に特異的な抗体は、
アポリポタンパク質C-Iの複数のペプチドフラグメント(SEQ ID NO:1-2を含む)並びに完全長タンパク質を認識する。当業者は、抗体が表1のポリペプチドに特異的であるか否かを、本明細書に記載するアッセイを用いて容易に確認することができる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、1本鎖抗体(scFv)、または抗体の抗原結
合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、無傷抗体の抗原結合部位または可変領域を含有する、無傷抗体の一部分であって、該部分は該無傷抗体のFc領域の重鎖定常ドメインを含有しない。抗体の抗原結合フラグメントの例には、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、およびFvフラグメントがある。
、IgD、およびIgEがある。抗体またはそのフラグメントは、本発明のポリペプチドのエピトープに結合する。抗体は、好適な実験動物においてインビボで作製するか、または組換えDNA法を用いてインビトロで作製してもよい。抗体の調製法およびキャラクタリゼーシ
ョン法は、当該分野で公知である。例えばDean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998);Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994);Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994);Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994);Drenckhahnら Methods Cell.
Biol. 37:7-56 (1993);Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992);Wrightら Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)参照。例えば、ポリクローナル抗体は、本発明の
ポリペプチドを動物(例えばヒトもしくは他の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ロバ、またはウマ)に投与することによって作製してもよい。免疫化した動物由来の血清を回収し、例えば硫酸アンモニウム沈殿後にクロマトグラフィー(例えばアフィニティークロマトグラフィー)を行うことによって、抗体を血漿から精製する。ポリクローナル抗体の作製法および処理法は、当該分野で公知である。
はそれ以上の結合アフィニティーで特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである)。
NO:1-59のポリペプチドに対して特定のKon速度/会合速度またはKoff速度の結合アフィ
ニティーを有する抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある態様では、本発明の抗体は、Kon=6 x 105 M-1s-1以上で特異的に結合する;Koff速度=5 x 10-6 s-1以上で
特異的に結合する;または500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、40pM、30pM、20pMもしくはそれ以上の結合アフィニティーで特異的に結合する。
よってモノクローナル抗体の結合を測定することによって行ってもよい。モノクローナル抗体の作製法および処理法は、当該分野で公知である。例えばKohlerおよびMilstein, Nature, 256:495 (1975)参照。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体を、最初の融合体から選択して直接調製してもよく、あるいは、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから同胞選択(sib selection)法を用いてクラス・スイッ
チ変異体を単離することによって二次的に調製してもよい。Steplewskiら, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985;Spriaら, J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984参照。本発明のモノク
ローナル抗体は、組換えモノクローナル抗体であってもよい。例えば米国特許第4,474,893号;米国特許第4,816,567号参照。本発明の抗体は、化学的に構築してもよい。例えば米国特許第4,676,980号参照。
ばJonesら, Nature 321:522 (1986);Reichmannら, Nature 332:323 (1988);Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)参照)、イヌ化抗体、イヌ抗体、またはヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、例えば直接的不死化、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウス、またはトリメラ(Trimera)法によって作製してもよい(例えばReisener
ら, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)参照)。
magletite)がある。
モニタリングしてもよい。動物由来試験サンプル中の、表1に示すポリペプチドに特異的
な抗体の増加または減少を測定することによって、疾患の寛解を目的とする特定の治療計画が有効であるか否かを判定してもよい。例えば、直接結合アッセイ、例えばRIA、ELISA、またはウェスタンブロット・アッセイを用いて、抗体の検出および/または定量を行ってもよい。
、またはヒトなど)由来の血清、血液、細胞、血漿、唾液、または尿がある。試験サンプルは、未処理であるか、または沈殿、分画、分離、希釈、濃縮、もしくは精製を行ってもよい。
数と接触させることを含む。すなわち、本発明の抗体は、サンプル中に存在するSEQ ID NO:159のポリペプチドの1つまたは複数と特異的に結合する。当業者は、抗体/ポリペプチド複合体結合の検出に使用されるアッセイおよび条件に詳しい。サンプル中のポリペプチドおよび抗体間の複合体形成を検出する。抗体/ポリペプチド複合体が形成されれば、患者サンプル中にポリペプチドが存在することを示す。
い。
い。
。抗体-抗原複合体の量は、当該分野で公知の方法によって測定できる。
能な条件下で生体サンプルと接触させる。ポリペプチド/抗体複合体を検出する。コントロールと比較してポリペプチド/抗体複合体のレベルの差異が検出されれば、該哺乳動物が腎疾患に罹患していることを示す。
添加する。抗体は固相上に使用する抗体と同じであるか、または異なる供与源または異なる種由来であってもよく、指示薬(例えば酵素コンジュゲート)に結合させてもよい。各添加の前に洗浄工程を行ってもよい。発色団(chromophore)または酵素基質を添加し、
呈色させる。呈色反応を停止させ、例えば分光光度計を用いて、色を定量する。
せる。本発明のポリペプチドを含むタンパク質を含有する可能性のある試験サンプルを基材に添加する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する第2の抗種抗体(anti-species antibodies)を添加する。これら第2の抗体は、固相抗体と異なる種由来である。第2の抗体と特異的に結合し、固相固体とは特異的に結合しない第3の抗種抗体(anti-species antibodies)を添加する。第3の抗体は指示薬(例えば酵素コンジュゲート)を含有してもよ
い。各添加の前に洗浄工程を行ってもよい。発色団または酵素基質を添加し、呈色させる。呈色反応を停止させ、例えば分光光度計を用いて、色を定量する。
上のエピトープ、または異なる1つもしくはそれ以上のエピトープに特異的に結合しても
よい。検出抗体を使用して、本発明のポリペプチドの固相への固定化を検出または可視化してもよい。この態様は、1つの抗体だけを使用して捕捉および検出の両方を行うアッセ
イに比較して、より特異的、かつ、より高感度であるため、有利である。
)、血球凝集(HA)、蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)、およびマイクロタイタープレート・アッセイ(マイクロタイタープレートの1つまたはそれ以上のウェル中で行うアッセ
イ)がある。本発明のあるアッセイは、リバーシブルフロークロマトグラフィー結合アッセイ、例えばSNAP(登録商標)アッセイを含む。例えば米国特許第5,726,010号参照。
以上の本発明のポリペプチドを、以下のような固相支持体または基材に直接または間接的に結合させる:マイクロタイター・ウェル、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、カラム、マトリクス、膜、合成もしくは天然ファイバー(例えばガラスもしくはセルロースを主成分とする物質、または、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステルなどの熱可塑性ポリマー)から成る繊維性のマット、粒子物質(例えばガラスまたは種々の熱可塑性ポリマー)から成る焼結構造、または、ニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホンなど(性質上、一般に合成である)から成るキャスト膜フィルム。本発明のある態様では、基材は焼結した微細ポリエチレン粒子であり、これは、一般に多孔性ポリエチレンとして知られている(例えばChromex社(ニューメキシコ州アルバカーキ)製、10-15ミクロン多孔性ポリエチレン)。これらの基材物質はすべて、好適な形状(例えばフィルム、シート、またはプレート)で使用することができ、あるいは、好適な不活性キャリア(例えば紙、ガラス、プラスチックフィルム、または織物)上にコーティングするか、またはそれに結合もしくはラミネートさせてもよい。抗体を固相上に固定化するための好適な方法には、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合性相互作用などがある。
および、支持体上に固定化された抗体の1つまたはそれ以上に結合する。その後、このポ
リペプチド/抗体/指示薬複合体を検出することができる。このタイプのアッセイでは、試験サンプル中のポリペプチドを定量化できる。
材上にコーティングする。試験サンプルを支持体または基材に適用し、インキュベートする。洗浄溶液で固相支持体を洗浄することにより、サンプル由来の未結合成分を除去する。表1のポリペプチドが試験サンプル中に存在すれば、それらは固相上にコーティングされた抗体に結合する。このポリペプチド/抗体複合体を、指示薬にコンジュゲートした第2の種特異的抗体(species-specific antibody)を用いて検出できる。その後、ポリペ
プチド/抗体/抗種抗体指示薬複合体を検出することができる。このタイプのアッセイでは、試験サンプル中のポリペプチドを定量化できる。
接触させることができる。例えば、ポリペプチドの存在および/または量を測定するため、予め希釈した血清もしくは血漿、または高濃度の標本(例えば尿)を試験するのが通常好ましい。
定の態様では、使用説明書、並びに、特に当業者によって理解されるサンドイッチアッセイに有用な2次抗体を含んでもよい。該キットの識別可能に標識した抗体コンポーネント、並びに、該抗体を標識するための試薬および方法も、本発明のキットの、便宜に提供されるコンポーネントである。
ンパク質フラグメントを検出するためのものである。キットは、1つまたはそれ以上の本
発明の抗体、および、サンプル中に存在する表1のアミノ酸配列を含有する完全長タンパク質またはタンパク質フラグメントへの該抗体の結合を測定する方法を含んでもよい。また、キットまたは製品は、1つまたはそれ以上の本発明の抗体または抗体フラグメント、
および、サンプル中のポリペプチドへの該抗体または抗体フラグメントの結合を測定する方法を含んでもよい。キットは、1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチドまたは抗体
を含有する装置、および、(例えば哺乳動物における腎疾患の同定のための)該1つまた
はそれ以上のポリペプチドまたは抗体の使用説明書を含んでもよい。また、キットは、キットの該1つまたはそれ以上のポリペプチドまたは抗体を腎不全の同定に使用することが
できることを示したラベルを含む包装材料を含んでもよい。当業者に公知の他のコンポーネント(例えばバッファー、コントロールなど)がそれらの試験キットに含まれてもよい。本発明のポリペプチド、抗体、アッセイ、およびキットは、例えば患者における腎疾患の個々の症例を診断するのに有用である。
連続する天然型アミノ酸から成る。本発明のある態様では、精製ポリペプチドは約10、15、20、25、30、35、40、50、60以上の連続する天然型アミノ酸から成る。
これは、ポリペプチドが小さいほど、完全長ポリペプチドのアッセイに比較して特異度および/または感度が高くなりうるためである。これらの、より小さいポリペプチドは、完全長ポリペプチドに比較して、製造がより安価であり、より高い純度で得られうる。更に、サンプル中に存在する、より小さいフラグメントおよびより小さいフラグメントのレベルは、疾病状態の指標となる。断片化されたタンパク質の示差的発現は、腎疾患のマーカーである。
Press, New Jersey, (1994);von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology,
Academic Press, (1987);および、GribskovおよびDevereux編, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのア
ラインメント法はコンピュータプログラムに体系化されており、それらには、GCGプログ
ラム・パッケージ(Devereuxら, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschulら, J. Molec. Biol. 215:403 (1990))、およびBestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix(商標), Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) (これはSmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム(Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))を使用する)がある。例えば、FASTAアルゴリズムを使用するコンピュータ・プログラムALIGNを、ギャップオープンペナルティ=-12、ギャップ伸長ペナルティ=-2のアフィン・ギャップ検索を用いて使用してもよい。
変されたポリペプチドの特性を評価してそれが生物学的同等物であるか否かを判定することによって行うことができる。変異体が、アッセイ(例えば免疫組織化学アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫酵素アッセイ、またはウェスタンブロット・アッセイ)で本発明のポリペプチドと実質的に同様に反応すれば(例えば元のポリペプチドの90-110%の活性を有すれば)、その変異体は生物学的同等
物である。ある態様では、アッセイは競合アッセイであり、生物学的に同等のポリペプチドは、相当する反応性抗原または抗体への本発明のポリペプチドの結合を約80、95、99、または100%低下させる能力を有する。相当する野生型ポリペプチドに特異的に結合する抗
体は、変異型ポリペプチドにも特異的に結合する。
のポリペプチドの結合を促進するための、リンカーまたは他の配列を含有してもよい。例えばポリペプチドを免疫グロブリンのFc領域またはウシ血清アルブミンにコンジュゲートさせてもよい。
ペプチドと結合していないアミノ酸配列である。アミノ酸スペーサーは約1、5、10、20、100、または1,000個のアミノ酸を含有してもよい。
ド(例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヒスチジン・タグ、およびブドウ球菌
プロテインA)を更に含有してもよい。1つより多い本発明のポリペプチドが、本発明の
融合タンパク質中に存在してもよい。本発明のポリペプチドは、異なる生物のタンパク質に機能的に結合するか、または融合タンパク質を形成してもよい。本発明の融合タンパク質は1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチド、そのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。融合タンパク質は天然に存在しない。「機能的に結合した」という用語は、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドが、本発明のポリペプチドのN
末端またはC末端のいずれかにインフレームで融合していることを意味する。
有してもよい。多量体ポリペプチドは多抗原ペプチド(MAP)であってもよい。例えばTam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996)を参照されたい。
。例えばELISAアッセイにおいて、本発明のポリペプチド(例えば30アミノ酸長ポリペ
プチド・フラグメント)を固相支持体(例えばプラスチック製マルチウェル・プレートのウェル)に結合させる。一群の抗体を標識して固相支持体に付加し、非特異的吸着が阻害されるような条件下で未標識の抗原に結合させ、未結合の抗体および他のタンパク質を洗浄除去する。抗体の結合を、例えば無色の基質を有色の反応生成物に変化させる反応によって、検出する。その後、同定された30アミノ酸長から徐々により小さな、オーバーラップしているフラグメントを試験し、目的のエピトープをマッピングしてもよい。
することができる。本発明の免疫原性ポリペプチドは、SEQ ID NO:1-6に示すアミノ酸配
列を有するポリペプチドのフラグメントであってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチド・フラグメントは約10、15、20、25、30、40、50、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチド・フラグメントは約50、40、30、20、15、10、またはそれ未満のアミノ酸長であってもよい。
以下の実施例は、本発明の具体的な態様、および、その種々の使用法について例証する。それらは単に説明を目的とするものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
患者血液サンプルをイヌ(複数)から回収した。これらのイヌは単一の家族のメンバーであり、1997年からテキサスA&M大学で飼育されていたものである。より具体的には、こ
の家族は、X連鎖性遺伝性ニューロパチー(XLHN)を有するヘテロ接合(キャリア)のメ
スのコロニーである。XLHNは、COL4A5遺伝子中の変異によって起こり、メス・イヌでは、IV型コラーゲンペプチドのモザイク状発現が起こり、3から6ヶ月齢で、糸球体性タンパク尿が発症する。Nabityら, J Vet Intern Med 2007; 21:425-430。コントロール対被験(
疾患)を選択し、コントロールは健常なイヌ、被験群または疾患群はクレアチニンレベルの上昇を示しているイヌとした。
ミドの添加によって沈殿させ、その後、ボルテックスで10秒間撹拌し、サンプルを室温で30分間インキュベートした。得られた沈殿を、13000rpm、30分間、10℃で遠心分離した。上清を、5.0mLの0.1%ギ酸/水を含むホウケイ酸培養管中にデカントし、均質となるまで混合した。
セトニトリル、そして最後に2.0mLの0.1%ギ酸/水で平衡化(conditioned)した。流速0.015mL/秒でサンプルをロードした後、1.25mLの0.1%ギ酸/水で洗浄した(流速0.015mL/秒)。次いで、1.25mLずつの画分を、5μLの20mg/mL N-ノニル-β-グルコピラノシド水溶液を含有するホウケイ酸ガラス管に回収した。画分を連続的に溶出し、まず0.1%ギ
酸/(35%アセトニトリル/水)、次に0.1%ギ酸/(65%アセトニトリル/水)を用い
て、流速0.015mL/秒で個別に回収した。それぞれの送液(run)の間に、カニューレお
よび溶媒移送ラインを3.0mLの0.1%ギ酸/アセトニトリル、次いで3.0mLの0.1%ギ酸/水
を用いて、流速0.5mL/秒でパージおよび洗浄した。
乾燥状態となるまでエバポレートした。次いで、乾燥サンプルを2つのバッチに分け、-80℃で保存した。分析には、60μLの0.1%ギ酸/5%アセトニトリル(画分の35%)または0.1%ギ酸/35%アセトニトリル(画分の65%)でサンプルを再構築し、液体クロマトグ
ラフィー/質量分析(LC/MS)で分析した。
被験サンプルおよびコントロールサンプルを液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)に施与し、示差的に生成されるポリペプチドを質量によって同定した。その後、既存
のデータベースのペプチドID検索を行うことによって、同定されたポリペプチドの質量の
アノテーションを行い、相当するタンパク質名を判定した。ペプチドアノテーションのためのユニークなデータベースをNCBI、Swissprot、Uniprotから作製した。
患したイヌで示差的に生成されたポリペプチドである。従って、これらのポリペプチドは、イヌにおける腎疾患の検出のためのユニークなバイオマーカーとなる。
マトグラフィー/質量分析法を以下に示す:
液体クロマトグラフィーのパラメータ
溶媒A:0.1%ギ酸/水;溶媒B:0.1%ギ酸/アセトニトリル;カラム:Acquity UPLC BEH130 C18 1.7μM 内径2.1 x 長さ150mm;ガードカラム:vanguard BEH 300 C18 1.7uM;注入量:25μL;トレイ温度:10℃;カラムオーブン温度:45℃;MS分析時間:60分;流路切
替バルブ(divert valve):無し
下のパラメータで、ペプチドの示差的発現について解析した:
ドを同定した:
イヌ血清を、IDEXX Reference Laboratoriesに提出された野外標本から得た。イヌの品種および年齢は種々であった。血清クレアチニンが<1.8 mg/dLである25サンプルを低ク
レアチニン群とし、血清クレアチニンが>1.8 mg/dLである25サンプルを高クレアチニン
群とした。この場合も、高クレアチニンは腎疾患と関係するため、イノシンレベルを評価し、イノシンが腎機能の低下のバイオマーカーとなり得るか否かを判定した。
し、示差的に生成される質量特性を、前記のインフォマティクスによって同定した。LC/MSは、各サンプル(すなわちイヌ)毎に、個別に実行した。SIEVEソフトウェア(Thermo Scientific社、マサチューセッツ州ウェルサム)を用いてLC/MSデータの統計解析を行った。LC/MSの生データをSIEVEに読み込ませ、ピークを同定した。統計解析を実施して、低クレアチニンおよび高クレアチニン・サンプルのピークを比較した。イノシンに相当する示差的ピークを同定した。高血清クレアチニンのイヌ25検体中13検体で、血清イノシンの枯渇が観察された。イノシンのイオン強度(LC/MSで測定)を図1に示す。図中、「腎疾患
」は高クレアチニンかつイノシン枯渇のイヌ13検体を示し、「コントロール」は低血清クレアチニンのイヌ25検体すべてを示す。
。その後、上清をLC/MSで分析した。SIEVEおよびRを用いて、示差的レベルで存在する分
子の同定を行った(p値<0.05)。
ガードカラム:vanguard BEH 300 C18 1.7uM
注入量:25μL
トレイ温度:10℃
カラムオーブン温度:45℃
MS分析時間:60分
流路切替バルブ:廃液へ 0-5、ソースへ 5-55、廃液へ 55-60
MSスキャンイベント1:FTMS;分解能30000;スキャン範囲100.0-500.0
MSスキャンイベント2:FTMS;分解能30000;スキャン範囲500.0-2000.0
MSチューンファイル値
ソースタイプ:ESI
キャピラリー温度(℃):250.00
シースガス流:24.00
Auxガス流:13.00
スイープガス流:0
イオントラップMSn AGC Target:10000
FTMS Injection waveforms:オフ
FTMS AGC Target:500000
ソース電圧(kV):4.50
ソース電流(μA):100.00
キャピラリー電圧(V): 68.28
チューブレンズ(V): 130.00
スキマーオフセット(V): 0.00
多重極RF増幅器(Multipole RF Amplifier)(Vp-p)):550.00
多重極00オフセット(V):-1.60
レンズ0電圧(V):-2.70
多重極0オフセット(V):-5.80
レンズ1電圧(V):-11.00
ゲートレンズオフセット(V):-60.00
多重極1オフセット(V):-10.50
フロントレンズ(V):-5.18
FTMSフルマイクロスキャン:1
FTMSフルMax Ion Time (ms):500
イオントラップMSnマイクロスキャン:3
イオントラップMSn Max Ion Time:100
ーロパチー(XLHN)を有するイヌで、補足研究を行った。XLHNは、遺伝子COL4A5中の変異によって起こる(詳細は実施例1参照)。これらのXLHNイヌは、糸球体異常から始まって尿細管障害に進行する腎疾患のモデルとなる。XLHNを有する4検体のオス仔イヌからの血
清および尿サンプル(表11)を、疾患前、疾患の中期、および疾患の後期に回収し、下記の腎臓LC/MSアッセイに記載するように、イノシンの分析を行った。
1.移動相A:1リットルの水に1mlの酢酸を添加し、十分撹拌する。
2.移動相B:1リットルのアセトニトリルに1mlの酢酸を添加し、十分撹拌する。
1.5mgの重水素化クレアチニンおよび6-クロロプリンリボシドを20mlのバイアルに秤取
する。
2.5mlの水を添加して希釈する(1mg/ml溶液)。
3.#2の5mlを2リットルのフラスコに移し、水を2リットルの印まで添加する(2.5μg/ml溶液)。
4.#3を内部STD添加溶液(spiking solution)として使用する。
1.10mgのクレアチニンおよび10mgのイノシンを2mlバイアルに秤取し、10mlの水を添加
して溶解する(1mg/ml溶液)。
2.345mgのウシ血清アルブミン(BSA)を5mlのリン酸バッファー溶液中に秤取する。十
分撹拌する。必要により、スケールアップまたはスケールダウンする(PBS-BSA溶液)。
3.5μlの1mg/ml溶液を990μlのPBS-BSA溶液中に移す(5μg/ml 標準点1)。
4.#3から一連の1/1希釈液を11段階調製する(標準点2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、およびブランク)。
1.血清サンプルを解凍する。
2.サンプルを10秒間ボルテックスした後、室温、3000xgで10分間遠心分離を行う。
3.50μlのサンプルおよびSTD曲線点をマイクロチューブまたは96ウェルプレートに移す。
4.50μlのIS溶液を各サンプルに添加する。
5.100μlのアセトニトリルを添加する。
6.ボルテックスで混合する。
7.水浴中、20分間超音波処理を行う。
8.25℃、3000xgで20分間遠心分離を行う。
9.0.4ミクロンのナイロンフィルターを用いて、褐色バイアル/96ウェルプレート中に
上清をろ過する。
10.サンプルをLC/MSで分析する。
の進行と共にイノシンの有意な低下が見られる。これらのデータは、イノシンが腎疾患および尿細管障害のバイオマーカーの役割を果たすことを立証している。
実施例1に記載するように、ヘテロ接合性メスXLHNイヌから患者血液サンプルを採取した。サンプルは、実施例1に記載するように調製した。ただし、すべての画分は0.1%ギ酸/(35%アセトニトリル/水)で溶出し、サンプルは、0.1%ギ酸/(3.5%アセトニトリル/水)で再構築した。
度は10℃とし、MS分析時間は60分とした。表12に、4検体のヘテロ接合性メスXLHNイヌにおける、一定時間にわたる5つのペプチド(SEQ ID NO:1(アポリポタンパク質C1);SEQ ID NO:31(シスタチンA);SEQ ID NO:18(フィブリノーゲンα鎖);SEQ ID NO:25(
インターαインヒビターH4(ITIH4));SEQ ID NO:23(キニノゲン)のLC/MS測定の結果を示す。表12において、「NF」は「不検出(not found)」(すなわち検出限界未満)
の略語であり、「ND」は「未測定(not determined)」の略語である。腎疾患の進行に伴い、ApoC1およびインターαインヒビターH4(ITIH4)レベルは上昇し、一方、フィブリノーゲンαのレベルは低下した。キニノゲンレベルは、コントロールイヌよりXLHNイヌでの方が高かった。シスタチンAレベルは、4検体のXLHNイヌ中少なくとも3検体で、コント
ロールイヌに比較して高かった。
種々の種およびサイズのイヌに二クロム酸塩を注射し、具体的には尿細管障害による、腎障害を誘導した。Rueggら, Toxicol Appl Pharmacol. 1987, 90(2):261-7;Pedraza-Chaverriら, BMC Nephrology 2005, 6:4;Chiusoloら, Toxicol Pathol. 2010, 38:338-45
参照。具体的には、イヌに0.2mL/kgの二クロム酸カリウム(5mg/ml)を注射した。種々の時点で回収した血液サンプルから血清を調製した。イヌNGAL ELISAキット(BioPorto Diagnostics社、デンマーク ゲントフテ)を用い、製造者の説明書に従って、NGAL(好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン)のアッセイを行った。二クロム酸塩注射後の種々の時点で採取した血液サンプル由来の血清中のイノシン濃度を測定した。前記の実施例(腎臓アッセイLC/MS)に記載したように、イノシンおよびクレアチニンをLC/MSで測定した。
理後約60から70時間の間に、イノシンレベルは回復し始めた。Fatimaら, Hum Exp Toxicol 2005, 24:631-8参照。クレアチニンおよびNGALを、参照マーカーとして含めた(図2)。概して、これらのデータは、イノシンレベルの低下が腎不全および尿細管障害のマーカーとなることを示している。
インターαインヒビターH4(ITIH4)))の相対濃度の測定値の経時変化を示す。
内に低下し、後の時点で回復(増加)した(図3B)。これらのデータは、SEQ ID NO:23
(キニノゲン)レベルの低下が腎不全および尿細管障害のマーカーとなることを示している。
塩処理の2日目までに低下し、2日目以降、回復(増加)した(図3C)。これらのデータ
は、SEQ ID NO:25(インターαインヒビターH4(ITIH4))レベルが腎不全および尿細管
障害のマーカーとなることを示している。
Claims (25)
- 腎疾患を診断する方法であって、
(a)患者サンプル中の、表1のポリペプチドの少なくとも1つの量を測定し(ここで、該ポリペプチド(単数または複数)はSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:59の1つまたはそれ以上を
含む)、そして
(b)患者サンプル中の該少なくとも1つのポリペプチドの量をコントロールサンプルと比較する(ここで、患者サンプル中のポリペプチドのレベルとコントロールサンプル中のものとの差異が、腎疾患の指標となる)
ことを含む、上記方法。 - 該ポリペプチドがアポリポタンパク質C-I、アポリポタンパク質C-II、キニノゲン、イン
ターαインヒビターH4(ITIH4)、フィブリノーゲンα鎖、フィブリノーゲンA-α鎖、シ
スタチンA、シスタチンB、および/もしくはケラチン10(Keratin type I cytoskeletal 10)、またはそれらのフラグメントである、請求項1記載の方法。 - 該ポリペプチドの量の測定を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)で行う、請求
項1記載の方法。 - 腎疾患が糸球体性である、請求項1記載の方法。
- 腎疾患が尿細管性である、請求項1記載の方法。
- 該患者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
- 該患者がヒト、ネコ、またはイヌである、請求項6記載の方法。
- 該患者サンプルが血液、血清、血漿、または尿である、請求項1記載の方法。
- 該ポリペプチドがSEQ ID NO:1、18、23、25、および/または31を含む、請求項1記載の
方法。 - ポリペプチドの量の測定をイムノアッセイによって行う、請求項1記載の方法。
- SEQ ID NO:1-59の1つまたはそれ以上を含む、単離されたポリペプチド。
- 腎疾患を診断する方法であって、
(a)患者サンプルを、イノシン/抗体複合体の形成が可能な条件下で、イノシンに特異的に結合する抗体と接触させ;
(b)イノシン/抗体複合体を検出する(ここで、患者サンプル中に存在するイノシン/抗体複合体とコントロールサンプル中のものとのレベルの差異が、腎疾患の指標となる)ことを含む、上記方法。 - 患者サンプル中のイノシンを検出する方法であって、
(a)イノシンに特異的に結合する抗体を、イノシン/抗体複合体の形成が可能な条件下で接触させ;
(b)イノシン/抗体複合体を検出する(ここで、患者サンプル中に存在するイノシン/抗体複合体とコントロールサンプル中のものとのレベルの差異が、腎疾患の指標となる)ことを含む、上記方法。 - 腎疾患を診断する方法であって、
(a)患者サンプル中のイノシンの量を測定し、そして
(b)患者サンプル中のイノシンの量をコントロールサンプル中のものと比較する(ここで、患者サンプル中のイノシンのレベルとコントロールサンプル中のものとの差異が、腎疾患の指標となる)
ことを含む、上記方法。 - 該イノシンの量の測定を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)で行う、請求項1
4記載の方法。 - 該イノシンのレベルが、コントロールと比較して患者サンプル中で低下している、請求項14記載の方法。
- 腎疾患が糸球体性である、請求項12-14のいずれか一項に記載の方法。
- 腎疾患が尿細管性である、請求項12-14のいずれか一項に記載の方法。
- 該患者が哺乳動物である、請求項12-14のいずれか一項に記載の方法。
- 該患者がヒト、ネコ、またはイヌである、請求項19記載の方法。
- 該患者サンプルが血液、血清、血漿、または尿である、請求項12-14のいずれか一項
に記載の方法。 - 該抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の抗原結合フラグメント、または1本鎖抗体である、請求項12または13記載の方法。
- 腎疾患を診断するためのキットであって、1つまたは複数の抗体を含有し、該抗体のそれ
ぞれがイノシンに特異的に結合する、上記キット。 - 腎疾患を診断するためのキットであって、
(a)イノシンに特異的に結合する1つまたは複数の抗体;
(b)患者サンプル中に存在するイノシンへの抗体の結合を促進する試薬
を含み、ここで、患者サンプル中に存在するイノシン/抗体複合体のレベルとコントロールサンプル中のものとの差異が、腎疾患の指標となる、上記キット。 - 該キットがイヌの腎疾患を診断するためのものである、請求項23または24記載のキット。
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