JP2018021047A

JP2018021047A - 癌免疫療法

Info

Publication number: JP2018021047A
Application number: JP2017156320A
Authority: JP
Inventors: ヨンジュンキム; Yong J Kim; ドリューエム．パードール; Drew M Pardoll; ジュアンフー; Juan Fu
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2018-02-08
Also published as: EP2758080A1; EP2758080A4; US20140341978A1; US9308253B2; CN103957939A; WO2013043647A1; EP2758080B1; CA2849259A1; JP2014527983A; HK1197182A1

Abstract

【課題】癌患者を治療するために使用することができる組成物の提供。
【解決手段】サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合するヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、一本鎖、抗体結合フラグメント、およびダイアボディなどの抗PD-1抗体；および微生物の産物を感知し、かつ/または獲得免疫応答を開始する、タンパク質のファミリーであるTLR(Toll様受容体)アゴニスト；を含む組成物であって、全癌細胞がTLRアゴニストと共に製剤化されている、組成物。
【選択図】図１１

Description

本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)の支援を受けて行われた。したがって、米国政府は、認可番号NIH K23-DE018464-02の下で一定の権利を保持する。

発明の技術分野
本発明は癌治療の分野に関係する。特に、それは癌免疫療法に関するものである。

発明の背景
複数の腫瘍タイプにおける安全性ならびに利用可能性のその広範な経歴のため、GM-CSFを分泌するように遺伝子操作され、致死的照射を受けた腫瘍細胞ワクチン(GVAX)は、免疫チェックポイント遮断抗体との併用療法の可能性を有する1つのワクチンプラットフォームである。しかしながら、GVAXにより分泌された局所的なGM-CSFは、マクロファージと樹状細胞に骨髄系前駆細胞を動員することができるが、このサイトカインはそれらの細胞の活性化を誘導しない可能性がある。したがって、GVAXは主に、免疫系の求心性アームにおいて最適な腫瘍抗原提示のために必要な抗原提示細胞(APC)を活性化することに限界がある。感染性病原体に対するワクチンに見られるような強力な免疫応答を表現型模写する1つの簡易戦略は、複数のTLRアゴニストを癌細胞ベースのワクチンと組み合わせることである。臨床的には、癌ワクチンの効力を増強するために、多数のアジュバントが癌患者のために開発されており、これらのアジュバントの多くは典型的にはTLRアゴニストである。

非標的化TLR刺激についての1つの現実的な懸念は、腫瘍細胞における長期TLR刺激による発癌促進への帰趨である。腫瘍細胞上に発現されたTLR4受容体の刺激は、発癌を促進することが示されている。しかしながら、造血コンパートメントでのTLRシグナル伝達は、抗腫瘍応答を誘発することが示されており、結果として複数の臨床試験につながった。腫瘍微小環境で樹状細胞を標的とし、かつ腫瘍微小環境でのTLR4刺激がインビボで潜在的発癌作用を誘導できるかどうかを試験するために、本発明者らのグループは、LPSで製剤化したGVAXを腫瘍内に注射し、TLR4リガンド吸収型GVAXの腫瘍内注射が3種類の異なるマウスモデルにおいてインビボで局所的抗腫瘍応答を改善することを見出した。

腫瘍のより安全でより効果的な治療薬を得ることが、当該技術分野では引き続き必要である。

本発明の一局面によれば、癌患者を治療するために使用することができる組成物が提供される。前記組成物は、(a)サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞、(b)PD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体、および(c)TLR(Toll様受容体)アゴニストを含有し、ここで、全癌細胞はTLRアゴニストと共に製剤化されている。

本発明の別の局面によれば、方法が提供される。剤が癌患者に投与される。剤は、(a)サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞、(b)PD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体、および(c)TLR(Toll様受容体)アゴニストであり、ここで、全癌細胞はTLRアゴニストと共に製剤化されている。全癌細胞はTLRアゴニストと共に製剤化される。

本発明の別の局面によれば、以下の剤：(a)サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞、(b)PD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体、および(c)TLR(Toll様受容体)アゴニストを含むキットが提供され、ここで、全癌細胞はTLRアゴニストと共に製剤化されている。必要に応じて、全癌細胞はTLRアゴニストと共に製剤化される。

これらおよび本明細書を読むことで当業者には明らかな他の態様が、当技術分野に提供される。
[本発明1001]
サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト；
を含む組成物であって、全癌細胞がTLRアゴニストと共に製剤化されている、組成物。
[本発明1002]
サイトカインがGM-CSF(顆粒球単球細胞刺激因子)である、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
全癌細胞が患者にとって自己由来である、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
全癌細胞がTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
全癌細胞がTLR4アゴニストと共に製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
全癌細胞がTLR4およびTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
TLRアゴニストが、GLA、R848、およびこれらの組合せからなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
癌細胞がメラノーマ細胞である、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がエマルションビヒクルを用いて製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がリポフェクタミン(商標)を用いて製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がカチオン性脂質を用いて製剤化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
以下の免疫療法剤：
サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト
を癌患者に投与する段階を含む方法であって、全癌細胞がTLRアゴニストと共に製剤化されている、方法。
[本発明1013]
サイトカインがGM-CSF(顆粒球単球細胞刺激因子)である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
全癌細胞が患者にとって自己由来である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
全癌細胞がTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1016]
全癌細胞がTLR4アゴニストと共に製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1017]
全癌細胞がTLR4およびTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1018]
TLRアゴニストがGLA、R848、およびこれらの組合せからなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1019]
全癌細胞がメラノーマ細胞である、本発明1012の方法。
[本発明1020]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がエマルションビヒクルを用いて製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1021]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がリポフェクタミン(商標)を用いて製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1022]
TLRアゴニストおよび全癌細胞がカチオン性脂質を用いて製剤化されている、本発明1012の方法。
[本発明1023]
以下の剤を含むキット：
サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト。
[本発明1024]
前記剤を投与するおよび/または製剤化するための指示書をさらに含む、本発明1023のキット。
[本発明1025]
エマルションビヒクルをさらに含む、本発明1023のキット。
[本発明1026]
リポフェクタミン(商標)をさらに含む、本発明1023のキット。
[本発明1027]
カチオン性脂質をさらに含む、本発明1023のキット。

図1A〜1D：TEGVAXは、流入領域リンパ節における活性化された形質細胞様樹状細胞(pDC)および従来型樹状細胞(cDC)を増加させることができる。図1A：腫瘍を担持しないマウスへのワクチン注射後3日目から、ワクチン流入領域リンパ節由来のpDCおよびcDCのゲートをかけた集団をCD86について定量化した。IDC-1005は、10％(w/v)スクアレンの水中油型エマルション中のGLAおよびR848であり、TEGVAXは、照射GVAXと共に製剤化したIDC-1005である。図1A〜1D：TEGVAXは、流入領域リンパ節における活性化された形質細胞様樹状細胞(pDC)および従来型樹状細胞(cDC)を増加させることができる。図1B：TEGVAXは、ワクチン注射後3日目に、GVAXと比較して、流入領域リンパ節由来のpDC上にCD86およびCD80活性化マーカーの増加を誘導した(*P＜0.05)。図1A〜1D：TEGVAXは、流入領域リンパ節における活性化された形質細胞様樹状細胞(pDC)および従来型樹状細胞(cDC)を増加させることができる。図1C：TEGVAXは、ワクチン注射後3日目に、GVAXと比較して、流入領域リンパ節由来のcDC上にCD86およびCD80活性化マーカーを増加させた(* P＜0.05)。図1A〜1D：TEGVAXは、流入領域リンパ節における活性化された形質細胞様樹状細胞(pDC)および従来型樹状細胞(cDC)を増加させることができる。図1D：TEGVAXまたはGVAXの注射後3日目から7日目までの流入領域リンパ節DLN由来のCD86+ pDCおよびcDC。図2A〜2D：TEGVAXは、複数の動物モデルにおいて、GVAXと比較して、有意なインビボ抗腫瘍応答を誘導する。これらすべてのインビボ治療実験は、少なくとも3つの別々の実験を代表しており、すべての実験において、各群は1群10匹のマウスで構成されている。図2A：触知可能なB16黒色腫を有するマウスを、対側肢においてはGVAX、TEGVAX(GVAX/IDC-1005)、およびIDC-1005で処置し、腫瘍の体積を毎日測定した。IDC-1005は、10％(w/v)スクアレンの水中油型エマルション中のGLAおよびR848である。図2B：7日目、14日目、および28日目(矢印)にワクチンとTLRアゴニストの複数回の注射により処置した触知可能なB16黒色腫。図2C：触知可能なSCCFVII舌癌を、対側肢においては10⁶個のSCCFVII-GVAXで処置し、腫瘍を毎日測定した。TEGVAXで処置したC3H/HeOUJマウスでは退縮が見られ、これらのマウスは、22日目および27日目に(矢印)、それぞれ異なる部位に、5×10⁴個および1×10⁵個のSCCFVIIで再負荷した(* P＜0.05；** P＜0.01）。これらの再負荷部位で腫瘍は増殖しなかった。図2D：B16治療アッセイは、インキュベーションなしでのGVAXとIDC-1005との混合物、対、TEGVAX(GVAXおよびIDC-1005の1時間インキュベーション)で行った。インキュベーション群は、インキュベーションなし群と比較して、有意な抗腫瘍効果を有していた(* P＜0.05)。図3A〜3D：TEGVAX処置は、腫瘍の壊死と、腫瘍浸潤リンパ球およびAPCを増加させた。図3A：処置群のそれぞれからB16腫瘍組織を採取して、H&Eで染色した。TEGVAXで処置された腫瘍は壊死巣(丸で囲んだ領域、20倍)の数の増加を示した。図3B：壊死巣はTEGVAXおよびGVAXで処置した腫瘍組織において20倍の倍率で10箇所の別個の領域にて定量化した(** P＜0.01)。図3C：処置群のそれぞれにおいて凍結腫瘍組織をαCD4およびαCD8 FITCコンジュゲートで染色し、DAPIで対比染色した。TEGVAXで処置されたB16黒色腫は、腫瘍微小環境の腫瘍組織へのCD4およびCD8細胞の浸潤が増加していた。図3D：腫瘍浸潤CD4、CD8、およびCD86細胞を、免疫蛍光顕微鏡を用いて10箇所の異なる視野でランダムに計数した。TEGVAXで処置されたB16腫瘍は、GVAXおよびIDC-1005で処置された腫瘍と比較して、有意に増加した浸潤リンパ球を有していた(* P＜0.05；** P＜0.01)。図4A〜4D：TEGVAXは、T_H1応答、ならびに腫瘍におけるB7-H1発現の上方制御を誘導する。図4A：腫瘍流入領域リンパ節を処置マウスから採取し、CD4およびCD8の両集団についてIFNγの細胞内染色を行った。図4B：CD4+ IFNγ+およびCD8+ IFNγ+の平均蛍光強度を処置群のそれぞれにおいて定量化した。図4C：処置された腫瘍組織を採取して、ラット抗マウスB7-H1抗体で染色し、抗ラットCy3コンジュゲートを用いてB7-H1陽性細胞を評価した。10箇所の異なる視野において40倍の倍率で盲検法での定量が実施され、図4Dに要約されている。図5A〜5D：TEGVAXのインビボ抗腫瘍応答は、CD4およびCD8 T細胞依存性である。図5A：GK1.5(CD4枯渇性)抗体と2.43(CD8枯渇性)抗体の両方をワクチン処置中に腹腔内注射した。図5B：CD4、CD8細胞をTEGVAXおよび対照治療アッセイにおいて個別に枯渇させた。図5C：TEGVAXの抗腫瘍応答はRag2-/-マウスにおいて抑止される。図5D：TEGVAXの抗腫瘍応答はMyD88-/-およびTRIF-/-ダブルノックアウトマウスにおいて抑止される。TEGVAXのインビボ効果は、これらのTLRシグナル伝達に欠陥のあるマウスでは、GVAXと同一である(** P＜0.01)。図6A〜B：TEGVAXで処置されたマウスでは、腫瘍特異的CTL細胞の数が増加している。P15Eペプチドを用いたインビボCTLおよびELISPOTアッセイは、ワクチンおよびアジュバントで処置されたB16腫瘍担持マウスで実施した。図6A：インビボCTLアッセイは、ワクチン処置後25日目に、処置群のそれぞれから実施した。P15Eペプチド特異的死滅は、以下の式：(1−CFSE_{ペプチドあり}の割合（％）/CFSE_{ペプチドなし}の割合（％）)×100を用いて計算した。図6B：23日目の処置群のそれぞれ由来の脾細胞に関するELISPOTアッセイ。P15EペプチドをT2kb APCにパルスした(** P＜0.01)。図7A〜7C：TEGVAX/抗PD-1処置は、確立されたB16腫瘍の退縮を誘導することができる。図7A：右のパネルは、ワクチンおよび抗PD-1のさまざまな組み合わせで処置された、確立されたB16腫瘍の腫瘍増殖速度を示す。図7A〜7C：TEGVAX/抗PD-1処置は、確立されたB16腫瘍の退縮を誘導することができる。図7B：左のパネルには2匹のマウスが示される。右のマウスはTEGVAX/抗PD-1で処置されたマウスのうち1匹であり、左のマウスはGVAXで処置されたマウスのうち1匹である。TEGVAX処置マウスは退縮を示さなかった。円は腫瘍接種部位を示す。矢印は白斑(vitiligo)の部位を示す。図7A〜7C：TEGVAX/抗PD-1処置は、確立されたB16腫瘍の退縮を誘導することができる。図7C：腫瘍流入領域リンパ節を採取し、TH1サイトカインをCD4、CD8、およびCD11c+ DC細胞から定量した。 (補足図1)：TEGVAX処置マウスの腫瘍流入領域LNにおける、増加したIL-12、TNFα、およびIFNα。腫瘍DLNを採取して、CD11c+細胞上のTh1サイトカインプロファイルを、処置群のそれぞれにおいて分析した。TEGVAX処置マウスは、GVAXまたは対照処置群と比較して、IL12、TNFα、およびIFNα陽性CD11c+細胞が有意に増加していた。 (補足図2)：TEGVAXは確立されたCT26モデルにおいて抗腫瘍応答を誘導する。10⁵個のCT26結腸癌細胞を足蹠に注射し、触知可能な腫瘍を有するマウスをワクチンで処置した。CT26-GVAXは、Yoshimuraら(11)に記載されるとおりに調製した。TEGVAXは、CT26-GVAX単独またはIDC-1005単独と比較して、マウスCT26結腸癌の増殖を有意に減少させた(** P＜0.01)。図10A〜B(補足図3)：TEGVAXに製剤化した複数のTLRアゴニストは、インビボで最大の抗腫瘍応答を有していた。図10A：TEGVAX、GVAX、R848を用いて製剤化したGVAX、またはGLAを用いて製剤化したGVAXで、触知可能なB16腫瘍を担持するマウスを処置した。すべての製剤化は、ワクチン注射に先立って、B16-GVAXを、10％(w/v)スクアレンの水中油型エマルションビヒクル中のアジュバントと共に4℃で1時間インキュベートすることから成っていた(** P＜0.01)。図10B：個々のアジュバントと、GVAXを含まないビヒクルは、インビボ抗腫瘍効果がなかった。 (補足図4)：リポフェクタミン(商標)2000(Invitrogen社)を用いてGLAおよびR848を吸収させて製剤化したTEGVAXは、水中油型エマルションビヒクルを用いて製剤化したTEGVAXに匹敵するインビボ抗腫瘍効果を有していた(** P＜0.01)。 (補足図5)：TEGVAXは、ワクチン由来の内在的にエンドサイトーシスされた代用腫瘍抗原であるQ-dotを有する活性化DCの数を増加させた。GVAXおよびTEGVAXをQtracker 655(Invitrogen)で標識して、マウスの足蹠に接種した。3日後、流入領域膝窩LNを採取し、リンパ球をCD3およびCD19抗体で枯渇させた。FACS分析により、ワクチン由来のQ-dotで標識された内在性pDCおよびcDCを定量化した。

発明の詳細な説明
本発明者らは、PD-1遮断剤と組み合わせた最適に製剤化した癌ワクチンを腫瘍処置用に治療的に使用し得る、というインビボでの証拠を発展させてきた。本発明者らは、この併用レジメンが免疫抗原性の乏しい確立された腫瘍に対して有効であり得るということを証明するための証拠を収集している。この併用レジメンのすべての成分は、個別に患者で試験され、臨床的に安全であることが見出された。開示された治療戦略は獲得免疫の回避によって作用し得るが、本出願人らは、提案したいかなる作用機序によっても拘束されることを意図していない。

さまざまな癌を有する患者は、この併用レジメンにより治療することができる。そのような癌としては、以下が挙げられる：結腸直腸癌、気道消化器扁平上皮癌、肺癌、脳腫瘍、肝臓癌、胃癌、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、および腎臓癌。このリストは、限定するためではなく例示するためのものである。

全癌細胞は、治療レシピエントに対して同種異系、同系、または自己由来であり得る。典型的には、全癌細胞は、それらの免疫原性およびそれらの代謝活性を維持する技術によって、それらを増殖不能にするように処理される。一般的に用いられる1つの技術は放射線照射である。そのような細胞。通常は、患者が担う腫瘍細胞と同じ一般的なタイプの腫瘍細胞が使用される。例えば、黒色腫に罹患している患者は、典型的には、増殖能力のないメラノーマ細胞を投与される。その細胞は、元来サイトカインを発現し分泌し得るか、またはそのような発現および分泌を指令する核酸を用いたトランスフェクションによってサイトカインを発現し分泌し得る。1つの適切なサイトカインはGM-CSFである。例えば、腫瘍細胞はGM-CSFをコードする導入遺伝子を発現することができるが、このことは、米国特許第5,637,483号、第5,904,920号、第6,277,368号および第6,350,445号、ならびに米国特許公開第20100150946号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。膵臓癌を治療するための、GM-CSFを発現する遺伝子改変癌細胞の一例は、米国特許第6,033,674号および第5,985,290号に記載されており、両方とも参照により本明細書に組み入れられる。他のサイトカインを使用することもできる。使用可能な適切なサイトカインには、樹状細胞の誘導、動員、および/または成熟を刺激するサイトカインが含まれる。そのようなサイトカインとしては、限定するものではないが、GM-CSF、CD40リガンド、IL-12、CCL3、CCL20、およびCCL21のうち1種または複数種が挙げられる。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ポリペプチドは、免疫調節活性を有し、かつGenBank受託番号AAA52122.1に対して少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカインまたは断片である。

別の一態様によれば、サイトカインは、1種または複数種のサイトカインを発現して分泌する不活性化バイスタンダー細胞によって送達される。バイスタンダー細胞は、樹状細胞の誘導、動員、および/または成熟を刺激するサイトカインのすべてを提供することができるか、または不活性化腫瘍細胞によって分泌されるサイトカインを補足することができる。免疫調節性サイトカインを発現するバイスタンダー細胞株は、米国特許第6,464,973号および第8,012,469号、Dessureault et al., Ann. Surg. Oncol. 14: 869-84, 2007、ならびにEager and Nemunaitis, Mol. Ther. 12: 18-27, 2005に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。

治療レジメンならびに組成物およびキットにおいて使用するのに適した抗体には、PD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗体はいずれも含まれる。使用できる抗体の例示的なタイプとしては、限定するものではないが、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、一本鎖、抗体結合フラグメント、およびダイアボディが挙げられる。一般的に、抗体は、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子またはその断片によって実質的にコードされる。抗体は抗原またはエピトープと特異的に結合することが可能である。例えば、Fundamental Immunology, 第3版, W.E. Paul編, Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97を参照されたい。抗体は、典型的には、抗原またはエピトープに特異的に結合する。特異的結合は、タンパク質および他の生物学的物質の不均質な集団の存在下でさえ、対応する抗原またはエピトープに対して起こる。抗体の特異的結合は、無関係な抗原への結合よりも実質的に大きい親和性で、抗体がその標的抗原またはエピトープに結合することを示す。親和性の相対的な差は、多くの場合少なくとも25％超、より多くの場合少なくとも50％超、ほとんどの場合少なくとも100％である。その相対的な差は、例えば、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍であり得る。

Toll様受容体(TLR)は、微生物の産物を感知し、かつ/または獲得免疫応答を開始する、タンパク質のファミリーである。TLRは樹状細胞(DC)を活性化する。TLRは、ロイシンリッチリピートの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内TIR(Toll/IL-1R)ドメインを含む、保存された膜貫通分子である。TLRは、しばしば「PAMP」（病原体関連分子パターン）と呼ばれる、微生物の明確な構造を認識する。TLRへのリガンド結合は、炎症および免疫に関与する諸因子の産生を誘導する細胞内シグナル伝達経路のカスケードを惹起する。

これらの受容体のために使用され得る例示的なアゴニストとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：リポタンパク質、リポポリペプチド、ペプチドグリカン、ザイモサン、リポ多糖、ナイセリアのポーリン、フラジェリン、プロフィリン、ガラクトセラミド、ムラミルジペプチド、グルコピラノシルリピドA(GLA)、およびレシキモド(R848)。ペプチドグリカン、リポタンパク質、およびリポテイコ酸は、グラム陽性菌の細胞壁成分である。リポ多糖類はほとんどの細菌によって発現されている。フラジェリンは、病原性および共生細菌によって分泌される細菌鞭毛の構造成分である。ガラクトシルセラミド(α-GalCer)は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞の活性化因子である。ムラミルジペプチドは、すべての細菌に共通する生理活性ペプチドグリカンモチーフである。このようなアゴニストは、Toll様受容体を介して自然(先天性)免疫の活性化を媒介する。アゴニストのそのコグネイト受容体への特異的結合は、多くの場合、親和性の観点から表現される。本発明のリガンドは、約10⁴M^-1〜約10⁸M^-1の親和性で結合することができる。親和性は、K_d＝k_off/k_onとして算出される(k_offは解離速度定数であり、k_onは結合速度定数であり、K_dは平衡定数である)。単一または複数のアゴニストを使用することが可能である。

ヒトでは、10種類のTLRが同定されている。細胞の表面に発現されるTLRには、TLR-1、-2、-4、-5、および-6が含まれ、一方TLR-3、-7/8、および-9はERコンパートメントで発現される。ヒト樹状細胞のサブセットは、明確に区別できるTLR発現パターンに基づいて同定することができる。例として、DCの骨髄性つまり「従来型」のサブセット(mDC)は、刺激時にTLR 1〜8を発現し、一連の活性化マーカー(例えば、CD80、CD86、MHCクラスIおよびII、CCR7)、炎症誘発性サイトカイン、およびケモカインが産生される。この刺激とそれを受けて生じる発現の結果は、抗原特異的なCD4+およびCD8+ T細胞のプライミングである。これらのDCは、抗原を取り込んで、それらを適切な形態でT細胞に提示する向上した能力を獲得する。対照的に、DCの形質細胞様サブセット(pDC)は、活性化時にTLR7とTLR9のみを発現し、結果としてNK細胞ならびにT細胞を活性化する。死滅しつつある腫瘍細胞はDC機能に悪影響を及ぼし得るので、TLRアゴニストでDCを活性化することは、癌治療への免疫療法アプローチにおいて抗腫瘍免疫をプライミングするために有益であり得ることが示唆されている。また、放射線および化学療法を用いる乳癌治療を成功させるには、TLR4の活性化が必要であることも示唆されている。

本発明において有用な、当技術分野で公知のTLRアゴニストとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
Pam3Cys、TLR-1/2アゴニスト；
CFA、TLR-2アゴニスト；
MALP2、TLR-2アゴニスト；
Pam2Cys、TLR-2アゴニスト；
FSL-1、TLR-2アゴニスト；
Hib-OMPC、TLR-2アゴニスト；
ポリリボイノシン：ポリリボシチジン酸(ポリI：C)、TLR-3アゴニスト；
ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)、TLR-3アゴニスト；
ポリL-リシンおよびカルボキシメチルセルロースで安定化したポリイノシン-ポリシチジン酸(Hiltonol(登録商標))、TLR-3アゴニスト；
モノホスホリルリピドA(MPL)、TLR-4アゴニスト；
LPS、TLR-4アゴニスト；
細菌フラジェリン、TLR-5アゴニスト；
シアリルTn(STn)、いくつかのヒト癌細胞上のMUC1ムチンと関連した炭水化物およびTLR-4アゴニスト；
イミキモド、TLR-7アゴニスト；
レシキモド、TLR-7/8アゴニスト；
ロキソリビン、TLR-7/8アゴニスト；および
非メチル化CpGジヌクレオチド(CpG-ODN)、TLR-9アゴニスト。

全癌細胞をTLRアゴニストと共に製剤化することは、有効性の向上に寄与する要因であるようである。製剤は、例えば4℃などの温度で、例えば1/4、1/2、1、2、3、5、10、24時間などの間、一緒にインキュベートされ得る。あるいは、親油性物質または乳化剤の存在下での結合を使用してもよい。このような剤は当技術分野で周知である。

さまざまな投薬スケジュールを想定することができ、例えば、同時のまたはずらしたタイミングで、単一または複数の剤を用いて、1回のサイクルまたは複数回のサイクルにて投与する。

治療剤を癌患者に投与する方法はさまざまである。例示的な方法としては、限定するものではないが、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、髄腔内、腫瘍内、腹腔内、舌下、および硬膜外投与が挙げられる。投与は、ヒト、哺乳類、哺乳類対象、動物、家畜対象、プラセボ用対象、研究用対象、または実験用対象に対してであり得る。典型的には、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬、または組成物などの剤を、適切な解剖学的部位において対象と接触させる。投与は、治療、薬物動態試験、診断アッセイ、研究、プラセボ、または実験方法の目的のためであり得る。本発明による剤は、単一の組成物として投与することができるが、必ずしもそうする必要はない。本発明では単一組成物としての投与が想定されるが、剤は単一の対象に別々の投与として送達することができ、同一または異なる時間に、同一経路または異なる経路で投与され得る。場合によっては、複数種の剤が対象の体内で互いと実際に接触して、インビボで組成物を形成してもよい。

上記の開示は、本発明を一般的に説明するものである。本明細書に開示されたすべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得ることができ、こうした実施例は、例示のみを目的として本明細書に提供され、本発明の範囲を限定するものではない。

臨床設定において全身的抗腫瘍免疫を誘導するための複数のTLRアゴニストの能力を評価するために、グルコピラノシルリピドA(GLA - TLR4アゴニスト)およびレシキモド(TLR7/8アゴニスト)をGVAXと共に製剤化し、触知可能なB16モデルにおいてインビボでそれらの抗腫瘍効果を検討した。GLAは、モノホスホリルリピドAよりも強力なTLR4アゴニストであることが判明した合成ヘキサアシル化分子であり、現在、癌ワクチンにおけるTLR4アゴニストアジュバントとして臨床試験中である。R848は、イミキモド(TLR7アゴニスト)と比べて50〜100倍のサイトカイン応答をもたらすことが見出されたTLR7/8アゴニストであり、また、この物質は患者での安全性についての第I相試験を通過している。本発明者らは、個々に臨床上安全であることが患者において試験されたこれらのアジュバントを組み合わせてTLRアゴニスト強化GVAX(TLR Agonist Enhanced GVAX: TEGVAX)を製剤化し、APCを活性化しかつ確立された腫瘍の背景において抗腫瘍T細胞を増加させるそれらの能力を検討した。

LiらおよびCurranらは、インビボで抗腫瘍応答を誘導するために抗PD-1および細胞性ワクチンを組み合わせることができることを示したが、この報告書では触知不可能な腫瘍の接種方法が利用されており、確立された腫瘍組織で臨床シナリオをモデル化しているわけではない。Curranらはまた、抗CTLA-4を抗PD-1およびワクチンと組み合わせていたが、本発明者らは、前臨床および臨床試験の両方でイピリムマブに関連した毒性があったため、抗PD-1遮断剤を選択した。腫瘍微小環境において顕著なインターフェロン応答を生じることができる安全なワクチンを開発することに焦点を絞って、触知可能な確立されたB16腫瘍に対するTEGVAXと抗PD-1の併用療法を試験するためにストリンジェントなモデルを利用した。

実施例1
材料および方法
マウスおよび試薬：6〜8週齢の雌C57BL/6、Balb/c、およびC3H/HeOUJマウス(Jackson Lab)は、ジョンズ・ホプキンス病院(JHH)の動物実験委員会(Animal Care and Use Committee)に従って飼育した。C57BL/6 MyD88^-/-TRIF^-/-、およびB6(Cg)Rag2tml(Rag2^-/-)マウスは、それぞれ、Franck Housseau博士とFan Pan博士(JHH)から入手した。B16およびB16 GVAX細胞は、10％ΔFCS、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100U/ml)を含むRPMI 1640培地で培養した。Cytofix/Cytoperm試薬キットおよび抗体は、BD Bioscience社から購入した。CD11c+細胞は、抗マウスCD11cマイクロビーズ(MACS, Miltenyi Biotec社)によって単離した。CD4枯渇性GK1.5抗体およびCD8枯渇性2.43抗体(Bio X Cell社)を200μg/用量で2日ごとに(計5回)腹腔内注射した。抗PD-1遮断抗体を発現するハイブリドーマ(クローンG4)は、Charles Drake博士(JHH)から得た。

1mg/mlのグルコピラノシルリピドA(GLA)および0.2mg/mlのレシキモド(R848)を、10％(w/v)スクアレンの水中油型エマルション(Immune Design社)中に調製した。IDC-1005は、エマルションビヒクル中の1mg/mlのGLAと0.2mg/mlのR848の混合物である。IDC-1005は、接種前に照射GVAX細胞と共に4℃で0.5〜2時間インキュベートした。IDC-1005を用いて製剤化したGVAXは、TEGVAXと表示される。いくつかの場合には、エマルションビヒクルなしのGLAおよびR848を、リポフェクタミンによりGVAX細胞に吸収させ、吸収されなかったTLRアゴニストおよびトランスフェクタントを除去するために4回洗浄した。

腫瘍治療アッセイ：C57BL/6マウスは、その足蹠に1〜5×10⁴個のB16を注射した。触知可能な腫瘍が発生した後(5〜10日)、IDC-1005を用いてまたは用いないで製剤化した10⁶個のB16 GVAX 100μlを対側肢に皮下注射した。対照群にはビヒクルを注射した。これらのすべての実験のために、1群10匹のマウスを使用した。C3H/HeOUJマウスおよびBalb/cマウスは、同等の方法で、それぞれ、SCCFVII/SF細胞およびCT26細胞と共に使用された(28)。以前に調製された照射済みの10⁶個のSCCFVII/SF-GVAXは、B16と同様の方法でSCCFVIIモデルにおいて使用された(3)。CT26モデルでは、GM-CSFを形質導入したCT26細胞がCT26 GVAXとして使用された(11)。すべてのワクチンについて、GM-CSFの力価を測定して、GM-CSFの発現レベルが50〜500ng/10⁶細胞/24時間の範囲であることを確認した。腫瘍を毎日測定した。いくつかの場合には、接種前にGVAXをQtracker 655(Invitrogen社)で標識した。PD-1実験では、ワクチン治療と併用して、腫瘍が触知可能になった後に、100μg/マウス/注射を週2回腹腔内注射した。

DC活性化アッセイ：ワクチン治療の3〜7日後に腫瘍担持マウスまたは無処置マウスから脾臓および流入領域リンパ節(DLN)を摘出した。破砕した脾臓は、DNAse I(Roche社)とLiberase Blendzyme 2(20,000 Mandl U/ml)(Roche社)を含む培地中で消化した。DCを濃縮した集団は、CD3⁺およびCD19⁺を枯渇することによって取得し、CD11c⁺およびB220⁺についてゲーティングした。これらは、CD80、CD86、CD40、およびMHCII抗体を用いたマルチカラーFACS解析により評価した。

ELISPOTアッセイ：ELISPOTプレート(マルチスクリーン(MultiScreen)HTSフィルタープレート、Millipore社)にマウスIFNγ抗体(MabTech社)を24時間コーティングし、T2kb細胞を10μg/mlのP15E(KSPWFTTL)ペプチドで一晩パルスした。脾臓由来の10⁶個の脾臓CD8細胞は三つ組みでプレートに播き、パルスした、またはパルスしていない10⁵個のT2kb細胞と共培養するか、または陽性対照として1μMのPMAおよび10ng/mlのイオノマイシンで刺激した。3日目に、ビオチン化抗マウスIFNγ抗体(MabTech社)とストレプトアビジン-HRPを加えた。AEC基質試薬(BD社)を用いてスポットを発色させ、ELISPOTプレートリーダー(Immunospot社)を用いて解析した。

インビボCTLアッセイ：脾細胞を0.5μMおよび5μMのCFSE(Molecular Probes社)で標識した。5μMのCFSEで標識した細胞を10μg/mlのP15E(KSPWFTTL)ペプチドでパルスした。0.5μMのCFSEで標識した細胞はβ-gal(TPHPARIGL)ペプチドでパルスした。マウスにこれらの細胞の1：1混合物を静脈内注射し、24時間後に脾細胞を単離してフローサイトメトリーにより解析した。抗原特異的な死滅は、以下の式：
(1−CFSE_P15Eの割合（％）/CFSE_β-galの割合（％）)×100
を用いて計算した。

免疫組織化学：厚さ10μmの凍結切片をアセトンで固定し、1％のBSAを用いて室温で30分間ブロックした。パラフィン包埋組織については、上記のように1％のBSAでブロックする前に切片を4％パラホルムアルデヒド中で固定した。αCD4,αCD8,αCD86 FITCコンジュゲートとαCD45およびαB7-H1一次抗体を4℃で1時間インキュベートした。いくつかの場合にはCy3コンジュゲート抗体を二次抗体として使用した。DAPIを核の対比染色として使用した。40倍の倍率で無作為に選択した10箇所の視野での陽性細胞を定量した。IHCスライドを染色し、無作為にマークした(JF)後、陽性染色の定量を盲検法で行った(LH)。顕微鏡はニコンEclipse E800であった。カメラはニコンDS-Qi1Mcであった。ソフトウェアはNIS-Element AR 3.0であった。

サイトカイン分析：採取したDCは、Golgistop(商標)(BD社)タンパク質輸送モネンシンおよびLPS 0.1μg/mlと共に5時間培養した。DCは、抗マウスCD11c、CD86、MHCII、IL-12、IFNαおよびTNFα発現について染色し、採取したリンパ球は、Cytokitによる膜透過化後に、抗マウスIL-2、IFNα、IFNγ、TNFα発現について染色した。データは、抗体をすすいだ後でFACS解析によって得た。

実施例2
複数のTLRアゴニストで強化したGVAX(TEGVAX)は、GVAXと比較して、流入領域リンパ節において、活性化された従来型および形質細胞様の両樹状細胞を増加させた。
GVAXによってもたらされる抗腫瘍応答をさらに高めるために、GLAおよびR848をGVAXと組み合わせて、このTEGVAX製剤が腫瘍を担持しないマウスのDLNにおける活性化樹状細胞の数を増加させるかどうかを試験した。GVAXと比較して、TEGVAXは、ワクチン接種部位のDLN由来の樹状細胞の活性化表現型を亢進させることができた(図1)。形質細胞様DC(pDC)と従来型DC(cDC)の両方を分析したところ、両集団ともTEGVAX処置群についてCD80およびCD86活性化マーカーの発現増加を示した(図1A〜C)。ゲーティングされたDCは活性化マーカーの増加を示し、アジュバント注射後3日目にピークに達し、7日目まで持続した(図1D)。最後に、これらの活性化DCが抗腫瘍応答のための適切なサイトカイン環境を提供するかどうかを評価するために、流入領域リンパ節から採取したCD11c+細胞からのサイトカインプロファイルを調べ、これもまた、T_H1応答に向けてT細胞レパートリーを偏らせることができるIL-12、IFNαおよびTNFαの量が増加したことを示した(補足図1)。

実施例3
確立された腫瘍のTEGVAX処置はインビボで腫瘍増殖速度を顕著に低減させた。
最初に、治療モデルで確立されたB16腫瘍を用いてTEGVAXを試験した。接種したB16腫瘍が触知可能になったとき(通常は7〜10日目)、対側肢へのTEGVAX、GVAX、GLA/R848(IDC-1005)、およびビヒクル対照の皮下注射によって腫瘍担持マウスを処置した。図2Aに示されるように、TEGVAXを受け取ったマウスは、一度だけの処置で著しく低い腫瘍増殖速度を示した。GVAX単独およびTLRアゴニスト単独はいずれも、中程度の効果を有していたが、併用治療は最良のインビボ抗腫瘍応答をもたらした。TEGVAXを、GLAのみまたはR848のみを含むGVAX製剤と比較した場合、GVAXにGLA/R848を組み合わせた製剤は、最良の抗腫瘍応答を有することが見出された(補足図2A)。

抗腫瘍応答をさらに改善するために複数回のTEGVAX処置を用いる実験を行い、複数回のTEGVAX処置を受けたマウスは、未処置マウスに見られた指数的増殖を示さないことを認めた(図2B)。TEGVAXは7日ごとに注射したが、それはこの時点で活性化DCのレベルが低下したためである(図1D)。TEGVAXで処置したが腫瘍が依然残存しているこれらのマウスに対し、原発腫瘍部位とは異なる部位に10⁵個のB16細胞を接種したところ、これらのマウスでは、腫瘍が第2の部位では増殖せず、これは後続のB16負荷に対するインビボ免疫を実証している(データは示さず)。また、C3HマウスでのSCCFVII扁平上皮癌モデルならびにBalb/cマウスでのCT26結腸癌モデルにおいてTEGVAXを試験して、匹敵する結果を得た。このことは、この抗腫瘍応答が多様な腫瘍組織学に適用され、マウスのバックグラウンドには依存しないことを実証している(図2C)(補足図3)。SCCFVIIモデルでは、1回のTEGVAX処置が実際に腫瘍の完全退縮を引き起こした。前述と同様に、これらのマウスにおけるSCCFVII腫瘍細胞による再負荷は、第2の部位での腫瘍増殖の証拠を示さなかった。

TEGVAXの抗腫瘍効果はTEGVAXの製剤化に依存していた。注射前の1時間の共インキュベーションなしにGVAXとGLA/R848で腫瘍担持マウスを治療した場合、抗腫瘍効果は認められなかった(図2D)。共インキュベーション時間は、疎水性TLRアゴニストがスクアレン油エマルションビヒクルによってGVAXに吸収されることを可能にし、この製剤化がTEGVAXの抗腫瘍応答のために必要であると考えられる。これを試験するために、リポフェクタミンを用いてGVAXにGLAとR848を吸収させ、細胞を洗浄して吸収されなかったアジュバント/トランスフェクタントを除去した。本発明者らは、トランスフェクション法で生成されたTEGVAXは、その抗腫瘍効果の面で、親油性ビヒクルとの長期インキュベーション法から生成されたTEGVAXに匹敵することを見出した(補足図4)。

実施例4
TEGVAXは腫瘍微小環境におけるリンパ球浸潤を増加させ、これは腫瘍壊死の誘導、局所領域でのT_H1応答、および腫瘍上のB7-H1発現の増加と関連していた。
治療アッセイの終了時に採取した腫瘍組織を試験し、リンパ球に関して腫瘍微小環境を試験した。組織学的分析によって、GVAXまたは対照で処置したマウスと比較して、TEGVAXで処置したマウスでは、顕著に増加した巣状壊死の領域が示された(図3A、B)。CD4およびCD8抗体を用いた免疫組織化学は、TEGVAX処置された腫瘍が、腫瘍組織内に豊富な浸潤性CD4およびCD8細胞を有することを示した(図3C、D)。腫瘍流入領域リンパ節を試験したとき、TEGVAX処置マウスがGVAXまたは対照処置と比較して増加したIFNγ+ CD4およびCD8を有していたことを認めた。これらのT_H1細胞の増加が腫瘍細胞でのB7-H1の上方制御と関連しているかどうかを試験するために、腫瘍組織を染色し、GVAXおよびビヒクル処置マウスと比較して、TEGVAXがB7-H1の発現も顕著に増加させたことを見出した(図4C)。

実施例5
TEGVAXの抗腫瘍応答は、CD4およびCD8の両細胞、ならびにMyD88/TRIFシグナル伝達に依存していた。
T細胞がTEGVAXの抗腫瘍応答にとって重要であるかどうかを評価するために、CD4およびCD8枯渇を用いるワクチン治療アッセイを行った。TEGVAXの治療効果は、CD4またはCD8 T細胞のいずれかの枯渇により抑止され、これは抗腫瘍免疫応答のためにはCD4およびCD8リンパ球の両方が重要であることを実証している。Rag2 KOマウスを用いた実験から、これらの実験結果を確認した(図5A、B、C)。

複数のTLRアゴニストをTEGVAXのための製剤成分として使用したため、TLRシグナル伝達がワクチン効果にとって重要であるかどうかの確認に努めた。B16腫瘍担持マウスのTEGVAX治療は、MyD88/TRIFダブルノックアウトマウスを用いて行った。前述と同様に、TEGVAXの抗腫瘍効果はこれらのマウスで完全に抑止され、TEGVAXの抗腫瘍効果はTLRシグナル伝達に依存することが確認された(図5D)。

実施例6
TEGVAXは腫瘍特異的p15E特異的細胞傷害性T細胞の数を増加させる。
活性化DCと相関するTEGVAXによる抗腫瘍効果の明らかなインビボ証拠を用いて、免疫系のエフェクターアームについても調べた。B16腫瘍での免疫優性p15E抗原の発現に基づいて、p15E特異的IFNγ分泌CTLのレベルを定量するためにインビボCTLアッセイを行った(図6)。図6に示されるように、TEGVAX処置群と他の対照群との増殖速度に明らかな隔たりが認められた21日目に、GVAXまたは他の対照マウスと比較して、TEGVAXで処置したマウスの脾臓ではp15E特異的CTLの殺傷活性の増加が認められた(図6A)。APCとしての、p15EペプチドでパルスしたT2kb細胞を用いて、処置群と対照群のそれぞれ由来のCD8 T細胞で、ELISPOTアッセイもまた実施した。これらの2つの独立したアッセイからは、TEGVAXで処置したマウスにおける腫瘍特異的(抗p15E)CTLの数および活性の増加が実証された(図6B)。

実施例7
抗PD-1抗体と組み合わせたTEGVAXは、確立されたB16腫瘍の退縮を誘導することができる。
TEGVAXはp15E特異的細胞傷害性T細胞ならびにIFNγ産生CD8細胞の数を増加させることが可能であることから、TEGVAXを免疫チェックポイント経路B7-H1/PD-1の遮断剤と組み合わせた。PD-1は活性化T細胞上に発現され、腫瘍細胞上のそのリガンドB7-H1(IFNγ分泌T細胞により上方制御される)の共局在は、抗PD-1遮断剤の臨床効果と相関する。獲得免疫耐性のメカニズムを支持するこれらの知見が意味することは、強力なT_H1応答をもたらし得るワクチンと組み合わせるのに、抗PD-1遮断剤が理論上適していることである。本発明者らのマウスモデルでは、TEGVAXは、IFNγ分泌T細胞を増加させただけでなく、腫瘍細胞上のB7-H1の発現を上方制御した(図4)。抗PD-1抗体処置をTEGVAXと組み合わせた場合、処置したマウスの50％において確立されたB16腫瘍が退縮することが認められた(図7A)。組合せ処置に応答したこれらのマウスでは、図7Bに示すように白斑(vitiligo)が認められた。抗PD-1単独またはGVAXと共に処置したマウスは、GVAX処置のみと比べて、腫瘍増殖速度の改善が見られなかった。これらのインビボ腫瘍治療アッセイは、TEGVAXまたは抗PD-1単独と比較して、TEGVAXおよび抗PD-1で処置したマウス由来の腫瘍DLNから採取されたT_H1サイトカインが増加するという相乗効果と相関していた(図7C)。

実施例8
考察
この報告書では、GVAXをTLR4(GLA)およびTLR7/8(R848)アゴニストと共に製剤化し、GVAX単独またはTLRアゴニスト単独と比較して、インビボ抗腫瘍応答の大幅な増強を3種類の異なるマウスモデルで実証した。これらのアジュバントが、活性化された形質細胞様DC(pDC)ならびに従来型DC(cDC)の数を増加させることが示された。これらのインビボ抗腫瘍応答はT細胞依存性であり、B16モデルでは腫瘍特異的p15E特異的T細胞がGVAX処置群と比較してTEGVAX処置群で上昇した。これらの実験のために、確立されたB16腫瘍に対する治療モデルを使用したが、この腫瘍は、ひとたび触知可能になると既知のワクチン製剤では治療することができない、免疫原性の低い腫瘍である。繰り返しTEGVAXで処置することによって、図2に示すように、腫瘍は「くすぶり続ける（依然として残存している）」(smoldering)成長速度を示す傾向がある。SCCFVIIモデルでは、TEGVAXによる一度だけの処置で、触知可能な腫瘍の退縮を引き起こした。CT26結腸癌モデルでは、触知可能な病変に対するTEGVAX処置はまた、インビボ抗腫瘍効果を実証した(補足図3)。TEGVAX処置は、腫瘍流入領域リンパ節におけるIFNγ+ CD4およびCD8細胞の増加ならびに腫瘍細胞上のB7-H1の発現増加と関連していた。TEGVAXを抗PD-1遮断剤と組み合わせた場合、図7に示すように、確立されたB16腫瘍の退縮が観察された。

GLAおよびR848を最初に選択したが、その理由は、他のTLRアゴニストと比べてこれらのアジュバントが増強された抗腫瘍サイトカインプロファイルを顕著に誘導し、かつ両方とも安全であることが患者で試験されていたからである。マウスおよびヒト樹状細胞を活性化する能力において、モノホスホリルリピドA(MPL)と比較したところ、TLR4アゴニストであるGLAは、インビボおよびインビトロの両方で複数のT_H1型サイトカインを増加させるという点で、より強力であることが見出された。イミキモドと比べて、TLR7/8アゴニストであるR848もまた、I型IFNプロファイルを増加させる上で顕著な改善を有することが見出された。したがって、確立された腫瘍に対する本発明者らのインビボ結果から、癌ワクチンとしてのTEGVAXの、「トランスレーショナル」に関する高い可能性が実証された。興味深いことに、処置マウスの腫瘍微小環境を調べたとき、GVAXと比較してTEGVAX処置マウスにおいて、腫瘍流入領域リンパ節由来のCD4およびCD8細胞からのIFNγレベルの増加、ならびに腫瘍からのB7-H1発現の増加が認められた(図4)。

従って、本発明者らの前臨床研究は、ワクチンと抗PD-1遮断剤の併用療法を試験するための優れた場であった。腫瘍細胞でのB7-H1誘導、およびB7-H1とリンパ球上のPD-1との、決定的な免疫回避機構としての会合の重要性が前臨床モデルにおいて実証され、B7-H1の発現は複数の癌タイプにおける予後不良と臨床的に相関していた。進行性黒色腫、肺癌、および腎臓癌の患者では、抗PD-1遮断抗体による単剤療法が有意な生存利益をもたらし、同時に行った組織学的分析は、B7-H1およびIFNγ発現とPD-1遮断に対する応答との間に強い相関関係を示した。上皮組織ならびにB16-F10腫瘍細胞において、IFNγはB7-H1の発現を誘導することができる。累積的に、これらの知見は獲得耐性のメカニズムを支持しており、それによって、抗PD-1遮断剤は、常在する腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞(一部にはIFNγを介して腫瘍上のB7-H1を誘導することによってそれ自体の抑制を引き起こす)のその抗腫瘍効果を引き出すことができる。したがって、抗PD-1遮断剤は、IFNγを誘導するワクチンとの併用療法に理論上適している。図7に示したTEGVAX/抗PD-1治療による確立されたB16の退縮は、抗PD-1療法を適切なワクチンと組み合わせる臨床試験のためのインビボ前臨床的正当性を提供する。

以前の報告書では、抗PD-1、抗CTLA-4、およびワクチンの組み合わせが抗腫瘍応答を促進し得ることが示されたが、そのインビボアッセイは、触知不可能な、確立されていないB16腫瘍に対して治療を開始することを含んでいた。本発明者らの治療アッセイは、B16接種の7〜10日後に治療が開始され、この時点ではほとんどの免疫療法が失敗するという点で、より一層ストリンジェントなものであった。また、確立された腫瘍の退縮を示すために、他の免疫チェックポイント遮断抗体と抗PD-1を組み合わせる必要はなかった。

TEGVAXと抗PD-1を組み合わせることの相乗効果は、腫瘍由来の流入領域リンパ節を試験したときに裏付けられた。腫瘍が退縮したため、つまりフローサイトメトリー用の十分な細胞を採取するには腫瘍サイズが小さかったために、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の収集は実現可能でなかった。しかしながら、膝窩リンパ節からのCD4およびCD8の両リンパ球ならびにCD11c+樹状細胞は、TEGVAXまたは抗PD-1単独での処置群における緩やかな上昇と比較して、IL-2、IL-12、およびIFNγ発現レベルについて数倍の上昇を示した(図7C)。これらのT_H1サイトカインは、TEGVAXまたは抗PD-1処置群と比較して、TEGVAX/抗PD-1処置群におけるp15E特異的CTLの数の増加と相関していた(データは示さず)。

トランスレーショナルな観点からは、イピリムマブはグレード3〜4の毒性および治療関連死という他に見られない報告に関係しているため、抗CTLA-4抗体の添加は、本発明者らのインビボ結果を改善するための最初の選択肢ではあり得ない。しかし、免疫チェックポイント分子の多くのファミリーの大幅な冗長性、ならびに臨床グレードのチェックポイント遮断抗体の利用可能性が理由で、抗PD-1治療に他の免疫チェックポイント遮断抗体を追加する可能性が存在する。増加したIFNγは腫瘍微小環境においてB7-H1を潜在的に上方制御し得る可能性があるため、別のアプローチとしては、抗PD-1と組み合わせることができる安全なワクチンを用いて、腫瘍特異的CTLのレベルを増加させることが考えられる。本研究のためにTLR4およびTLR7/8活性を有する2つのTLRアゴニストを選んだが、他のTLRアゴニスト(フラジェリン、CpGなど)または他のPAMP分子が抗腫瘍応答をさらに増強できるかどうかは不明である。最後に、繰り返しになるが、TEGVAXのすべての成分は、安全であることが患者で試験されている。単独での強力な抗腫瘍剤としてのその実証と共に、TEGVAXは、抗PD-1抗体との併用で、臨床試験のための高いトランスレーショナルな可能性を有している。

本発明者らは以前、LPSで製剤化したGVAXを用いた腫瘍内注射によるインビボ応答を示したが、今回は、治療薬としてTLR4およびTLR7/8アゴニストの両方を用いて製剤化したGVAXによる、はるかに強力な応答を報告する。これらの治療モデルにおける、全身注射と比較した腫瘍内注射の根底にあるメカニズムは異なるが、累積的にこれらの実験は、腫瘍内または全身的に注射される細胞性ワクチンと共に製剤化されたTLRアゴニストには、潜在的発癌作用はないと考えられることを実証する。腫瘍細胞におけるMyD88-NF-κBシグナル伝達経路は、潜在的発癌性の影響を有することが示されている。しかし、TLRアゴニストは、抗腫瘍応答のための獲得免疫系をプライミングするために、樹状細胞においてMyD88-TRIF経路を活性化することが明確に示されている。本報告書では、GVAXに製剤化されたTLRアゴニストが流入領域リンパ節でDCを刺激することができ、いかなる不都合な潜在的発癌作用も全身的治療モデルで実証することができなかった。

GVAX、および一部のモデルでは、TLRアゴニストそれ自体は、腫瘍増殖速度に対して早期に適度な効果を有するが、研究したすべてのマウスモデルではTEGVAX群と対照群の間に明確な隔たりが存在する。また、GLA/GVAXおよびR848/GVAXとTEGVAXとを比較して、最良のインビボ抗腫瘍応答を有するのは、明らかに、TLR4およびTLR7/8活性の両方を組み合わせたTEGVAXである(補足図2)。B16実験では、生存B16腫瘍細胞を最初の腫瘍接種部位もしくはワクチン接種部位から離れた部位に皮下注射したが、腫瘍増殖はまったく認められなかった。SCCFVIIモデルについても同様に、一度だけのTEGVAX処置後に再負荷実験を行っても、腫瘍の成長は示されなかった(図2C)。

本発明者らは、TEGVAXのインビボ抗腫瘍効果に関与する抗腫瘍T細胞へのT細胞の強力なプライミングを誘導するために、cDCのみならずpDCをも増加させることができるのは、TLR4およびTLR7/8刺激の両方の組み合わせであると考えている。TEGVAX治療アッセイをMyD88-TRIFダブルノックアウトマウスで実施したところ、抗腫瘍効果は完全に抑止された(図4C)。MyD88はTLR7/8シグナル伝達のための重要なメディエーターであり、TRIFおよびMyD88の両方はTLR4シグナル伝達の重要な下流メディエーターである。流入領域リンパ節のCD11c+細胞を調べたとき、対照と比較してTEGVAX処置群でのT_H1サイトカインの発現増加を認めた(図5)。CD11cのドットプロットおよびこれらのT_H1サイトカインは、二重陽性細胞の増加が主としてCD11c+集団のシフトに由来するという情報を提供し、TLRアゴニストを加えることで、細胞1個に基づいた炎症性サイトカインの産生の増加ではなく、APCのリンパ節への移動の増加を主に誘導したことを示唆している。この目的のためにQ-dotでTEGVAXを標識し、流入領域リンパ節における、細胞間移行によってQ-dotで標識された内因性APCを定量した(補足図5)。pDCおよびcDCの両集団について、Q-dotで標識された、より活性化されたDCが定量的に存在しており、これは、TLRアジュバントが腫瘍と流入領域リンパ節の間を循環する活性化DCの数を増加させ、そこでそれらはT細胞をプライミングすることができる、という本発明者らの仮説と一致している。

LPS吸収型GVAXを用いた本発明者らの以前の研究は、細胞性ワクチンへのTLR4アゴニストの吸収がインビボ抗腫瘍効果にとって重要であることを実証した。GVAXへのGLAおよびR848の吸収もまた、TEGVAXにより観察された抗腫瘍応答の増強に重要であると推測された。インキュベーションなしにGLAおよびR848アジュバントをGVAXと単に共注射した際には、インビボ抗腫瘍応答がなかった(図2D)。TLRアゴニストとGVAXを親油性ビヒクルと一緒に1時間インキュベートした場合のみ、B16モデルで部分的な応答を引き出すだけでなく、SCCFVIIモデルでは退縮を誘導することができるTEGVAX製剤を得た。これをさらに試験するために、スクアレン水中油型エマルションを使わずにリポフェクタミンを用いて、GVAXをGLAおよびR848と共に製剤化し、B16モデルにおいて、匹敵するインビボ抗腫瘍応答を実証した(補足図4)。したがって、今後の研究の一面には、TEGVAX製剤のさらなる最適化が含まれる。

まとめると、この報告書は、TEGVAXが、確立された腫瘍の場合でさえ、腫瘍特異的T細胞のプライミングを顕著に増強することができる治療ワクチンとして、GVAXに比して著しい改善を提供し、かつそれが抗PD-1遮断抗体または癌患者における免疫チェックポイント遮断の他の形態との併用療法に追加される優れた候補であることを実証している。

Claims

サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト；
を含む組成物であって、全癌細胞がTLRアゴニストと共に製剤化されている、組成物。
サイトカインがGM-CSF(顆粒球単球細胞刺激因子)である、請求項1記載の組成物。
全癌細胞が患者にとって自己由来である、請求項1記載の組成物。
全癌細胞がTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、請求項1記載の組成物。
全癌細胞がTLR4アゴニストと共に製剤化されている、請求項1記載の組成物。
全癌細胞がTLR4およびTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、請求項1記載の組成物。
TLRアゴニストが、GLA、R848、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
癌細胞がメラノーマ細胞である、請求項1記載の組成物。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がエマルションビヒクルを用いて製剤化されている、請求項1記載の組成物。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がリポフェクタミン(商標)を用いて製剤化されている、請求項1記載の組成物。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がカチオン性脂質を用いて製剤化されている、請求項1記載の組成物。
以下の免疫療法剤：
サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト
を癌患者に投与する段階を含む方法であって、全癌細胞がTLRアゴニストと共に製剤化されている、方法。
サイトカインがGM-CSF(顆粒球単球細胞刺激因子)である、請求項12記載の方法。
全癌細胞が患者にとって自己由来である、請求項12記載の方法。
全癌細胞がTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、請求項12記載の方法。
全癌細胞がTLR4アゴニストと共に製剤化されている、請求項12記載の方法。
全癌細胞がTLR4およびTLR7/8アゴニストと共に製剤化されている、請求項12記載の方法。
TLRアゴニストがGLA、R848、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
全癌細胞がメラノーマ細胞である、請求項12記載の方法。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がエマルションビヒクルを用いて製剤化されている、請求項12記載の方法。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がリポフェクタミン(商標)を用いて製剤化されている、請求項12記載の方法。
TLRアゴニストおよび全癌細胞がカチオン性脂質を用いて製剤化されている、請求項12記載の方法。
以下の剤を含むキット：
サイトカインを発現する、増殖不能な全癌細胞；
ヒトPD-1(Programmed Death 1)に特異的に結合する抗PD-1抗体；および
TLR(Toll様受容体)アゴニスト。
前記剤を投与するおよび/または製剤化するための指示書をさらに含む、請求項23記載のキット。
エマルションビヒクルをさらに含む、請求項23記載のキット。
リポフェクタミン(商標)をさらに含む、請求項23記載のキット。
カチオン性脂質をさらに含む、請求項23記載のキット。