CN110812476B - 弥漫大b细胞淋巴瘤的免疫佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于趋化因子CCL20的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂及其应用，以全硫代修饰的趋化因子CCL20mRNA 3’UTR的靶向性ODN作为免疫佐剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中应用，该免疫佐剂在DLBCL体内外研究中均发挥良好的抗肿瘤效应，其与DLBCL细胞共孵育能明显降低DLBCL的细胞增殖速率，其作为免疫佐剂与灭活肿瘤细胞混合局部注射后，小鼠一般情况良好，无惊厥、骚动、竖毛、抽搐等异常情况出现，局部注射部位无红肿、炎症、溃烂、硬结等异常现象，且非荷瘤小鼠无死亡现象，提示其可作为DLBCL免疫佐剂，可运用于临床，具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于趋化因子CCL20的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂及其应用。
背景技术
作为除手术、化疗、放疗以外的癌症第四种疗法，免疫疗法因使用肿瘤特异性抗原攻击癌细胞，具有侵袭性和副作用少的特点而受到广泛的关注。目前的免疫治疗费用高，免疫效果较弱，限制了临床应用。新型肿瘤疫苗虽然与传统疫苗相比安全性得到显著提高，但免疫效果和免疫原性均较弱，因此应用佐剂增强和/或塑造抗原特异性免疫反应在肿瘤免疫治疗中显得尤为重要。
趋化因子是一类趋化粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等炎症细胞定向迁移的细胞因子，其表达与自然杀伤细胞、淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞相关，并在肿瘤免疫中发挥重要作用。研究已经证实，趋化因子及其受体在恶性肿瘤中存在异常表达，在肿瘤发生、发展、侵袭等方面发挥重要作用。因此，趋化因子和趋化因子受体可作为抗肿瘤治疗的重要靶点。近年来以趋化因子和趋化因子受体为靶标的研究主要集中在药物研发方面，分为内源性配体趋化因子类似物、单克隆抗体和小分子拮抗剂三大类。研究方法多为从化合物库中大规模筛选出先导化合物类似物并进行优化得到。以研究最为广泛的趋化因子受体CXCR4为例，研究发现，CXCR4抑制剂Plerixafor(AMD3100)虽已被美国食品药品监督管理局批准应用于非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者的干细胞动员，但药物毒性限制其长期服用，Plerixafor也缺乏CXCR4特异性，因为它可以作为拮抗剂与另一个CXCL12受体CXCR7结合。其他CXCR4抑制剂在控制肿瘤生长和转移方面的作用更为欠缺。
趋化因子及其受体在肿瘤免疫中的调节上具有两面性：一方面，趋化因子及其受体调节免疫系统使肿瘤细胞逃避机体的抗肿瘤免疫反应；另一方面，趋化因子及其受体可以活化免疫细胞，并趋化免疫细胞向肿瘤组织迁移进而杀伤肿瘤细胞，又可抑制肿瘤血管的生成，对肿瘤的发生和转移进行抑制。鉴于此，趋化因子及其受体有望作为疫苗佐剂，但由于炎症、细胞因子血症等副作用，趋化因子及其受体的免疫制剂开发并不理想。
研究已经证实，肿瘤微环境，尤其是免疫微环境在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)发生、发展中发挥重要作用。发明人前期通过对DLBCL患者表达谱芯片进行生物信息分析后发现，趋化因子CCL20及其受体CCR6在DLBCL患者、细胞系中存在高表达。进一步功能学实验证实了CCL20在DLBCL发生、发展中发挥重要作用。但由于目前在研的趋化因子及其受体拮抗剂在控制肿瘤生长和转移方面的作用仍有欠缺，缺乏特异性，且目前批准的趋化因子及其受体拮抗剂存在药物长期毒性，炎症、细胞因子血症等副作用，使得关于趋化因子及其受体的免疫制剂开发并不理想，目前暂未见CCL20相关抑制剂和免疫佐剂的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于趋化因子CCL20的在弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂，包括靶向性ODN构成的核酸佐剂，所述靶向性ODN的磷酸骨架全硫代修饰，所述靶向性ODN的序列如SEQ ID NO：1所示，见表1。
表1
| ODN序列(5’-3’) | 碱基数 | |
| SEQ ID NO：1 | GCAATATGAATCAACTTC | 18 |
本发明的有益效果在于：本发明以全硫代修饰的趋化因子CCL20 mRNA 3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)的靶向性寡脱氧核苷酸作为免疫佐剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中应用，该免疫佐剂在DLBCL体内外研究中均发挥良好的抗肿瘤效应，其与DLBCL细胞共孵育能明显降低DLBCL的细胞增殖速率，其作为免疫佐剂与灭活肿瘤细胞混合局部注射后，小鼠一般情况良好，无惊厥、骚动、竖毛、抽搐等异常情况出现，局部注射部位无红肿、炎症、溃烂、硬结等异常现象，且非荷瘤小鼠无死亡现象，提示其可作为DLBCL免疫佐剂，可运用于临床，具有广阔的前景。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式中表3中第1条ODN经高效液相色谱纯化的分析图；
图2所示为本发明具体实施方式中表3中第2条ODN经高效液相色谱纯化的分析图；
图3所示为本发明具体实施方式中表3中第3条ODN经高效液相色谱纯化的分析图；
图4所示为本发明具体实施方式中SEQ ID NO：1的ODN与SU-DHL-2细胞共孵育48h后CCL20 mRNA表达水平变化图；
图5所示为本发明具体实施方式中SEQ ID NO：1的ODN与SU-DHL-6细胞共孵育48h后CCL20 mRNA表达水平变化图；
图6所示为本发明具体实施方式中10μg/ml SEQ ID NO：1的ODN与SU-DHL-2细胞共孵育后CCL20 mRNA表达水平图；
图7所示为本发明具体实施方式中10μg/ml SEQ ID NO：1的ODN与SU-DHL-6细胞共孵育后CCL20 mRNA表达水平图；
图8所示为本发明具体实施方式中使用CCK8法测定使用SEQ ID NO：1的ODN后SU-DHL-2细胞增殖情况变化图；
图9所示为本发明具体实施方式中使用CCK8法测定使用SEQ ID NO：1的ODN后SU-DHL-6细胞增殖情况变化图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：利用ODN的原理，研发针对CCL20的DLBCL佐剂。
本发明的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂，包括靶向性ODN构成的核酸佐剂，所述靶向性ODN的磷酸骨架全硫代修饰，所述靶向性ODN的序列如SEQ ID NO：1所示。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明以全硫代修饰的趋化因子CCL20mRNA 3’UTR的靶向性ODN作为免疫佐剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中应用，该免疫佐剂在DLBCL体内外研究中均发挥良好的抗肿瘤效应，其与DLBCL细胞共孵育能明显降低DLBCL的细胞增殖速率，其作为免疫佐剂与灭活肿瘤细胞混合局部注射后，小鼠一般情况良好，无惊厥、骚动、竖毛、抽搐等异常情况出现，局部注射部位无红肿、炎症、溃烂、硬结等异常现象，且非荷瘤小鼠无死亡现象，提示其可作为DLBCL免疫佐剂，可运用于临床，具有广阔的前景。
进一步的，一种上述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖中的应用。
进一步的，一种上述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在治疗弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用。
进一步的，一种上述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在制备抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖的药物中的应用。
进一步的，一种上述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
进一步的，一种上述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在制备抗癌免疫疫苗中的应用。
本发明的靶向性ODN的筛选和设计：
1)在美国国立生物技术信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Nucleotide数据库中，以“CCL20”为检索词，检索人和小鼠CCL20 mRNA 3’UTR的序列信息。然后利用DNA STAR Lasergene软件中的子软件“MegAlign”对人和小鼠CCL20 mRNA的3’UTR序列进行比对，筛选出CCL20 mRNA 3’UTR序列长度>18nt的保守序列。接下来，利用Oligo软件对两段保守序列内部自由能进行评估，结果显示，两段保守序列均有成为ODN结合靶区的可能性。最后，将ODN长度定义为18nt，设计了15个与之互补的候选靶向性ODN序列(表2)。再次利用Oligo软件对候选ODN的二级结构和能量特征进行分析，筛选出三条ODN(第3、10、11条)用于后续研究。理论上，这三条ODN相对不易形成分子间或分子内的二级结构，并且相对较易与靶区mRNA结合。继续利用NCBI中的Nucleotide BLAST子数据库中的Reference RNAsequences(refseq_rna)对所有可能与这三条ODN高度匹配的mRNA序列进行了分析，结果显示，这三条ODN在理论上均能够与人和小鼠CCL20 mRNA 3’UTR上的靶点特异性结合，而不与细胞内的其他mRNA非特异性结合(表2)。
表2
| 序号 | 靶区序列 | 靶向性ODN序列 |
| 5’-3’ | 5’-3’ | |
| 1 | AUGAAGUUGAUUCAUAUU | AATATGAATCAACTTCAT |
| 2 | UGAAGUUGAUUCAUAUUG | CAATATGAATCAACTTCA |
| 3 | GAAGUUGAUUCAUAUUGC | GCAATATGAATCAACTTC |
| 4 | AAGUUGAUUCAUAUUGCA | TGCAATATGAATCAACTT |
| 5 | AGUUGAUUCAUAUUGCAU | ATGCAATATGAATCAACT |
| 6 | GUUGAUUCAUAUUGCAUC | GATGCAATATGAATCAAC |
| 7 | UUGAUUCAUAUUGCAUCA | TGATGCAATATGAATCAA |
| 8 | UGAUUCAUAUUGCAUCAU | ATGATGCAATATGAATCA |
| 9 | GAUUCAUAUUGCAUCAUA | TATGATGCAATATGAATC |
| 10 | AUUCAUAUUGCAUCAUAG | CTATGATGCAATATGAAT |
| 11 | UUCAUAUUGCAUCAUAGU | ACTATGATGCAATATGAA |
| 12 | UGUAUUUUAUGUUAUUUA | TAAATAACATAAAATACA |
| 13 | GUAUUUUAUGUUAUUUAU | ATAAATAACATAAAATAC |
| 14 | UAUUUUAUGUUAUUUAUA | TATAAATAACATAAAATA |
| 15 | AUUUUAUGUUAUUUAUAG | CTATAAATAACATAAAAT |
2)对第3、10、11条靶向性ODN的特异性评价，结果见表3所示。
表3
3)靶向CCL20的ODN的合成和鉴定
通过化学方法对筛选出的三条靶向性ODN(见表3)进行合成和鉴定，结果显示，三条ODN长度均为18nt；分子量分别为5803.7μg/μmol，5794.7μg/μmol，和5724.7μg/μmol；GC比值分别为27.8％、27.8％和38.9％。为抵抗核酸酶对ODN的降解、延长其半衰期，对ODNs的磷酸骨架进行了全硫代修饰。三条ODN均经过高效液相色谱纯化(见图1-3)。
实施例1：
弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂，包括靶向性ODN构成的核酸佐剂，所述靶向性ODN的磷酸骨架全硫代修饰，所述靶向性ODN的序列如SEQ ID NO：1所示。
将表3所示的三条靶向性ODN(其中第三条为SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN)分别用磷酸缓冲盐溶液溶解后，均分别调整至浓度为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml和20μg/ml备用。取对数生长期的人源DLBCL细胞系SU-DHL-2和SU-DHL-6，用含有10％胎牛血清的1640培养基将细胞浓度调整为5x106/ml，接种于24孔板，1ml/孔，分别向细胞中加入不同浓度的三条靶向性ODN，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养0、12、24、48、72h，收集与ODN共同孵育的细胞，置于1.5ml小离心管中，离心1000rpm，5min后提取细胞总RNA，逆转录获取cDNA，运用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测CCL20 mRNA水平。
结果显示，随着时间和浓度的增加，与表3中第三条靶向性ODN，即SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN共同孵育的DLBCL细胞中的CCL20 mRNA水平呈降低趋势(图4-7)，但与表3中的第一、二条ODN共同孵育的DLBCL细胞中CCL20 mRNA水平未发生明显变化，说明SEQ IDNO：1所示的靶向性ODN可以有效抑制DLBCL细胞系CCL20的表达。
实施例2：
取对数生长期的人源DLBCL细胞系SU-DHL-2和SU-DHL-6接种在96孔板内，分为实验组和对照组，每孔5000个细胞，将SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN以10μg/ml浓度加入实验组细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中共培养，每隔24h利用CCK8试剂盒检测1次细胞活性(图8-9)。检测前2h每孔加入10μlCCK8检测试剂，37℃，5％CO2孵育2h后利用酶标仪测定450nm处各孔OD值。相对增殖活力＝处理组OD值/空白对照组OD值。结果显示，与对照组相比，实验组细胞增殖速率明显下降，说明SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN与DLBCL细胞共孵育能明显降低DLBCL的细胞增殖速率。
实施例3：
收获处于对数生长期的小鼠B淋巴瘤细胞A20，调整浓度为2x106/200μl，加入阿霉素(终浓度为100μg/ml)，37℃水浴30min，PBS洗3次，加入等量的生理盐水备用。将体重为25g左右的雌性DBA/2小鼠随机分成三组：对照组、1x105肿瘤细胞组和1x106肿瘤细胞组。于后两组小鼠右侧肋下接种上述灭活过的肿瘤细胞，于对照组接种等量生理盐水。14天后分别给三组小鼠对侧下肢皮肤接种1×106、1×105、1×106、1×106、1×105、1×106个肿瘤细胞。观察各组小鼠的成瘤率及有无肿瘤消退现象。
结果见表4所示，从表4中可以看出，对照组与免疫过的小鼠全部成瘤，成瘤时间未见明显差异，且没有出现肿瘤消退现象。说明灭活的A20细胞为弱免疫原性细胞，接近于人弥漫大B细胞淋巴瘤状况，不能有效激活机体免疫系统，也说明构建有效的佐剂是弥漫大B细胞淋巴瘤免疫治疗的研究重点。
表4
| 组别 | 是否免疫处理 | 肿瘤成瘤情况(％) | 成瘤时间(天) |
| 对照组 | 否 | 100 | 13.25±0.94 |
| 1×10<sup>5</sup>肿瘤细胞组 | 是 | 100 | 15.17±1.17 |
| 1×10<sup>6</sup>肿瘤细胞组 | 是 | 100 | 13.00±0.89 |
收获处于对数生长期的小鼠B淋巴瘤细胞A20，调整浓度为2×106/100μl，加入阿霉素(终浓度为100μg/ml)，37℃水浴30min，PBS洗3次，加入等量的生理盐水备用。将体重为25g左右的DBA/2小鼠随机分成三组，每组6只，雌雄各半：空白对照组、单独治疗组和ODN组。给予小鼠下肢皮肤接种1×106A20肿瘤细胞。接种后第2天、第5天、第8天、第15天分别在小鼠对侧肋下给予免疫治疗：空白对照组注射0.2ml生理盐水，单独治疗组注射0.1ml生理盐水+0.1ml 2×106个灭活肿瘤细胞，ODN组注射0.1ml 50μg ODN+0.1ml 2×106个灭活肿瘤细胞。每1-2天观察小鼠一般情况及成瘤情况。表5所示为接种肿瘤细胞第15天不同组小鼠的成瘤情况。
结果显示，未接种肿瘤细胞的小鼠精神好，活动力强；随着肿瘤生长小鼠精神萎靡，活动力明显下降。接种肿瘤第15-20天呈死亡高峰，但ODN组小鼠均未出现躁动、竖毛等异常现象，个别小鼠出现肿瘤消退现象。因此，CCL20mRNA 3’UTR的靶向性ODN在B细胞淋巴瘤小鼠模型中有一定抗肿瘤作用，可能通过活化局部的免疫微环境，增强肿瘤抗原的提呈，活化淋巴细胞达到控制肿瘤的作用。另外，CCL20 mRNA 3’UTR的靶向性ODN局部注射后小鼠一般情况良好，提示其作为免疫佐剂的可能性，为在弥漫大B细胞淋巴瘤中临床应用打下良好的基础。
表5
实施例中的SU-DHL-2和SU-DHL-6均为人源DLBCL细胞系，SU-DHL-2表型趋向于活化B细胞型，SU-DHL-6表型趋向于生发中心来源型，这两种细胞系能很好代表DLBCL全部亚型。本发明筛选、合成CCL20 mRNA 3’UTR的靶向性ODN(即SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN)，筛选方法可行、严谨。筛选出的ODN进行全硫代修饰不仅能在体外较好地抑制CCL20表达，抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖，还能避免被生物体内核酸酶消化，增强体内稳定性，为其在人体中应用打下基础。
CCL20 mRNA 3’UTR的靶向性ODN(即SEQ ID NO：1所示的靶向性ODN)作为免疫佐剂与灭活肿瘤细胞混合局部注射后，小鼠一般情况良好，无惊厥、骚动、竖毛、抽搐等异常情况出现，局部注射部位无红肿、炎症、溃烂、硬结等异常现象，非荷瘤小鼠无死亡现象，提示该佐剂不会诱导过剩的炎性细胞因子的产生，被期待作为副作用少的非炎症性核酸免疫佐剂应用于抗癌免疫疫苗。鉴于趋化因子CCL20在DLBCL发生、发展中发挥重要作用，本发明筛选、合成CCL20 mRNA 3’UTR的靶向性ODN，并进行全硫代修饰。本发明提供的CCL20 mRNA 3’UTR的靶向性ODN在DLBCL体内外研究中均表现出良好的抗肿瘤效应，且小鼠耐受性良好，可作为免疫佐剂，为接下来的临床应用打下基础。
综上所述，随着RNA在疾病中作用的不断深入研究，RNA逐渐成为干预治疗的重要靶点。ODN以前体mRNA和/或mRNA为靶点，通过阻止蛋白因子与RNA的重复序列结合，修复有缺陷的RNA或进行选择性剪接，从而产生新的目标蛋白，这与既往公开技术中的含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG-ODN)存在本质区别。CpG ODN，与细菌DNA类似，被哺乳动物细胞通过Toll受体9(Toll-likereceptor 9，TLR9)识别后，通过一系列信号级联转导，触发机体防御机制，引起明显及多样化的免疫反应。针对上述技术的各个缺点，本发明利用ODN的原理，研发针对CCL20的DLBCL佐剂，以全硫代修饰的趋化因子CCL20 mRNA 3’UTR靶向性ODN作为免疫佐剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中应用，该免疫佐剂在DLBCL体内外研究中均发挥良好的抗肿瘤效应，其与DLBCL细胞共孵育能明显降低DLBCL的细胞增殖速率，其作为免疫佐剂与灭活肿瘤细胞混合局部注射后，小鼠一般情况良好，无惊厥、骚动、竖毛、抽搐等异常情况出现，局部注射部位无红肿、炎症、溃烂、硬结等异常现象，且非荷瘤小鼠无死亡现象，提示其可作为DLBCL免疫佐剂，可运用于临床，具有广阔的前景。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 福建医科大学附属协和医院
<120> 弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaatatgaa tcaacttc 18
Claims (3)
1.弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂，其特征在于，包括靶向性ODN构成的核酸佐剂，所述靶向性ODN的磷酸骨架全硫代修饰，所述靶向性ODN的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种权利要求1所述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在制备抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖的药物中的应用。
3.一种权利要求1所述的弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫佐剂在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110812476A (zh) | 2020-02-21 |
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