JP2018021005A

JP2018021005A - ジンセノサイドｆ２を有効成分として含む肝がんの予防または治療用組成物

Info

Publication number: JP2018021005A
Application number: JP2017049804A
Authority: JP
Inventors: イルチョン、ウォン; Won Ii Jeong; キム、ミョンホ; Myung Ho Kim; ホキム、ミョン; ミンチョン、ジョン; Jong Min Jeong; ヨンキム、ソ; So Yeon Kim; チャンキム、ソン; Sun Chang Kim
Original assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2016-08-05
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2018-02-08
Also published as: CA2961005C; EP3278807A1; CA2961005A1; AU2018271265A1; AU2017201862A1; JP6923922B2; CN107684556A; US9943534B2; US20180036324A1; JP2018138610A

Abstract

【課題】正常細胞には影響を与えずに、肝がん細胞を死滅させ、肝がんの形成を特異的に抑制し、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）の発現を減少させ、肝がん治療剤として有用に使用することができる組成物を提供する。【解決手段】本発明に係る組成物は、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または治療用組成物である。【選択図】図１ａ

Description

本発明はジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または治療用薬学組成物に関する。
また、本発明はジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または改善用健康機能食品組成物に関する。

また、本発明はジンセノサイドＦ２を含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝がんの予防または治療方法に関する。

大韓民国の中壮年期（４０〜６０歳）の１０万人を基準に、男性７４．８人、女性１５．６人に発症する肝がんは、１年に１０万人の中２４．１人が死亡する死亡率１位の疾患である（２０１３年度の国立がん情報センターの資料参照）。

現在の肝がんを治療するための最善の方法としては、手術的切除と肝移植がある。ただし、肝移植の場合はドナーを求めるのに難しく、手術的切除の場合は手術が可能な患者が全体の患者の２０％以内に制限されていて、すべての肝がん患者の治療方法としては適していない。

他の治療方法としては、全身抗がん療法、肝動脈化学塞栓術、肝動脈内注入化学療法（HAIC）及び放射線治療などが存在しているが、これらの治療法の場合、肝がん細胞だけでなく、正常な細胞も一緒に死滅させる致命的な副作用が存在する。

また、代表的な肝がんの治療薬として使用されている世界最初の経口用治療剤であるソラフェニブ（sorafenib）成分のネクサバールは、長期間服用すると膵臓が縮小されるなどの副作用が報告されており、副作用がない肝がん治療剤の研究が活発に行われている。

一方、ジンセノサイドは高麗人参に含まれているサポニンであり、３０種以上の様々な種類が存在し、構造に応じてＰＰＤ（protopanaxadiol）系とＰＰＴ（protopanaxatrio）系に分けられ、化学構造に基づいてそれぞれ異なる薬理活性を示すことが知られている（Curr Vasc Pharmacol. 2009 July;7(3):293-302）。前記ジンセノサイドの中でも、高麗人参の極めて少量に存在するマイナージンセノサイドは分離することが難しいため、それに関する研究は不備である。

このような背景下、本発明者らは、肝がんの治療効果に優れた化合物を発掘しようと鋭意努力した結果、ジンセノサイドＦ２が正常細胞には影響を与えずに肝がんの形成及び増殖を抑制することができることを確認し、本発明を完成した。

韓国登録特許第１０−１３６０２３１号公報韓国登録特許第１０−１４３３６６１号公報

本発明の発明者らは肝がん治療剤に関連する研究を進める中、肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２を処理した結果、正常細胞の生存には影響を与えずに、肝がんの形成を抑制し、肝細胞の損傷を示唆するＡＬＴ及びＡＳＴの発現が減少することを確認して、前記ジンセノサイドＦ２を含む組成物が優れた肝がん治療効果を示すことを初めて究明した。

本発明の主な目的は、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ジンセノサイドＦ２を含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝がんの予防または治療方法を提供することにある。

本発明による組成物は、正常細胞には影響を与えずに、肝がん細胞を死滅させ、肝がんの形成を特異的に抑制し、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）の発現を減少させて、肝がん治療剤として有用に使用することができる。

ヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に対するジンセノサイドＦ２の細胞死滅効果を示したグラフである。マウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）に対するジンセノサイドＦ２の細胞死滅効果を示したグラフである。ジンセノサイドＦ２がマウスの正常肝細胞の生存に影響を与えないことを示すグラフである。位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡を通じてヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に対するジンセノサイドＦ２の細胞死滅効果を示した写真である。ジンセノサイドＦ２により細胞死滅が誘導されたヒト肝がん細胞株の量を蛍光度に通じて示したグラフである。マウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）にジンセノサイドＦ２を処理する時、破片化されたＤＮＡが増加することを示すグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与する時に形成されたがんの大きさを示した写真である。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時に形成されたがんの大きさを示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時に形成されたがんの個数を示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時のマウスの体重を示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時の腫瘍の重量を示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時の総重量に対比した腫瘍の重量を示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時のアラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）の発現レベルを示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase, AST）の発現レベルを示したグラフである。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与する時に、肝がんの形成が抑制され、免疫細胞の浸潤が増加することを示した写真である。肝がんが誘導されたマウスにジンセノサイドＦ２または担体を投与時、免疫細胞であるＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、調節Ｔ細胞（Treg）、好中球（Neu）、及びマクロファージ（Mac）の個数を示すグラフである。単位１ｘ１０^３／ｇは、肝組織重量（g）当たりに存在する当該細胞の個数を意味する。％は肝組織から分離した免疫細胞の個数のうち当該細胞の個数が占める割合を意味する。

前記の目的を達成するために、本発明の一つの態様は、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明における用語、「ジンセノサイドＦ２」は、高麗人参や紅参などの主要な活性成分であるサポニンの一種であり、ＰＰＤ（protopanaxadiol）系に属するジンセノサイドを意味する。

前記ジンセノサイドＦ２は商業的に販売されているものを購入したり、または自然界で栽培または採取した高麗人参から分離、または分離されたジンセノサイドから転換したものを使用することができる。または合成方法により合成されたジンセノサイドＦ２を使用することができるが、本発明の肝がんの予防または治療効果を示すジンセノサイドＦ２であれば、制限なく使用することができる。

本発明の一実施例では、高麗人参から粗サポニンを分離した後、前記粗サポニンで獲得したジンセノサイドからジンセノサイドＦ２を製造した。
本発明における用語、「予防」は、本発明におけるジンセノサイドＦ２を個体に投与して肝がんの発病を抑制したり、遅らせるすべて行為を意味することができる。

本発明における用語、「治療」は、本発明の前記組成物を肝がん発病の疑いのある個体に投与することにより、肝がんの症状が好転したり、有利になるようにするすべての行為を意味することができる。

本発明の一実施例では、肝がんが誘発されたマウスにジンセノサイドＦ２を処理した後、肝がん組織の大きさ、個数及び重量を分析した結果、担体の処理群に比べてがん組織の大きさが著しく減少し、個数が２倍以上に減少したことを確認した（図４ａ〜４ｃ）。また、両処理群のすべては体重の差はないが、ジンセノサイドＦ２を処理した群は担体を処理した群に比べて肝組織の重量が減少したことを確認した（図４ｄ〜４ｆ）。

したがって、前記の医薬学組成物は、肝がんの予防または治療剤として効果的に使用することができることが分かった。
本発明において、前記薬学組成物は肝がん細胞に特異的に細胞死滅効果を示すことができ、前記肝がん細胞は、ヒト肝がん細胞株であるＨｅｐ３Ｂまたはマウス肝がん細胞株であるＨｅｐａ１−６であり得るが、これらに限定されるものではなく、一般的な肝がん細胞すべてに死滅効果を示すことができる。

本発明の一実施例では、ジンセノサイドＦ２をヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に処理した結果、ジンセノサイドＦ２の濃度依存的に肝がん細胞株の生存率が減少することを確認した（図１ａ、２ａ及び２ｂ）。また、ジンセノサイドＦ２をマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）に処理した結果、ジンセノサイドＦ２の濃度依存的に肝がん細胞株の生存率が減少することを確認した（図１ｂ及び３）。しかし、ジンセノサイドＦ２を正常の肝細胞に処理した結果、正常の肝細胞の生存には何ら影響を及ぼさないことを確認した（図１ｃ）。

従って、前記ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む薬学組成物は肝がん細胞に限り、特異的に細胞死滅効果を示すだけで、正常細胞に対しては何の影響も及ぼさないため、副作用のない肝がんの予防または治療剤として使用することができることが分かった。

本発明において、前記薬学組成物はアラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）の発現を減少させることができる。

本発明における用語、「アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）」は、アラニンのアミノ基を２−オキソグルタル酸に伝達してグルタミン酸を形成する肝細胞内の酵素であり、血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（Serum Glutamic Pyruvate Transaminase、SGPT）またはアラニンアミノ基転移酵素（ALAT）と並行して使用される。

前記アラニンアミノ基転移酵素は、肝細胞が損傷した場合は血清に流出されるため、肝細胞の損傷の有無を判断する指標として使用することができ、具体的に、本発明では肝がんによる肝細胞の損傷の有無を判断する指標として使用することができる。

また、本発明における用語、「アスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）」は、アスパラギン酸のアミノ基を２−オキソグルタル酸に伝達してグルタミン酸を形成する肝細胞内の酵素であり、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase、SGOT）またはアスパラギン酸アミノ転移酵素（aspartate aminotransferase、ASAT）と並行して使用される。

前記アスパラギン酸アミノ基転移酵素は、肝細胞が損傷した場合、血清に流出されるため、前記アラニンアミノ基転移酵素と共に肝細胞の損傷の有無を判断する指標として使用することができ、具体的に、本発明では、肝がんによる肝細胞の損傷の有無を判断する指標として使用することができる。

本発明の一実施例では、肝がんが誘発されたマウスにジンセノサイドＦ２を処理した後、マウスの腹部大動脈から採取した血液の血清内のアラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）の発現量を測定した結果、対照群に比べてジンセノサイドＦ２処理群において、前記タンパク質の発現量が減少したことを確認した（図５ａ及び５ｂ）。

したがって、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む薬学組成物は、肝機能を保全する効果を示すことが分かった。
本発明において前記薬学組成物は、免疫細胞の数を増加させることができる。

本発明における用語、「免疫細胞」は、抗体を生産する細胞を総称するもので、前記免疫細胞は、ＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び大食細胞を含む群から選択されたいずれか一つ以上でありうるが、これに限定されるわけではない。

本発明の一実施例では、肝がんが誘発されたマウスにジンセノサイドＦ２を処理した後、マウスの肝臓から免疫細胞を分離した後、様々な細胞に特異的なマーカーを使用して細胞を分析した結果、ジンセノサイドＦ２処理群が担体処理群に比べてＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び大食細胞が増加したことを確認した（図６ｂ）。

したがって、前記ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む医薬組成物は、肝がん組織の近いところで免疫細胞を増加させて肝がんの形成を抑制することができることが分かった。

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激することなく、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体、賦形剤または希釈剤を意味することができ、具体的には、非自然的担体（non-naturally occuring carrier）であってもよい。本発明において使用可能な前記担体の種類は特に限定されないが、当該技術分野で一般的に使用され、薬学的に許容可能な担体であれば、いずれのものであっても使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどを挙げることができる。これらは単独で使用したり、２種以上を混合して使用することができる。

薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、経口または非経口の様々な剤型であってもよい。製剤化する場合には、通常使用している充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

具体的に、経口投与用の固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口用の液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与用の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

また、本発明の薬学組成物は薬剤学的に有効な量のジンセノサイドＦ２を含むことができる。本発明における用語、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、一般的に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの量、具体的には、０．０５〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回から数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては、他の製剤が使用されるかどうかを含め、具体的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、及び組成物の比率、治療期間、具体的組成物と組み合わせて使用したり、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野でよく知られている類似因子に応じて異なるように適用することが望ましい。

本発明の薬学組成物は肝がん治療剤、抗がん剤の効能を向上させることができる補助剤（adjuvants）添加物、治療効果を増進させることができる補助治療薬（例えば、抗がん補助剤）などで使用することができる。

本発明の他の一つの態様は、ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む肝がんの予防または改善用食品組成物を提供する。
本発明において、用語「ジンセノサイドＦ２」及び「予防」は前記で説明した通りである。

本発明における用語、「改善」は、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味することができる。
本発明における用語、「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味の食品をすべて含む。

前記健康機能（性）食品（functional food）とは、特定保健用食品（food for special health use、FoSHU）と同様の用語で、栄養供給の他、生体調節機能を効率的に示すよう加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、「機能（性）」とは、人体の構造及び機能についての栄養素を調整したり、生理学的作用などの保健の用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造の時には、当業界で通常的に添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記食品の剤形の場合、食品として認められている剤形であれば制限なく製造することができる。本発明の食品用組成物は様々な形態の剤形に製造することができ、一般的な薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用などがないという利点があり、携帯性に優れ、本発明の食品は免疫増強効果を増進させるためのサプリメントとして摂取が可能である。

前記健康食品（health food）は、一般的な食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（health supplement food）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によっては、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は、混用される。

具体的には、前記健康機能食品はジンセノサイドＦ２を飲料、お茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液などとして製造した食品であり、これを摂取した場合、健康上の特定の効果をもたらすことを意味するが、一般的な薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用がないという長所がある。

本発明の食品組成物は、日常的に摂取することが可能なため、高い免疫増進効果を期待することができ、非常に有用である。
前記組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に限定されず、当該技術分野で通常使用される担体であれば、いずれのものであっても使用することができる。

また、前記組成物は食品組成物に一般的に使用され、香り、味、視覚などを向上させることができる追加の成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含むことができる。また、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、カルシウム（Ca）、クロム（Cr）、マグネシウム（Mg）、マンガン（Mn）、銅（Cu）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。

また、前記組成物はまた、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、サイクラミン酸ナトリウム、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物を添加することができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用される。

前記ジンセノサイドＦ２をそのまま添加したり、他の食品または食品成分と併用して使用することができ、通常の方法に応じて適切に使用することができる。有効成分の混合量はその使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適切に決定することができる。一般的には、食品または飲料の製造時に、本発明の食品組成物は食品または飲料に対して５０重量部以下、具体的には２０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康及び衛生を目的として長期間摂取した場合には、前記の範囲以下の含有量を含むことができ、安全性の面で何ら問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。

本発明の食品組成物の一例として、健康飲料組成物に使用することができ、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースのような二糖類；デキストリン、シクロデキストリンのような多糖類；キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味料は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料；サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、具体的には、約０．０２〜０．０３ｇである。

前記の他に、健康飲料組成物は様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有することができる。その他の天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造用果肉を含有することができる。これらの成分は、独立して、または混合して使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部あたり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

本発明の食品組成物は、肝がんの予防または改善効果を示すことができれば、様々な重量％で含むことができるが、具体的には、ジンセノサイドＦ２を食品組成物の総重量比０．００００１〜１００重量％、または０．０１〜８０重量％で含むことができる。

本発明の他の一つの態様は、ジンセノサイドＦ２を含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝がんの予防または治療方法を提供する。
本発明において用語、「ジンセノサイドＦ２」は前記で説明した通りである。

本発明における用語、「投与」は、ある適切な方法で個体に本発明の組成物を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は目的組織に到達することができる限り、いずれかの一般的な経路を通じて投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与されることができるが、これに限定されない。

本発明における用語、「個体」は、肝がんの予防または治療が必要か、または必要とする可能性があるヒトを含むラット、マウス、家畜などのすべての動物を意味する。具体的には、ヒトを含む哺乳動物でありうる。

前記組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
前記の「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用された薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素により決定してもよい。例えば、ジンセノサイドＦ２を含む前記薬学組成物は、１日に０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、具体的には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与してもよい。

本発明の薬学組成物を毎日投与または間歇的に投与してもよく、１日当たりの投与回数は、１回または２〜３回に分けて投与することが可能である。また、前記組成物は、肝がんの予防または治療のために単独、または他の薬物治療と併用して使用することができる。前記要素をすべて考慮して、副作用のない、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。

以下、本発明を実施例を通じて本発明の構成及び効果をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ジンセノサイドＦ２の製造
ジンセノサイドＦ２の製造方法は次の通りである。
具体的には、高麗人参、西洋参及び竹節参を含む高麗人参の葉及び根を２０倍体積の８０％酒精を加えて２回抽出して、乾燥し粗サポニンを獲得した。前記粗サポニンを水に再度溶解させて、ＨＰ−２０樹脂に吸着させた後、水１００％で洗浄し、糖を除去した。糖を除去した後、４０％酒精で１次洗浄してプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol）系であるジンセノサイドＲｅ及びＲｇ１を優先的に除去した。その後、８０％酒精で洗浄した後、乾燥して、溶出されたプロトパナキサジオール（protopanaxadiol）系であるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄを獲得した。前記プロトパナキサジオールジンセノサイド混合物を基質として使用して韓国公開特許第２０１３−０１３４９３０号に記載された方法に基づいて７０％以上のジンセノサイドＦ２を獲得した。前記ジンセノサイドＦ２をＯＤＳ樹脂を利用して、吸着した後、ジンセノサイドＦ２を得るのに適正な濃度の酒精を濃度区配分で連続的に流して、９５％以上の純度の高いジンセノサイドＦ２分画を得た。

実施例２：ジンセノサイドＦ２の癌細胞死滅効果
実施例２−１：ヒト肝がん細胞株、マウス肝がん細胞株及び正常な肝細胞に対する死滅効果の比較
前記実施例１で製造したジンセノサイドＦ２をヒト肝がん細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞、マウス肝がん細胞株であるＨｅｐａ１−６細胞及びマウス正常肝細胞に様々な濃度（１０〜６０μＭ）で処理した後、２４時間経過した後、細胞生存率を測定するのに使用されるＥＺ−ＣＹＴＯＸ（daeillab service、大韓民国）を使用して製造会社が提供する実験方法に応じて、前記細胞の生存率を測定した。

測定の結果、ヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）とマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）の場合、ジンセノサイドＦ２の濃度依存的に生存率が減少することを確認したが（図１ａ〜１ｂ）、マウス正常肝細胞の場合、細胞生存率にほとんど変化が表れないことを確認した（図１ｃ）。

したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がん細胞株には細胞毒性を示し、細胞死滅効果を示すが、正常細胞には細胞毒性を示さないことから、肝がん細胞特異的に細胞死滅効果を示すことを確認した。

実施例２−２：ヒト肝がん細胞株に対する死滅効果
位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用してジンセノサイドＦ２のヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）の死滅効果を確認した。

具体的には、前記実施例１で製造したジンセノサイドＦ２をヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に様々な濃度（１０〜６０μＭ）で処理した後、２４時間経過した後、前記細胞の状態を位相差顕微鏡で観察した。また、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole、Vector laboratory、米国）及びＴＵＮＥＬ（terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling、Roche life science、米国）を使用して、前記細胞を染色した。前記染色は、製造会社が提供する方法に応じて行い、染色の程度を蛍光顕微鏡で観察した。

位相差顕微鏡で観察した結果、ジンセノサイドＦ２によりヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）の細胞死滅が起こることを確認した（図２ａ）。また、蛍光顕微鏡で観察した結果、ＤＡＰＩで染色された細胞数には差がないが、ＴＵＮＥＬに染色される細胞の数がジンセノサイドＦ２の濃度依存的に増加していることを確認した（図２ａ及び２ｂ）。

したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がん細胞株に対して細胞毒性を示し、細胞死滅効果を示すことをもう一度確認した。
実施例２−３：マウス肝がん細胞株に対する死滅効果
ＤＮＡの分解の程度を確認して、ジンセノサイドＦ２のマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）に対する死滅効果を確認した。

具体的には、前記実施例１で製造したジンセノサイドＦ２をマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１−６）に様々な濃度（１０〜６０μＭ）で処理した後、２４時間経過した後、前記細胞を回収し、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（iNtRON、米国）を使用して製造会社が提供する実験方法に応じて、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを抽出した後、ゲル電気泳動（gel electrophoresis）を実施した。

実施結果、ジンセノサイドＦ２によって破片化されたｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡが表れることを確認し、特に、ジンセノサイドＦ２の濃度が増加するにつれて破片化されたｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡが増加することを確認した（図３）。

したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がん細胞株に対して細胞毒性を示し、細胞死滅効果を示すことをもう一度確認した。
実施例３：ジンセノサイドＦ２の肝がんの形成抑制効果
実施例３−１：肝がんの形成誘導マウスの製造
肝がん誘導物質であるジエチルニトロソアミン（Diethylnitrosamine、DEN）を２０ｍｇ／ｋｇの濃度にして、生後１４日の雄マウスの腹腔内に注射して肝がんの形成を誘導した。生後２０週齢から担体（オリーブオイル）、またはジンセノサイドＦ２（５０ｍｇ／ｋｇ）を週３回処理した後、２０週後に犠牲させて肝がん形成の抑制程度を確認した。

実施例３−２：ジンセノサイドＦ２の肝がんの形成抑制効果
前記実施例３−１で犠牲させたマウスを開腹して肝臓を摘出した後、担体処理群及びジンセノサイドＦ２処理群のがん組織の大きさ、個数及び重量を比較した。

比較の結果、ジンセノサイドＦ２を処理した群は、担体を処理した群に比べて肝臓からがん組織の大きさが大幅に減少し、個数が２倍以上減少したことを確認した（図４ａ〜４ｃ）。また、両方の処理群は共に体重の差はないが、ジンセノサイドＦ２を処理した群は、担体を処理した群に比べて肝組織の重量が減少したことを確認した（図４ｄ〜４ｆ）。

したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がんの形成及び増殖を抑制する効果を示すことを確認した。
実施例３−３：ジンセノサイドＦ２の肝機能保存効果
前記実施例３−１で犠牲させたマウスの腹部大動脈から血液を採取して遠心分離器を用いて３，３００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離した後、血清のみを分離した。その後、血清中のアラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）、トリグリセリド（triglyceride）をアイデックス（IDEXX Laboratories、米国）社のキットを使用して製造会社で提供する実験方法に応じて、ベットテスト（VetTEST、IDEXX、米国）で測定した。

測定の結果、肝細胞の損傷を示唆しているＡＬＴ及びＡＳＴ数値が担体の処理群に比べてジンセノサイドＦ２処理群で減少を確認した（図５ａ及び５ｂ）。
したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がんの形成を抑制すると同時に、肝の機能を保存することができる効果を示すことを確認した。

実施例３−４：ジンセノサイドＦ２の免疫細胞の増加効果
前記実施例３−１で犠牲させたマウスを開腹して肝臓を摘出した後、肝の組織学的変化を観察するために、Ｈ＆Ｅ（ヘマトトキシン及びイオシン）染色を実施した。

その結果、ジンセノサイドＦ２を処理した群は、担体の処理群に比べて肝がんの形成が抑制され、肝がん組織の近いところに免疫細胞の浸潤が増加することを確認した（図６ａ）。

前記免疫細胞の活性を具体的に測定するために、前記の抽出された肝臓での免疫細胞を分離し、様々な細胞に特徴を示す、下記表１のマーカーを使用して、フローサイトメトリー蛍光分析器（LSRII、BD bioscience）を介して染色された細胞を分析した。

その結果、ジンセノサイドＦ２を処理した群は担体を処理した群に比べて、免疫細胞の中でＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞及び大食細胞が増加したことを確認した（図６ｂ）。

したがって、ジンセノサイドＦ２は肝がんの増殖を抑制するＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞及び大食細胞を肝がん組織の近くに増加させる効果を示すことを確認した。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに、他の具体的な形態で実施することができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む、肝がんの予防または治療用薬学組成物。
前記薬学組成物が、肝がん細胞に特異的に細胞死滅効果を示すものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記薬学組成物が、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（aspartate aminotransferase、AST）の発現を減少させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記薬学組成物が、免疫細胞の数を増加させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
前記免疫細胞が、ＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及び大食細胞を含む群から選択されたいずれか一つ以上であるものである、請求項４に記載の薬学組成物。
ジンセノサイドＦ２を有効成分として含む、肝がんの予防または改善用食品組成物。
ジンセノサイドＦ２を含む組成物をヒトを除いた個体に投与する段階を含む、肝がんの予防または治療方法。