JP2017535794A - 免疫調節不全についてのマーカーとしてのｐｉｆ結合 - Google Patents

免疫調節不全についてのマーカーとしてのｐｉｆ結合 Download PDF

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Abstract

複数の実施形態は、免疫調節不全についてのマーカーとして対象の循環中の免疫細胞へ結合する着床前因子（ＰＩＦ）の検査方法に関する。いくつかの実施形態は、再発性妊娠中断（ＲＰＬ）を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫機能障害のレベルの検出方法、ならびに有効量のＰＩＦまたはその類似体を投与することを含む免疫機能障害のレベルの検出方法及び循環免疫細胞へのその結合の検査方法に関する。当該方法内で、対象の循環免疫細胞へのＰＩＦの結合における約２０パーセントの変化が、免疫機能障害のレベルを示す。【選択図】図１０Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月３日出願の「ＰＩＦ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓ ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（免疫調節不全についてのマーカーとしてのＰＩＦ結合）」という表題の米国仮出願番号第６２／０７４，３８４号と、２０１５年２月６日出願の「ＰＩＦ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓ ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（免疫調節不全についてのマーカーとしてのＰＩＦ結合）」という表題の米国仮出願番号第６２／１１３，２９８号と、２０１５年８月２８日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄａｍａｇｅ（神経損傷の治療のための組成物及び方法）」という表題の米国仮出願番号第６２／２１１，６６０号、ならびに２０１４年９月１６日出願の「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａｃｕｔｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（急性放射線症候群の治療方法）」という表題の米国仮出願番号第６２／０５１，０７７号に対する優先権及びその利益を請求する２０１５年９月１６日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ａｃｕｔｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（急性放射線症候群を治療するための組成物及び方法）」という表題の国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５０５３２号に対する優先権及びそれらの利益を請求する。各出願の内容は、それらの個々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の分野
本開示は概して、対象由来の細胞または他の生物試料へのＰＩＦ結合の検出及び／または定量化による、対象における免疫調節不全の識別に関する診断応用に関する。本開示は、ヒトを含む動物から得た試料の分析からの、免疫調節不全によって生じる再発性妊娠中断及び子宮内膜症の診断にも関する。免疫調節不全の識別は、免疫調節不全によって生じる疾患の治療及び／または根絶の適切な経過を判断するために重要である。
再発性流産または習慣性流産とも呼ばれる再発性妊娠中断（ＲＰＬ）は、最後の月経周期から２０週前に３回連続して妊娠中断するものとして歴史的に定義されている。散発性妊娠中断の発生率に基づくと、再発性妊娠中断の発生率は３００例の妊娠においておよそ１例となるはずである。しかしながら、疫学的試験は、女性の１〜２％が再発性妊娠中断を経験していることを明らかにしている。診断検査及び治療介入を必要とする臨床実体としてＲＰＬを定義することは、その後の胎児の喪失についての危険性の上昇と当該障害についての治療可能な病因を発見する確率とに関する知識にかかっている。信頼可能な公表されたデータは２例ではなく３例以上の流産を有している集団におけるＲＰＬについての病因を発見する確率を推定してきていないが、最良の入手可能なデータは、その後の妊娠における流産の危険性が、生児出生の履歴のない患者における３例の喪失後の３３％と比較して、２例の喪失後に３０％であることを示唆している。ＲＰＬの全症例のおよそ１／３以上が説明されていないままであろう。
子宮内膜症は組織学的に、骨盤腹膜、卵巣、及び腸を含む子宮外位置への子宮内膜組織の変位を特徴とする。不妊及び骨盤痛の重要な原因である、子宮内膜症に関する個人の及び地球規模での社会経済的負担は、重要な意味を持つ。腹腔鏡検査が、依然として当該容態の診断のための基準診断法である。しかしながら、手術の侵襲的な性質は、当該疾患についての検査用バイオマーカーのないことと相まって、症状の発症から最終の診断まで平均７〜１１年の遅延を結果的に生じる。不運なことに、診断の遅延は、疾患進行の点で甚大な結果をもたらし得る。
哺乳類動物の妊娠は、母体の免疫系が、両方の当事者系統にとって有益である非常に有効な様式で、胎児と相互作用する独特な生理学的事象である。胚由来因子である着床前因子（ＰＩＦ−１）は、受精直後の妊娠の母方の認識を生み出すことによって妊娠の免疫寛容を生じ得る。
免疫細胞上の細胞受容体に対するＰＩＦ結合の特性は、対象における免疫調節不全を診断するのに有用なシステムまたは装置を生み出すために利用することができる。本開示は、固定化ＰＩＦを含む固体支持体に関し、ここで、試料に対するＰＩＦ結合親和性を、免疫調節不全による再発性妊娠中断及び／または子宮内膜症に罹患している患者集団を識別するために分析し得る。
本開示は、免疫調節不全についてのマーカーとして、対象の循環免疫細胞に対する着床前因子（ＰＩＦ）またはその機能的断片若しくはその類似体の結合を検査する方法に関する。いくつかの実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を、１つまたは複数の免疫細胞を含む対象由来の試料へ曝露すること、及び対象の１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその機能的断片との結合事象を検査することを含む、免疫調節不全による再発性妊娠中断（ＲＰＬ）の履歴を有する雌性対象の識別方法に関し、ここで、基準と比較した１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、当該ＲＰＬが免疫調節不全によることを示す。
いくつかの実施形態において、基準と比較して１つまたは複数の免疫細胞に対する結合がＰＩＦから１つまたは複数のその機能的断片へわずかに変化することは、ＲＰＬが免疫調節不全によるものではないことを示している。
いくつかの実施形態において、有効量のＰＩＦは、溶液中で約３００ｎＭから約５００ｎＭのＰＩＦであり得、または結合し、プラスチック表面上に被覆されたマトリックス材料へ吸着若しくは連結した抗体によって固定化し得る。
本開示は、方法がさらに、試料をＰＩＦまたはその機能的断片へ曝露する前に対象から試料を単離することを含み得る実施形態を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＰＩＦまたはその機能的断片若しくはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその機能的断片若しくはその類似体を固体支持体へ固定化することを含み得、ここで、固体支持体は、チップ、カラム、プレート、または多重ウエルプレートから選択される。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片と１つまたは複数の免疫細胞の間の結合を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化、及び／または検出することを含み得、ここで、１個以上の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、フローサイトメトリーによって試料中の免疫細胞数を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定し得、ここで、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞からなる試料を、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片を含むカラムへ曝露することを含み、かつここで、結合事象を検査するステップは、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の免疫細胞の数を定量化することを含み、ここで、１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、またはＰＢＭＣのうちの１つまたは組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する当該ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する当該ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片若しくはその類似体は、１個以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、ここで、結合事象を、ＦＩＴＣ標識したＰＩＦまたはその類似体へ曝露した試料中の蛍光レベルを、ＦＩＴＣの蛍光を生じるのに十分な光の波長による試料の刺激後に定量化及び／または検出することによって測定する。
本開示の方法は、ＰＩＦまたはその機能的断片若しくはその類似体を対象の１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップに関する。いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片若しくはその類似体を対象へ投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を、１つまたは複数の免疫細胞を含む対象由来の試料へ曝露すること、及び対象の１つまたは複数の免疫細胞と、ＰＩＦまたはその機能的断片との結合事象を検査し、ここで、基準と比較した１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、当該雌性対象が免疫調節不全によりＲＰＬに罹患している可能性が高いことを示すことを含む、免疫調節不全によりＲＰＬに罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法に関する。
いくつかの実施形態において、基準と比較して１つまたは複数の免疫細胞に対する結合がＰＩＦから１つまたは複数のその機能的断片へわずかに変化することは、当該雌性対象が、免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高くないことを示す。
いくつかの実施形態において、有効量のＰＩＦは、約３００ｎＭから約５００ｎＭのＰＩＦであり得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、試料をＰＩＦまたはその機能的断片へ曝露する前に、対象から試料を単離することを含み得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその機能的断片を固体支持体へ固定化することを含み得、ここで、固体支持体は、チップ、カラム、プレート、または多重ウエルプレートから選択される。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片と１つまたは複数の免疫細胞との結合を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現の量を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化及び／または検出することを含み得、ここで、１個以上の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、または末梢血単核球(ＰＢＭＣ)のうちの１個または組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、フローサイトメトリーによって免疫細胞の数を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化され得、ここで、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞からなる試料を、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片を含むカラムへ曝露することを含み、かつここで、結合事象を検査するステップは、フローサイトメトリーによる１つまたは複数の免疫細胞の数を定量化することを含み、ここで、１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、またはＰＢＭＣのうちの１つまたは組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する当該ＰＩＦの結合の減少を定量することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する当該ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、１つ以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を含み、かつここで、結合事象は、蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片を対象へ投与することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を、１つまたは複数の免疫細胞を含む対象由来の試料へ曝露すること、及び対象の１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその機能的断片の間の結合事象を検査し、ここで、基準と比較した１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、雌性対象が子宮内膜症に罹患していることを示すことを含む、子宮内膜症に罹患している雌性対象の識別方法に関する。
いくつかの実施形態において、基準と比較して１つまたは複数の免疫細胞に対する結合がＰＩＦから１つまたは複数のその機能的断片へわずかに変化することは、雌性対象が子宮内膜症に罹患していないことを示す。
いくつかの実施形態において、有効量のＰＩＦは、約３００ｎＭから約５００ｎＭのＰＩＦであり得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、対象由来の試料をＰＩＦまたはその機能的断片へ曝露する前に、試料を対象から単離することを含み得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその機能的断片を固体支持体へ固定化し、この中で固体支持体は、チップ、カラム、プレート、または多重ウエルプレートから選択することを含み得る。いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片と１つまたは複数の免疫細胞との結合を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化、及び／または検出することを含み得、この中で１個以上の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、免疫細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化され得、ここで、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片を含むカラムへ曝露することを含み、かつここで、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化することを含み、ここで、１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、またはＰＢＭＣのうちの１つまたは組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ１４＋及び／または樹状細胞に対する当該ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する当該ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、１個以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつここで、結合事象は、蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片を対象へ投与することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に結合するＰＩＦの増加のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞を含む対象由来の試料へ曝露すること、及び対象の１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその機能的断片との結合事象を検査し、ここで、基準と比較した１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、当該雌性対象が、免疫調節不全による子宮内膜症に罹患している可能性が高いことを示すことを含む、免疫調節不全による子宮内膜症に罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法に関する。
いくつかの実施形態において、基準と比較して１つまたは複数の免疫細胞に対する結合がＰＩＦから１つまたは複数のその機能的断片へわずかに変化することは、雌性対象が、免疫調節不全による子宮内膜症に罹患している可能性が低いことを示す。
いくつかの実施形態において、有効量のＰＩＦは、約３００ｎＭから約５００ｎＭのＰＩＦであり得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、対象由来の試料をＰＩＦまたはその機能的断片へ曝露する前に、試料を対象から単離することを含み得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその機能的断片を固体支持体へ固定化し、ここで、固体支持体は、チップ、カラム、プレート、または多重ウエルプレートから選択することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片と１つまたは複数の免疫細胞との結合を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片に対して結合する免疫細胞の数を観察、定量化、及び／または検出することを含み得、ここで、１個以上の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、結合事象を検査するステップは、免疫細胞数をフローサイトメトリーによって定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化し得、ここで、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片を含むカラムヘ曝露することを含み、かつここで、結合事象を検査するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化することを含み、ここで、１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、またはＰＢＭＣのうちの１つまたは組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する当該ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する当該ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片は、１個以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつここで、結合事象は、ＦＩＴＣ部分の蛍光を生じるのに十分な光の波長の存在下で、ＦＩＴＣ標識したペプチドによって発光される蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその機能的断片を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片を対象へ投与することを含み得る。
いくつかの実施形態において、有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含み得る。
本開示の一実施形態は、ＲＰＬと診断された、または罹患している疑いがある対象に由来する試料を、ＰＩＦまたはその機能的断片を含む固体支持体へ曝露すること、ＰＩＦまたはその機能的結合断片へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合している免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセントから約２５パーセントまで多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。本開示の一実施形態は、ＲＰＬと診断された、または罹患していると疑われる対象に由来する試料を、ＰＩＦまたはその機能的断片を含む固体支持体へ曝露すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の別の実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、対象の結合特性を作成すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦへ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、ＲＰＬを発症するのに十分な対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。いくつかの場合において、免疫細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはＣＤ１４＋細胞のうちの１つまたは複数である。
本開示の一実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、ＲＰＬを発症するのに十分な対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞のうちの１つ以上の存在、非存在、または量を検出すること、免疫細胞の数が、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有しているものとして対象を診断すること、ならびに有効量の免疫調節薬を投与することによって対象を治療することを含む、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有している対象の治療方法にも関する。
本開示の一実施形態は、子宮内膜症と診断されている、または罹患していると疑われる対象に由来する試料を、ＰＩＦまたはその機能的断片を含む固体支持体へ曝露すること、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、対象の結合特性を作成すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料に由来する、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、子宮内膜症を発症するのに十分な対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、子宮内膜症を発症するのに十分な対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞のうちの１つ以上の存在、非存在、または量を検出すること、免疫細胞の数が約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有しているものとして、対象を診断すること、ならびに有効量の免疫調節薬を投与することによって、対象を治療することを含む、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有する対象の治療方法に関する。
本開示の一実施形態は、免疫調節不全に罹患しているまたは罹患していると疑われる対象に由来する試料を、ＰＩＦまたはその機能的断片を含む固体支持体へ曝露すること、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料に由来する、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、対象の結合特性を作成すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、固定化したＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合する免疫細胞の数と比較すること、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして対象を分類することを含む、対象の免疫調節不全のレベルの検出方法に関する。
本開示の一実施形態は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞のうちの１つ以上の存在、非存在、または量を検出すること、免疫細胞の数が約２０パーセント多い場合、免疫調節不全のレベルを有しているものとして対象を診断すること、ならびに有効量の免疫調節薬を投与することによって対象を治療することを含む、免疫調節不全のレベルを有する対象の治療方法に関する。
いくつかの実施形態において、定量化するステップは、対象の結合特性を作成することを含む。いくつかの実施形態において、対象の結合特性を作成することは、免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ１４＋細胞の数、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ４＋細胞の数、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせの量とを相関させることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ１４＋細胞の数、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ４＋細胞の数、及びＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせの量とを相関させることを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ１４＋細胞の数、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したＣＤ４＋細胞の数、及びＰＩＦへ結合したＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせの量とを相関させるステップは、ＰＩＦまたはその機能的断片と当該細胞との結合会合を検出及び／または定量化することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、さらに、本明細書に開示する１つまたは複数の細胞タイプに対するＰＩＦまたはその機能的断片の結合会合と、免疫機能障害に罹患しているまたは免疫機能障害と診断されていないことが知られているの対象由来のまたは当該対象と関連した結合会合とを相関させることを含む。いくつかの実施形態において、相関させるステップは、対象についての情報を、タンパク質または細胞の会合と関連する公知の値または予測値に関するデータベースを用いて、タンパク質または細胞の会合と関連する値と比較することを含む。いくつかの実施形態において、いかなる開示した法も、開示したアルゴリズムのうちのいずれかを用いることによって、開示した障害を発症するのに十分な免疫機能障害を対象が獲得するであろうまたは当該免疫機能障害に罹患している危険性を特徴づけ、識別し、または算出するステップを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合した１４−３−３エータの結合、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したミオシン９の結合、ＰＩＦまたはその機能的断片へ結合したチモシンα１の結合、及びＰＩＦへ結合したＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ１４＋細胞に由来するＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせの量とを相関させるステップを含み、公知の及び予測されたタンパク質相互作用に関するデータベースを用いて、直接的及び間接的な会合を含むタンパク質の相互作用を算出することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、固定化したＰＩＦへ結合する免疫細胞の数を検出または定量するステップの前に、試料を対象から単離することを含む。いくつかの実施形態において、試料を単離するステップは、固定化したＰＩＦへ試料を曝露する前に、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞を含む細胞集団のうちの１つまたは組み合わせを対象の血液から単離することを含む。
いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４０パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４５パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４５パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約２５パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約３０パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約３５パーセント多い。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４０パーセント少ない。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４５パーセント少ない。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約２５パーセント少ない。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約３０パーセント少ない。いくつかの実施形態において、免疫調節不全、ＲＰＬまたは子宮内膜症に罹患していると疑われる人の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、基準試料由来の、ＰＩＦへ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約３５パーセント少ない。いくつかの実施形態において、固定化したＰＩＦまたはその類似体の量は、約２００マイクロモル濃度超、３００マイクロモル濃度超、４００マイクロモル濃度超、５００マイクロモル濃度超、６００マイクロモル濃度超、７００マイクロモル濃度超、８００マイクロモル濃度超、９００マイクロモル濃度超、または１０００マイクロモル濃度超の濃度で付着する。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ディッシュ、プレート、カラム、またはシリカチップである。
本開示の一実施形態は、免疫調節不全によるＲＰＬの病歴を有する雌性対象の識別方法に関し、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を投与すること、及び循環免疫細胞への当該ＰＩＦの結合を検査し、ここで、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の結合の変化は、当該対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全による可能性が高いことを示し、かつ基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の正常な結合は、対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全によるものではない可能性が高いことを示すことを含む。
本開示の一実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその類似体を投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している雌性対象の識別方法に関し、ここで、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその類似体の結合の変化は、当該対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全による可能性が高いことを示し、かつ基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の正常な結合は、当該対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全によるものではない可能性が高いことを示す。
本開示の一実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその類似体を投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法に関し、ここで、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の結合の変化は、当該対象が免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高いことを示し、かつ基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の正常な結合は、当該対象が免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高くないことを示す。
本開示の一実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全に罹患している対象の識別方法に関し、ここで、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の結合の変化は当該対象の免疫調節不全を示し、かつ基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の正常な結合は、当該対象の免疫調節不全の欠如を示す。
本開示の一実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその機能的断片を投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、子宮内膜症に罹患している対象の識別方法に関し、ここで、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の結合の変化は、当該対象の子宮内膜症を示し、かつ基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦまたはその機能的断片の正常な結合は、当該対象の子宮内膜症の欠如を示す。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦ結合は、対象からの免疫細胞の単離後にフローサイトメトリーによって測定する。いくつかの実施形態において、循環免疫細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態において、変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対するＰＩＦの結合の減少である。いくつかの実施形態において、変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対するＰＩＦの結合の増加である。いくつかの実施形態において、非洗剤緩衝液は、スルファベタインである。
本開示の性質及び利点に関する完全な理解のために、詳細な説明が、添付の図面に関連して以下に続く。
樹状細胞(ＤＣ)へ結合するＰＩＦの減少が、ＲＰＬの危険性に関するマーカーを表すことができる、またはＲＰＬを獲得する若しくはＲＰＬに罹患する危険性の上昇と相関していることを示す。実施した本実験において、４例のＲＰＬ対象は、ｍＤＣの１０倍超の増加を示したのに対し、７例のＲＰＬ対象は、ＨＰ群と類似の値を有しており（０．１０±０．０８）、ｐＤＣの百分率における差は何ら観察されなかった（ＲＰＬ群における０．１１３±０．０９対ＨＰ群における０．１１６±０．０３）。在胎期間は、ＨＰ群においてｐＤＣの値もｍＤＣの値も変化しなかった。ＰＩＦ結合細胞は、ＲＰＬ群におけるｐＤＣ及びｍＤＣにおいて等しく減少した（ｐＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４１．２±１９．２対ＨＰ群における５８．２±１８．３、ｐ＝０．０３８１；ｍＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４６．１±１４．２対ＨＰ群における５７．９±９．１；ｐ＝０．０２９）。個々のＲＰＬ対象に存在するｍＤＣのレベルとｍＤＣ ＰＩＦ＋の％との関連性はなかった。 樹状細胞(ＤＣ)へ結合するＰＩＦの減少が、ＲＰＬの危険性に関するマーカーを表すことができる、またはＲＰＬを獲得する若しくはＲＰＬに罹患する危険性の上昇と相関していることを示す。実施した本実験において、４例のＲＰＬ対象は、ｍＤＣの１０倍超の増加を示したのに対し、７例のＲＰＬ対象は、ＨＰ群と類似の値を有しており（０．１０±０．０８）、ｐＤＣの百分率における差は何ら観察されなかった（ＲＰＬ群における０．１１３±０．０９対ＨＰ群における０．１１６±０．０３）。在胎期間は、ＨＰ群においてｐＤＣの値もｍＤＣの値も変化しなかった。ＰＩＦ結合細胞は、ＲＰＬ群におけるｐＤＣ及びｍＤＣにおいて等しく減少した（ｐＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４１．２±１９．２対ＨＰ群における５８．２±１８．３、ｐ＝０．０３８１；ｍＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４６．１±１４．２対ＨＰ群における５７．９±９．１；ｐ＝０．０２９）。個々のＲＰＬ対象に存在するｍＤＣのレベルとｍＤＣ ＰＩＦ＋の％との関連性はなかった。 樹状細胞(ＤＣ)へ結合するＰＩＦの減少が、ＲＰＬの危険性に関するマーカーを表すことができる、またはＲＰＬを獲得する若しくはＲＰＬに罹患する危険性の上昇と相関していることを示す。実施した本実験において、４例のＲＰＬ対象は、ｍＤＣの１０倍超の増加を示したのに対し、７例のＲＰＬ対象は、ＨＰ群と類似の値を有しており（０．１０±０．０８）、ｐＤＣの百分率における差は何ら観察されなかった（ＲＰＬ群における０．１１３±０．０９対ＨＰ群における０．１１６±０．０３）。在胎期間は、ＨＰ群においてｐＤＣの値もｍＤＣの値も変化しなかった。ＰＩＦ結合細胞は、ＲＰＬ群におけるｐＤＣ及びｍＤＣにおいて等しく減少した（ｐＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４１．２±１９．２対ＨＰ群における５８．２±１８．３、ｐ＝０．０３８１；ｍＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４６．１±１４．２対ＨＰ群における５７．９±９．１；ｐ＝０．０２９）。個々のＲＰＬ対象に存在するｍＤＣのレベルとｍＤＣ ＰＩＦ＋の％との関連性はなかった。 樹状細胞(ＤＣ)へ結合するＰＩＦの減少が、ＲＰＬの危険性に関するマーカーを表すことができる、またはＲＰＬを獲得する若しくはＲＰＬに罹患する危険性の上昇と相関していることを示す。実施した本実験において、４例のＲＰＬ対象は、ｍＤＣの１０倍超の増加を示したのに対し、７例のＲＰＬ対象は、ＨＰ群と類似の値を有しており（０．１０±０．０８）、ｐＤＣの百分率における差は何ら観察されなかった（ＲＰＬ群における０．１１３±０．０９対ＨＰ群における０．１１６±０．０３）。在胎期間は、ＨＰ群においてｐＤＣの値もｍＤＣの値も変化しなかった。ＰＩＦ結合細胞は、ＲＰＬ群におけるｐＤＣ及びｍＤＣにおいて等しく減少した（ｐＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４１．２±１９．２対ＨＰ群における５８．２±１８．３、ｐ＝０．０３８１；ｍＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４６．１±１４．２対ＨＰ群における５７．９±９．１；ｐ＝０．０２９）。個々のＲＰＬ対象に存在するｍＤＣのレベルとｍＤＣ ＰＩＦ＋の％との関連性はなかった。 ＣＤ１４＋細胞に対する結合が対照と比較して増幅したことを示す。細胞を活性化した時に差は観察されなかった。ＰＨＡの存在下での他の系列に対する結合を対照と比較して検査した場合、ＣＤ４に対する結合もＣＤ８に対する結合も低下したのに対し、ＣＤ１９に対する結合における差は確認されなかった。 所与のサイトカインを発現する対象のリンパ球の百分率に及ぼすＰＩＦの効果を検査し、本結果を健常対照の結果と比較した実験を示す。本実験は、ＰＩＦ単独を用いてかつＰＨＡによる活性化後に実施した。本データは、ＰＩＦをＰＩＦｓｃｒ対照と比較したＩＬ１０、ＩＬ４、及びＴＮＦαのレベルを検査する、対照対象における２４〜９６時間の実験を示す。ＩＬ１０＋細胞の数は、対照と比較して有意に増加した。この増加に次いで、１μｇ／ｍＬのＰＨＡへの曝露の９６時間後に基線への回復が続いた。サイトカイン比を、対照と比較し、３０ｎＭのＰＩＦは、炎症促進性／抗炎症性比（ＴＮＦ／ＩＬ１０／ＩＬ４）の低下をもたらした。加えて、これらのサイトカインに及ぼす０〜４μｇ／ｍＬのＰＨＡの効果を検査すると、用量依存性応答が確認され、ここで、対照と比較したＰＩＦの最大効果が４μｇ／ｍＬにおいて確認された。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 所与のサイトカインを発現する対象のリンパ球の百分率に及ぼすＰＩＦの効果を検査し、本結果を健常対照の結果と比較した実験を示す。本実験は、ＰＩＦ単独を用いてかつＰＨＡによる活性化後に実施した。本データは、ＰＩＦをＰＩＦｓｃｒ対照と比較したＩＬ１０、ＩＬ４、及びＴＮＦαのレベルを検査する、対照対象における２４〜９６時間の実験を示す。ＩＬ１０＋細胞の数は、対照と比較して有意に増加した。この増加に次いで、１μｇ／ｍＬのＰＨＡへの曝露の９６時間後に基線への回復が続いた。サイトカイン比を、対照と比較し、３０ｎＭのＰＩＦは、炎症促進性／抗炎症性比（ＴＮＦ／ＩＬ１０／ＩＬ４）の低下をもたらした。加えて、これらのサイトカインに及ぼす０〜４μｇ／ｍＬのＰＨＡの効果を検査すると、用量依存性応答が確認され、ここで、対照と比較したＰＩＦの最大効果は４μｇ／ｍＬにおいて確認された。 図４−１の続きである。 図４−１の続きである。 所与のサイトカインを発現する対象のリンパ球の百分率に及ぼすＰＩＦの効果を検査し、本結果を健常対照の結果と比較した実験を示す。本実験は、ＰＩＦ単独を用いてかつＰＨＡによる活性化後に実施した。本データは、ＰＩＦをＰＩＦｓｃｒ対照と比較したＩＬ１０、ＩＬ４、及びＴＮＦαのレベルを検査する、対照対象における２４〜９６時間の実験を示す。ＩＬ１０＋細胞の数は、対照と比較して有意に増加した。この増加に次いで、１μｇ／ｍＬのＰＨＡへの曝露の９６時間後に基線への回復が続いた。サイトカイン比を、対照と比較し、３０ｎＭのＰＩＦは、炎症促進性／抗炎症性比（ＴＮＦ／ＩＬ１０／ＩＬ４）の低下をもたらした。加えて、これらのサイトカインに及ぼす０〜４μｇ／ｍＬのＰＨＡの効果を検査すると、用量依存性応答が確認され、ここで、対照と比較したＰＩＦの最大効果は４μｇ／ｍＬにおいて確認された。 図５−１の続きである。 ＲＰＬ対象の健常対照対象に対する比較を示す。本データは、いくつかのサイトカインの主要な変化を示した。ＰＨＡの存在下で、ＴＮＦα／ＩＬ１０比は、ＲＰＬ対象及び対照対象の両方において低下した。対照的に、ＰＩＦの存在下で、ＴＮＦα／ＩＬ１０比は、ＲＰＬ対象において上昇したが、対照対象では低下した。ＩＮＦγ基線発現は、ＲＰＬ対象においてより高く、ＰＨＡはさらに、ＲＰＬ対象においてＩＮＦγ基線発現を亢進させたのに対し、対照対象においては４倍亢進が確認された。しかしながら、ＰＩＦの存在下では、ＩＮＦγ基線発現は、ＲＰＬ対象においてほぼ３倍低下した。ＲＰＬ対象において、基線ＩＬ４は高く、ＰＨＡによって影響されることはなかったが、ＰＩＦによって減少した。対照対象において、基線ＩＬ４は低く、ＰＨＡはＩＬ４を４倍増加させたが、ＰＩＦは、ＩＬ４を同量だけ減少させた。ＩＮＦｇ／ＩＬ４比は、同様に挙動した。 ＰＩＦが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に直接的に作用することを示す。ＰＩＦと粗面ＬＰＳ（Ｒａ ＬＰＳ）または滑面ＬＰＳ（Ｏ５５：Ｂ５ ＬＰＳ）との相互作用能を、頑強かつ感受性のある表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を介して評価した。その後、この２つのＬＰＳ分子は、５、２５及び１００μＭ濃度において、ＰＩＦ結合センサーを通過した。本データは、検査した全濃度において、観察可能なＬＰＳ（リガンド）及びＰＩＦ−センサー相互作用を何ら示さなかった。 ＰＩＦが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に直接的に作用することを示す。ＰＩＦと粗面ＬＰＳ（Ｒａ ＬＰＳ）または滑面ＬＰＳ（Ｏ５５：Ｂ５ ＬＰＳ）との相互作用能を、頑強かつ感受性のある表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を介して評価した。その後、この２つのＬＰＳ分子は、５、２５及び１００μＭ濃度において、ＰＩＦ結合センサーを通過した。本データは、検査した全濃度において、観察可能なＬＰＳ（リガンド）及びＰＩＦ−センサー相互作用を何ら示さなかった。 図８Ａは、ＳＰＲ系分析を示す。ＳＰＲ系分析は、高濃度で検査した場合でさえ、ＰＩＦがその受容体自体もその下流の仲介因子ＴＬＲ４−ＭＤ２も標的としないことを示した。この相互作用の欠如をさらに確認するために、ＴＬＲ４−ＭＤ２表面も構築して、図８Ｂに示すように、高濃度（０．５ｍＭ）のＰＩＦへ曝露した。 図８Ａの続きである。 ＣＤへ結合するＰＩＦが用量依存的であることを示す。 図９Ａ−１の続きである。 ＣＤへ結合するＰＩＦが用量依存的であることを示す。 ＰＩＦがＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞を特異的に標的とすることを示す。 図９Ｃ−１の続きである。 図９Ｃ−１の続きである。 ＣＤ３に対するＰＩＦの結合特異性を文書化するためのアイソタイプ対照を示す。 図９Ｄ−１の続きである。 ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合は特異的であり、対照として機能したスクランブル型ＰＩＦ（ＰＩＦｓｃｒ）によって再現されないことを示す。 ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合が用量依存的であり、当該結合が、最低限の結合を有していることが公知のスクランブル型ＰＩＦと比較して、高いペプチド用量で増幅することを実証する。アイソタイプ対照の使用はフローサイトメトリー実験の妥当性を実証した。そのようなデータは、ＰＩＦが調節性Ｔ細胞を特異的に結合することを示す。 ＣＤ１４＋細胞の抽出特性を示す。赤色（上部）の線は、総可溶化液特性であるのに対し、青色（下部）の線は、濾液、すなわち、ＰＩＦカラムへ結合した、数が非常により少ないタンパク質である。この数の減少は、予期通りであり、特異的なＰＩＦ−タンパク質間相互作用を示した。 インビボで培養したＰＩＦがヒト免疫系を標的とすることを実証する。ＰＩＦが未処置のマウスにおける免疫系を標的とするかどうかを判定するために、ＦＩＴＣ−ＰＩＦを静脈内（ＩＶ）または腹腔内(ＩＰ)注射した後、それぞれ５分後及び３０分後に屠殺した。体内のＰＩＦの全体的な分布を、撮像を通じて分析した。データは、標識したＰＩＦの５分以内の多量の取り込みが脾臓及び骨髄内に確認されたことを明らかにした。標識したペプチドの多量の蓄積が腎臓において観察され、迅速なクリアランスを反映した。ＩＰ注射後に、この取り込み及びクリアランスは、予期した通り、ＩＶ投与後よりも緩徐であった。このことは、腎臓がＰＩＦクリアランスの腫瘍部位であることを示す。 インビボで培養したＰＩＦがヒト免疫系を標的とすることを実証する。ＰＩＦが未処置のマウスにおける免疫系を標的とするかどうかを判定するために、ＦＩＴＣ−ＰＩＦを静脈内（ＩＶ）または腹腔内(ＩＰ)注射した後、それぞれ５分後及び３０分後に屠殺した。体内のＰＩＦの全体的な分布を、撮像を通じて分析した。データは、標識したＰＩＦの５分以内の多量の取り込みが脾臓及び骨髄内に確認されたことを明らかにした。標識したペプチドの多量の蓄積が腎臓において観察され、迅速なクリアランスを反映した。ＩＰ注射後に、この取り込み及びクリアランスは、予期した通り、ＩＶ投与後よりも緩徐であった。このことは、腎臓がＰＩＦクリアランスの腫瘍部位であることを示す。 ＰＩＦがインビボでの免疫系を直接的に標的とすることを更に確認する。本発明者らは、未処置のマウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞抗原受容体シグナル伝達の調節因子である、循環ＣＤ４５＋細胞とのＦＩＴＣ−ＰＩＦ相互作用を検査した。２色フローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、単離した循環マウス白血球とともにインキュベートしたＦＩＴＣ−ｓＰＩＦが、１２．５〜５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＰＩＦへ曝露した場合、当該細胞の最多２５％と結合し、検査したペプチド濃度間で差は認められず、それぞれ２３〜２５％であることを発見した。このことは、未処置のマウスにおいて、免疫が賦活化された場合に観察されるものと対照的に、ＰＩＦ標的が限定されることを示す。 ＰＩＦがインビボでの免疫系を直接的に標的とすることを更に確認する。本発明者らは、未処置のマウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞抗原受容体シグナル伝達の調節因子である、循環ＣＤ４５＋細胞とのＦＩＴＣ−ＰＩＦ相互作用を検査した。２色フローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、単離した循環マウス白血球とともにインキュベートしたＦＩＴＣ−ｓＰＩＦが、１２．５〜５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＰＩＦへ曝露した場合、当該細胞の最多２５％と結合し、検査したペプチド濃度間で差は認められず、それぞれ２３〜２５％であることを発見した。このことは、未処置のマウスにおいて、免疫が賦活化された場合に観察されるものと対照的に、ＰＩＦ標的が限定されることを示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合を示す。 図１２Ｄ−１の続きである。 バイオインフォマティクス分析を用いて、１４−３−３シータに対するＰＩＦの結合を示す。このようなデータは、ＰＩＦが、特異的な結合部位においてこのクラスのタンパク質との直接的な相互作用を通じて、当該タンパク質へ結合することを確認する。この結合は、１４−３−３がコ・リガンド２ＢＴＰと相互作用する箇所で生じる。 図１３−１の続きである。 図１３−１の続きである。 ＣＤ３＋細胞及びＣＤ４５＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合が、健常な血清へのＰＢＭＣの前曝露によって影響されないことを示す。 図１４Ａ−１の続きである。 図１４Ａ−１の続きである。 ＣＤ３＋細胞及びＣＤ４５＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合が、健常な血清へのＰＢＭＣの前曝露によって影響されないことを示す。 図１４Ｂ−１の続きである。 図１４Ｂ−１の続きである。 対照的に、子宮内膜症患者の血清への曝露後に、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合が低下することを示す。フローサイトメトリーデータはまた、平坦化したパターンを示す。 図１４Ｃ−１の続きである。 図１４Ｃ−１の続きである。 対照的に、子宮内膜症患者の血清への曝露後に、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合が低下することを示す。フローサイトメトリーデータはまた、平坦化したパターンを示す。 図１４Ｄ−１の続きである。 図１４Ｄ−１の続きである。 タンパク質標的群をより良好に定義し、観察されたタンパク質の異なる群を連関する中心的なタンパク質を識別するために実施したクラスター分析の結果を示す。先導する相互作用因子は、ビメンチン、カルモジュリン、ＳＥＴ−核癌遺伝子（アポトーシス阻害薬）及びミオシン９（ＭＹＨ９）とした。この分析は、４つの主要なタンパク質群、すなわちＰＤＩ／ＨＳＰ、ビメンチン／１４−３−３、免疫活性化、及び細胞骨格に関与するタンパク質を識別した。 ＴＬＲ４効果の伝達に関与するタンパク質を識別するために検査したＣＤ１４＋細胞において識別したＰＩＦ標的の分析を示す。本データは、ＴＬＲ４作用に対して有意なＰＩＦによって標的化される３つの主要なタンパク質、すなわちミオシン９、免疫賦活化に関与するチモシンａ１、及び１４−３−３エータを示した。 表１５と関連して実施したクラスター分析を示す。 表１５と関連して実施したクラスター分析を示す。 ＰＢＭＣにおけるＮＦＡＴ発現に及ぼすＰＩＦの効果を示す。ここに示すデータは、ＰＩＦが、同時活性化したＰＢＭＣにおいてＣＤ４賦活化した細胞を減少させることを示す。データ及びウェスタンブロット分析を示す。 ＰＢＭＣにおけるＮＦＡＴ発現に及ぼすＰＩＦの効果を示す。ここに示すデータは、ＰＩＦが、同時活性化したＰＢＭＣにおいてＣＤ４賦活化した細胞を減少させることを示す。データ及びウェスタンブロット分析を示す。 妊娠していない雌馬（雌のウマ）のものと比較した、受精１２日後の妊娠雌におけるＰＩＦの検出を示す。 妊娠した及び妊娠していない両方の雌馬における雌馬免疫細胞集団に対して結合するＦＩＴＣ標識したＰＩＦを示す。単球に対する結合は、両方の集団において有意である。 受胎時からのマウスへのＰＩＦ投与のプロトコルを示す。自然妊娠中断及びＬＰＳ誘発性妊娠中断に及ぼすＰＩＦの効果を示す。正常マウス及びＬＰＳ曝露した妊娠マウスの両方における胎児の発達に関するＰＩＦの促進も示す。 図２１−１の続きである。
いくつかの実施形態において、「着床前因子」及び「ＰＩＦ」という用語は、移植前のヒト胚によって分泌される１５アミノ酸ペプチドであるＰＩＦ−１（１５）を指す。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、生存可能な胚によってのみ分泌される。ＰＩＦは、胎児及び胎盤によって分泌され、母体循環において検出することができ、母体循環中のＰＩＦの存在は、生児出生と有意に相関する。ＰＩＦは、脱落膜に作用して、局所免疫を調節し、胚−脱落膜接着を亢進し、アポトーシスを制御することによって、着床を促進する上で必須の役割を担っている。着床及び栄養膜侵襲を促進することを越えて、ＰＩＦは、胚に及ぼす自家栄養保護効果も有し、発達を促進し、再発性妊娠中断（ＲＰＬ）の病歴のある患者に由来する血清の毒性を打ち消す。加えて、ＰＩＦは、糖尿病の若齢マウスモデルにおける免疫調節効果を示し、ここで、ＰＩＦは、全身のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインを調節し、糖尿病発症を長期間予防する。自己免疫性脳炎モデルにおいて、ＰＩＦは、重症麻痺を逆転させ、神経炎症促進性Ｔｈ１型遺伝子及びタンパク質を下方調節し、活性化型脾細胞に及ぼす直接的な作用を通じてＩＬ６及びＩＬ１７の分泌を阻害する。有効な胚−母体相互作用に対する決定的な要素は、免疫抑制のない免疫寛容の発達である。ＰＩＦは、自己免疫障害、移植、及び逆転した脳損傷の前臨床モデルにおいて実証されるように、活性化された全身免疫に及ぼす頑強な効果を有しながら最低限の効果を発揮するよう、全身の免疫を調節する。
いくつかの実施形態において、「着床前因子」または「ＰＩＦ」は、合成ＰＩＦ−１とも呼ばれ得、これは、天然のペプチドの効果を複製し、活性化された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖及びサイトカインの分泌に及ぼす強力な免疫調節効果を発揮し、ＰＢＭＣ上の新規の部位を通じて作用し、公知の免疫抑制薬とは異なる効果を有する。いくつかの実施形態において、「着床前因子」または「ＰＩＦ」は、何らかのこのようなアミノ酸に対して約７５、８０、８１、８２、８３、８４ ８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％相同である、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９から選択されるアミノ酸、その模倣体、及びこれらの組み合わせを指す。
妊娠中、母系の免疫系は、父系遺伝子によってコードされる胎児同種抗原を許容しなければならない。妊娠部位は、免疫抑制性環境によって支配される。いくつかの許容機序は、胎児−母体インターフェイスで動作する、すなわち、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用による脱落膜へと循環する免疫細胞におけるアポトーシスの、免疫調節効果を伴う妊娠特異的ホルモンの分泌、補体タンパク質の存在、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ−Ｇ及びＨＬＡ−Ｅ）によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の阻害、Ｔ細胞活性の阻害、及びインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）による調節性Ｔ細胞増殖の誘導として説明されている。
樹状細胞（ＤＣ）は、ほぼすべての末梢組織において、ならびに一次性及び二次性リンパ器官において認められる抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣの機能は、末梢において抗原性材料を収集して、それをリンパ節へ輸送することであり、ここで、リンパ節は、未処置のＴリンパ球によって走査される。ＤＣのサブセット、抗原のタイプ、及び微小環境に応じて、ＤＣは、免疫を活性化することができ、または免疫寛容を誘導することができる。
免疫寛容原性ＤＣは、免疫寛容に関与する。免疫寛容原性ＤＣは、ＤＣの機能的状態を表し、Ｔ細胞活性化を阻害して調節性Ｔ細胞の発達及び増殖を誘導及び促進する能力によって定義される。ＰＩＦは、末梢血単球からの免疫寛容原性ＤＣの発生における役割を担い得る。未処置のＣＤ１４単球は、ＰＩＦの一次標的である。
胎児−母体インターフェイスにおけるＤＣは、妊娠中の免疫ホメオスタシスの維持に関与する。ＤＣ活性化の状態は、胎児−母体の免疫学的平衡に影響する鍵となる担い手として明らかとなった。その上、マウス脱落膜におけるＤＣの機能及び表現型は、胎児−母体インターフェイスに存在するパラクリン仲介因子の効果によって制御される。胎児は、循環母系ＤＣの表現型及び機能の調節も誘導し得る。末梢ＤＣは、胸腺へと再循環し得、獲得した胸腺寛容の誘導に寄与する。
正常ヒト妊娠における末梢血ＤＣは、ＨＬＡ−ＤＲ分子の同時発生の上方調節なしで、同時刺激分子及び成熟化マーカーの上方調節を特徴とする不完全活性化の状態で認められた。単球由来のＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲ上方調節の阻害は、妊娠した雌性動物由来の血清によって維持される。可溶性循環因子は、ＤＣの状態の調節に寄与し得ることが可能である。
末梢血骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞の百分率及び比は、妊娠していない女性よりも妊娠した女性において低い。この差は、免疫刺激性ｍＤＣのレベル低下が、母親と胎児の間の免疫学的不均衡または免疫寛容の一時的な逆転に関与することを示し得る。
調節性Ｔ細胞は、免疫応答において重要な役割を担っている。調節性Ｔ細胞は、妊娠の母性認識に重要とみなされ、免疫障害を制御する上での重要な要素とみられている。ＰＩＦは、この重要な免疫系統を標的にし得、ＰＩＦの調節作用をさらに支持する。免疫系に及ぼすＰＩＦの作用は、直接的であると考えられており、ＣＤ１４、ＣＤ４、及びＣＤ８免疫系統は、同じ、たいていは細胞内にある、タンパク質標的を共有する。ＰＩＦは、その投与後短時間以内で免疫系を直接標的とし、全身免疫と有効に相互作用する。
対象の循環免疫細胞へのＰＩＦペプチドの結合は、正常であろうと、上昇しようと、低下しようと、当該対象の免疫健康についての情報を提供し得、対象のための「免疫フィットネスセンサー」として潜在的に作用し得る。
本組成物及び方法を説明する前に、本開示が、説明する特定の過程、組成物、または方法に限定されないことは理解されるべきである。なぜならそれらは変化し得るからである。本明細書において使用する用語が、特定の版または実施形態のみを説明する目的のためにあり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本開示の範囲を限定するよう意図するものではないことも理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明するものと類似のまたは等価の何らかの方法及び材料が、本開示の実施形態の実施または検査において使用することはできるが、好ましい方法、装置、及び材料をこれから説明する。本明細書に記載の公開物はすべて、それらの内容の全体が参照により組み込まれる。本開示が、先行発明の効力によってこのような開示よりも古いものとして権利を与えられてはいないということを認めることとして、本明細書のいかなるものも解釈されるものではない。
本明細書で及び添付の特許請求の範囲において使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が明確にその他の点で記載しない限り、複数の参照物も含む。したがって、例えば、「ペプチド」に対する参照は、当業者に公知の１つ以上のペプチド及びその等価物などに対する参照等である。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、ともに使用されている数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。それゆえ、約５０％は、４５％〜５５％の範囲で意味する。
「投与すること」は、治療薬とともに使用する場合、標的対象、器官、組織若しくは細胞の中若しくは上へ治療薬を直接投与すること、または治療薬を患者へ投与して、それにより治療薬が標的とする対象、器官、組織または細胞に正の影響を与えることを意味する。したがって、本明細書で使用する場合、「投与すること」という用語は、ＰＩＦとともに使用する場合、ＰＩＦを標的となる対象、器官、組織、または細胞の中または上へ提供すること、ＰＩＦを患者へ、例えば静脈内注射によって全身的に提供し、それにより、治療薬が標的となる器官、組織または細胞へ到達すること、ＰＩＦをそのコード配列の形態で標的組織へ（例えば、いわゆる遺伝子療法技術によって）提供することを含むことができるが、これらに限定しない。「投与すること」は、非経口、経口または局所投与によって、あるいは他の公知の技術と組み合わせたこのような方法によって達成され得る。
「類似体」という用語は、天然の全長のタンパク質と構造上類似しており、かつ当該類似体が元とする天然の全長タンパク質の少なくとも１つの生化学的活性または生物活性を共有する任意のペプチド模倣体、機能的断片、突然変異体、塩、医薬として許容され得る塩、多形、または非天然ペプチドを指す。いくつかの実施形態において、「類似体」という用語は、少なくとも１つのαアミノ酸及び少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含む任意のポリペプチドを指し、ここで、当該ポリペプチドは、当該類似体が元とする天然の全長タンパク質の少なくとも１つの生化学的活性または生物活性を共有する。例えば、ＰＩＦの場合、ＰＩＦ類似体は、野生型ＰＩＦと７０％以上相同であり得、野生型ＰＩＦの少なくとも１つの結合特性を共有し得る。ＰＩＦは、複数の受容体へ結合することが公知である。それゆえ、いくつかの実施形態において、類似体は、野生型ＰＩＦと構造上類似しているが天然のＰＩＦが結合する天然のリガンドのうちの１つへのみ結合するＰＩＦペプチド模倣体、機能的断片、突然変異体、バリアント、塩、多形、または非天然ペプチドを指す。
本明細書で使用する「動物」または「患者」または「対象」という用語には、野生動物、家畜及び牧畜のようなヒト及び非ヒト脊椎動物を含むが、これらに限定しない。いくつかの実施形態において、「動物」または「患者」または「対象」という用語はヒトを指す。いくつかの実施形態において、対象はウマであり得る。いくつかの実施形態において、対象はマウスであり得る。いくつかの実施形態において、対象は、単離した細胞試料の源として機能する哺乳類動物であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、細胞試料が単離または提供される非ヒト動物であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、細胞試料が単離または提供される哺乳類動物であり得る。「哺乳類動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ヤギ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定しない。
「免疫調節（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」または「免疫調節（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」は、本開示の化合物が免疫系の１つ以上の態様を変化させる（調節する）能力を指す。免疫系は、生体を感染から、ならびに複数の細胞間相互作用によってならびにサイトカイン、ケモカイン、リンホカイン及び抗体を含む、免疫細胞に対して自己分泌効果、パラクリン効果、及び内分泌効果を及ぼす可溶性因子を産生することによって互いに調節するリンパ球、マクロファージ、及び他の抗原提示細胞を包含する細胞機序及び体液機序による外来抗原から防護するよう機能する。
「アレイ」は、当該用語が本明細書で使用される場合、典型的には、たがいに関して空間的に離れた位置における、通常は、可能性のある相互作用パートナー（例えば、細胞）または他の試薬、基質などへの、配置された実体（例えば、ＰＩＦまたはＰＩＦ類似体）の同時曝露を可能にするフォーマットにおける実体の配置を指す。いくつかの実施形態において、アレイは、固体支持体上の空間的に離れた位置に配置された実体を含む。いくつかの実施形態において、アレイ上の空間的に離れた位置は（その形状とは無関係に）、「スポット」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、アレイ上の空間的に離れた位置は、互いに関して規則正しいパターンで（例えば、格子において）配置される。
「改善する」という用語は、本開示が、提供、適用または投与中の対象、器官、組織または細胞の様相、形態、特徴及び／または物理的属性のいずれかを変化させることを伝えるために使用する。例えば、基準と比較した形態の変化は、循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の減少、循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の増加、循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の変化がないこと、ＤＣに対するＰＩＦの結合の減少、ＤＣに対するＰＩＦの結合の増加、またはＤＣに対するＰＩＦの結合の変化がないことのうちのいずれか単独によってまたは組み合わせで示され得る。
「阻害すること」という用語には、症状の発症を予防し、症状を緩和し、または疾患、容態若しくは障害を排除するための、本開示の化合物の投与を含む。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互交換可能に使用し、アミド結合または非アミド等価物によって共有結合した２個以上のアミノ酸を指す。本開示のペプチドは、任意の長さであることができる。例えば、当該ペプチドは、長さ５〜１２、１２〜１５、１５〜１８、１８〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、またはそれより長いなど、約２〜約１００以上の残基を有することができる。好ましくは、ペプチドは約２〜約１８残基である。本開示のペプチドには、ｌ型異性体、ｄ型異性体、ならびにｌ型異性体及びｄ型異性体の組み合わせを含む。当該ペプチドには、タンパク質の翻訳後プロセシングと典型的に関係した修飾、例えば、環化（例えば、ジスルフィド結合またはアミド結合）、リン酸化、グリコシル化、カルボキシル化、ユビキチン化、ミリスチル化、または脂質修飾を含むことができる。
「医薬として許容され得る」によって、担体、希釈剤または賦形剤が製剤または組成物の他の成分と適合性がなければならずかつ当該担体、希釈剤または賦形剤の受け手に対して有害であってはならないことが意味される。
本明細書で使用する場合、「治療薬」という用語は、患者の望ましくない容態または疾患を治療、根絶、緩解、予防または改善するために利用する薬剤を意味する。一部において、本開示の実施形態は、ＲＰＬに関する対象の病歴またはＲＰＬに対する素因を説明し得る免疫調節不全を含む、免疫調節不全についてのマーカーとして対象の循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の検査方法に関する。
組成物の「治療有効量」または「有効量」は、所望の効果を達成するために、すなわち、対象の循環免疫細胞との正常なまたは異常な結合を実証するために算出された事前に決めておいた量である。本方法によって企図される活性には、医学的治療薬及び／または診断用試薬適用の両方を含む。治療効果及び／または予防効果を得るために本開示により投与する化合物の具体的な用量はもちろん、例えば、投与する化合物、投与経路、及び検査中の容態を含む、症例を取り囲む特定の状況によって決定されるであろう。本化合物は、広範な薬用量範囲にわたって有効であり、例えば、投与する薬用量は通常、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内に、より通常には０．１〜３ｍｇ／ｋｇの範囲に収まるであろう。しかしながら、投与する有効量は、検査する容態、投与する化合物の選択、及び選択する投与経路を含む関連状況の点で、医師または科学者によって判断されるであろうし、それゆえ、上述の薬用量範囲は、いかなる方法においても、本開示の範囲を制限するよう意図するものではないことが理解されるであろう。本開示の複数の実施形態の治療有効量の化合物は典型的には、生理学的に許容される賦形剤組成物で投与する場合、有効な全身濃度または組織中の局所濃度に到達するのに十分であるような量である。診断試薬の目的のために、有効量とは、試料または試料の構成要素へ結合するのに十分な化合物（生体外で固定されているまたは溶液中にある場合、ＰＩＦまたはその類似体など）の量である。いくつかの実施形態において、試料の構成要素は、１つの細胞または複数の細胞であり得る。
概して、「試料」という用語は、本明細書で説明するように、関心対象の源から得られるまたは当該源に由来する生体試料を指す。いくつかの実施形態において、関心対象の源は、動物またはヒトのような生体を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、生体組織または生体液を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、骨髄、血液、血球、腹水、組織または微小針生検、細胞含有体液、遊離浮遊核酸、痰、唾液、尿、脳脊髄液、腹腔水、胸水、糞便、リンパ液、婦人科系流体、皮膚スワブ、膣スワブ、口腔スワブ、鼻腔スワブ、乳管洗浄物若しくは気管支肺胞洗浄物などの洗浄物若しくは灌注物、吸引物、掻爬物、組織生検検体、外科的検体、糞便、他の身体流体、分泌物、及び／若しくは排泄物、ならびに／またはこれら由来の細胞などであり得、あるいはそれらを含み得る。いくつかの実施形態において、生体試料は、個体から得た細胞であり、または当該細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は、任意の適切な手段によって関心対象の源から直接得た「一次試料」である。例えばいくつかの実施形態において、一次生体試料は、生検（例えば、微小針吸引物または組織生検またはパンチ生検）、手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の収集物からなる群から選択する方法によって得る。いくつかの実施形態において、文脈から明らかであろうように、「試料」という用語は、一次試料を加工することによって（例えば、一次試料の１つ以上の構成要素を除去することによって及び／または一次試料へ１つ以上の薬剤を添加することによって）得る調製物を指す。例えば、半透膜を用いた濾過である。そのような「加工した試料」は、例えば、試料から抽出した核酸若しくはタンパク質、あるいはｍＲＮＡの増幅または逆転写、ある特定の構成要素の単離及び／または精製などのような技術へ一次試料を提供することによって得た核酸またはタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、試料は、対象から得た何らかの流体、細胞、組織、または収集物あるいはこれらの組み合わせである。試料は、研究目的、診断目的、治療目的、またはその他の目的のために得ることがある。本明細書に開示する方法のうちのいずれも、１つまたは複数の試料をＰＩＦペプチドまたはその類似体へ試料を曝露するステップの前に、試料を得るまたは単離するステップを含み得る。試料には、例えば、血液、血液成分、血漿、細胞、組織、毛髪、皮膚、尿、または糞便の試料を含むがこれらに限定しない。試料は、静脈穿刺、生検、流体収集、頬側スワブ、指穿刺、またはその他の手段のような方法によって得られ得る。いくつかの実施形態において、試料は、妊娠した雌性に由来し、妊娠していない雌性から採取した類似のまたは同じタイプの試料と比較される。いくつかの実施形態において、試料は、ヒトまたは他の哺乳類動物（ウシまたはウマなど）から採取する。いくつかの実施形態において、試料は、胎盤細胞、子宮内膜細胞、脾細胞、血球、リンパ球または免疫細胞のうちの１つまたは複数を含む。
本明細書で使用する「治療する」、「治療した」、または「治療すること」という用語は、治療処置及び予防手段または防止手段の両方を指し、ここで、目的は、望ましくない生理学的容態、障害または疾患を予防または遅延させること（弱化させること）、あるいは有益なまたは所望の臨床結果を得ることである。本開示の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、症状の緩解、容態、障害または疾患の程度の減弱、容態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、容態、障害または疾患の発症の遅延または進行の遅延、容態、障害または疾患の状態の緩解、及び寛解（部分的であろうと全体的であろうと）を、検出可能であろうと検出不可能であろうと、または容態、障害若しくは疾患の亢進若しくは改善を含むが、これらに限定しない。治療には、過剰なレベルの副作用を有さない臨床的に有意な応答を惹起することを含む。治療には、治療を受けていない場合に期待される生存と比較して生存を長期化することも含む。
本明細書で使用する場合、「十分な」及び「生じるのに十分な」という用語は概して、公知の転帰をもたらすのに適切な現象、条件、治療、または介入を説明する。「子宮内膜症を発症するのに十分な」という用語は、子宮内膜症と相関する免疫機能障害のレベルを意味する。「ＲＰＬを発症するのに十分な」という用語は、再発性妊娠中断（ＲＰＬ）と相関する免疫機能障害のレベルを意味する。「免疫機能障害を発症するのに十分な」という用語は、免疫機能障害を発症するのに十分な免疫低下のレベルを意味する。
本明細書で使用する場合、「結合事象」という用語は、少なくとも２つの異なる分子間での共有結合または非共有結合を指す。いくつかの実施形態において、結合は、受動的な静電性非共有結合を指す。いくつかの実施形態において、結合事象は、特定のリガンドが１つ以上のパートナーと結合する（例えば非共有結合する）緊密度及び／または特定のリガンドが１つ以上のパートナーから解離する速度若しくは頻度の尺度である。当該技術分野で公知のように、種々の技術のうちのいずれかを利用して、結合事象を決定することができる。多くの実施形態において、結合事象は、親和性の尺度を表す。いくつかの実施形態において、結合事象は、細胞とＰＩＦまたはその類似体の間で測定する親和性である。いくつかの実施形態において、細胞がＰＩＦまたはその類似体へ結合する事象は、細胞が他のペプチドへ結合する親和性と比較して表す。いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその類似体に対する細胞の相対的な結合事象は、アッセイするペプチドに対する細胞の結合事象全部の平均と比較した倍数変化として表す。いくつかの実施形態において、結合事象は、相対的な結合親和性である。いくつかの実施形態において、結合親和性は０である。いくつかの実施形態において、相対的な結合親和性は、約０〜約１である。いくつかの実施形態において、相対的な結合親和性は、対照または一連の対照と比較して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの倍数差である。いくつかの実施形態において、相対的な結合親和性は、約０〜約−１である。いくつかの実施形態において、相対的な結合親和性は、対照または一連の対照と比較した約−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０またはそれより多くの倍数差である。
本明細書で使用する場合、「結合特性」という用語は、２つ以上の分子の結合と相関する１つまたは複数の値を表すデータの集積を指す。いくつかの実施形態において、結合特性は、対象由来の試料と関係している。いくつかの実施形態において、「結合特性」という用語は、アミノ酸配列（ＰＩＦまたはその機能的断片など）が、免疫細胞または免疫細胞によって発現されるタンパク質を含む生体分子及び／または細胞へ結合、付着、吸収、または相互作用する１つまたは複数の特徴的な方法を含む１セットのデータを指す。
一般的に言えば、「組織」という用語は、特定の機能の性能において連合した、同様に特化した細胞の何らかの集まりを指す。
本明細書で使用する場合、「免疫細胞」は、免疫応答に関与する免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、マスト細胞、単球、マクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、１つまたは複数のＴＬＲ、ＴＣＲ、またはＢＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞から選択する細胞の集団のうちの１つまたは組み合わせを含む。免疫応答は、後天性または先天性であり得、関与する細胞には、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、マスト細胞、単球、マクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗体、リンパ球、サイトカイン、トール様受容体（ＴＬＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、調節性Ｔ細胞、及び免疫応答に関与し得るその他の細胞を含み得るが、これらに限定しない。
本明細書で使用する場合、「固体支持体」は、分離方法の固定相を指し、アミノ酸配列を固定化することができる非水性マトリックスである。そのような支持体には、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、コロジオン炭（ｃｏｌｌｏｄｉｏｎ ｃｈａｒｃｏａｌ）、ビーズ、砂、及びその他の適切な材料を含む。何らかの適切な方法を使用して、アミノ酸配列を固体支持体へ固定または吸着することができ、固体支持体がリガンドまたは分子へ結合する能力の少なくとも一部を保有することができる。固体支持体は、ディッシュ、プレート、カラム、シリカチップの形態、またはペプチドを表面へ架橋するのに十分な何らかのマトリックス材料を任意に含むその他の適切な形態にあり得る。
本明細書で使用する場合、「機能的断片」という用語は、断片を元とする野生型ポリペプチドと類似のまたは実質的に類似の少なくとも部分的な生体機能を保有するのに十分な長さのアミノ酸配列の何らかの部分を意味する。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスと結合したポリペプチドの機能的断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドに関して７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を含む、及び表４におけるポリペプチドへ結合する１つまたは複数のリガンドへの少なくとも部分的な結合を保有するのに十分な長さを有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示する何らかのポリペプチドの断片であり、約２０以下、約１９以下、約１８以下、約１７以下、約１６以下、約１５以下、約１４以下、約１３以下、約１２以下、約１１以下、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、または約２以下の連続したアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らのポリペプチドの断片であり、約２０以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１９以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１８以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１７以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１６以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１５以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１４以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１３以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１２以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１１以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約１０以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約９以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約８以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約７以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約６以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約５以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約４以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約３以下のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、断片は、表４に開示した何らかのポリペプチドの断片であり、約２以下のアミノ酸の長さを有する。
本明細書で使用する場合、「検査すること」は、１つまたは複数の要素間の特定の物理的特徴の存在または非存在を観察、定量化及び／または検出する作業を意味する。開示した方法の場合、いくつかの実施形態において、検査する作業は、ＰＩＦまたはその機能的断片が分子、アミノ酸配列、及び／または細胞と結合、会合またはそうでなければ相互作用する程度をモニター、観察、及び／または測定することを指す。
本明細書で使用する場合、「分類すること」は、ある群の人間、対象、及び／または実体を、ある特定の容態（複数可）、特徴（複数可）、及び／または物理的特長を用いて割り当てるまたは特徴づけるまたは関連付ける作業を意味する。
本明細書で使用する場合、「曝露すること」は、何かへ開いた要素を配置する作業を意味する。いくつかの実施形態において、曝露することは、環境の中に、及び要素と別の物質、試薬、条件、または刺激との接触を可能にするのに十分な条件下に要素を配置することを指す。いくつかの実施形態において、曝露するという用語は、ＰＩＦまたはその機能的断片を物質、試薬、または条件と接触させ、それにより当該接触が効果を生じることを含む。いくつかの実施形態において、曝露することは、有効量のＰＩＦを対象へ投与することを含む。
本明細書で使用する場合、「比較すること」は、２つの要素間の類似性または相違性を推定、測定、または評価する作業を意味する。本開示のいくつかの実施形態において、比較するステップは、実験、ある群の実験、またはこのような実験に使用するアルゴリズムにおいて適用されるような対照データに対してデータを収集及び／または分析及び／または正規化して、それにより量が測定され及び／または当該量に対応する値が、実験（複数可）の特長、条件、様式、対照または変数へ割り当てられることを含む。いくつかの実施形態において、比較することは、２つ以上のデータ点及び／またはデータ値間の類似性または相違性を観察することを含む。
本明細書で使用する場合、「免疫調節不全」は、対象における免疫学的不均衡を特徴とする疾患または障害または容態を意味する。いくつかの実施形態において、免疫調節不全は、獲得した環境因子（病原体など）及び／または遺伝因子によって生じる対象における免疫学的不均衡を指す。いくつかの実施形態において、免疫調節不全は、対象と比較した異常な免疫細胞機能を指す。いくつかの実施形態において、異常な免疫細胞機能は、抗原特異的免疫応答を生じることのできるＴ細胞の不適切なクローン増殖によって顕著であり得る。いくつかの実施形態において、免疫調節不全は、再発性妊娠中断など、容態を獲得または経験することに対して対象をより許容させ得ることの可能な不適切な生得的免疫系反応を含む。免疫調節不全によって生じ得る疾患には、例えば、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーヴス病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、硬直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、小児脂肪便症性皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ−ｄｅｒｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労症候群性免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、デゴス病（Ｄｅｇｏ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、円板状狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛症性線維筋炎（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ−ｆｉｂｒｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、ギラン・バレー症候群、特発性肺線維症、特発性塞栓血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、尋常性天疱瘡、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、及びウエゲナー肉芽腫症を含み得る。
本出願は、化合物を説明する。いかなる特定の理論によっても結び付けられることなく、本明細書に説明する化合物は、ＰＩＦの１つのまたは複数の受容体を介したＰＩＦ仲介性シグナル伝達のアゴニストとして作用する。したがって、これらの化合物は、ＲＰＬ、子宮内膜症、及び免疫調節不全の、しかしこれらに限定しない、治療において有意な治療上の利点を提供するシグナル伝達経路を調節する。本開示の化合物は非溶媒和化形態及び、水和形態を含む溶媒和化形態で存在し得る。本開示の化合物は、酸付加塩及び／または塩基付加塩を含むがこれらに限定しない、両方の医薬として許容され得る塩を形成することもできる。さらに、本開示の化合物は、無定形形態（非結晶形態）を含む種々の固体状態で、包接化合物、プロドラッグ、多形、生体加水分解可能なエステル、ラセミ混合物、非ラセミ混合物の形態で、または光学的に純粋な鏡像異性体及びジアステレオマーを含むがこれらに限定しない精製された立体異性体として存在し得る。概して、これらの形態はすべて、先に説明し及び本開示の範囲内に包含されるよう企図するように、本化合物の遊離塩基形態または遊離酸形態に対する代替的な形態として使用することができる。
「多形」は、化合物の固体結晶形態を指す。同じ化合物の異なる多形は、異なる物理的、化学的及び／または分光学的特性を呈することができる。異なる物理的特性には、安定性（例えば、熱または光に対する）、圧縮率及び密度（製剤及び製品製造において重要）、ならびに解離速度（生物学的利用率に影響する可能性がある）を含むがこれらに限定しない。多形に関する異なる物理的特性は、多形の加工に影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に開示する組成物のうちのいずれかの少なくとも１つの多形を含む。
先に記載したように、本開示の化合物はとりわけ、医薬として許容され得る塩、エステル、アミドまたはプロドラッグとして投与することができる。「塩」という用語は、本開示の化合物の無機塩及び有機塩を指す。当該塩は、化合物の最終的な単離及び精製の間にインサイツで、あるいは遊離の塩基形態または酸形態における精製した化合物を、適切な有機塩基若しくは無機塩基または有機酸若しくは無機酸と個別に反応させること、及びこのように形成した塩を単離することによってインサイツで調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩、ならびにこれらに類するものを含む。当該塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びこれらに類するもののようなアルカリ金属及びアルカリ土類金属、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、及びこれらに類するものを含むがそれらに限定しない非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンを含んでもよい。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，６６：１〜１９（１９７７）を参照されたい。「塩」という用語は、無機酸及び／または有機酸を用いて形成された酸性塩ならびに無機塩基及び／または有機塩基を用いて形成された塩基性塩を指す。これらの酸及び塩基の例は、当業者に周知である。このような酸付加塩は通常、医薬として許容され得るであろうが、医薬として許容され得ない酸の塩は、本化合物の調製及び精製において有用となることがある。塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩及びベンゼンスルホン酸塩から形成される塩を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはＰＩＦ類似体またはＰＩＦ突然変異体のいずれかを含む組成物の塩は、遊離塩基、またはその塩、鏡像異性体若しくはラセミ化合物を適切な酸の１つ以上の等価物と反応させることによって形成され得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬として許容され得る塩は、少なくとも１つの塩基性基または少なくとも１つの塩基性ラジカルを有する類似体を指す。いくつかの実施形態において、本開示の医薬として許容され得る塩は、酸付加塩を形成する遊離アミノ基、遊離グアニジノ基、ピラジニルラジカル、またはピリジルラジカルを含む。いくつかの実施形態において、本開示の医薬として許容され得る塩は、（例えば）塩酸、硫酸若しくはリン酸のような無機酸を有する、または適切な有機カルボン酸若しくはスルホン酸、例えばカルボン酸若しくはスルホン酸、例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸若しくはシュウ酸のような脂肪族モノ若しくはジカルボン酸、またはアルギニン若しくはリジンのようなアミノ酸、安息香酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸のような芳香族カルボン酸、マンデル酸若しくは桂皮酸のような芳香族−脂肪族カルボン酸、ニコチン酸若しくはイソニコチン酸のようなヘテロ芳香族カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸若しくは２−ヒドロキシエタンスルホン酸のような脂肪族スルホン酸、または芳香族スルホン酸、例えばベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸若しくはナフタレン−２−スルホン酸を有する本化合物の酸付加塩である類似体を指す。いくつかの塩基性基が存在する場合、モノ酸添加塩またはポリ酸添加塩が形成され得る。反応は、真空下でまたは凍結乾燥によって除去され得る、塩が不溶性である溶媒若しくは媒体において、または塩が可溶性である溶媒、例えば、水、ジオキサン、エタノール、テトラヒドロフランまたはジエチルエーテル、あるいは溶媒の混合物において実施され得る。反応は、メタセシス法でもあり得、当該反応は、イオン交換樹脂上で実施され得る。いくつかの実施形態において、塩は、患者によって生理学的に許容される塩であり得る。本開示による塩は、その無水形態において、または水和した結晶形態（すなわち、水の１つ以上の分子と複合体形成したまたは結晶化している）にあるように認められる。いくつかの実施形態において、ＰＩＦの塩は、固体支持体へ固定化され得、または医薬として許容され得る担体中で再懸濁され、本明細書に開示する何らかの方法において使用される溶液中にあり得る。
本開示の化合物の医薬として許容され得るエステルの例としては、Ｃ１〜Ｃ８アルキルエステルが挙げられる。許容され得るエステルには、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキルエステル、及びベンジルのようなアリールアルキルエステルも含む。Ｃ１〜Ｃ４アルキルエステルが通常使用される。本開示の化合物のエステルは、当該技術分野で周知の方法により調製してもよい。本開示の化合物の医薬として許容され得るアミドの例としては、アンモニア、第一級Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミン、及び第二級Ｃ１〜Ｃ８ジアルキルアミンに由来するアミドが挙げられる。第二級アミンの場合、アミンはまた、少なくとも１個の窒素原子を含有する５員または６員のヘテロシクロアルキル基の形態にあってもよい。アンモニア、Ｃ１〜Ｃ３第一級アルキルアミン及びＣ１〜Ｃ２ジアルキル第二級アミンに由来するアミドが通常使用される。本開示の化合物のアミドは、当業者に周知の方法により調製してもよい。
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換は、以下の表１〜表３に示すように定義し得る。本開示のＰＩＦ化合物には、保存的置換（核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかに由来）が、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入されたＰＩＦ化合物を含む。アミノ酸は、物理的特性ならびに二次及び三次タンパク質構造に対する寄与により分類することができる。保存的置換は、あるアミノ酸から、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として、当該技術分野で認識されている。いくつかの実施形態において、保存的置換は、ある核酸から、類似の特性を有する、またはコードする場合、類似の結合親和性を有する別の核酸への置換として、当該技術分野で認識されている。例示的な保存的置換を、表１に示す。
Figure 2017535794
代替的に、保存的アミノ酸は、表２に示すようにＬｅｈｎｉｎｇｅｒ，（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク州ニューヨーク市（１９７５），７１〜７７頁)に説明されるように群分けすることができる。
Figure 2017535794
代替的に、例示的な保存的置換を、表３に示す。
Figure 2017535794
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互交換可能に使用し、アミド結合または非アミド等価物によって共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。本開示のペプチドは、任意の長さであることができる。例えば、本ペプチドは、長さ５〜１２、１２〜１５、１５〜１８、１８〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、またはそれより長いなどの約２〜約１００以上の残基を有することができる。好ましくは、ペプチドは、長さ約２〜約１８残基である。本開示のペプチドには、ｌ型及びｄ型異性体、ならびにｌ型及びｄ型異性体の組み合わせも含む。本ペプチドには、タンパク質の翻訳後プロセシングと典型的に関係する修飾、例えば、環化（例えば、ジスルフィド結合またはアミド結合）、リン酸化、グリコシル化、カルボン酸化、ユビキチン化、ミリスチル化、または脂質修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、本開示の組成物または医薬組成物は、表４に示すＰＩＦ配列のうちの任意の１つまたは組み合わせと約７０％以上、約７５％以上、約７９％以上、約８０％以上、約８５％以上、約８６％以上、約８７％以上、約９０％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％の相同性を共有する、表４に示す任意のＰＩＦ配列の類似体に関する。いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはＰＩＦペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９から選択するアミノ酸配列、これらの模倣体、または任意のこのようなアミノ酸配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的なこれらの機能的断片を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、配列番号２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的な配列を含む、当該配列から本質的になる、または当該配列からなる、アミノ酸配列を指し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦ突然変異体は、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰＳＤ、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰＳ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮ、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡ、ＸＶＺＩＫＰＧＳ、ＸＶＺＩＫＰＧ、ＸＶＺＩＫＰ、ＸＶＺＩＫ、ＸＶＺＩ、ＸＶＺから選択される配列を含み、式中、Ｘは、非天然アミノ酸または天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ＰＩＦ突然変異体は、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰＳＤ、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰＳ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫＰ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮＫ ＸＶＺＩＫＰＧＳＡＮ、ＸＶＺＩＫＰＧＳＡ、ＸＶＺＩＫＰＧＳ、ＸＶＺＩＫＰＧ、ＸＶＺＩＫＰ、ＸＶＺＩＫ、ＸＶＺＩ、ＸＶＺから選択される配列を含み、式中、Ｘは、非天然アミノ酸または天然アミノ酸であるが、例外は、Ｚがアルギニンの場合、Ｘはメチオニンではなく、及びＸがメチオニンの場合、Ｚはアルギニンではないことである。いくつかの実施形態において、ＰＩＦの類似体または突然変異体は、合成でありまたは合成的に作製される。
本明細書に開示するペプチドにはさらに、アミノ酸の構造的及び機能的類似体を有する化合物、例えば、合成または非天然のアミノ酸（ノルロイシンなど）またはアミノ酸類似体または非天然側鎖を有するペプチド模倣体を、当該模倣体が、本開示の化合物の１つ以上の機能または活性を共有する限り、含む。本開示の化合物にはそれゆえ、「模倣体」形態及び「ペプチド模倣体」形態を含む。本明細書で使用する場合、「非天然側鎖」は、複数のアミノ酸からなるポリペプチド鎖の主鎖を形成しないα炭素原子、β炭素原子、またはγ炭素原子に対する共有結合によって結合した原子の修飾されたまたは合成の鎖である。ペプチド類似体は、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、Ｈｅ、７−アザトリプトファン、４−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−アラニン、サルコシン、Ｎ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−フェニルグリシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−７−アザトリプトファン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−４−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−トレオニン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−リジン、ホモシステイン、及びＴｙｒから選択する非天然アミノ酸のうちの１つまたは組み合わせを含み得、Ｘａａ２は非存在であり、またはＡｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−メチル−アラニン、Ｇｌｕ、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、サルコシン、ノルロイシン、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｇｉｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｎ−メチル−セリン、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｎ−メチル−トレオニン、Ｄ−Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｅｕ、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎ−メチル−バリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、Ｄ−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｎ−メチル−チロシン、１−アミノシクロプロパンカルボン酸、１−アミノシクロブタンカルボン酸、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、４−アミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−カルボン酸、アミノイソ酪酸、（５）−２−アミノ−３−（ｌＨ−テトラゾール−５−イル）プロパン酸、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−グルタミン酸、２−アミノペンタン酸、２−アミノヘキサン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノオクタン酸、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、２−アミノウンデカン酸、２−アミノドデカン酸、オクチルグリシン、トラネキサム酸、アミノ吉草酸、及び２−（２−アミノエトキシ）酢酸からなる群から選択するアミノ酸である。アラニンの天然側鎖またはＲ基は、メチル基である。いくつかの実施形態において、本組成物の非天然側鎖は、水素原子のうちの１つ以上が重水素原子によって置き換えられたメチル基である。非天然側鎖は、以下の公開物、すなわち、ＷＯ／２０１３／１７２９５４、ＷＯ２０１３１２３２６７、ＷＯ／２０１４／０７１２４１、ＷＯ／２０１４／１３８４２９、ＷＯ／２０１３／０５０６１５、ＷＯ／２０１３／０５０６１６、ＷＯ／２０１２／１６６５５９、米国出願第２０１５００９４４５７号、Ｍａ，Ｚ.，及びＨａｒｔｍａｎ．Ｍ．Ｃ．（２０１２）．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｖｉａ ｍＲＮＡ Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｉｎ Ｊ．Ａ．Ｄｏｕｔｈｗａｉｔｃ ＆ Ｒ．Ｈ．Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｅｄｓ．）．Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（３６７〜３９０頁）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて当該技術分野に開示されており、これらはすべて、それらの全体が参照により組み込まれる。
「模倣体」、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」及び「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、本明細書で相互交換可能に使用し、概して、選択した天然ペプチドまたはタンパク質機能ドメイン（例えば、結合モチーフまたは活性部位）の三次結合構造または活性を模倣するペプチド分子、部分ペプチド分子または非ペプチド分子を指す。これらのペプチド模倣体には、組換えでまたは化学的に修飾したペプチド、及び以下にさらに説明するように、小分子薬模倣体のような非ペプチド薬を含む。いくつかの実施形態において、組成物、医薬組成物及びキットは、表４に示すＰＩＦ配列のうちの任意の１つまたは組み合わせと約７０％以上、約７５％以上、約７９％以上、約８０％以上、約８５％以上、約８６％以上、約８７％以上、約９０％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の相同性を共有するペプチドまたはペプチド模倣体または類似体を含み、ここで、１つまたは複数のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基または非天然側鎖を有するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチド模倣体が提供され、ここで、ループが２つのシステイン残基間に形成される。いくつかの実施形態において、ペプチド模倣体は、公知の２０のタンパク新生アミノ酸のうちで認められていないアミノ酸側鎖、当該分子の末端間または内部部分間での環化をもたらすよう使用する非ペプチド系リンカー、メチル基（Ｎ−メチル化）または他のアルキル基によるアミド結合水素部分の置換、ペプチド結合と、化学処理または酵素処理に対して耐性のある化学基または化学結合との置き換え、Ｎ末端及びＣ末端修飾、ならびに非ペプチド性伸長（ポリエチレングリコール、脂質、炭水化物、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド塩基、種々の小分子、またはリン酸基若しくは硫酸基など）との共役のような天然ペプチドに対して多くの類似性を有し得る。本明細書で使用する場合、「環状ペプチド模倣体」または「環状ポリペプチド模倣体」は、その構造の一部としてループ、架橋部分、及び／または内部架橋のような１つ以上の環状特長を有するペプチド模倣体を指す。本明細書で使用する場合、「架橋部分」という用語は、アミノ酸上の原子のうちの１つまたは組み合わせを当該アミノ酸残基の外側にあるその他の原子へ化学的に連結する化学的部分を指す。例えば、アミノ酸三次構造の場合、架橋部分は、あるアミノ酸側鎖を別の連続的なまたは非連続的なアミノ酸側鎖と化学的に連結する化学的部分であり得る。
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチド模倣体が提供され、ここで、ループは、
Figure 2017535794
 からなる群から選択される架橋部分を含む。
式中、各Ｘは独立して、ＮまたはＣＨであり、それにより環は２個を上回るＮを含有せず、各Ｚは独立して結合、ＮＲ、０、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ、ＮＲＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）ｖＮＲ、ＮＲＳ（Ｏ）ｖであり、各ｍは独立して、０、１、２、及び３から選択され、各ｖは独立して、１及び２から選択され、各Ｒは独立して、Ｈ及びＣ１〜Ｃ６から選択され、かつ各架橋部分は、独立して選択されたＣ０〜Ｃ６スペーサーによってペプチドへ結合する。
いくつかの実施形態において、本開示のＰＩＦペプチドは、２０の遺伝的にコードしたアミノ酸（またはＤ型アミノ酸）の１つ以上の天然側鎖を他の側鎖、例えば、アルキル、低級アルキル、環状４員、５員、６員、から７員までのアルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ及びこれらの低級エステル誘導体と、ならびに４員、５員、６員、から７員までの複素環と置き換えることによってペプチド模倣体を生じるよう修飾される。例えば、プロリン類似体は、プロリン残基の環の大きさが５員から４員、６員、または７員へと変化するようにすることができる。環状基は、飽和または不飽和であり得、不飽和の場合、芳香族または非芳香族であり得る。複素環式基は、１つ以上の窒素ヘテロ原子、酸素ヘテロ原子及び／または硫黄ヘテロ原子を含有することができる。このような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）、及びトリアゾリルが挙げられる。これらの複素環式基は、置換または非置換であることができる。基が置換される場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換若しくは非置換のフェニルであることができる。ペプチド模倣体は、リン酸化、スルホン化、ビオチン標識、または他の部分の付加若しくは除去によって化学的に修飾されたアミノ酸残基も有することがある。
さらなる実施形態において、式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−Ｒ１５であり、式中、Ｒ１はＭｅｔまたＭｅｔの模倣体であり、Ｒ２はＶａｌまたはＶａｌの模倣体であり、Ｒ３はＡｒｇまたはＡｒｇの模倣体、または任意のアミノ酸であり、Ｒ４はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ５はＬｙｓまたはＬｙｓの模倣体であり、Ｒ６はＰｒｏまたはＰｒｏの模倣体であり、Ｒ７はＧｌｙまたはＧｌｙの模倣体であり、Ｒ８はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、Ｒ９はＡｌａまたはＡｌａの模倣体であり、Ｒ１０はＡｓｎまたはＡｓｎの模倣体であり、Ｒ１１はＬｙｓまたはＬｙｓの模倣体であり、Ｒ１２はＰｒｏまたはＰｒｏの模倣体であり、Ｒ１３はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、Ｒ１４はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体であり、かつＲ１５はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体である化合物が提供される。さらなる実施形態において、式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０を含み、式中、Ｒ１はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、Ｒ２はＧｌｎまたはＧｌｎの模倣体であり、Ｒ３はＡｌａまたはＡｌａの模倣体であり、Ｒ４はＶａｌまたはＶａｌの模倣体であり、Ｒ５はＧｌｎまたはＧｌｎの模倣体であり、Ｒ６はＧｌｕまたはＧｌｕの模倣体であり、Ｒ７はＨｉｓまたはＨｉｓの模倣体であり、Ｒ８はＡｌａまたはＡｌａの模倣体であり、Ｒ９はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、かつＲ１０はＴｈｒまたはＴｈｒの模倣体である化合物、式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−Ｒ１５−Ｒ１６−Ｒ１７−Ｒ１８を含み、式中、Ｒ１はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、Ｒ２はＧｌｙまたはＧｌｙの模倣体であり、Ｒ３はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ４はＶａｌまたはＶａｌの模倣体であり、Ｒ５はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ６はＴｙｒまたはＴｙｒの模倣体であり、Ｒ７はＧｌｎまたはＧｌｎの模倣体であり、Ｒ８はＴｙｒまたはＴｙｒの模倣体であり、Ｒ９はＭｅｔまたはＭｅｔの模倣体であり、Ｒ１０はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体であり、Ｒ１１はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体であり、Ｒ１２はＡｒｇまたはＡｒｇの模倣体であり、Ｒ１３はＴｙｒまたはＴｙｒの模倣体であり、Ｒ１４はＶａｌまたはＶａｌの模倣体であり、Ｒ１５はＧｌｙまたはＧｌｙの模倣体であり、Ｒ１６はＳｅｒまたはＳｅｒの模倣体であり、Ｒ１７はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体であり、かつＲ１８はＬｅｕまたはＬｅｕの模倣体である化合物、及び式Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９を含み、式中、Ｒ１はＶａｌまたはＶａｌの模倣体であり、Ｒ２はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ３はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ４はＩｌｅまたはＩｌｅの模倣体であり、Ｒ５はＡｌａまたはＡｌａの模倣体であり、Ｒ６はＧｌｎまたはＧｌｎの模倣体であり、Ｒ７はＴｙｒまたはＴｙｒの模倣体であり、Ｒ８はＭｅｔまたはＭｅｔの模倣体であり、かつＲ９はＡｓｐまたはＡｓｐの模倣体である化合物が提供される。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、ＡｒｇでもＡｒｇの模倣体でもない。
種々の技術が、対応する天然物と同じまたは類似の所望の生物活性を有するが、溶解度、安定性、及び／または加水分解若しくはタンパク質分解に対する感受性に関してペプチドよりも好ましい活性を有するペプチド模倣体を構築するために利用可能である（例えば、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｇａｉｎｏｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４，２４３〜２５２，１９８９を参照されたい）。ある特定のペプチド模倣体化合物は、本開示のペプチドのアミノ酸配列を基にしている。しばしば、ペプチド模倣体化合物は、選択したペプチドの３次元構造を基にした３次元構造（すなわち、「ペプチドモチーフ」）を有する合成化合物である。ペプチドモチーフは、所望の生物活性、すなわち、ＰＩＦ受容体に対する結合を有するペプチド模倣体化合物を提供し、ここで、模倣体化合物の結合活性は、実質的に低下せず、しばしば、模倣体がモデル化される天然ペプチドの活性以上である。ペプチド模倣体化合物は、高い細胞透過性、より大きな親和性及び／または長い生物学的半減期のような治療上の適用を高める追加的な特徴を有することができる。
ペプチド模倣体設計戦略は、当該技術分野で容易に入手可能である（例えば、Ｒｉｐｋａ及びＲｉｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，４４１〜２，４５２，１９９８、Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１，１１４〜１，１１９，１９９７、Ｈｒｕｂｙ＆Ｂａｉｓｅ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，９４５〜９，９７０，２０００を参照されたい）。あるクラスのペプチド模倣体は、部分的にまたは完全に非ペプチドであるがペプチド骨格原子を模倣しかつ天然アミノ酸残基の側鎖基の官能性を同様に模倣する側鎖基を含む主鎖である。いくつかのタイプの化学結合、例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオアミド結合、レトロアミド結合、還元型カルボニル結合、ジメチレン結合及びケトメチレン結合は、プロテアーゼ耐性ペプチド模倣体の構築におけるペプチド結合に概して有用な置換基であることが当該技術分野で公知である。別のクラスのペプチド模倣体は、別のペプチドまたはタンパク質へ結合するが、天然ペプチドの構造的な模倣体では必ずしもない小さな非ペプチド分子を含む。さらに別のクラスのペプチド模倣体は、コンビナトリアルケミストリー及び大量の化学ライブラリーの発生から生じている。これらは概して、天然ペプチドと構造上無関連だが、元のペプチドの「トポグラフィー的」模倣体として機能するための非ペプチド足場の上に位置する必要な官能基を有する、新規のテンプレートを含む（Ｒｉｐｋａ及びＲｉｃｈ，１９９８，上述）。
ｎＰＩＦ（配列番号１）という名称の、同定された最初の天然ＰＩＦ化合物は、１５のアミノ酸ペプチドである。このペプチドの合成版であるｓＰＩＦ（配列番号１３）は、天然ペプチドｎＰＩＦ（配列番号Ｉ）と類似の活性を示した。このペプチドは、プラスモジウムであるスポロゾイト周囲タンパク質の小さな領域と相同である。第二のＰＩＦペプチド（配列番号７）には１３のアミノ酸があり、受容体相互作用因子（ＳＭＲＴ）として識別される甲状腺及びレチノイン酸転写コリプレッサーと呼ばれる大きなタンパク質の短い部分との相同性を共有し、合成版は、ｓＰＩＦ−２（配列番号１４）である。第三の異なるペプチドｎＰＩＦ−３（配列番号１０）は、１８のアミノ酸からなり、逆転写酵素の小さな部分と符合し、このペプチドの合成版ｓＰＩＦ−３は（配列番号１５）である。ｎＰＩＦ−４（配列番号１２）は、逆転写酵素の小さな部分との相同性を共有する。
ＰＩＦペプチドのリストは、天然及び合成の両方とも、以下の表４に提供する。種々のＰＩＦペプチド及びスクランブル型ＰＩＦペプチドに対する抗体も提供する。
Figure 2017535794
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本開示はとりわけ、試料中の数免疫細胞を検出するために、または試料中の免疫細胞由来のサイトカイン発現を刺激するために、固相または液体溶液中の診断試薬として使用するＰＩＦまたはその類似体に関する。別の実施形態において、ＰＩＦペプチドまたは類似体を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療有効量のＰＩＦペプチドまたはその医薬として許容され得る塩を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、表４の配列識別子のうちの任意の１つ以上を含むペプチドを含んでいない。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、配列番号１を含むまたは配列番号１からなるペプチドを含んでいない。
指定した徴候に関する治療処置のために、作用薬をそれ自体投与してもよく、または非経口投与、経皮投与、直腸投与、鼻腔投与、局所的静脈投与、若しくは好ましくは経口投与のための単位剤形における医薬組成物へと化合及び製剤化することができる。そのような医薬組成物は、当該技術分野で周知の様式で調製され、医薬担体を伴った、表５由来の作用薬のうちの少なくとも１つまたは組み合わせを含む。本明細書のいたるところで使用する「作用薬」という用語は、式の化合物から選択した少なくとも１つの化合物またはその医薬として許容され得る塩を指す。
そのような組成物において、活性のある化合物は、「有効成分」として知られる。当該組成物を製造する上で、有効成分は通常、担体と混合され、または担体によって希釈され、またはカプセル、サシェ、紙若しくは他の容器の形態にあり得る担体内に封入されるであろう。担体が希釈剤として機能する場合、当該担体は、有効成分のための媒体のビヒクル、賦形剤として作用する固体、半固体、または液体の材料であり得る。したがって、本組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、オブラート剤、エリキシル剤、エマルション剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、軟質及び硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌済み注射液、ならびに滅菌済み包装済み散剤の形態にあることができる。
「医薬調製物」及び「医薬組成物」という用語には、哺乳類動物、例えば、ヒトへの投与に適した調製物を含む。本開示の化合物を医薬品として哺乳類動物、例えばヒトへ投与する場合、本化合物は、それ自体、または、例えば、医薬として許容され得る担体との組み合わせで約０．１〜約９９．５％の有効成分を含有する医薬組成物として、付与することができる。
「医薬として許容され得る」という表現は、ヒトへ投与する場合に、生理学的に許容され得、かつ、胃のむかつき、めまい及びこれらに類するもののような、アレルギー反応または類似の不都合な反応を典型的に生じることのない、分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「医薬として許容され得る」という用語は、動物における、及びより具体的にはにはヒトにおける使用のために、連邦政府若しくは州政府の規制省庁によって認可された、または米国薬局方若しくは他の概して認識されている薬局方に列挙されたことを意味する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＰＩＦ、ペプチド、模倣体またはそれらの医薬として許容され得る塩及び少なくとも１つの医薬として許容され得る担体を含む。
「医薬として許容され得る担体」という表現は、当該技術分野で認識されており、これには哺乳類へ本開示の化合物を投与するのに適した、医薬として許容され得る物質、組成物またはビヒクルを含む。担体には、ある器官、または身体の一部から、別の器官、または身体の一部へと本薬剤を運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容され得」なければならず、患者に対して損傷してはならない。医薬として許容され得る担体として機能できる物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖類、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンのようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロースエチル及び酢酸セルロースのようなセルロース及びその誘導体、粉状トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター及び坐剤用蝋のような賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油のような油、プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなグリコール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル、アガー、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張性塩類溶液、リンゲル溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝溶液、ならびに医薬製剤において採用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。適切な医薬担体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において説明されている。いくつかの実施形態において、医薬として許容され得る担体は、滅菌済みかつ発熱物質非含有の水である。いくつかの実施形態において、医薬として許容され得る担体は、乳酸リンゲル溶液として時に知られるリンゲル乳酸である。
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、ならびに着色料、放出剤、コート剤、甘味料、香味料及び着香料、保存料ならびに抗酸化物質も、本組成物中に存在することができる。
医薬として許容され得る抗酸化物質の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びこれらに類するもののような水溶性抗酸化物質、パルミチン酸アスコルビル、酪酸化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、酪酸化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール、及びこれらに類するもののような油溶性抗酸化物質、ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、及びこれらに類するもののような金属キレート剤が挙げられる。
本開示の製剤には、経口投与、鼻腔投与、局所投与、頬側投与、舌下投与、直腸投与、膣内投与及び／または非経口投与に適したものを含む。製剤は、単位剤形において簡便に存在し得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を生じるために担体と組み合わせることのできる有効成分の量は概して、治療効果を生じる化合物の当該量であろう。概して、１００パーセントのうち、この量は、有効成分の約１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントに及ぶであろう。
適切な担体、賦形剤、及び希釈剤に関するいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓａｌｉｃａｔｅ）、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、トラガカント、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩、話、ステアリン酸マグネシウム、水、及び鉱油が挙げられる。製剤は追加的に、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、保存料、甘味料または香味料を含むことができる。組成物は、当該技術分野で周知の手順を採用することによって、患者への投与後に有効成分の迅速な、持続した、または遅延した放出を提供するよう製剤化され得る。
インプラントによる局所送達は、医薬剤を含有するマトリックスの、影響される部位への外科的配置を説明する。植え込まれたマトリックスは、拡散、化学反応、または溶媒活性化因子によって医薬剤を放出する。
例えば、いくつかの態様において、本開示は、表５の活性のある化合物と、医薬として許容され得る担体若しくは希釈剤とを含む医薬組成物、または表５の活性のある化合物を含む有効量の医薬組成物に関する。
本開示の化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続的注入による、非経口投与のために製剤化することができる。本化合物は、所定の時間にわたって皮下的に持続的な注入によって投与することができる。注射のための製剤は、単位剤形において、例えば、アンプルまたは複数回用量容器において、保存料を添加して、存在することができる。本組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルションのような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような調合剤を含有することができる。
経口投与のために、本化合物は、これらの化合物を当該技術分野で周知の医薬として許容され得る担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。このような担体によって、本開示の化合物は、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤及びこれらに類するものとして、治療される患者による経口消化のために製剤化することができる。経口使用のための医薬調製物は、固体賦形剤を添加すること、結果として生じる混合物を任意に粉砕すること、及び顆粒からなる混合物を加工することによって得ることができ、所望の場合、適切な助剤を添加することを変更して、錠剤または糖衣錠中心を得る。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトールを含むがこれらに限定しない糖類のような充填剤、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などだがこれらに限定しないセルロース調製物を含む。所望の場合、架橋したポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などだがこれらに限定しない崩壊剤を添加することができる。
糖衣錠中心へは、適切なコーティングを提供することができる。この目的のために、濃縮された糖溶液を使用することができ、当該糖溶液は任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。染料または顔料は、活性のある化合物の用量の異なる組み合わせの識別または当該組み合わせを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングへ添加することができる。
経口的に使用することのできる医薬調製物には、ゼラチンでできた押込みばめカプセル剤、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤とでできた軟質の、調整されたカプセル剤を含むが、これらに限定しない。押込みばめカプセル剤は、例えばラクトースのような充填剤、例えばデンプンのような結合剤、及び／または例えばタルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、及び任意に安定化剤と混合した有効成分を含有することができる。軟質カプセルにおいて、活性のある化合物は、脂肪油、液状パラフィン、または液状ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁することができる。加えて、安定化剤を添加することができる。経口投与のための製剤はすべて、このような投与に適した薬用量であるべきである。
頬側投与のために、本組成物は、例えば、従来様式で製剤化した錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。
吸入による投与のために、本開示による使用のための化合物は、高圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形態で、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用とともに、簡便に送達される。加圧エアゾールの場合、薬用量単位は、測量された量を送達するための弁を提供することによって、決定することができる。例えば、吸入器または吹入れ器における使用のためのゼラチンのカプセル及びカートリッジは、本化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉状基剤との粉状混合物を含有するよう製剤化することができる。
本開示の化合物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸のような直腸組成物において製剤化することもできる。
すでに説明した製剤に加えて、本開示の化合物は、デポー調製物として製剤化することもできる。このような長く作用する製剤は、植え込み（例えば、皮下的または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。デポー注射は、約１〜約６か月間またはそれより長い間隔で投与することができる。したがって、例えば、本化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルションとしての）またはイオン交換樹脂ともに、またはやや可溶性の誘導体として、例えば、やや可溶性の塩として製剤化することができる。
経皮投与において、本開示の化合物は、例えば、硬膏剤へ適用することができ、または生体へ結果的に供給される経皮的な治療系によって適用することができる。
本化合物の医薬組成物は、適切な固体またはゲル相の担体または賦形剤も含むことができる。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、及び例えばポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定しない。
非経口投与のために、類似体は、例えば、医薬として許容され得る非経口ビヒクルと結合して、液剤、懸濁剤、エマルション剤または凍結乾燥散剤として製剤化することができる。このようなビヒクルの例は、水、塩類溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び、不揮発性油のような非水性ビヒクルも使用することがある。ビヒクルまたは凍結乾燥散剤は、等張性を維持する添加物（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性を維持する添加物（例えば、緩衝液及び保存料）を含有してもよい。製剤は、通常使用する技術によって滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、０．９％塩化ナトリウム溶液中に１．５重量％の類似体を溶解することによって調製する。
本開示は、筋肉内、舌下、静脈内、腹腔内、髄腔内、膣内、尿道内、皮内、頬側、吸入を介した、噴霧器を介した及び皮下注射を介したを含む投与経路に関する。あるいは、医薬組成物は、個体から取り出した細胞へ種々の手段によって導入してもよい。このような手段には例えば、微粒子銃及びリポソームまたは他のナノ粒子用の装置を含む。
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤を含む。固体剤形において、類似体は概して、スクロース、ラクトース、デンプン、または他の概して安全とみなされる（ＧＲＡＳ）添加物のような少なくとも１つの不活性の医薬として許容され得る担体と混合させる。このような剤形は、通常の実施のように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、マグネシウム状態のような滑沢剤も含むことができる。カプセル剤、錠剤、及び丸剤とともに、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。錠剤及び丸剤は、当該技術分野で公知の技術を用いて、腸溶コーティングとともに、または徐放形態で調製することができる。
経口投与のための液体剤形には、水のような、当該技術分野で通常使用する不活性希釈剤を含有するエリキシルとともに、医薬として許容され得るエマルション、溶液、懸濁液及びシロップを含む。これらの組成物には、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料または着香料のような１つ以上のアジュバントも含むことができる。
当業者は、組成物及び医薬組成物の適切な薬用量が治療中の固体及び目的に応じて変化し得ることを認識するであろう。例えば、個々の患者の齢、体重、及び病歴が、療法の治療効能に影響し得る。さらに、組成物のより少量の薬用量が、症状の一過性の休止を生じるために必要とすることがあり、一方、より多量の用量が、疾患、障害、または徴候と関係する症状の完全な休止を生じるために必要とすることがある。有能な医師は、これらの要因を考慮して、過度の実験なしで用量が所望の治療結果に達成しつつあることを確認するために投薬計画を調整することができる。臨床医及び／または治療医は、個々の患者の応答とともに療法をいかにかついつ中断、調整、及び／または終止させるかがわかっていることにも留意する。薬用量は、医薬組成物について選択した特定の類似体の強度によることもある。
組成物または医薬組成物の用量は、変化し得る。組成物の用量は、１日１回であり得る。いくつかの実施形態において、複数回用量は、１日に対象へ投与され得る。いくつかの実施形態において、総薬用量は、少なくとも２回の適用期間において投与される。いくつかの実施形態において、期間は、１時間、１日、１か月、１年、１週間、または２週間であることができる。本発明の追加の実施形態において、総薬用量は、２つ以上の個別の適用期間において投与され、または１時間、１日、１か月、１年、１週間、若しくは２週間の時間経過にわたって個別の用量で投与される。
いくつかの実施形態において、作用薬のうちの１つまたは複数は、免疫調節薬、ホルモン薬、抗炎症性化合物、アルファ−アドレナリン作動性アゴニスト、鎮痛性化合物、及び麻酔性化合物から選択される化合物のうちの１つまたは組み合わせである。そのような化合物の非限定例を以下の表５に示す。
Figure 2017535794
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本開示の化合物は、例えば、アジュバントのような他の有効成分、または他の適合性のある薬剤若しくは化合物との組み合わせで投与することもでき、ここで、このような組み合わせは、本明細書に説明する方法の所望の効果を達成する上で望ましいまたは有利であることが判っている。
システム及びアレイ
多くの実施形態において、アレイは、表面（複数可）へＰＩＦ及び／若しくはその類似体ならびに／または他のペプチド若しくは分子が空間的に離散した位置で固定された固体支持体を含む。このようなアレイは、任意の源（例えば、組換えで作製する、生化学的に単離する、合成する、市販のものを購入するなど）からＰＩＦ及び／またはその類似体を用いて調製することができる。その上、個々のペプチド成分の識別及び相対量は、特定のプロジェクトの必要条件または特定の研究者の関心に従って、決定または調整してもよい。
例えば、多くの実施形態において、実行可能なだけ多くの異なるＰＩＦ及び／またはその類似体を含むアレイを設計、調製及び／または利用することが望ましいであろう。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態において、妊娠、子宮内膜症、またはＲＰＬのような特定の細胞または細胞タイプまたは障害と関係する（または関係していない）ことが公知のペプチド成分のみを含むアレイを設計、調製、及び／または利用することが望ましくあり得る。数件の特定の例を付与するために、いくつかの実施形態において、１つまたは複数の異なるペプチド成分を含有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多数の異なる「スポット」（物理的に離散した位置）を含有するアレイを利用する。いくつかの実施形態において、約１〜約１００，０００スポット、約１００〜約１０，０００、または約１，０００〜約５，０００のスポットを含有するアレイを利用する。
いくつかの実施形態において、アレイ上のスポットは、空間的な組織化を含む。いくつかの実施形態において、アレイ上のスポットは、格子の中に配置される。いくつかの実施形態において、統計的有意性が判定できるよう、複数の格子を用いて複数の実験を同じ実験的変化性で同時に実施して、それにより統計的有意性が決定できるよう、アレイは、反復性格子の中に配置される。
いくつかの実施形態において、種々のＰＩＦまたはＰＩＦ類似体またはこれらの組み合わせは、アレイ上の公知の位置及び成分の公知の組成の両方に各スポットが対応するアレイのスポットにおいて表される。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの成分は、アレイ上に点在する。ある特定の実施形態において、成分は個別に点在する。いくつかの実施形態において、いくつかのペプチドまたは類似体の成分からなる混合物は、単一のスポット内に含有される。いくつかの実施形態において、本発明に従った使用のためのアレイには、単一成分のスポットと成分の組み合わせのスポットとの両方を含む。いくつかの実施形態において、成分は、同じアレイにおいて複数回点在し、それによりアレイには、複製スポットを含む。いくつかの実施形態において、本発明に従った使用のためのアレイは、特定のＰＩＦペプチドまたはその類似体を欠失するスポットを含有しており、それゆえ、例えば、ＰＩＦペプチドまたはその類似体を含有するスポットに加えて、陰性対照として利用され得る。ある特定の実施形態において、ローダミンデキストランは、陰性対照スポットの中に含まれる。
本発明に従った使用のためのアレイは、任意の適切な基質材料上に調製され得る。多くの実施形態において、材料は、細胞、例えば、哺乳類動物細胞の生存可能性及び／または増殖を支持するであろう。いくつかの実施形態において、アレイは、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリラート、ポリビニル化合物（例えば、ポリビニルクロリド）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガラス、フルオロポリマー、フッ化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ケイ素基質（溶融シリカ、ポリシリコン、または単一ケイ素結晶など）からなる群から選択される基質材料を利用する。あるいはまたは加えて、金属（金、銀、チタン薄膜）を使用することができる。いくつかの実施形態において、ポリアクリルアミドで被覆したアクリルスライドを使用する。いくつかの実施形態において、アレイは、スポットのペプチド成分（ＰＩＦまたはＰＩＦ類似体など）と細胞または細胞が発現するタンパク質の間の結合事象を支持する１つまたは複数の基質材料を利用する。いくつかの実施形態において、ポリアクリルアミドで被覆したアクリルスライドを使用する。いくつかの実施形態において、アレイは、スポットのペプチド成分（ＰＩＦまたはＰＩＦ類似体）と試料中の細胞または細胞が発現するタンパク質の間の結合事象を支持する１つまたは複数の基質材料を利用する。
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞を培養することにおける使用のためのアレイを提供する。いくつかの実施形態において、細胞を培養することにおける使用のためのアレイには、培地が提供される。いくつかの実施形態において、細胞を培養することにおける使用のためのアレイには、細胞培養を支持するための十分な容積の培地が１、２、３、４、５またはそれより長い日数提供される。
いくつかの実施形態において、本発明は、診断用アッセイとしての使用のためのアレイを提供する。いくつかの実施形態において、アレイは、診断キットまたは検出キットの一部として提供される。いくつかの実施形態において、アレイは、検出キットの一部として提供される。ある特定の実施形態において、本発明に従った使用のためのキットには、１つ以上の基準試料、説明書（例えば、試料の加工用、検査の実施用、結果の解釈用など）、培地、及び／または検査を実施するのに必要な他の試薬を含み得る。
いくつかの実施形態において、本システムは、固体支持体に対する少なくとも１つのＰＩＦペプチドまたはその類似体を含む当該固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、ここで、当該アレイは、免疫調節不全と関係したポリペプチド配列を各々含む少なくとも２つ以上のポリペプチド、または本明細書に提供する複数の表のうちのいずれかのポリペプチドから選択されるその類似体を含む。いくつかの実施形態において、システムは、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、ここで、固体支持体は、表面へ固定した１つまたは複数のＰＩＦペプチド及び／またはその類似体、ならびに免疫調節不全、子宮内膜症、再発性妊娠中断、若しくは妊娠と関係したポリペプチド配列を各々含む少なくとも２つ以上のポリペプチド、または本明細書に開示するペプチドのうちのいずれかから選択されるその類似体を含み、ここで、当該固体支持体は、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、クォーツガラス、ポリ（エチレンテレフタル酸）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、酢酸エチレンビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン類、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、塩化ポリビニル、ポリビニルフェノール、及びこれらのコポリマー混合物から選択される材料を含む。
いくつかの実施形態において、本システムは、（ｉ）第一及び第二の溶液を調製し、各第一及び第二の溶液は、免疫調節不全、子宮内膜症、ＲＰＩ、若しくは妊娠と関係したポリペプチド配列と関係したポリペプチド配列またはその類似体を含む公知の濃度のポリペプチドを含むこと、（ｉｉ）第一及び第二の溶液を固体支持体と、免疫調節不全、子宮内膜症、ＲＰＬ、または妊娠と関係するポリペプチド配列またはその類似体を含むポリペプチドを固体支持体へ吸収させるのに十分な時間接触させ、ここで、免疫調節不全、子宮内膜症、再発性妊娠中断、若しくは妊娠と関係したポリペプチド配列と関係したポリペプチド配列またはその類似体は、表１または表４のポリペプチドから選択され、かつここで、溶液を調製して当該溶液を固体支持体と接触させるステップは、少なくとも１つのアレイ上に存在するスポットまたは離散した位置の数に対応して少なくとも約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００または７００回反復されることを含むステップによって調製した、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含む。いくつかの実施形態において、第一及び第二の溶液を固体支持体と接触させる１回以上反復したステップは、免疫調節不全、子宮内膜症、ＲＰＬ、または妊娠と関係したポリペプチド配列またはその類似体を含む各ポリペプチドが、少なくとも１つのアレイ上の離散した指定可能な位置で吸収されるよう自動化装置によって実施される。
いくつかの実施形態によると、アレイは、表面プラズモン共鳴または（ＳＰＲ）を測定する装置内での使用のために構成された銀などの金属で被覆したチップまたはシリカ表面を含む。いくつかの実施形態において、チップは、ＣＭ５チップなど、ビアコアチップ（ＧＥ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって具備）である。当該センサーチップは、保護シースの中にあるポリスチレン支持フレームへと固定される。センサーチップ及びシース組立て体からなる各カセットは、気密性に密封したパウチの中で、窒素雰囲気下で個々にパックされる。
ビアコアチップは、製造元の説明書により使用することができる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１４４３０１９４５０９６１／ｌｉｔｄｏｃ２２０３１０２３＿２０１５０９２３１６４４０４．ｐｄｆに認められ、これは全体として参照により組み込まれる）が、当業者は、ＣＭ５チップが、非限定例として、その表面上にシクロメチルデキストランを含む、その上に１つまたは複数の本明細書に開示するポリペプチドまたは類似体が公知の化学作用を通じて固定化され得ることを知っているであろう。簡潔には、当該プロトコルは、以下の内、１つまたは複数のステップを含む：
（ａ）チップ表面上での濃縮を防止するために、密封したセンサーチップパウチを室温で１５〜３０分間平衡化させておく（ｂ）公知のランニングバッファーを用いてビアコア機器を準備する。当該緩衝液は濾過すべきであり（０．２２μｍ）、集積緩衝液脱気装置を有していないシステムのために脱気する、（ｃ）センサーチップパウチを開く。センサーチップ支持体が全回数においてシースへと完全に挿入されたままであることを確実にする、（ｄ）機器マニュアルハンドブックに説明されているように機器の中にセンサーチップをドッキングさせる、（ｃ）機器の中にドッキングされていない
センサーチップは、閉じた容器中に保存されるべきであり、ポリペプチドまたはその類似体を固定化する。リガンドまたは捕捉分子は、デキストラン上のカルボキシル基を介してセンサーチップ表面へ共有結合する。カップリングに使用することのできる分子にある官能基には、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＯＨ及び−ＣＯＯＨを含む。当該表面は、ほとんどの固定化アプローチのためによって調製され、カルボキシメチルデキストラン表面は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる混合物を用いて活性化される。試薬溶液は、新鮮に調製され、使用直前に混合されるべきである。固定化の効率は、溶液が新鮮でない場合、低下するであろう。
いくつかの実施形態によると、アレイは、キットの一部として供給され得る製剤を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＩＦペプチド及び／またはＰＩＦ類似体またはこれらの医薬として許容され得る塩を含んでおり、ＰＩＦペプチド及び／またはＰＩＦ類似体またはこれらの医薬として許容され得る塩は、非天然アミノ酸であり、または配列番号２０と少なくとも７０％相同である。別の実施形態において、キットは、再水和混合物を有する類似体の医薬として許容され得る塩を含む。別の実施形態において、類似体の医薬として許容され得る塩は、１つの容器中にあるのに対し、再水和混合物は、第二の容器中にある。再水和混合物は、乾燥形態で供給されてもよく、当該再水和混合物へ、水または他の液状溶媒が添加されて、投与前に懸濁液または溶液を形成してもよい。再水和混合物は、組成物を、少なくとも１用量の下剤を服用する対象へ投与する前に、本発明の凍結乾燥した不溶性の塩を可溶化するために設計された混合物である。別の実施形態において、期とは、経口的に利用可能な丸剤形態中の医薬として許容され得る塩を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、固体支持体に対する少なくとも１つのＰＩＦペプチドまたはその類似体を含む固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、ここで、アレイは、免疫調節不全と関係したポリペプチド配列を各々含む少なくとも２つ以上のポリペプチド、または以下に説明するように、表４のポリペプチドから選択されるその類似体を含む。
本キットは、２つ以上の容器、パック、またはディスペンサーを、調製及び固定化のための説明書とともに含有してもよい。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書に説明する医薬組成物または組成物を含む少なくとも１つの容器と、注射器のような組成物の送達のための手段を備えた第二の容器とを含む。いくつかの実施形態において、本キットは、溶液中のまたは凍結乾燥したまたは乾燥した類似体を、再水和混合物とともに含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、当該類似体及び再水和混合物は、１つ以上の追加の容器中にあってもよい。
本キット中に含まれる組成物は、異なる組成物の保管期限が保存され、かつ容器の材料によって吸収も変化もしないよう任意に選択した当該容器中に供給され得る。例えば、適切な容器には、試薬または食品を保持するために典型的に採用されるガラス、ポリカーボネートのような有機ポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、セラミック、金属または任意の他の材料から作製され得る単純なボトル、アルミニウムまたは合金のようなホイルで裏打ちされた内部からなり得るエンベロープを含む。他の容器には、検査チューブ、バイアル、フラスコ、及び注射器がある。容器は、取り外しの際に組成物の成分を混合させる容易に取り外し可能な膜によって分離された２つの区画を有し得る。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム、または他の不活性材料であり得る。
キットはまた、説明材料とともに供給され得る。説明は、紙若しくは他の基材の上に印字され得、及び／またはフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、若しくは他の可読記録装置のような、電子可読媒体として供給され得る。詳細な説明は、キットと物理的に関係していなくてもよく、代わりに、ユーザーは、当該キットの製造元または販売元によって指定された、または電子メールとして供給されたインターネットウェブサイトへ導かれ得る。
別の実施形態において、投与されることになっている医薬製剤、すなわち、ＰＩＦペプチド及び／またはＰＩＦ類似体またはこれらの医薬として許容され得る塩を含む医薬製剤、容器（例えば、バイアル、ボトル、パウチ、エンベロープ、缶、チューブ、噴霧器、エアゾール缶など）、任意に、保管中及び使用前に製剤を収容するための任意に密封された固体支持体、ならびに本明細書に開示する徴候のうちの任意の１つ以上を治療するのに有効な様式で薬剤投与を実施するための説明書を含有する包装したキットが提供される。説明書は典型的には、添付文書、ラベル、及び／または当該キットの他の構成要素上に記載された説明であろう。
製剤のタイプ及び意図される投与様式に応じて、当該キットには、製剤を投与するための装置（例えば、経皮送達装置）も含み得る。投与装置は、点滴装置、スワブ、スティック、または噴霧器若しくはエアゾール缶のノズル若しくは出口であり得る。製剤は、本明細書に説明する任意の適切な製剤であり得る。例えば、製剤は、作用薬の単位薬用量を含有する経口剤形、またはチューブ内に含有されるゲル若しくは軟膏であり得る。当該キットは、同じ薬剤の異なる薬用量からなる複数の製剤を含有してもよい。当該キットはまた、異なる作用薬からなる複数の製剤を含有してもよい。
本キットにはまた、典型的には、個々のキット構成要素、すなわち、ペプチド形態（固定されたまたは固定されていない）と、投与装置（含む場合）と、本明細書に開示するペプチドの固定のための固体支持体または本明細書に開示する固定されたペプチドを含む固体支持体と、使用のために記載された説明とを包装するための手段を含む。このような包装手段は、ボール紙若しくは紙箱、プラスチックまたはホイルパウチなどの形態を取り得る。
方法
本開示の実施形態は、免疫調節不全についてのマーカーとしての対象の循環免疫細胞へ結合するＰＩＦの検査方法に関する。いくつかの実施形態は、有効量のＰＩＦを投与すること、及び循環免疫細胞へのＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全によるＲＰＬの病歴のある雌性対象の識別方法に関する。当該方法内で、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の正常値からの偏差は、対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全による可能性が高いことを示すのに対し、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの正常な結合は、対象のＲＰＬ病歴が免疫調節不全によるものではない可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、対象の循環免疫細胞は、ＤＣである。ある特定の実施形態において、ＤＣは、ｐＤＣ、ｍＤＣ、またはこれらの組み合わせである。
他の実施形態は、有効量のＰＩＦを投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法に関する。当該方法内で、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の減少は、対象が、免疫調節不全によりＲＰＬに罹患している可能性が高いことを示し、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの正常な結合は、対象が、免疫調節不全によりＲＰＬに罹患していない可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、対象の循環免疫細胞は、ＤＣである。ある特定の実施形態において、ＤＣは、ｐＤＣ、ｍＤＣ、またはこれらの組み合わせである。
他の実施形態は、有効量のＰＩＦを投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、免疫調節不全に罹患している対象の識別方法に関する。他の実施形態は、有効量のＰＩＦまたはその類似体を投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を分析することを含む、免疫調節不全に罹患している対象の識別方法に関する。当該方法内で、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の減少は、対象の免疫調節不全を示し、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの正常な結合は、対象者の免疫調節不全がないことを示す。いくつかの実施形態において、対象の循環免疫細胞はＤＣである。ある特定の実施形態において、ＤＣは、ｐＤＣ、ｍＤＣ、またはそれらの組み合わせである。
他の実施形態は、有効量のＰＩＦを投与すること、及び循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの結合を検査することを含む、子宮内膜症に罹患している対象の識別方法に関する。当該方法内で、基準と比較した循環免疫細胞に対するＰＩＦの結合の減少は、対象の子宮内膜症を示し、基準と比較した当該循環免疫細胞に対する当該ＰＩＦの正常な結合は、対象に子宮内膜症がないことを示す。いくつかの実施形態において、対象の循環免疫細胞はＤＣである。ある特定の実施形態において、ＤＣは、ｐＤＣ，ｍＤＣ、またはこれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、免疫調節不全に罹患している対象の識別方法は、有効量のＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞を含む対象由来の試料へ曝露すること、及び対象の１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその類似体の間の結合事象を検査することを含み得、ここで、基準と比較した１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、対象が免疫調節不全に罹患していることを示す。
いくつかの実施形態において、結合事象は、アッセイによって検査、判定、測定、または特徴づけられ得る。いくつかの実施形態において、当該アッセイは例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、またはアフィニティークロマトグラフィーであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦ結合は、例えば、バイオセンサーのようなセンサーを用いて判定され得る。
概して、ＥＬＩＳＡプロトコルは、マイクロプレートのウェル上へ被覆した、関心対象のタンパク質に特異的な捕捉抗体を用いて開始する。関心対象のタンパク質を含有する標準物、対照検体、及び未知のものを含む試料が、これらのウェル中へとピペッティングされる。第一のインキュベーションの間、タンパク質抗原は、捕捉抗体へ結合する。洗浄後、検出抗体をウェルへ添加し、この抗体は、第一のインキュベーションの間に捕捉した固定化したタンパク質へ結合する。過剰量の検出抗体の除去後、ＨＲＰ複合体（二次抗体またはストレプトアビジン）を添加して、検出抗体へ結合させる。第三のインキュベーション及び過剰量のＨＲＰ共役体を除去するための洗浄の後、基質溶液を添加し、酵素によって、検出可能な形態（色相シグナル）へと転換させる。この着色した生成物の強度は、元の検体中に存在する抗原の濃度と直接比例する。ＥＬＩＳＡを、抗原を定量化するために使用する。ＥＬＩＳＡは、結果が迅速で、一貫しており、かつ分析することが比較的容易にあるので、高処理量スクリーニングに適用可能である。結果は、高度に精製され、事前に適合した捕捉及び検出抗体を利用するサンドイッチ形式を用いて得ることができる。すぐに使えるＥＬＩＳＡキットは、何百もの通常検査されているタンパク質及び他の生体分子のために市販されている。
概して、フローサイトメトリーは、細胞蛍光及び光散乱に関する個々の測定が可能な方法である。そのような測定は、１秒間当たり何千個もの細胞の速度で実施し、結果として生じる情報を用いて、細胞の部分集団を個々に選別または分離することができる。簡潔には、細胞をフローサイトメトリーの収集ステージ上へと搭載する。試料を流体システムへと引き入れ、フローチャンバーまたはフローセルへとポンプ輸送する。細胞は、シース流体流と組み合わされ、シース流体流は迅速にそれを一度に一回移動させて、１個以上の光源（例えば、レーザー）を通過させる。レーザーからの光ビームは、細胞がフローチャンバーを通過すると当該細胞を励起させる。光散乱及び／または蛍光が捕捉され、スペクトルがフィルター処理され、光検出器を通じて電気信号（電圧）へと変換される。次に、外部コンピュータシステムが電圧データをデジタル化する。デジタル情報は、セルの特徴を定量化するために分析される。フローサイトメトリーは、１つ以上の試料の高速分析に特に有用であり得る。いくつかの場合、フローサイトメトリーは、滅菌ＰＢＳ中でセルを２回洗浄すること、及びいかなる望ましくない細胞も０．１６Ｍ塩化アンモニウム溶液で溶解することを包含し得る。免疫細胞は、１、５または１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＰＩＦまたはＦＩＴＣ−ＰＩＦｓｃｒとともに室温で１時間インキュベートした後、３回洗浄して、結合していないペプチドを除去して、フローサイトメトリーのために固定し得る。細胞タイプは、その散乱特性を基に分離してもよい。その内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる公開第ＷＯ／２００９／０４５４４３号は、フローサイトメトリーデータを得る方法についての追加の情報を提供する。
概して、アフィニティークロマトグラフィーは、複合体混合物から特定の分子または一群の分子を精製するための強力なクロマトグラフィー法である。酵素と基質環の間、受容体とリガンドの間、または抗体と光源の間の相互作用など、２つの分子間の高度に特異的な生物学的相互作用を基にしている。典型的には可逆的であるこれらの相互作用は、親和性リガンドと呼ぶ相互作用分子のうちの１つを固体マトリックス上へと配置して、標的分子が移動相にありながら固定相を作ることによって、精製に使用する。関心対象の分子は典型的には、周知かつ定義された特性を有するであろうし、当該特性は、アフィニティ精製法の間に利用することができる。当該方法自体は、固相または固定相または培地の上に標的分子を捕捉するものと考えることができる。移動相における他の分子は、この特性を有しないので、捕捉されないであろう。次に、固定相は、混合物から取り出し、洗浄し、溶離剤として公知の方法における捕捉から標的分子を放出することができる。いくつかの場合、アフィニティークロマトグラフィーは、関心対象のタンパク質が、関心対象のタンパク質を含む混合物をアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）マトリックス上へ搭載すること、ＡＣマトリックスをアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む、ｐＨが８．０より大きな洗浄溶液で洗浄すること、及び関心対象のタンパク質をＡＣマトリックスから溶出することによって結合するＡＣマトリックスを用いて、関心対象の精製したタンパク質を生成することを包含し得、ここで、洗浄は、非緩衝塩の存在なしで実施する。その内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる公開第ＷＯ／２０１２／１６４０４６号は、アフィニティークロマトグラフィーを完了させる方法についての追加の情報を提供する。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦは、固体支持体及び１つまたは複数のＰＩＦペプチドまたはその類似体と結合し得、ここで、１つまたは複数のＰＩＦペプチドまたは類似体は、アレイの指定可能な位置で固体支持体へ付着させる。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリマーで任意に被覆したスライドである。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリマーで被覆されている。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリアクリルアミドである。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、クォーツガラス、ポリ（エチレンテレフタラート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、酢酸エチレンビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン類、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、塩化ポリビニル、ポリビニルフェノール、ならびにこれらのコポリマー及び混合物から選択される材料である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの付着セットは、固体支持体へ固定された２つの異なるポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦ結合は、標準または基準の結合特性と比較され得る。いくつかの実施形態において、基準の結合特性は、ＰＢＭＣサブタイプに対するＰＩＦ結合を検査するための比較として機能する。健常対象において、ＦＩＴＣ−ＰＩＦは、正常患者において低い３００〜５００ｎＭへ曝露した場合、約１００％のＣＤ１４＋細胞と、ならびに、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞に１０％未満結合する。ＦＩＴＣ−ＰＩＦへの同じ曝露の後の非妊娠対象におけるＣＤ１４＋細胞に対する結合における２０％超の低下、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞に対する結合の２０％超の亢進は、ＲＰＬまたは免疫調節不全についての危険性を構成する。ＰＢＭＣに対するＰＩＦの結合は、妊娠中に及びマイトジェンまたは免疫活性化因子への曝露後に、有意に増加する。未処置の細胞におけるＣＤ１４＋細胞と１００％を結合することができないこと、または活性化後の結合を亢進させることができないことは、ＲＰＬ及び子宮内膜症を含むがこれらに限定しない障害においてみられるような免疫機能障害を反映する。正常と比較したＣＤ１４＋細胞へのＰＩＦの結合の減少は、対象の先天免疫が影響されていることを示し得る。正常と比較した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びこれらの組み合わせ（ＰＢＭＣ）から選択される細胞へのＰＩＦの結合の２０％超の増加は、対象の適応免疫が影響されることを示し得る。したがって、いくつかの実施形態において、血液試料を患者から収集し、フィコール・ハイパックを用いてＰＢＭＣを分離し、分離したＰＢＭＣの結合特性を検査する。ＦＩＴＣ−ＰＩＦ（５００ｎＭ）が、室温の培地（ＲＰＭＩ無血清）中で３０分間ＰＢＭＣへ曝露される。その後、ＰＢＭＣを洗浄して、過剰量のＦＩＴＣ−ＰＩＦを除去し、標識したＰＢＭＣをフローサイトメーターの中に入れ、特異的な抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１９抗体、及び抗ＣＤ５６抗体を用いることによって、種々の免疫表現型との相互作用を２０３色で分析する。特異的結合は、ゲート処理された象限において判定する。基準結合特性は、ＰＩＦがＣＤ１４＋細胞（すなわち、単球及び／またはマクロファージ）の約１００％へ結合し、かつＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞及び／またはＢ細胞の約１０％未満へ結合するというものである。それゆえ、いくつかの実施形態において、免疫調節不全は、ＰＩＦがＣＤ１４細胞（すなわち、単球及び／またはマクロファージ）の約８０％のみへ結合し、かつＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞ならびに／またはＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の２０％超へ結合する場合に識別される。代替的な実施形態において、ＦＩＴＣ−ＰＩＦが、約２５μＭという比較的高濃度で添加される。当該比較的高濃度では、異なる結合結果が、種々の形態の免疫調節不全に罹患している対象において予期される。具体的には、より高い濃度では、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞ならびに／またはＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞に対するＰＩＦの結合は、正常対象において亢進すると予期され、したがって、結合の亢進がないこと、または亢進する結合がないことは、対象の免疫機能障害を示している。他の代替的な実施形態において、ＰＩＦ結合は、ＰＨＡの存在下で検査され、ここで、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１９＋細胞に対する結合は、およそ３０倍低下すると期待される。それゆえ、ＰＨＡの存在下で、予期される通り亢進しないＰＨＡ結合は、対象の免疫機能障害を示している。本明細書で、「基準」、「対照」、「標準」、「平均」という用語、及びこれらに類するものは概して、先に説明する正常な結合特徴を指す。
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有意な変化を測定すること、分析することまたは比較することを含む。いくつかの実施形態において、「有意な変化」は、統計的に有意な結果を指す。概して、統計的有意性（または統計的に有意な結果）は、ｐ値が有意レベル未満である場合に得られる。ｐ値は、帰無仮説が真であるとして、極端な結果を少なくとも得る確率であり、一方アルファ（α）レベルの有意性は、無機仮説が真であるとして、帰無仮説を拒絶する確率である。データ収集前に選択される有意性レベルは例えば、０．０５（５％）であり得る。いくつかの実施形態において、スチューデントのｔ検定が、有意性を評価するために使用され得る。概して、ｔ検定は、帰無仮説が支持される場合に検定統計値がスチューデントのｔ分布に従うあらゆる統計仮説検定である。この検定は、２セットのデータが互いに有意に異なるかどうかを判定するために使用することができ、検定統計値における尺度項目の値が公知であった場合、検査統計値が正規分布に従うであろう場合に最も普遍的に適用される。尺度項目が未知でありかつ、データを基にした概算値によって置き換えられる場合、検定統計値（ある特定の条件下において）は、スチューデントのｔ分布に従う。いくつかの実施形態において、他の統計的検定を用いて有意性を判定し得る。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドを用いて、ＰＩＦペプチドを使用して、異なる免疫表現型に対するその結合を検定し得る。いくつかの実施形態において、そのようなＰＩＦペプチド結合が、妊娠対象及び非妊娠対象において比較され得る。いくつかの実施形態において、基準と比較したこのようなＰＩＦ結合の差は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）または標準偏差（ＳＤ）として表し得る。いくつかの実施形態において、基準と比較したこのようなＰＩＦ結合の差は、２標準偏差として表し得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、免疫細胞機能に及ぼすＰＩＦの効果を測定するために使用され得、ここで、ＲＰＬの病歴を有する対象は、基準と比較される。やってくる実施形態において、免疫細胞機能は、サイトカイン分布の変化を検査することによって判定され得る。いくつかの実施形態において、有意な変化は、±約２０％であり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、子宮内膜症の病歴を有する１個体以上の対象に由来する血清によって影響されるかどうかを測定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、有意な変化は、±約２０％であり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、またはこれらの類似体、及びそれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態において、ＰＩＦペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、アミノ酸の構造的及び機能的類似体を有する化合物、例えば、合成アミノ酸または非天然アミノ酸あるいはアミノ酸類似体を有するペプチド模倣体から、当該模倣体が本開示の化合物の１つ以上の機能または活性を有する限り、選択され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、非妊娠マウスにおけるＣＤ４５＋細胞に対する結合を検定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ標的を評価することによって、インビボでＰＩＦ標的を判定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的は例えば、脾臓または骨髄であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、対象から試料を単離または採取するステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、ＰＩＦまたはその類似体と１個以上の細胞の間の結合事象または結合親和性を検査または分析または測定する前に、試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）へ曝露することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、試料を１つまたは複数の細胞に対するＰＩＦまたはその類似体に対して曝露した後、単離されているかまたは試料中の成分としてのいずれかで、１つまたは複数の細胞を単離して、１つまたは複数の細胞のタンパク質発現に基づいた結合特性を作成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、単離した骨髄細胞、脾細胞、ＰＢＭＣ、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、樹状細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＦｏｘＰ３＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞などの免疫細胞を含む。さらに、いくつかの実施形態において、測定するタンパク質発現は、１つまたは複数の単離した細胞が発現するサイトカインの量を測定または分析することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、１つまたは複数の細胞へ結合したタンパク質へ共有結合したまたは非共有結合した色素または他の検出部分に由来する色素または蛍光の量を定量化することによって、当該タンパク質の量を分析するステップを含む。結合事象は、ＰＩＦまたはその類似体など、ポリペプチドへ結合するために当該技術分野で公知の任意の技術を用いて可視化、検出または定量化され得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦまたはその類似体のような固定化したタンパク質は、いかなる方法においても使用するポリペプチドの量の可視化または定量化を容易にする色素または他の標識の挿入、共有結合または非共有結合、または吸着を可能にする検出部分を含み得る。本明細書の方法のうちのいずれもに有用なポリペプチドの標識の例は、次の通りである：レゾルフィン、マラカイトグリーン、フルオレセイン、ＦＩＴＣまたはジアミノベンジジンのような一重項酸素遊離基発生体、金属キレート剤のような分析物結合基（この非限定例としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ピリジニウム、イミダゾール及びチオールが挙げられる）、ヨウ素のような重原子担体、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ及びＨＡタグのような親和性タグ、ベンゾフェノン及びアリジジンのような光励起性架橋剤、アゾベンゼンのような光スイッチ標識、ならびにニトロベンジル基、ジメトキシニトロベンジル基またはＮＶＯＣのような感光性保護基、あるいはタグまたは標識を含む本明細書に開示するポリペプチド特異的抗体のような大きな高分子（本明細書に開示する免疫組織化学実験に使用するものは１つの非限定例である）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、標識または検出部分の励起を電磁波で刺激することによって、タンパク質へ共有結合または非共有結合した色素または他の検出部分からの色素または蛍光の量を定量化することによって、１つまたは複数の細胞へ結合したタンパク質の量を分析するステップを含む。例えば、光励起性検出部分の場合、ＰＩＦまたは他のポリペプチドへ結合した化学部分は、濃度依存的様式でタンパク質から当該化学部分を切断する光へ曝露され得る。試料中の反応産物の量は、当該反応産物に対応して得たシグナルの量と相関させることができる。
本開示はさらに、（ａ）本明細書に開示するアレイまたはシステムへ細胞試料を接触させること、（ｂ）１つ以上の結合事象を定量化すること、（ｃ）結合事象を基にした細胞試料の１つ以上の結合署名を判定すること、及び（ｄ）細胞試料の結合署名を対照細胞試料の結合署名と比較することを含む、対象における免疫調節不全の診断方法に関する。本開示は、細胞試料を本明細書に開示するアレイまたはシステムへ接触させることを含む、細胞の単離方法も提供する。いくつかの実施形態において、細胞の単離方法は、細胞試料を本明細書に開示するアレイまたはシステムへ、細胞が細胞試料の他の成分よりも密にアレイまたはシステムへ接着するのに十分な時間、かつ十分な条件下で接触させることを含む。いくつかの実施形態において、細胞の単離方法はさらに、アレイまたはシステムを細胞試料の他の非結合成分を細胞から洗い出す緩衝液ですすぐことも含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、１つまたは複数のＰＩＦペプチドまたはその類似体を対象へ投与した後に、インビボでタンパク質へ共有結合または非共有結合した色素または他の検出部分から色素または蛍光の量を定量化することによって、１つまたは複数の細胞へ結合したタンパク質の量を分析するステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のうちのいずれもが、１つまたは複数の細胞を単離して、１つまたは複数の細胞のタンパク質発現を基にした結合特性を作成することの前に、試料を１つまたは複数の細胞へインビボで対するＰＩＦまたはその類似体へ曝露することを含む。いくつかの実施形態において、当該分析は、デジタル顕微鏡によって実施し得る。いくつかの実施形態において、当該分析は、生検の切片を採取すること及び当該切片をデジタル顕微鏡または光学顕微鏡へ曝露することを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、例えばＣＤ１４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋細胞などの免疫細胞に対する当該ＰＩＦペプチドの結合を、アフィニティークロマトグラフィーに続いて質量分析を実施してタンパク質を識別し、濃度を階級分けすることによってそれらの間の結合を比較することによって、判定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＦペプチドは、例えば、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋細胞のような免疫細胞に対する当該ＰＩＦペプチドの結合を、アフィニティークロマトグラフィーに続いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析を実施して、タンパク質を識別し、濃度を階級分けすることによってそれらの間の結合を比較することによって、判定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本結果は、濃度量の階級分けまたはタンパク質発現の定量化が変化するかどうか、あるいは、関与する異なるタンパク質または経路があるかどうかを判定するために、異常なＰＢＭＣと比較され得る。
いくつかの実施形態において、妊娠ウマ及び非妊娠ウマ由来の血清中のＰＩＦが比較され得る。いくつかの実施形態において、妊娠ウマ及び非妊娠ウマ由来の血清中のＰＩＦが比較され得る。いくつかの実施形態において、単離した細胞に対して結合している固定化されたＰＩＦは、平均±標準誤差として表し得る。いくつかの実施形態において、健常な、ＰＩＦ処置した、ＬＰＳ処置した、及びＰＩＦ＋ＬＰＳ処置したマウスにおける血清及び胎盤におけるサイトカインレベルが比較され得る。いくつかの実施形態において、本結果は、平均±標準誤差として表し得る。いくつかの実施形態において、免疫機能障害は、値に有意な変化がある場合、診断され得る。例えば、いくつかの実施形態において、有意な変化は、平均の結果の標準誤差または標準偏差の約２倍よりも大きな移行を含み得る。
いくつかの実施形態において、健常な、ＰＩＦ処置した、ＬＰＳ処置した、及びＰＩＦ＋ＬＰＳ処置したマウスにおける血清及び胎盤におけるサイトカインレベルが比較され得る。いくつかの実施形態において、本結果は、平均±標準誤差として表し得る。
いくつかの実施形態において、免疫機能障害は、値に有意な変化があった場合、診断され得る。上述の実施形態のうちのいずれにもおいて、有意な変化は、平均の結果の標準誤差または標準偏差の約２倍よりも大きな移行を含み得る。
本出願において開示するいかなる公開物も（雑誌の論文であろうと特許出願であろうと他の公開物であろうと）、それらの内容の全体が本明細書に組み込まれる。使用する方法及び材料を説明する本開示及び実施形態は、以下の非限定例に対する参照により、さらに理解され得る。
実施例１
ＰＩＦは、妊娠中に必須の役割を担っており、ＰＢＭＣに及ぼすｓＰＩＦの免疫調節効果によって実証されているように、局所免疫にだけでなく、全身的にも作用する。観処置のＣＤ１４＋単球は、ＰＩＦの主要な標的である。
本研究の目的は、ｓＰＩＦが、末梢血（ＰＢ）単球から免疫寛容原性ＤＣを生じるうえで役割を担っているかどうかを調べることであった。これらの知見は、全身性母系免疫寛容を生じるうえでのこのペプチドの起こり得る関与を示すであろう。
ＤＣは、特異的抗原特性を有することによって、及びより重要なことには、免疫調節機能（Ｔ細胞活性化を阻害して、調節性Ｔ細胞の発達及び増殖を誘導及び促進する能力）によって免疫寛容原性と定義することができる。
健常ドナーＰＢからの免疫磁気選別によって精製したＣＤ１４＋単球を、「従来の」ＤＣ分化または推定免疫寛容原性（ｔｏｌｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）分化を促進するために、異なるサイトカイン組み合わせを有する無血清条件下で培養した。
表現型特徴づけ及び機能検査も、妊娠３か月及び６か月における女性のＰＢから単離したＤＣに関して実施した。
ＰＩＦが免疫寛容原性ＤＣの発生に関与する可能性があるという知見は、妊娠および自己免疫疾患中に生じる免疫変化をさらに説明することができた。
妊娠中断についてのマーカーとしてのｐＤＣ及びｍＤＣに対するＰＩＦの結合
生育可能な妊娠を通じてのＰＩＦの産生は、胚が生存して子宮内環境を整えるために必要である。ＰＩＦは、母系免疫系統も整え、合成ＰＩＦ（ｓＰＩＦ）は、天然ＰＩＦの機能を置き換える。子宮内膜細胞及び単球／マクロファージの細胞は、ＰＩＦの主要標的である。直接的な作用を通じて、ＰＩＦは、再発性妊娠中断（ＲＰＬ）に罹患している対象に由来する血清の存在下で培養した胚の死亡を予防するための救助因子として作用する。その上、ＰＩＦは、ＲＰＬ対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性を低下させることがすでに示されている。免疫系は、ＲＰＬにおける支配的な役割を直接的または間接的のいずれかで担っているので、かつ樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答を調節するので、本発明者らは、１３人のＲＰＬ対象及び１１人の健常妊娠（ＨＰ）対象における循環Ｔｈ２促進形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）及びＴｈ１炎症促進性骨髄性ＤＣ（ｍＤＣ）に対する外来性ＰＩＦの数及び結合を比較した。
使用した材料及び試薬：ポリプロピレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）溶解溶液ＩＸ（ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ダルベッコＡ（Ｏｘｏｉｄ）、ＰＩＦ−１ ＦＩＴＣ（ロットＡＡＦ−１９２／／３８７−６６）、抗ＦＩＴＣ（ＢＤ）、抗ｈＣＤ１２３ ＰＥ（ＢＤ）、抗ｈＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（ＢＤ）、抗ｈＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ（ＢＤ）、及びＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ。
方法：１００μＬの全血を２ｍＬの溶解溶液とともに室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。試料を２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１２００ｒｐｍで遠心分離した（小休止１）。ペレットを１００μＬのＰＢＳ中で緩徐に再懸濁し、抗ＣＤ１２３抗体、抗系統カクテル抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とともに暗所においてＲＴで１５分間インキュベートした。試料を２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１２００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中で緩徐に再懸濁し、０．１１８μＭとともにＲＴで１時間インキュベートした。試料を２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１２００ｒｐｍで遠心分離した。試料を５００μＭのＰＢＳで再懸濁し、即時ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。
結果：４人のＲＰＬ対象は、ｍＤＣの１０倍超の増加を示したのに対し、７人のＲＰＬ対象は、ＨＰ群と類似の値を有しており（０．１０±０．０８）、ｐＤＣの百分率における差は観察されなかった（ＲＰＬ群における０．１１３±０．０９対ＨＰ群における０．１１６±０．０３）。在胎期間は、ＨＰ群におけるｐＤＣまたはｍＤＣのいずれの値も変更しなかった。ＰＩＦ結合細胞は、ＲＰＬ群におけるｐＤＣ及びｍＤＣにおいて等しく減少した（ｐＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４１．２±１９．２対ＨＰ群における５８．２±１８．３、ｐ＝０．０３８１、ｍＤＣ ＰＩＦ＋：ＲＰＬ群における４６．１±１４．２対ＨＰ群における５７．９±９．１、ｐ＝０．０２９）。個々のＲＰＬ対象に存在するｍＤＣのレベルとｍＤＣ ＰＩＦ＋の％の間には関連性がなかった（図１Ａ〜図１Ｄ）。これらのデータは、ＤＣに対するＰＩＦ結合の低下が、ＲＰＬの危険性に関するマーカーを表すことができることを示唆する。
実施例２
ＲＰＬの症例における妊娠前の免疫の変化の識別
ＰＩＦが健常な非妊娠対象と比較して１８回の流産歴のある対象における免疫欠如を識別することができるかどうかを判定するために、１８回の流産歴のある対象を試験した。未処置の免疫細胞及び活性化した免疫細胞の両方に対するＰＩＦの結合を検査した。概して、妊娠前は、ＰＩＦは主として、ＣＤ１４＋細胞へ結合するが、妊娠中は高フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−ＰＩＦ曝露時に結合が６０〜７０％から８０〜９０％まで高まった。それゆえ、妊娠前の結合の亢進は、免疫細胞の病的活性化を示す。そのような結合は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）にも影響する。この効果は、いくつかの遺伝子発現に及ぼす効果がありながら、サイトカイン分泌に及ぼす効果がモデル化されている、未処置の細胞において発揮される。対照的に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、抗ＬＰＳ、及び／または抗ＰＨＡによる活性化後に、免疫応答は大いに増幅される。それゆえ、ＰＩＦに対するＰＢＭＣの曝露後の不適切な応答は、妊娠前の過剰な免疫活性化を反映しており、潜在的な妊娠病理または起こり得る再発性妊娠中断（ＲＰＬ）の指数を提供し得る。
ＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合を判定するために、１８回の流産歴のある対象を試験した。加えて、所与のサイトカインを発現する本対象者のリンパ球の百分率に及ぼすＰＩＦの効果を判定し、本結果を健常対照の結果と比較した。さらに、同じ実験を、ＰＢＭＣを強力なマイトジェンである植物性血球凝集素（ＰＨＡ）１μｇ／ｍＬを用いて活性化することによって、実施した。
正常なドナーのＰＢＭＣを洗浄して、１μｇ／ｍＬのＰＨＡ及び３０ｎＭのＰＩＦ若しくはスクランブル型ＰＩＦ（ＰＩＦｓｃｒ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した（２４穴のクラスターにおける１穴あたり２．４×１０６個）。培地は、２日後の後毎日、本実験が完了する４日後まで、ＰＩＦ含有新鮮培地（ＰＨＡ非含有）と交換した。それぞれ２μＭ及び１０μｇ／ｍＬのモネンシン及びブレフェルジン（Ｂｅｒｆｅｌｄｉｎ）を収集６時間前に添加した。細胞を表面マーカー特異的抗体（ＣＤ４＋）と混合した後、製造元のプロトコル（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって固定及び透過のために加工し、サイトカイン特異的抗体（抗ＩＦＮγまたは抗ＩＬ１０）を用いて染色した。細胞は、３色分析を用いるＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーターにおいて分析した。散乱ゲート開閉は、小さな及び大きな（芽球性）リンパ球の両方を含んでおり、サイトカイン陽性細胞をすべて計数した。細胞は、１．５μｇ／ｍＬのＦＩＣへ３０分間曝露した後、接着していないリガンドを洗い落とした。その後、ＰＢＭＣに対する結合は、２色のフローサイトメトリーを用いることによって判定した。データは、ＣＤ１４＋細胞に対する結合が、対照と比較して増幅することを示した（図２）。細胞を活性化した時、差は観察されなかった。ＰＨＡの存在下で他の系統に対する結合を対照と比較して検査した時、ＣＤ４及びＣＤ８の両方に対する結合は低下したが、ＣＤ１９に対する結合の差は確認されなかった（図２）。
第二の実験において、所与のサイトカインを発現する対象のリンパ球の百分率に及ぼすＰＩＦの効果を決定し、本結果を健常対照の結果と比較した。このことは、ＰＩＦ単独及びＰＨＡによる活性化後に実施した。データは、ＰＩＦをＰＩＦｓｃｒ対照と比較するＩＬ１０、ＩＬ４、及びＴＮＦαを検査する、対照対象における２４〜９６時間の実験を示す。ＩＬ１０＋細胞の数は、対照と比較して有意に増加した。この増加に続いて、１μｇ／ｍＬのＰＨＡへの曝露９６時間後に基線に戻った。サイトカイン比を対照と比較し、３０ｎＭのＰＩＦは、炎症促進性／抗炎症性比（ＴＮＦ／ＩＬ１０／ＩＬ４）の低下をもたらした。加えて、これらのサイトカインに及ぼす０〜４μｇ／ｍＬのＰＨＡを検査した時、用量依存的応答を特記し、ここで、対照と比較したＰＩＦの最大効果は、４μｇ／ｍＬで確認された（図３〜図５、表６〜表８）。
Figure 2017535794
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その後、ＲＰＬ対象を健常対照対象と比較した。本データは、いくつかのサイトカインにおける主要な変化を示した。ＰＨＡの存在下で、ＴＮＦα／ＩＬ１０比は、ＲＰＬ及び対照対象の両方において低下した。対照的に、ＰＩＦの存在下で、ＴＮＦα／ＩＬ１０比はＲＰＬ対象において増大したが、対照対象において低下した。ＩＮＦγ基線発現は、ＲＰＬ対象においてより高かった。ＰＨＡはさらに、ＲＰＬ対象においてＩＮＦγ基線発現を亢進したが、対照対象においては４倍亢進を確認した。しかしながら、ＰＩＦの存在下で、ＩＮＦγ基線発現は、ＲＰＬ対象においてほぼ３倍低下した。ＲＰＬ対象において、基線ＩＬ４は高く、ＰＨＡによって影響されなかったが、ＰＩＦによって低下した。対照対象において、基線ＩＬ４は低く、ＰＨＡはＩＬ４を４倍高めたのに対し、ＰＩＦは、ＩＬ４を同量だけ減少させた。ＩＮＦｇ／ＩＬ４比は同様に挙動した（図６）。サイトカインにおける基線変化及びＰＨＡ誘発性変化の両方において、Ｔｈ１／Ｔｈ２の上昇のような応答の差は、免疫調節不全を示す。
実施例３
ＰＩＦは、１４−３−３タンパク質、熱ショックタンパク質及びジイソメラーゼタンパク質を標的として、免疫応答を調節する：インビボでの免疫ターゲティングについての証拠
ＰＩＦペプチドの合成
合成ＰＩＦ（ＭＶＲＩＫＰＧＳＡＮＫＰＳＤＤ；１５アミノ酸）及びスクランブル型ＰＩＦ（ＰＩＦｓｃｒ；ＧＲＶＤＰＳＮＫＳＭＰＫＤＩＡ）を、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩｎｃのＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）の化学的性質を採用する固相ペプチド合成（ペプチド合成装置，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって合成した。最終精製は、逆相ＨＰＬＣによって実施し、同一性は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析及び９５％超の純度のアミノ酸分析によって実証した。
インビトロ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光光度法試験
ＳＰＲ実験はすべて、ビアコアＸユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。実験は、３７℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５容積％を補充した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて１０μＬ／分の定常流量で実施した。界面活性剤Ｐ２０は、ランニングバッファーとしてｐＨ７．４へ調整した。まず、最適な固定化はＰＩＦ１５に対して整え、ＲＰ（陰性対照として使用）及びＴＬＲ４−ＭＤ２はｐＨスカウティングを介して測定した。ＣＭ５チップのカルボキシル化デキストランマトリックス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対するこれらのペプチドの共有結合固定化は、ＰＩＦ１５及びＴＬＲ４−ＭＤ２に対してｐＨ５．０へならびにＲＰに対してｐＨ４．０へ調整した１０ｍＭ酢酸ナトリウムを固定化緩衝液として用いる標準的なアミンカップリングを用いて実施した。ＰＩＦ１５センサー表面を利用する実験すべてについて、ＲＰは、第一基準フローセル（ＦＣ１）へ固定化し、ＰＩＦ１５は「下流の」フローセル（ＦＣ２）へ固定化した。センソーグラムは、基準減算シグナル（すなわち、ＦＣ２−ＦＣ１）として提示する。１μＭの濃度でＨＢＳ−ＰＥ中に懸濁したＣＤ１４及びＴＬＲ４−ＭＤ２は各々、ＰＩＦ１５センサー表面上を通過し、ＰＢＭＣＳに及ぼす効果がＰＩＦとＣＤ１４またはＴＬＲ４−ＭＤ２との結合を介して生じるかどうかを評価した。（ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、大腸菌ＥＨ１００由来の粗面（Ｒａ）ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来の平滑ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＰＩＦ１５センサー表面上を通過して、ＰＢＭＣに及ぼす刺激物質（ＰＨＡ及びＬＰＳ）活性に対するＰＩＦの調節効果がＰＩＦと当該刺激物質の間の直接的な相互作用の結果であるのかまたは同族細胞効果を有するＰＩＦ由来なのかを検査した。刺激物質は、ＨＢＳ−ＰＥ中に（ＰＨＡについては２．５、５若しくは１０μＭで、またはＬＰＳについては５、２５若しくは１００μＭで）懸濁した。ＰＩＦ特異的モノクローナル抗体（クローンＰＩＦ−１／ＧＥＮＨ１．１２．７）（Ｇｅｎｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＨＢＳ−ＰＥ中に（１０００、５００または２５０ｎＭで）懸濁し、陽性対照としてＰＩＦセンサー表面上に負荷した。ＴＬＲ４センサー表面も作製して（ＴＬＲ４はＦＣ２中に固定化した）、ＰＩＦとＴＬＲ４の間の相互作用の可能性をさらに評価した。ＰＩＦは、０．５ｍＭの濃度でＨＢＳ−ＮＥ中に懸濁し、ＴＬＲ４センサー表面上に負荷した。
ＰＢＭＣ結合試験
不妊治療を経験した非妊娠対象は、標準的なインフォームドコンセントに署名した。試験は認可ＣＡＲＩ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（イリノイ州シカゴ市）であった。血液は、識別子を有さない過剰な検体を使用する精密検査方法の一部として採取した（ｎ＝１２）。追加の試料を得た。ＰＢＭＣは、末梢血から単離した（フィコール・ハイパック密度勾配法）。ＰＢＭＣは、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ、ＦＩＴＣ−ＰＩＦｓｃｒ、及び大きさの符合した無関連ペプチドを（０〜１００μＭ）濃度で、抗体カクテル（抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３；ＰＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともにインキュベートした。アイソタイプ抗体は、陰性対照として使用した。２色及び３色染色を実施した。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーターによる蛍光測定（２００００〜５００００回ゲート開閉した事象／試料）は、Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩソフトウェア（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。
ＰＢＭＣ
同意を得た後の３名の異なる非妊娠健常ドナーから全血ユニットを得た。フィコール・ハイパックを用いることによる分離の後、単離したＰＢＭＣは、ＣＤ１４、ＣＤ４またはＣＤ８アフィニティカラムを用いて個別に各ユニットを通過させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地中で凍結させ、さらなる加工のためにＥｐｒｏｇｅｎへ−８０℃で搬送した。
ＣＤ１４、ＣＤ８及びＣＤ４細胞抽出
ＰＩＦ樹脂アフィニティカラムは、本試験のために特別に設計され、通常使用する多ステップ法の代わりに用いた。本データは、ＰＩＦカラムのみを対照との比較として示した（アガーのみのカラムは、特定のタンパク質を抽出することができた）。簡潔には、ＰＩＦ１５に対し、Ｎ末端にある炭素スペーサー（Ｃ６）に続いて当該末端にシステインがあり、次に、システインのチオール基をアガロース樹脂（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，テキサス州）へ複合体化させた。細胞の抽出のためのプロトコルは次の通りであった。５０μＬ／ｍＬのＰＩＦ樹脂を１分間遠心分離し（６，０００×ｇ）、コンパクト反応チューブ（ＣＲＴ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）中の１５０μＬの非洗剤系溶解緩衝液（ＮＤＬＢ）（Ｅｐｒｏｇｅｎ）で遠心分離により２回洗浄した。８〜１０Ｍの細胞を含有するバイアルを１．５ｍＬのＮＤＬＢで、−８０℃に至る２回の凍結解凍周期によって溶解し、結果として生じる可溶化液を約６０００×ｇで遠心分離した。４５０μＬの可溶化液上清を、洗浄した樹脂を含有するＣＲＴへ添加し、これうぇお４℃で１時間、間欠的にボルテックスしてインキュベートし、良好なＰＩＦ樹脂−タンパク質接触を確実にした。当該管を１分間遠心分離した（６０００×ｇ）後、１００ｍＬのＮＤＬＢで２回洗浄した。濾液を組み合わせ、ＰｒｏｔｅｏＳｅｐ（登録商標）ＲＰ ＨＰＬＣ実行のために４００μＬの総容積へ希釈した。可溶化液で処理した樹脂を１５０μＬの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ溶液で２回、ボルテックスによって１０分間抽出した後、１分間遠心分離した。ＰＩＦ抽出したタンパク質を含有する結果として生じる濾液を組み合わせ、ＭＳ分析前に−８０℃で凍結した。
プロテオミクスＭＳ分析：トリプシン消化
タンパク質抽出物の溶液中トリプシン消化を、製造元の手順により、フィルター支援型試料調製消化キット（ＦＡＳＰ）を用いて実施した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）。簡潔には、上述由来の４０μＬのタンパク質可溶化液を４μモルのＤＴＴで、室温で１時間還元した。この試料をスピンフィルター中の２００μＬの尿素試料溶液と混合し、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。さらなる２００μＬの尿素試料溶液で洗浄した後、試料のフロースルーを廃棄した。スピンフィルター上のタンパク質を９０μＬの尿素試料溶液中のヨードアセトアミド中、暗所で２０分間アルキル化した。フィルター中のタンパク質を１００μＬの尿素試料溶液で２回洗浄し、１４０００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）をスピンフィルターへ添加し、１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、２回以上反復した。トリプシン消化を３７℃で一晩、１：１００のトリプシン：タンパク質比を用いて実施した。インキュベーション後、スピンフィルターを４０μｌの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で２回洗浄し、１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、濾液を清潔な管へ収集した。５０μｌの０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加して、１４０００×ｇで１０分間遠心分離することによってペプチドを抽出した。トリプシン処理したペプチドを含有する収集した濾液を、５μｌのギ酸で酸性化し、Ｃ１８固相抽出（ＳＰＥ）（ＳｕｐｅｌｃｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳＰＥ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を介して脱塩した。濾液を真空下で乾燥させ、トリプシン処理したペプチドを、その後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために２０μＬの０．１％ギ酸中で再懸濁した。
プロテオミクスＭＳ分析：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
試料は、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｖｃｌｏｓ二重圧リンカーイオントラップシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）へ連結したＥａｓｙ ｎＬＣ−ＩＩシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いた逆相ナノフロー液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。標準的なウマチトクロムＣ消化物を品質の対照として注入した。２マイクロリットルの試料をトラップカラム（ＥＡＳＹ−Ｃｏｌｕｍｎ ２ｃｍ、内径１００μｍ、５μｍ、Ｃ１８−Ａ）上へとオートサンプラーを介して負荷した後、分析用カラム（ＥＡＳＹ−Ｃｏｌｕｍｎ、１０ｃｍ、内径７５μｍ、３μｍ、Ｃ１８−Ａ２）へと２５０ｎＬ／分の流量で方向づけた。移動相は、溶媒Ａ（０．１％ギ酸含有９９．９％水）及び溶媒Ｂ（０．１％ギ酸含有９９．９％アセトニトリル）からなった。分離は、１００分の実行時間を用いて達成した。第一の線形勾配は、９０分間の２％〜４０％Ｂであり、第二の線形勾配は、５分間の４０％〜８０％Ｂであり、５分間保持した後、初回移動相組成（２％Ｂ）へと戻した。タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）は、データ依存走査によって所与のクロマトグラフィー時点で上位１０の多量のイオンに関して獲得した。
プロテオミクスＭＳ分析：ペプチド／タンパク質識別
タンデム質量スペクトルはすべて、Ｘｃａｌｉｂｕｒ第２．７．０版によって抽出し、Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ）によって分析し、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ．Ｓｅｑｕｅｓｔ（第１．３．０．３３９版）及びＸ！Ｔａｎｄｅｍをセットアップして、トリプシンで指標を付けた逆に鎖状につながれたＩＰＩマウスタンパク質データベース（第３．８６版、１１９０６８件登録）を、０．８Ｄａの断片イオン質量耐性及び２．０Ｄａの親イオン耐性で検索した。システインのカルバミドメチル化は、固定化した修飾としてＳｅｑｕｅｓｔ及びＸ！Ｔａｎｄｅｍにおいて指定し、メチオニンの酸化は種々の修飾としてであった。Ｓｃａｆｆｏｌｄ３（ＰｒｏｔｅｏｍｅＳｏｆｔｗａｒｅ，オレゴン州ポートランド市）を用いて、Ｓｅｑｕｅｓｔ検索結果を編集し、ＭＳ／ＭＳに基づいたペプチド及びタンパク質の識別を確証した。ペプチドの識別は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズムによって指定されたように９５．０％を超える確率で確立することができる場合に受理した。タンパク質の識別は、９９．９％を超える確率で確立できかつ少なくとも２つの識別されたペプチドを含有する場合に適合するとした。タンパク質の確率は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズムによって割り当てられた。標識のない相対量の定量化は、スペクトル計数アプローチによって実施した。
ＰＩＦ結合試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００μＬの５００ｎＭ ＦＩＴＣ−ＰＩＦを静脈内または腹腔内注射した。それぞれ５分後または３０分後に、マウスを屠殺し、ヘキサンドライアイス浴中に浸漬し、凍結培地中に包埋し、４０μｍの全身切片を作製した。切片を脱水し、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ蛍光を撮像するための励起波長（２９５ｎｍ）に設定したＴｙｐｈｏｏｎ（商標）９１４０バイオアナライザー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて走査した。ＦＩＴＣ−ＰＩＦへ氷上で１時間曝露したＣ５７ＢＬ／６マウスから白血球または脾細胞を収集した。細胞を洗浄し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁し、ＦＩＴＣ−ＰＩＦと結合する細胞の百分率を、ＰＥ／ＣＤ４５＋標識細胞に対してゲート開閉する２色フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。
フローサイトメトリー試験
異なる濃度のＦＩＴＣ−ＰＩＦへ氷上で１時間曝露したＣ５７ＢＬ／６マウスから白血球または脾細胞を収集した。細胞を洗浄し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁し、ＦＩＴＣ−ＰＩＦと結合する細胞の百分率を測定した。循環ネズミ免疫細胞に対するＰＩＦの結合と関係した細胞タイプの識別を検査した。免疫細胞は、屠殺後に収集した。収集した細胞をＦＩＴＣ−ＰＩＦ（１２．５〜５０μｇ／ｍＬ）の溶液とともに、抗ＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともにインキュベートした。アイソタイプ対照は、陰性対照として機能した。２色染色は、従来の技術を用いて実施した。蛍光測定（試料あたり２００００〜５００００例のゲート開閉した事象）は、データ獲得及び分析用のＳｙｓｔｅｍ ＩＩソフトウェアを使用するＣｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）において実施した。
統計分析
データは、ダネット誤差保護を備えた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析し、９５％の信頼区間は、データ分析用のマイクロソフトエクセルのためのＡｎａｌｙｓｅ−ｉｔ（登録商標）（Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｔｄ）を用いて算出した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とみなした。経路分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアを用いて実行し、所与の経路のタンパク質確率における遺伝子の最大の数による等級分けは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｊｅｃｔアルゴリズムソフトウェアを用いて分析した。タンパク質標的はクラスター化及び相互作用を、Ｓｔｒｉｎｇ第９．１版ソフトウェアを用いて決定した。
ＰＩＦは、ＰＢＭＣに直接作用する
ＰＩＦは、マクロファージによるＬＰＳ（リポ多糖、細菌抗原）誘発性一酸化窒素（ＮＯ）産生を防止する。それゆえ、ＰＩＦが免疫細胞に直接作用するかどうか、または阻害作用が直接的なペプチド−ＬＰＳ相互作用による阻害効果であるかどうかを判定することは重要であった。ＰＩＦと粗面ＬＰＳ（Ｒａ ＬＰＳ）または平滑ＬＰＳ（Ｏ５５：Ｂ５ ＬＰＳ）の間の相互作用能力は、頑強かつ高感度の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を介して評価した。本方法は、リガンド−センサー相互作用が生じる場合に偏差するレーザービームを利用する。抗ＰＩＦモノクローナル抗体の使用で、センサー表面に対するＰＩＦの結合が活発であることを確認した。その後、５、２５及び１００μＭ濃度における２つのＬＰＳ分子は、ＰＩＦ結合センサー上を通過した（図７Ａ及び図７Ｂ）。本データは、検査した全濃度において、観察可能なＬＰＳ（リガンド）及びＰＩＦ−センサー相互作用を実証しなかった。ＬＰＳは主として、免疫シナプスを活性化するようマクロファージ上のＣＤ１４受容体を標的化することによって作用する。しかしながら、ＬＰＳは、ＣＤ１４受容体とは無関係に作用することもできる。加えて、ＰＩＦは主として、刺激されていないＣＤ１４＋細胞を標的とする。
それゆえ、本発明者らは、ＰＩＦがＣＤ１４受容体を介して免疫細胞と直接相互作用するかどうか、またはＰＩＦがＴＬＲ４−ＭＤ２部位の下流を代替的に標的とするかどうかを検討した。ＴＬＲ−４経路の阻害は、免疫細胞上のＰＩＦの効果を遮断する。しかしながら、この情報は、リガンド自体がＰＩＦによって標的とされるかどうかを完全に除外するものではない。ＳＰＲを基にした分析は、高濃度で試験した場合でさえ、ＰＩＦが受容体自体もその下流仲介因子ＴＬＲ４−ＭＤ２も標的としないことを示した（図８Ａ）。この相互作用がないことをさらに確認するために、ＴＬＲ４−ＭＤ２表面も構築し、高濃度（０．５ｍＭ）のＰＩＦへ曝露した（図８Ｂ）。そ‘のような高濃度でさえ、固定化したＴＬＲ４−ＭＤ２に対するＰＩＦの適切な結合が観察できなかった。したがって、ＰＩＦは、活性化因子との相互作用を介した二次的な相互作用を通じてよりもむしろ特異的な標的を包含する同族細胞過程を通じて採用する。
ＰＩＦは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞を標的とする
ＰＩＦは１０％未満のＴ細胞と結合し、これはマイトジェンの存在下で大いに拡大する効果である。調節性Ｔ細胞が耐性における主要な役割を担っているので、本発明者らは、ＰＩＦが未処置の細胞においてこの重要な細胞サブタイプと相互作用するかどうかをさらに検討した（図９）。２色のフローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、未処置のＣＤ３＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合を検討し、用量依存的結合を示した（図９Ａ及び図９Ｂ）。さらにＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞に対する結合を測定し、ＰＩＦはこれらのＴｒｅｇ細胞を標的とすることを示した（図９Ｃ）。対照的に、ＰＩＦは、ゲート開閉したＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞へ結合できず、その相互作用の特異性を反映していた（データ非表示）。図９Ｄは、アイソタイプ対照が有意な結合を示さなかったことを示しており、ＰＩＦの特異性を示している。その後、本発明者らは、ＰＩＦが標的とする細胞がＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋であるかどうかを検討した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、これらの細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合が用量依存的であり、かつ当該結合が、最低減の結合を有することが公知のスクランブル型ＰＩＦと比較して高いペプチド用量で増幅されることを示している。このようなデータは、ＰＩＦが調節性Ｔ細胞を特異的に結合することを示している。
ＰＩＦは、刺激していないヒトＣＤ１４細胞、ＣＤ４細胞、及びＣＤ８細胞におけるタンパク質を標的とする
胚におけるＰＩＦタンパク質標的の識別のための新規の方法が開発及び確証された。本方法は、ＰＩＦアフィニティークロマトグラフィー後の質量分析に基づいている。ＰＩＦは、刺激していないＣＤ１４＋細胞を標的とするが、ＰＩＦは、当該受容体またはその下流の仲介因子へ結合しない。それゆえ、本発明者らは、生得的細胞（ＣＤ１４＋）及び免疫の適応部分に属する細胞（ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞）の両方における免疫細胞における特異的ＰＩＦ標的を識別することを目的とした。健常ドナー由来のある全単位の血液を用いて、ＰＢＭＣをまず分離し、その後、９５％超の純度に到達する抗ＣＤ１４＋抗体カラムを通過させた。次に、収集した細胞を抽出し、抗ＰＩＦ系アフィニティークロマトグラフィーを通過させた。図１１は、抽出後のＣＤ１４＋細胞のクロマトグラフィー特性を示す。非常に多数のタンパク質を抽出物中で識別した。対照的に、濾液における抽出後、タンパク質の数は少なく、生得的ＰＩＦ−タンパク質相互作用を示した。明らかに、存在する総タンパク質のうちのわずかな部分のみがＰＩＦアフィニティ樹脂上に保有されているのに対し、可溶化物中のタンパク質のほとんどは溶出されている。第一の抽出後の残余の保有されていないタンパク質のその後の再抽出は、追加のタンパク質が可溶化物から抽出されないことを示し、ＰＩＦアフィニティカラム抽出が完全であり、ＭＳによって識別されたタンパク質に対して特異的であることを示した。非洗剤系溶解緩衝液の使用が決定的であることを特記することは重要である。洗剤を含有する溶解緩衝液を使用した場合、タンパク質抽出が上手くいかなかったことが観察された。
同様に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＰＢＭＣを全単位の血液から単離した後、それぞれ、抗ＣＤ４＋抗体カラム及び抗ＣＤ８＋抗体カラムを用いて精製した。収集した細胞を各々溶解し、ＣＤ１４＋細胞と同じ様式で、半定量質量分析によって抽出した。収集した細胞を各々抽出し、収集したタンパク質を識別した。ＰＩＦタンパク質標的の主要な細胞位置を検討すると、大部分は細胞質位置に認められ、その他は核に、及びまれに膜に存在した。このような観察は、新規のクロマトグラフィー法がＰＩＦ結合パートナーを識別するための頑強な手段であることを示す。これらのＰＩＦアフィニティカラム抽出物から単離したタンパク質は次に、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。以下の表９〜表１１は、ＣＤ１４細胞における７０超のタンパク質標的がＰＩＦアフィニティ抽出及びＬＣＭＳＭＳによって識別され、当該タンパク質標的のうちのいくつかは同じクラスに属するアイソタンパク質であったことを示す。表１２及び表１３は、ＰＩＦ抽出物がＣＤ４及びＣＤ８リンパ球に非常に類似していることを明確に示すＣＤ４及びＣＤ８の細胞可溶化液について識別したタンパク質を詳述する。さらに、識別したＣＤ１４タンパク質をＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についてのＣＤ１４タンパク質と比較する時（表１４）、ＰＩＦが、これらの免疫細胞系列における十分に規定したクラスのタンパク質を特異的に標的にし、３つの系列すべてについて抽出したタンパク質がほぼ同一であることを示す明確な事態が生じる。ターゲティングにおけるこの特異性は、免疫応答のＰＩＦ調節の性質を解読する上で役立つべきである。
Figure 2017535794
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ストリングソフトウェア分析：ＰＩＦは、ＣＤ１４細胞における４つの主要タンパク質群１７９、すなわちＰＤＩ／ＨＳＰ、ビメンチン／１４−３−３、マクロファージ／好中球の活性化、細胞遊走及び膜アーキテクチャを標的とする
ＣＤ１４細胞において、いくつかは、同じクラスに属するアイソタンパク質である。それゆえ、クラスター分析を実施して、タンパク質標的をより良好に定義し、観察した異なる群のタンパク質を連関させる中枢的なタンパク質を識別した（図１５）。主要な相互作用因子は、ビメンチン、カルモジュリン、ＳＥＴ−核癌遺伝子（アポトーシス阻害薬）及びミオシン９（ＭＹＨ９）であった。本分析は、タンパク質の４つの主要な群、すなわち、ＰＤＩ／ＨＳＰ、ビメンチン／１４−３−３、免疫活性化、及び細胞骨格に関与するものを識別した。ストリングソフトウェア系分析によって、本発明者らは、生物学的機能を基にした有意な等級分けをＰＩＦタンパク質が標的とすることを判定でき（表１５）、アクチン及び一酸化窒素の調節は、同様に細胞外エキソソームにおいても識別され及び有効な細胞間連絡を可能にする細胞の外側へ輸送することのできるタンパク質であり得るほとんどのタンパク質と最高に連結し得ると等級分けした。
Figure 2017535794
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ＣＤ１４＋細胞において、ＰＩＦは、ビメンチン及びＰＤＩを標的とする：酸化的ストレスにおける役割
抽出後、ＣＤ１４＋タンパク質は、質量分析を用いて識別した。先の表９〜表１１に列挙したように、およそ７０のタンパク質標的を識別した。ＰＩＦは、サイトカインの分泌及び発現、及び未刺激のまたは活性化されたヒトＰＢＭＣにおけるいくつかの他の遺伝子を調節する。識別した標的すべてのタンパク質群約１０％を表した１４−３−３群が最高である。当該標的の構造は、２つの異なるサブタイプを結合する二量体として非常に同様に機能している。これらの多機能性足場であるホスホセリン／ホスホトレオニン結合タンパク質は、細胞シグナル伝達、ストレスに対する応答及びアポトーシス促進性シグナルＢａｄ及びＢａｘの遮断に関与している。当該タンパク質は、同様に、いくつかのタンパク質、酵素及びペプチドを標的とする。したがって、１４−３−３タンパク質は、ＤＮＡ損傷を調節し得る。３８ ２１３ この群の最高の等級分けは、血小板、マスト細胞の活性化及びアポトーシスを調節する１４−３−３ｚ／ｄであった。このタンパク質は、同時活性化したＰＢＭＣ（Ｇｅｏ――――）において増加した（６倍）ＣＤＣ２５Ａ／Ｂ／Ｃ細胞分裂周期プロモーターを標的とする。アイソ−１４−３−３イプシロンタンパク質は、ウイルス複製及びアポトーシスを調節する。３８ ２１７。１４−３−３テータは、包含された神経変性である。全体的なＰＩＦのターゲティング及びもしかしたら調節している１４−３−３タンパク質は、細胞機能の大きなかつ多様的な全部におけるＰＩＦの役割に対する信頼性を付与する。それゆえ、本発明者らは、ＰＩＦがこれらの標的へ結合するかどうか、及びＰＩＦが当該標的の発現も調節することができるかどうかを検討した。ビメンチンは、ＰＩＦが標的とする最高の等級分けタンパク質であった。マクロファージにおいて、このタンパク質は、酸化的ストレスを調節し、敗血症に対する応答において主要な役割を担っている。ビメンチン発現は、ＰＢＭＣ同時活性化の４時間後に低下した（２．２倍）。さらなる標的は、細胞ストレス機能障害を低下させるタンパク質ジイソメラーゼ／チオレドキシン（ｔｈｏｒｅｄｏｘｉｎ）（ＰＤＩ）であった。ＰＩＦは、この群の主要なタンパク質である２つのタンパク質ＰＤＩ及びＰＤＩ Ａ４を標的とする。ＰＤＩ分子は、４つのチオレドキシンドメインを含有する。ＰＩＦのＲＩＫＰ活性部位は、ＰＤＩ及びＨＳＰを標的とする。
ＰＩＦは、熱ショックタンパク質及び１４−３−３タンパク質を標的とし及び調節する：タンパク質ミスフォールディング及び細胞生存を調節する上での役割
適切なタンパク質の折りたたみ及び細胞保護は、細胞機能に対して決定的である。ＰＩＦは、タンパク質のＨＳＰクラスター、すなわち、この重要な過程を制御するＨＳＰ９０Ｂ−Ｏ、ＨＳＰ９０Ｂ１、アイソ２−ＨＳＰＡ、及びＨＳＰ７０Ａ５を標的とする。同時活性化したＰＢＭＣにおいてのみ、ＨＳＰ９０／Ｂ遺伝子が上方調節されるのに対し、ストレス応答発現に関与するＨＳＰ７０は減少した。
群内で識別した最多数のＰＩＦ結合標的は、１４−３−３タンパク質であり、当該タンパク質は、識別した標的すべての約１０％であった。当該タンパク質は、細胞シグナル伝達、ストレスシグナル伝達に対する応答、ならびにアポトーシス促進性シグナルＢａｄ及びＢａｘを遮断する上で重要な役割を担っている多機能性足場であるホスホセリン／ホスホトレオニン結合タンパク質である。当該タンパク質は、いくつかのタンパク質、酵素及びペプチドを同様に標的とする。当該タンパク質のうちで最高と等級分けされるのは１４−３−３ｚ／ｄであった。１４−３−３ｚ／ｄタンパク質は、血小板、マスト細胞活性化、及びアポトーシスを調節する。したがって、１４−３−３は、ＤＮＡ損傷を制御することに関与することができた。ＰＩＦは、未処置のＰＢＭＣにおいて発現を高めた（２．８倍）。アイソ１４−３−３イプシロンは、ウイルス複製及びアポトーシスを調節する。対照的に、１４−３−３エータ発現は、同時活性化後に低下した（−２．４倍）。１４−３−３ガンマは、グルコース代謝に関与するインスリン様成長因子受容体へ結合する。データは、ＰＩＦが、この群のメンバーをほとんどすべて調節及び標的とすることを示し、細胞生存及び機能に及ぼす複雑な調節効果をあきらかにしている。
本発明者らは、ＰＩＦが、ジスルフィドイソメラーゼ／チオレドキシン（ＰＤＩ）及びＰＤＩ Ａ４を胚だけでなく免疫細胞においても標的とすることを発見した。これらのタンパク質は、シャペロンとしてタンパク質の凝集、ならびに異常な折りたたみ及び酸化的ストレスに対する（チオレドキシンを通じての）保護を防止するシャペロンとして作用する。このＰＤＩ機能を補充するため、ＰＩＦは、ただ保護することだけでなく細胞ストレス、タンパク質ミスフォールディングも低下させ、細胞生存に必要とされる決定的な機能を有する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、ＨＳＰ ９０Ｂ−Ｏ、ＨＳＰ ９０Ｂ１、アイソ２−ＨＳＰＡ、及びＨＳＰ７０Ａ５）も標的とする。ＨＳＰ関連遺伝子も、ＰＩＦによって同様に調節される。免疫活性化後、ＨＳＰ９０群の遺伝子は増加したのに対し、ＨＳＰ７０は減少して、起こり得る保護的自己調節を示唆した。総合的なＰＩＦターゲティングは、保護的な役割を支持する。
ＰＩＦは、ミオシン９及びチモシン−アルファ−１を標的とする：マクロファージ及び好中球の活性化における役割
最高と等級分けされたタンパク質標的は、ミオシン９であった。ミオシン９は、同様にＰＩＦ標的であるカルモジュリンと相互作用するマクロファージの膜の突出及び走化性に関与する。ＰＩＦは、チモシン−アルファ１も標的とする。チモシン−アルファ１は、ヒストンＨ４（ＰＩＦ標的）と相互作用し、日和見感染及びウイルス感染に対する抵抗性の発達を支援する。ＰＩＦは、Ｓ１００Ａ８を標的とし、それは白血球及びマクロファージの両方を活性化する。対応するＥＦハンドカルシウム結合ドメインが２４時間（−８．８倍）及び４８時間（−２．２倍）で、未処理ＰＢＭＣにおいて下方調節された。リンパ球特異的タンパク質１型は、好中球の活性化及び走化性に関与する。
ＰＩＦは、ミオシン９及びチモシン−アルファ−１を標的とする：マクロファージ及び好中球の活性化における役割
保護のほかに、生得的免疫活性化は、ホメオスタシスを維持するはずである。ＰＩＦは、活性化型マクロファージを標的とする。この群において、最高と等級分けされたタンパク質標的は、本データからもＰＩＦ標的と識別されるカルモジュリンと相互作用するマクロファージの膜の突出及び走化性に関与するミオシン９であった。ＰＩＦは、日和見感染及びウイルス感染に対する抵抗性の発達を支援するヒストンＨ４（ＰＩＦ標的）と相互作用するチモシン−アルファ１も標的とする。ＰＩＦは、白血球及びマクロファージの両方を活性化するタンパク質Ｓ１００Ａ８を標的とする。リンパ球特異的タンパク質１型は、好中球の活性化及び走化性に関与する。したがって、識別したタンパク質標的は、生得的免疫制御に必要とされるマクロファージ及び好中球の両方を制御する。
ＰＩＦは、細胞骨格タンパク質を標的とする：細胞及び膜アーキテクチャにおける役割
細胞移動において主要な役割を有するアクチンは、ＰＩＦ結合試験において識別した最高と等級分けされたタンパク質のうちの１つであった。識別した他のＰＩＦ結合タンパク質は、アクチンの安定化において主要な役割を担っているトロポミオシンアルファ１、３、４、ならびにアクチンを調節し及び膜の構造を維持することに関与するトロポモジュリンであった。ＰＩＦ標的は、細胞移動における主要な役割を担っているアクチン１を最高と等級分けした。本データと関連しているのは、ＰＩＦが、アクチンの安定化における主要な役割を担っておりかつタリン１と相互作用もするトロポミオシンアルファ１、３、及び４へも結合することである。タリン１は、トロポモジュリン（ＰＩＦによってこれも標的とされる）とともに、膜構造の完全性を支持するよう作用する細胞膜へ細胞骨格を結合させることに関与する。顕著なことに、これらのデータは、免疫細胞の完全性を維持する上で重要な役割を担っているＰＩＦを明確に示している。
ＰＩＦは、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞における限定された数の標的へ結合する：凝固における役割
ＰＩＦが未刺激のＴ細胞の約５％を標的とすることを実証したので、本発明者らはさらに、これら２つの系列におけるタンパク質標的を検討した。Ｔ細胞活性化を有しないＰＩＦ結合が低いという事実を認識して、本発明者らは、各ＣＤ４またはＣＤ８のＰＩＦ標的分析のために全単位の血液を用いた。ＰＢＭＣ由来の２名の異なるドナーを用いて、ＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞を分離及び抽出した。この後、ＰＩＦベースのアフィニティークロマトグラフィー及び質量分析を実施した。本発明者らは、両Ｔ細胞部分系列における標的数が、識別したＣＤ１４＋標的に関して観察した数と比較して３０％未満と非常に低いことを発見した（表１６〜表１８）。ほとんどのタンパク質標的９５％超は、３つの細胞調製物（ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ８）すべてにおいて符合した。ＣＤ４及びＣＤ８におけるタンパク質標的を比較すると、２１／２４例において、当該タンパク質標的は符合した（表１９）。これらの結果は、異なる対象における分離及び方法分析の再現性を支持している。
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本結果は、同数のＰＢＭＣを単離したすべての場合においてデータの再現性を確認するために非常に重要である。このことは、未刺激のＴ細胞において存在する少ない結合による少ない検出に関する何らかの可能性を回避した。ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞に対して共通の軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質は、ＣＤ１４細胞において認められなかった。細胞外の場所に、そこのみではないが、主に存在するこのタンパク質は、関節炎に関与し、トロンボスポンジンファミリーの一部としてであり、同様に、トロンボスポンジン４も、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞においてのみ認められた。トロンビン軽鎖は、ＣＤ４細胞においてのみ確認された。トロンビン軽鎖は、フィブリノーゲンからフィブリンへの転換において主要な役割を有しており、凝固カスケードにおけるいくつかの因子の活性化に関与している。プレｍＲＮＡスプライシングと関連したセリン／アルギニンリッチスプライシング因子２は、ＣＤ１４＋及びＣＤ４＋の系列にとって共通である。細胞骨格を細胞膜と連関させるタリン１細胞骨格タンパク質は、ＣＤ１４＋細胞及びＣＤ８＋細胞に共通であった。このタンパク質は、好中球の回転に関与している。本データは、ほとんどのＰＩＦ標的がＣＤ１４、ＣＤ８、ＣＤ４系列によって共有されていることを含意する。
ＰＩＦは、インビボでの全身免疫を標的とする
インビトロで培養したＰＩＦは、ヒト免疫系を標的とする。しかしながら、このことがインビボでも生じるかどうかは、これまで確立されていない。ＰＩＦが未処置のマウスにおける免疫系を標的とするかどうかを判定するために、ＦＩＴＣ−ＰＩＦを皮下注射（ＩＶ）または腹腔内注射（ＩＰ）した後、５分後及び３０分後にそれぞれ屠殺した。体内のＰＩＦの全体的な分布を、撮像を通じて分析した。データは、５分以内で、標識したＰＩＦの主な取り込みが、脾臓及び骨髄内で確認されることを明らかにした（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。標識したペプチドの主要な蓄積が、腎臓において観察され、迅速なクリアランスを反映していた。ＩＰ注射後、取り込み及びクリアランスは、予期したように、ＩＶ投与後よりも緩徐であった。このことは、腎臓がＰＩＦクリアランスの主要部位であることを示す。
ＦＩＴＣ−ＰＩＦは、循環ＣＤ４５＋免疫細胞へ結合する
ＰＩＦが、インビボでの免疫系を直接標的とすることをさらに確認するために、本発明者らは、未処置のマウスにおける循環ＣＤ４５＋細胞とのＦＩＴＣ−ＰＩＦ相互作用を検討した。これらは、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原受容体シグナル伝達の調節因子である。２色フローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、１２．５〜５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ＰＩＦへ曝露した場合、単離した循環マウス白血球とともにインキュベートしたＦＩＴＣ−ｓＰＩＦが、当該細胞の最多２５％を結合しており、検査したペプチド濃度２３〜２５％においてそれぞれ差は認められなかったことを発見した。このことは、未処置のマウスにおいて、免疫が活性化される場合に観察されるものとは対照的に、ＰＩＦ標的が限定されていることを示している。直接的なＰＩＦ−脾臓と免疫細胞との相互作用は、インビトロの試験においてさらに確認した（図１２Ｃ）。エクスビボでのＣＤ４５細胞に対する結合も確認した（図１２Ｄ）。このことは、ＰＩＦがその短い循環半減期にもかかわらず、全身免疫を標的とすることを確認した。
ＰＩＦは、１４−３−３エータタンパク質バイオインフォマティクス立体配座を標的とする
１４−３−３タンパク質は、当該タンパク質の足場構造及び可撓性により、多数の標的と相互作用することが公知である。これらのタンパク質とＰＩＦの間の起こり得る密接な相互作用をさらに定義するために、本発明者らは、バイオインフォマティクスを用いて、当該タンパク質と異なるタンパク質との相互作用を検討した。本データは、ｐＩＦと有意に相互作用している群のうちの唯一のメンバーが１４−３−３エータであることを明らかにした（図１３）。興味深いことに、有意な結合は、当該タンパク質がペプチド２ＢＴＰと複合体形成する場合にのみ存在していた。他の１４−３−３タンパク質に対する結合の分析は、あまり有意ではなかった。このことは、１４−３−３タンパク質が、当該タンパク質の複数の結合パートナーにより、免疫応答を調節するためにＰＩＦと相互作用し得ることを含意する。
ＳＰＲ分析：ＬＰＳ、ＣＤ１４または下流のＴＬＲ４−ＭＤ２と係合せずにＰＢＭＣに及ぼすＰＩＦの直接的な作用についてのエビデンス
本発明者らは、ＰＩＦがマクロファージによるＬＰＳ（リポポリ多糖細菌抗原）誘導性一酸化窒素（ＮＯ）産生を防止することを既に観察している。１７，１８ ２６０それゆえ、このことは、当該阻害作用が直接的なペプチド−ＬＰＳ相互作用によるかどうかに対して重要であるＰＩＦと粗面ＬＰＳ（Ｒａ ＬＰＳ）と滑面ＬＰＳ（Ｏ５５：Ｂ５ ＬＰＳ）の間の結合を、ＰＩＦ結合センサー上を通過させることによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて検討した（図７Ａ及び図７Ｂ）。ＬＰＳ（リガンド）とＰＩＦ−センサーとの相互作用は、検査した濃度すべてにおいて観察された。それゆえ、本発明者らは、ＰＩＦがＣＤ１４受容体またはそのすぐ下流にあるＴＬＲ４−ＭＤ２リガンドを標的にするかどうかを検討した。ＳＰＲ系分析は、高濃度で検査した場合でさえ、ＰＩＦが受容体も、すぐ下流にある仲介因子も標的としないことを示した（図８Ａ）。高濃度（０．５ｍＭ）のＰＩＦにおけるＴＬＲ４−ＭＤ２表面との相互作用がないことも確認した（図８Ｂ）。ＰＩＦはそれゆえ、活性化因子との二次的相互作用を通じてよりもむしろ、特異的標的を包含する同族の細胞過程を通じて作用する。
ＰＩＦの効果は、ＴＬＲ４下流タンパク質に依存する可能性が高い
本発明者らは、ＰＩＦがＴＬＲ４と結合しないが、ＴＬＲ４ｓｉＲＮＡがペプチド効果を遮断したことを既に示した。ＴＬＲ４は、ＣＤ１４＋細胞によって大部分が発現し、それゆえＰＩＦ標的は、ＴＬＲ４効果の伝達に関与するタンパク質を検討することが可能なこれらの細胞において識別される（図１６）。本データは、ＰＩＦによって標的とされる３つの主要タンパク質、すなわち免疫活性化に関与するミオシン９、チモシンａ１、ならびにＴＬＲ４作用に有意な１４−３−３エータを示した。それゆえ、ＴＬＲ４阻害薬による当該シグナル伝達タンパク質のいずれの破壊も、炎症応答を制御するＰＩＦの能力を損ない得る。
免疫細胞ターゲティングにおける追加の役割：ＣＤ４＋細胞及び２８１個のＣＤ８＋細胞におけるＰＩＦ標的は、ＣＤ１４＋標的と非常に相関している
ＣＤ１４＋標的と比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（未刺激）のリンパ球部分系列におけるタンパク質標的を検討することは重要であった。全体として、両Ｔ細胞部分系列における標的の数は非常に少なかった（ＣＤ１４＋標的と比較して３０％未満）（表１２及び表１３）。ＰＩＦが標的とするタンパク質のほとんどは、３つの細胞調製物（ＣＤ１４＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）すべてにおいて９５％超の符合で非常に保存されていた。識別したタンパク質と符合する２１／２４例におけるＣＤ４＋標的及びＣＤ８＋標的は同一であった。このことは、分離及び方法分析が異なる対象において再現性があり、その理由として、すべての場合において、同数のＰＢＭＣが単離されたからであるという強い支持を提供する。このことは、未刺激のＴ細胞に存在する少ない結合による限定された検出に関するあらゆる可能性を回避した。タンパク質識別の方法の頑強性も確認した。しかしながら、データが示すように、当該系列におけるタンパク質発現が非常に少ないが、これらの系列において識別されるいくつかの決定的なタンパク質が以下に説明するＣＤ１４細胞においてみられない。
考察
免疫系は複雑で、曝露される筋書きへの定常的な適応を必要とする。ＰＩＦは、先天免疫及び適応免疫の両方を調節することが示されており、いくつかの多種多様な前臨床的免疫障害におけるインビボでの効能を示した。ＰＩＦ相互作用は、直接的、特異的及び複数標的化していなければならない。上述の実験は、ＰＩＦが免疫系を直接標的とし、免疫監視に必要とされる調節性Ｔ細胞ＦｏｘＰ３＋と相互作用することを示している。加えて、ＰＩＦは、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞によって大部分が共有される未刺激のＣＤ１４細胞におけるいくつかのタンパク質を標的とする。酸化的ストレス及びタンパク質ミスフォールディングに対する保護におけるＰＩＦの役割に則して、ＰＩＦは、ビメンチン、ＰＤＩ／チオレドキシン、ＨＳＰと、及び興味深いことに、免疫機能における決定的な役割を有するいくつかの１４−３−３タンパク質と相互作用する。さらに、ＰＩＦとミオシン９及びチモシン−アルファ１との相互作用は、免疫応答の調節を支持する。いくつかの細胞骨格タンパク質への結合は、細胞運動性及び膜アーキテクチャにおける関与を示す。最後に、インビボでのデータは、注射直後にＰＩＦが免疫系によって迅速に取り込まれることを確認している。全体として、インビトロ及びインビボでの両データは、直接的かつ標的とされるＰＩＦ−免疫系相互作用を支持する。
免疫応答における鍵となる要素は、調節因子が免疫系にいかに影響するかを理解することである。本発明者らは、この問題に対照するためのアプローチ、すなわち、無細胞の、細胞ベースの、相互作用標的の識別、及びインビボでの証拠を使用した。
ＬＰＳは、細胞に対する複雑な作用を有する細菌に由来する免疫系の主要活性化因子である。ＬＰＳは主として、ＣＤ受容体と相互作用し、当該受容体はさらに、ＴＬＲ４−ＭＤ２下流効果を通じてリガンド誘導性活性を伝達する。しかしながら、ＬＰＳは、細胞に入って、おそらくインフラマソームを活性化する、ＴＬＲ４非依存性作用も有する。ＰＩＦは、ＬＰＳ誘導性免疫機能をインビトロ及びインビボの両方で調節するが、ＰＩＦの作用は、リガンドに対する結合とは無関係であり、したがって、明確な細胞ベースの作用を支持する。ＰＩＦは、ＬＰＳが主として結合する未刺激の細胞におけるＣＤ１４＋細胞を標的とするので、当該ペプチドは、受容体へもその中間的な下流経路へも結合しない。このようなデータは、ＬＰＳ作用との干渉が、おそらくＴＬＲ−４経路における下流の、免疫細胞自体内に存在する標的によって発揮されなければならないＰＩＦ細胞ベースの作用についての見解を支持する。
養子性免疫系とのＰＩＦの相互作用を、非刺激条件下で検討した。当該未処置細胞に対するＰＩＦ結合が約５％であることを認識すると、胚が小さな抗原である妊娠最初期において免疫系の活性化を強制的にもたらすことはないであろうということから、この相互作用の性質を判定することは重要であった。しかしながら、これは事実ではないらしく、その理由は、すでに移植前に免疫寛容原性促進性調節性Ｔ細胞（ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３＋）の増加があるからである。本発明者らのデータは、結合が少ないにもかかわらず、ＰＩＦが、ＦｏｘＰ３活性化マーカーを特異的に発現する当該細胞を標的とするという考えを支持する。そのようなデータは、ＰＩＦが、受精直後に当該細胞のマーカーの発現を亢進する上で役立ち得ることを示す。ＰＩＦは、生育可能な胚によって分泌され、受精直後及び着床前に母体循環において検出される。このデータは、ＰＩＦの作用が、非妊娠設定におけるこの特定の決定的な細胞タイプとの相互作用を包含し得、したがって、妊娠の最初期の母体の認識に寄与し得るという考えも支持する。
ＰＩＦがＣＤ１４＋細胞及びＴ細胞の両方を直接標的とすることを示す本データは、関与する特定の標的の検討を促した。検証したＰＩＦベースのアフィニティークロマトグラフィー法に続いて、本発明者らは、ＰＩＦの可撓性構造により、ＰＩＦは、複数のタンパク質と相互作用することを発見した。興味深いことに、３つの系列において識別される標的はほとんど符合したが、ＣＤ１４は、標的の３倍以上の数を有していた。このことは、細胞が３個体の異なるドナーに由来したので注目すべきである。ＰＩＦの作用に即して、酸化的ストレスに関与するいくつかのタンパク質を、とりわけ、ビメンチン及びＰＤＩ／チオレドキシンとともに識別した。ＰＤＩ／チオレドキシンは、酸化的ストレスに対する保護に決定的であり、これまで若年性糖尿病モデルにおける膵臓におけるＰＩＦによってインビボで上方調節されることが示されている。細胞ストレスに対する保護におけるＰＤＩの作用を大いに補完するＨＳＰを標的とすることのほかに、１４−３−３タンパク質も、ＰＩＦ−挿入剤の主要なタンパク質群として識別された。この群は、ＰＩＦ標的すべての１０％を表し、このクラスのタンパク質のメンバーをすべて実質的に網羅した。
ミオシン９及びチモシン−アルファ１のようなタンパク質との相互作用は、ＰＩＦが保護にだけでなく、免疫調節及び活性化にも関与するという見解を支持する。
細胞骨格は、細胞の機能及び生存において決定的な役割を担っている。細胞骨格は、細胞のアーキテクチャ及び膜の完全性を維持し、細胞運動性を可能にする。これらの多種多様なタンパク質と相互作用することによって、ＰＩＦは、細胞移動を制御するのを支援する。
全体として、ＰＩＦタンパク質結合候補の多様性は、免疫系とのＰＩＦの相互作用が頑強であり、ある特定の場合においてＰＩＦは、同じ遺伝子へ結合するだけでなく当該遺伝子の発現も調節するという証拠を提供している。したがって、ＰＩＦは、同じ遺伝子への結合と作用の間のループを閉鎖する。このことが、直接的なフィードバックを通じて発揮されるのかまたはそれに代わるものとして間接的な機序によって発揮されるのかは不確かである。
上述の試験に利用したＰＩＦアフィニティークロマトグラフィー法に続いて、半定量質量分析を行った。この方法は、マウス胚抽出物の選択的画分に対して結合するビオチン−ＰＩＦを、ＰＩＦベースのアフィニティークロマトグラフィーの結果と比較した。本データは、高い一致を示し、これに続いて、ＰＤＩ及びＨＳＰの結合部位を標的にするものとしてＰＩＦペプチドのＲＩＫＰ活性部位を識別することを行った。２つの異なる組織と種の間で標的に関して６３％の一致があったので、これらの観察の検証を強く支持する。成体と胚の間のタンパク質の等級分けの差はさらに、得られたデータの妥当性を確認する。
インビトロでの観察は、インビボでの確認を必要とする。この場合、ＰＩＦが投与の数分以内に全身免疫系によって直接取り込まれることを実証することは、関連するネズミモデルにおけるＰＩＦ−免疫細胞相互作用を確認した。脾臓及び骨髄へ結合していないＰＩＦの一部が腎臓に迅速に到達することも示した。ＰＩＦは、脳へ到達して、ミクログリアを標的にするが、その時までにすでに循環から除去されてしまっている。このことは、非常に高濃度（臨床試験について計画したものよりも４０００倍高い）でのマウス及びイヌの両方へのＰＩＦの注射が、確証されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて分析した場合、循環から２時間以内に除去されたので、さらに支持されている。
上述のデータは、多重ターゲティングによって、ＰＩＦが、細胞保護から免疫活性化及び細胞構造までに及ぶ免疫応答を調節するという見解を支持している。
母子免疫は、環境性の病原体へ持続的に曝露され、抑制された状態は、宿主及び後代の両方を害するであろう。逆説的に言えば、いくつかの自己免疫障害は、疾患が重症でない限り、妊娠中に改善することがあるが、先行の貧弱な妊娠結果は、その後の疾患に寄与する。したがって、胎児は、相乗作用で相互作用しなければならず、適応免疫ＣＤ３＋細胞とのＰＩＦ相互作用は、妊娠中に亢進する。
ＣＤ３細胞及びＣＤ４５細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合は子宮内膜症血清によって影響される
子宮内膜症は免疫障害であるので、本発明者らは、これらの患者由来の血清が適切なＦＩＴＣ−ＰＩＦ相互作用に影響するかどうかを判定することを目的とした（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。本発明者らは、ＣＤ３＋細胞及びＣＤ４５＋細胞の両方に対するＰＩＦの結合が、対照血清と比較した場合（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）、子宮内膜症血清の存在下で変化する（図１４Ａ及び図１４Ｂ）ことを発見した。そのようなデータは、ＰＩＦ結合が、患者が子宮内膜症に罹患しているかどうかを判断するための感度のある指数を提供し得るという証拠を提供するので、どの因子（複数可）が結合の変化をもたらし得るのかを識別するための基礎として機能するであろう。
ウマ妊娠初期におけるＰＩＦ検出
受精後、妊娠１２日後の雌ウマを、血清試料を用いた抗ＰＩＦベースのモノクローナル抗体ベースのアッセイを用いるＰＩＦベースのＥＬＩＳＡを用いて検査した。ＰＩＦ−タグ１ｎｍｏｌ（ステリフォーム高結合活性）は、プレート上を被覆したプレートへ密に結合する。プレートは、シーブロック／トゥイーンでブロッキングし、洗浄した。ＰＩＦ−タグ及びプレートは、５ｕｇ／ｍｌのビオチン抗ＰＩＦ−Ｍａｂ＋ ＰＩＦ（０．７８ｎｇ〜１００）ｎｇ／ｍｌ＋血清／緩衝液１：４または緩衝液と事前に混合して、１時間インキュベーションした。１００ｕｌの混合物、対照及び試料をプレートへ添加した。ストレプトアビジン＋ＨＲＰを添加し、４５分間インキュベートした。結果は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。妊娠集団（ｎ＝１９）における平均レベルを非妊娠患者（ｎ＝１０）におけるしようと比較した。図１９は、非妊娠集団と比較した場合にＰＩＦのＯＤレベルが妊娠個体において有意であることを示す。Ｐ＜０．００３。また、標準偏差曲線は、当該アッセイが線形であることを実証したのを示す。
妊娠雌ウマに対するＰＩＦ結合
方法：妊娠ウマ（ｎ＝４）及び非妊娠ウマ（ｎ＝８）の頚静脈から全血をヘパリンリチウムバキュテナーへと収集した。全血をヒストパック（Ｓｉｇｍａ）密度勾配上へ層状化させ、勾配を通じて赤血球を定着させ、先の白血球の多い血漿層を残した。細胞を滅菌ＰＢＳ中で２回洗浄し、いかなる残留ＲＢＣも０．１６Ｍ塩化アンモニウム溶液で溶解した。免疫細胞を１、５または１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＰＩＦまたはＦＩＴＣ−ＰＩＦｓｃｒとともに室温で１時間インキュベートした後、３回洗浄して、結合していないペプチドを除去し、フローサイトメトリーのために固定した。細胞タイプは、それらの散乱特徴を基に分離した。データは、ＦＩＴＣ結合が、単球において最も明白であり、それとともに他の群に対する最低限の結合が確認されることを示した。また、妊娠ウマと非妊娠ウマの間に差は認められなかった。図２０及び表２０は、妊娠ウマ及び非妊娠ウマの両方における平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示し、ＦＩＴＣ−ＰＩＦと対照の間の有意差を示す結合特徴を示す（Ｐ＜０．００１）。
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以下の表２１は、非妊娠ＣＤ＋／ＣＤ２５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合、対妊娠ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋結合の比較を示す。平均±標準偏差（ＳＤ）、２ＳＤ。
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非妊娠および妊娠集団におけるＰＢＭＣ部分集団に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合
種々のＴ細胞集団に対するＰＩＦの結合を、２色フローサイトメトリー及び特異的抗ＣＤ４＋抗体、抗ＣＤ８＋抗体、抗ＣＤ２５＋抗体、抗ＣＤ４５＋抗体を用いて検討した。結果は、平均±ＳＤ及びＳＤ２として表した。
ＮＦＡＴ１評価：ヒト対象材料成人末梢血の使用は、ＩＲＢ治験実施計画書「造血幹細胞能力」の下での収集を包含しており、（ＩＲＢ０９−９０−１９５，クリーブランド大学病院）によって認可された。本試験の実施方法は、認可された指針に従っている。
フローサイトメトリー試験：Ｍｉｌｌｅｎｏｖａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで妊孕性治療中の非妊娠不妊患者及び妊娠３か月患者が、標準的なインフォームドコンセント（ＣＡＲＩ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，シカゴ市）に署名した。実験はすべて、ＣＡＲＩ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの指針及び規制に従って、かつ２００６年３月にイリノイ大学シカゴ校の治験審査委員会からの認可を得て実施した。血液は、識別子を有さない過剰量の検体の使用で精密検査過程の一部として採取した。本発明者らは、妊娠患者及び非妊娠患者の両方におけるＣＤ１４＋細胞及びＣＤ３＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合に関して報告した。本発明者らは、抗ＣＤ４５抗体及び陰性対照としてのアイソタイプ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンノゼ市）を用いて同じ患者集団におけるＣＤ４５＋細胞に対する結合も検討した。ＣＤ４５標的は免疫寛容について関連性のある平型（ｐａｎ）白血球のマーカーとして公知である。加えて、白血球細胞または脾細胞をＣ５７ＢＬ／６雌性マウス（８〜１１週齢）から収集し、異なる濃度のＦＩＴＣ−ＰＩＦへ氷上で１時間曝露した。細胞を洗浄し１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク地区）中に再懸濁し、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合細胞の百分率を測定した。結合特異性を実証するために、脾細胞を１００倍高い濃度の標識していないＰＩＦへも曝露した後、フローサイトメトリー分析を行った。循環ネズミ免疫細胞へ結合したＰＩＦと関連する細胞タイプの識別を検査した。免疫細胞を、マウス屠殺後に収集した。収集した細胞は、ＦＩＴＣ−ＰＩＦ、（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）、＋抗ＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンノゼ市）とともにインキュベートした。アイソタイプ対照は、陰性対照として機能した。２色染色を、従来技術を用いて行った。蛍光測定（試料に付き２０，０００〜５０，０００ゲート開閉事象）は、データ獲得及び分析用のシステムＩＩソフトウェアを用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ（商標）フローサイトメトリーにおいて実施した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，フロリダ州マイアミ市）。
統計分析：タンパク質の蓋然性を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズムソフトウェアを用いて分析した。タンパク質標的のクラスター化及び相互作用は、Ｓｔｒｉｎｇ第９．１版ソフトウェアを用いて判定した。遺伝子経路分析は、付与された経路における最多数の遺伝子によって等級分けするＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州レッドウッド市）を用いて実施した。
ＰＩＦはＣＤ４＋細胞におけるＮＦＡＴ１発現を下方調節する
本発明者らは、ＰＩＦがＰＢＭＣにおける早期のＣａ＋＋流動に影響しないことを報告した。しかしながら、先行遺伝子データ及び本クラスター分析は、ＰＩＦがカルモジュリン及びカルレティキュリンを含むいくつかのカルシウム調節タンパク質を標的とすることを実証した。ＮＦＡＴ１は、下流の標的であり、ＮＦＡＴ１はＰＩＦがＰＢＭＣにおいて調節することがすでに実証されたＩＬ２分泌を調節する。それゆえ、このシグナル伝達経路を連関させるために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって刺激される単離したＣＤ４＋細胞（９５％超の純度）に及ぼすＰＩＦの効果は、ＮＦＡＴ１発現（ウェスタンブロット）を評価して判定した。ヒト対象材料成人末梢血の使用は、（ＩＲＢ０９−９０−１９５，クリーブランド大学病院）によって認可されたＩＲＢプロトコル「造血幹細胞能力」の下での収集を包含する。本試験の実施方法は、認可された指針に従っている。血液は、健常なヒトドナーから得、フィコール・プラークＰＢＭＣ分離後のＭＡＣＳによるＣＤ１４−／４＋選別を介して精製した。細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン中で（未刺激）、またはＮＦＡＴ１（ＮＦＡＴｃ２）発現に及ぼすＰＩＦ効果を検査する５μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８を含有する１μｇ／ｍＬの接着性抗ＣＤ３とともに、２４時間培養した。３×１０５個のＣＤ４＋細胞と等価のタンパク質抽出物をレーン当たり負荷し、抗ＮＦＡＴ１抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び抗βアクチン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組み合わせを用いたウェスタンブロットによって分析した。図１８Ａは、ＮＦＡＴ１の発現に及ぼす同時活性化の効果及び誘導した細胞に及ぼすＰＩＦの効果のグラフ提示である。図１８Ｂは、βアクチンのバンドを用いて各レーンについて標準化した相対的なＮＦＡＴ１発現に関するウェスタンブロット平均定量化、及び各ゲルに関して最も濃いＮＦＡＴ１バンドに関する相対的な百分率として算出した各ＮＦＡＴ１バンドの強度である。最も濃いバンドは、１００％に任意に設定し、次に、相対的な百分率を平均化及びグラフ化した。データは、同時活性化後にＮＦＡＴ１が１．７倍増加することを示した。しかしながら、培養物に対するＰＩＦの転嫁は、当該発現における大きな２７倍の減少をもたらした。このことは、識別したタンパク質標的を、顆粒の転写因子調節と連関させた。
ＦＩＴＣ−ＰＩＦは循環ＣＤ４５＋免疫細胞へ結合する
どの免疫細胞系統ＰＩＦがインビボで直接標的とするかを判定するために、未刺激のＦＩＴＣ−ＰＩＦと単離した脾細胞との相互作用の下で、フローサイトメトリーを用いて白血球を検討した。ＰＩＦ濃度の上昇は、リガンドとのＰＩＦ結合の上昇をもたらした。脾細胞に対するＰＩＦ結合特異性を実証するために、ＦＩＴＣ−ＰＩＦへ曝露した細胞を、±１００倍濃度の標識していないＰＩＦへ添加した。フローサイトメトリーを用いて、データは、ＰＩＦの存在下で、９５％超低下することを示し、それにより結合特異性を実証した。どの細胞タイプがＰＩＦとの相互作用に関与するのかを判定するために、健常マウスにおける循環ＣＤ４５＋細胞に対する結合を検討した。これらの細胞は、平型白血球シグナル伝達マーカーとみなす。本発明者らは、２色フローサイトメトリーを用いて、単離した循環マウス白血球とともにインキュベートしたＦＩＴＣ−ＰＩＦ（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）が当該細胞の最多２５％を結合することを発見した。
ＣＤ４５＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合は妊娠中に低下する
本発明者らは、ＣＤ１４＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合が、非妊娠女性において最大であり、それゆえ妊娠中に検査した場合、変化しないことを報告した。対照的に、ＣＤ３＋細胞に対する結合は、妊娠前は低いが、妊娠中に有意に亢進する。報告したのと同じ患者において、本発明者らは、ＣＤ４５＋細胞に対する結合も比較した。本データは、妊娠対象においてフローサイトメトリーによって分析したＰＢＭＣへのＦＩＴＣ−ＰＩＦの結合が非妊娠患者と比較して有意に低下することを示した（ｎ＝４／群）。平均±標準偏差（２７％±６．１対１７．２５％±１．７）、Ｐ＜０．０１。このデータは、ＰＩＦ結合が動的であり、対象の機能的状態（すなわち、妊娠）とともに変化することをさらに実証している。
これらのデータは、全身の器官及び特定の器官の両方に指示されるＰＩＦ標的化を統合する。妊娠対象におけるＣＤ４５＋細胞に対するＦＩＴＣ−ＰＩＦ結合の低下は、ＰＩＦの公知の寛容促進効果と関連し得る。ＣＤ４５−ライゲーションは、ＰＩＦによって調節されるＮＦＡＴ１発現の亢進を通じて、Ｔ調節性細胞−樹状細胞相互作用を促進する。インビトロでの脾細胞及び免疫細胞の両方とのＰＩＦの相互作用は、結合と相互作用の特異性とを確認した。このことは、前臨床モデルにおいてＰＩＦを用いて観察される全体的な保護への重要な見解を提供しており、薬物動態的効果よりもむしろ薬力学的効果を反映している。これらは、進行中の臨床移行試験をもたらした。全体として、本発明者らは、保護、免疫活性化及び細胞構造に関与する未処理の免疫細胞に関するＰＩＦの直接的、特異的及び相乗的な標的化を実証した。本発明者らはさらに、ＰＩＦが、インビボでの迅速な除去と連関した全身免疫を標的とすることを確認している。結果的に、ＰＩＦは、免疫障害に罹患している患者の治療へと現に移行中である。
ネズミの妊娠中の循環サイトカインに及ぼすＰＩＦ効果
正常マウスに及ぼす効果を以下の表２２における妊娠１４日後のＬＰＳ処置したもの及びＬＰＳ＋ＰＩＦと比較する。
Figure 2017535794
対照及びＬＰＳ処置したものとの胎盤比較におけるサイトカインレベルに及ぼすＰＩＦ効果ならびにＬＰＳ処理したマウスに及ぼすＰＩＦ効果を以下の表２３に示す。
Figure 2017535794
このデータは、ＰＩＦが、血清中及び胎盤中の両方におけるいくつかのサイトカインを調節することを示している。留意すべきは、妊娠を改善するために、ＰＩＦは、胎児の体重も促進し、及び図２１に示すように、自然発生的なＬＰＳ誘導性妊娠中断の割合も低下させる。

Claims (90)

  1. 免疫調節不全による再発性妊娠中断（ＲＰＬ）に罹患している雌性対象の識別方法であって、
    有効量の着床前因子（ＰＩＦ）またはその類似体を、１つまたは複数の免疫細胞を含む前記対象由来の試料へ曝露すること、及び
    前記対象の１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその類似体との結合事象を検査し、ここで、基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化が、前記ＲＰＬが免疫調節不全によることを示すこと
    を含む、前記方法。
  2. 基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦから前記１つまたは複数のその類似体への結合のわずかな変化は、前記ＲＰＬが免疫調節不全によるものではないことを示す、請求項１に記載の方法。
  3. 前記有効量のＰＩＦは、約３００〜約５００ｎＭのＰＩＦである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記試料をＰＩＦまたはその類似体へ曝露する前に、試料を前記対象から単離することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその類似体を固体支持体へ固定化することをさらに含み、前記固体支持体は、チップ、カラム、プレートまたは多重ウエルプレートから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記固体支持体は、カラムである、請求項５に記載の方法。
  7. 結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその類似体と１つまたは複数の免疫細胞との会合を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 結合事象を検査するステップは、前記１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 結合事象を検査するステップは、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化及び／または検出することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 結合事象を検査するステップは、前記免疫細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、前記ＰＩＦまたはその類似体はカラムへ固定化され、ここで、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその類似体を含む前記カラムへ曝露することを含み、かつここで、結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の免疫細胞を定量化することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項９〜１０のステップのいずれかに記載の方法。
  12. 前記循環免疫細胞は、樹状細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する前記ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する前記ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、１つ以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつ、結合事象は、蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記対象へ投与することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 免疫調節不全による再発性妊娠中断（ＲＰＬ）に罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法であって、
    有効量の着床前因子（ＰＩＦ）またはその類似体を、１つまたは複数の免疫細胞を含む前記対象に由来する試料へ曝露すること、及び
    前記対象の前記１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその類似体との結合事象を検査し、ここで、基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、前記雌性対象が免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高いことを示すこと
    を含む、前記方法。
  19. 基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦから前記１つまたは複数のその類似体への結合のわずかな変化は、前記雌性対象が、免疫調節不全によるＲＰＬに罹患している可能性が高くないことを示す、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記有効量のＰＩＦは、約３００〜約５００ｎＭのＰＩＦである、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 試料をＰＩＦまたはその類似体へ曝露する前に、前記試料を前記対象から単離することをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、ＰＩＦまたはその類似体を固体支持体へ固定化することをさらに含み、ここで、前記固体支持体は、チップ、カラム、プレートまたは多重ウエルプレートから選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記固体支持体は、カラムである、請求項２２に記載の方法。
  24. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体と１つまたは複数の免疫細胞との会合を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 結合事象を検査する前記ステップは、１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化及び／または検出することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって前記免疫細胞の数を定量化することを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化し、ここで、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその類似体を含む前記カラムへ曝露することを含み、かつ、結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の免疫細胞の数を定量化することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記循環免疫細胞は、樹状細胞である、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する前記ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する前記ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、１つ以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつ結合事象は、蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記対象へ投与することを含む、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 子宮内膜症に罹患している雌性対象の識別方法であって、
    有効量の着床前因子（ＰＩＦ）またはその類似体を、１つまたは複数の免疫細胞を含む、前記対象由来の試料へ曝露すること、及び
    前記対象の前記１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその類似体との結合事象を検査し、ここで、基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、前記雌性対象が子宮内膜症に罹患していることを示すこと
    を含む、前記方法。
  36. 基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦから前記１つまたは複数のその類似体への結合のわずかな変化は、前記雌性対象が子宮内膜症に罹患していないことを示す、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記有効量のＰＩＦは、約３００〜約５００ｎＭのＰＩＦである、請求項３５または３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 試料をＰＩＦまたはその類似体へ曝露する前に、前記試料を前記対象から単離することをさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、前記ＰＩＦまたはその類似体を固体支持体へ固定化することをさらに含み、前記固体支持体は、チップ、カラム、プレートまたは多重ウエルプレートから選択される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記固体支持体は、カラムである、請求項３９に記載の方法。
  41. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体と１つまたは複数の免疫細胞との会合を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 結合事象を検査する前記ステップは、前記１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化及び／または検出することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって前記免疫細胞の数を定量化することを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化し、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露するステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその類似体を含む前記カラムへ曝露することを含み、かつ結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の免疫細胞を定量化することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項４３〜４４のステップのいずれかに記載の方法。
  46. 前記循環免疫細胞は、樹状細胞である、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する前記ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含む、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する前記ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含む、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、１つ以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつ結合事象は、蛍光のレベルを定量化及び／または検出することによって測定する、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記対象へ投与することを含む、請求項３５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記有意な変化は、ＣＤ３＋細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の増加及びＣＤ４５＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 免疫調節不全による子宮内膜症に罹患している可能性が高い雌性対象の識別方法であって、
    有効量の着床前因子（ＰＩＦ）またはその類似体を、１つまたは複数の免疫細胞を含む、前記対象由来の試料へ曝露すること、及び
    前記対象の前記１つまたは複数の免疫細胞とＰＩＦまたはその類似体との結合事象を検査し、基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦの結合の有意な変化は、前記雌性対象が、免疫調節不全による子宮内膜症に罹患している可能性が高いことを示すこと
    を含む、前記方法
  53. 基準と比較した前記１つまたは複数の免疫細胞に対するＰＩＦから前記１つまたは複数のその類似体への結合のわずかな変化は、前記雌性対象が、免疫調節不全による子宮内膜に罹患していない可能性が高いことを示す、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記有効量のＰＩＦは、約３００〜約５００ｎＭのＰＩＦである、請求項５２または５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 試料をＰＩＦまたはその類似体へ曝露する前に、前記試料を前記対象から単離することをさらに含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、前記ＰＩＦまたはその類似体を固体支持体へ固定化することをさらに含み、前記固体支持体は、チップ、カラム、プレートまたは多重ウエルプレートから選択される、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記固体支持体は、カラムである、請求項５６に記載の方法。
  58. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞との会合を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 結合事象を検査する前記ステップは、前記１つまたは複数の免疫細胞による１つまたは複数のサイトカインの発現量を観察、定量化及び／または検出することを含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  60. 結合事象を検査する前記ステップは、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を観察、定量化及び／または検出することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項５２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって免疫細胞の数を定量化することを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前に、カラムへ固定化し、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、１つまたは複数の免疫細胞の試料を、固定化したＰＩＦまたはその類似体を含む前記カラムへ曝露することを含み、かつ結合事象を検査する前記ステップは、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の免疫細胞の数を定量化することを含み、ここで、前記１つまたは複数の免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、樹状細胞、末梢血単核球のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項６０〜６１のステップのいずれかに記載の方法。
  63. 前記循環免疫細胞は、樹状細胞である、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記有意な変化は、ＣＤ１４＋細胞及び／または樹状細胞に対する前記ＰＩＦの結合の減少を定量化することを含む、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記有意な変化は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する前記ＰＩＦの結合の増加を定量化することを含む、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記ＰＩＦまたはその類似体は、１つ以上のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識を含み、かつ結合事象は、蛍光の前記レベルを定量化及び／または検出することによって測定する、請求項５２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ＰＩＦまたはその類似体を１つまたは複数の免疫細胞へ曝露する前記ステップは、前記ＰＩＦまたはその類似体を前記対象へ投与することを含む、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記有意な変化は、樹状細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の減少、ＣＤ１４＋細胞に対するＰＩＦまたはその類似体の結合の増加、及びＣＤ４＋細胞に対するＰＩＦの結合の増加のうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項５２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 再発性妊娠中断（ＲＰＬ）を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    ＲＰＬと診断されたまたは罹患している疑いのある対象に由来する試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である着床前因子（ＰＩＦ）またはその類似体を含む固体支持体へ曝露すること、
    前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  70. ＲＰＬを発症するのに十分な、対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    前記対象の結合特性を作成すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  71. ＲＰＬを発症するのに十分な対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数を、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、ＲＰＬを発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  72. ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有している対象の治療方法であって、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞のうちの１個以上の存在、非存在、または量を検出すること、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞の数が、免疫細胞の基準数よりも約２０パーセント多い場合、ＲＰＬを発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有しているものとして、前記対象を診断すること、及び
    有効量の免疫調節薬を投与することによって、前記対象を治療すること
    を含む、前記方法。
  73. 子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    子宮内膜症と診断されたまたは罹患している疑いのある対象由来の試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同であるＰＩＦまたはその類似体を含む固体支持体へ曝露すること、
    前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない前記対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  74. 子宮内膜症を発症するのに十分な、対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    前記対象の結合特性を作成すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類遺体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  75. 子宮内膜症を発症するのに十分な、対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    ＰＩＦへ結合した前記免疫細胞の数を、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類遺体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、子宮内膜症を発症するのに十分な既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  76. 子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有している対象の治療方法であって、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞の存在、非存在、または量を検出すること、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞の数が、免疫細胞の基準数よりも約２０パーセント多い場合、子宮内膜症を発症するのに十分な免疫調節不全のレベルを有するものとして前記対象を診断すること、及び
    治療有効量の免疫調節薬を投与することによって、前記対象を治療すること
    を含む、前記方法。
  77. 免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    免疫調節不全と診断されたまたは罹患している疑いのある対象由来の試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同であるＰＩＦまたはその類似体を含む固体支持体へ曝露すること、
    前記固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を定量化すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない前記対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した前記免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  78. 対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同であるＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    前記対象の結合特性を作成すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  79. 対象の免疫調節不全のレベルの検出方法であって、
    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、これらの模倣体及びそれらの組み合わせから選択したいずれかのＰＩＦアミノ酸に対して約７５％相同である固定化したＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数を検出または定量化すること、
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数を、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合する免疫細胞の数と比較すること、ならびに
    ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数が、既知の免疫調節不全に罹患していない対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全に罹患しているものとして前記対象を分類すること
    を含む、前記方法。
  80. 免疫調節不全のレベルを有している対象の治療方法であって、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞のうちの１個以上の存在、非存在、または量を検出すること、
    前記対象由来の試料中の免疫細胞の数が、免疫細胞の基準数よりも約２０パーセント多い場合、免疫調節不全のレベルを有しているものとして、前記対象を診断すること、及び
    有効量の免疫調節薬を投与することによって、前記対象を治療すること
    を含む、前記方法。
  81. 定量化する前記ステップは、前記対象の結合特性を作成することを含む、請求項６９、７０、７１、７３、７４、７５、７７、７８、または８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記対象の結合特性を作成することは、免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ１４＋細胞の数、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ４＋細胞の数、及びＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせとを相関させることを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ１４＋細胞の数、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ４＋細胞の数、及びＰＩＦまたはその類似体へ結合ＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせとを相関させるとをさらに含む、請求項６９、７０、７１、７３、７４、７５、７７、７８、または８０のいずれか一項に記載の方法。
  84. 免疫調節不全のレベルと、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した１４−３−３エータの結合親和性、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した１４−３−３エータの結合親和性、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したミオシン９の結合親和性、ＰＩＦまたはその類似体へ結合したチモシン−α１の結合親和性、及びＰＩＦまたはその類似体へ結合したＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ１４＋細胞由来のＣＤ８＋細胞の数のうちの１つまたは組み合わせの量とを相関させるステップは、公知の及び予測されたタンパク質相互作用に関するデータベースを用いて、直接的及び間接的な会合を含むタンパク質の相互作用を算出することを含む、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記ＰＩＦへ結合する免疫細胞の数を検出または定量化するステップの前に、試料を対象から単離することをさらに含む、請求項６９、７０、７１、７３、７４、７５、７７、７８、または８０に記載の方法。
  86. 試料を単離する前記ステップは、前記試料をＰＩＦへ曝露する前に、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞を含む細胞集団のうちの１つまたは組み合わせを、前記対象の血液から単離することを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜４０パーセント多い、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  88. ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数は、対象の試料由来の、ＰＩＦまたはその類似体へ結合した免疫細胞の数よりも約１５パーセント〜約４０パーセント少ない、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記固体支持体は、ディッシュ、プレート、カラム、またはシリカチップである、請求項６９に記載の方法。
  90. 前記免疫細胞は、のＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ１４＋細胞のうちの１つまたは複数である、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
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