JP2005512953A - 着床前因子の新しいアッセイ方法および着床前因子ペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】 本発明は、ＰＩＦが存在することを検出するために用いられるアッセイ方法、およびそのアッセイ方法を用いて認識されるＰＩＦペプチドに関する。具体的には、本発明はＰＩＦを検出するためのフローサイトメトリーアッセイに関する。本発明は、少なくともある程度は、蛍光標識された抗リンパ球抗体および抗血小板抗体を用いたフローサイトメトリーではＰＩＦの存在下ロゼット形成の増加を示した、という観察に基づく。さらに、本発明は、ＰＩＦの存在下ＣＤ２に結合するモノクローナル抗体が減少したことがフローサイトメトリにより示された、という観察にも基づく。さらに、本発明は、ＰＩＦペプチドに関することであり、ＰＩＦペプチドがジャーカット細胞培養液に添加されたとき、ＰＩＦペプチドは（Ｉ）ジャーカット細胞への抗ＣＤ２抗体の結合を減少させること、（ｉｉ）ジャーカット細胞でのＣＤ２の発現を上昇させること、もしくは（ｉｉｉ）ジャーカット細胞の生存性を減少させること、のいずれかであることが観察される。さらに他の例では、本発明は、抗ＣＤ２抗体のＣＤ２基質へ結合する際の試験試料の影響を決定することにより、ＰＩＦを検出するＥＬＩＳＡアッセイを規定する。

Description

本発明は、受精したこと、および胚が生存していることを示すごく初期のマーカーである着床前因子（ＰＩＦ，Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）に関し、ＰＩＦ活性を検出する新規工程に関し、およびＰＩＦペプチドに関する。

不妊は、世界中で数百万の夫婦が悩む重大な健康上の問題である。この問題の原因としては、ヒトの胚の初期の死が一般的な事象である。自然の単一妊娠の約７３％が、妊娠の６週目に達する前に失われる（Ｂｏｋｌａｇｅ ＣＥ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｅｒｍ．Ｉｎｔ Ｊ Ｆｅｒｔｉｌ １９９０；３５：７５）。これはほとんどが、着床前もしくは着床した直後の初期の胚の死による。年齢が高い女性では低い受精率を示すという報告、および若い女性から卵母細胞の提供を受けることによりその率が改善するという報告から、卵母細胞の質が妊娠を成功させるのに重要な要因であることが分かる（Ｎａｖｏｔ Ｄ，Ｂｅｒｇｈ ＰＡ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＭＡら、Ｐｏｏｒ ｏｏｃｙｔｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆａｉｌｕｒｅ ａｓ ａ ｃａｕｓｅ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｃｌｉｎｅ ｆｅｍａｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３７；１３７５）。

体外受精（ＩＶＦ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は不妊の問題に対処するために開発された技術である。しかし、着床のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで胚を培養する人工的な条件下では、胚の生存を維持する事はより困難である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、胚の発達率はｉｎ ｖｉｖｏよりも低く、一般的に、２５−６５％の胚だけが胞胚段階まで発達する（Ｇａｒｄｎｅｒ ＤＫ，Ｌａｎｅ Ｍ，ＫＯｕｒｉｄａｋｉｓ Ｋ，Ｓｃｈｏｏｌｖｃｒａｆｔ ＷＢ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｂａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ：Ｇｏｍｅｌ Ｖ，Ｌｅｕｎｇ ＰＣＫ，ｅｄｓ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｃ １０ｔｈ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，１９９７：１８７）。現段階の技術では、着床し、生存し続けることができそうな胚を識別することが出来ない。Ｉｎ ｖｉｖｏで、受精および初期の胚の着床のマーカーとして現在用いられているヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）のみが、着床後数日で検出することができる。胚が生存していることを示す適切なマーカーがないので、最近では、着床することが出来ないたくさんの胚が体内に移され、したがって、妊娠が成功する可能性を低下させている。

胚が生存していないかもしれないという可能性に対処するために、よりたくさんの胚が同時に母体に移される。たくさんの胚を移すと、遺伝的に危険である多胎妊娠を導く可能性があり、一方、少数の胚を移すと、どの胚も着床しないかもしれず、全てのＩＶＦ周期（ＩＶＦ ｃｙｃｌｅ）を失う危険性がある。胚の選択を改善すること、および胚の生存を決定する適切なマーカーを決定することが必要であることは明らかである。さらに、生存していて、なおかつ着床可能な胚に特有な生成物の培養培地を検査するという非侵襲的な方法を用いると、胚に損傷を与えることなく、結果的に最も妊娠を成功させそうな胚を選択することが出来る。

妊娠が成功するかしないかを決定する別の要因は、胚の免疫機構と母体の免疫機構との間の相互作用である。受精直後に、全身的に母体が妊娠を認識する。特定の初期の胚の信号により引き起こされる母体の免疫機構の調節がこの工程のかぎである。卵母細胞が受精されるとすぐに、その接合体はハッチング胞胚期に至るまで、硬い半透過性の膜である透明帯に覆われる。したがって、胚により分泌される化合物を通して、胚が卵管および子宮腔で発達する間と同時に、胚―母体の連絡が起こらなければならない。

妊婦の血清と生存胚を適切な条件下で培養すると、ＣＤ２抗体の存在下で、血小板とＴリンパ球によるロゼット形成の増加を引き起こす。１９９７年７月８日に発行された、Ｂａｒｎｅａらによる米国特許番号５，６４６，００３、および１９９９年１１月９日に発行されたＢａｒｎｅａらによる米国特許番号５，９８１，１９８に開示される通り、着床前因子（ＰＩＦ）の存在は、リンパ球、血小板、妊娠した被験者から採取した熱不活性化血清、テンジクネズミ補体およびＴ１１（抗ＣＤ２）モノクローナル抗体（Ｄａｋｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を混合することにより検出され、血小板とリンパ球とのロゼット形成は、妊娠被験者ではＰＩＦにより増加される。ＰＩＦは（ｉ）２細胞期へ進行中の、生存する初期のヒトおよびマウス胚から分泌され、；胚を次のＶＩＦへ移した３−４日後に末梢循環中で検出され、（ｉｉｉ）初期のネガティブなＰＩＦの結果３％に対し、出産された新生児（ｔａｋｅ ｈｏｍｅ ｂａｂｉｅｓ）７３％と関連し、（ｉｖ）子宮内で受精後５−６日で探知され、（ｖ）非妊娠血清、もしくは生存していない胚中には存在せず、そして（ｖｉ）ヒトに加え、マウス、馬、牛、そして豚などの様々な妊娠した哺乳類に存在する。さらに、ＰＩＦは、自然流産の際にｈＣＧの分泌が減少する２週間前に循環中から消失することが知られている。

上述のＰＩＦアッセイで用いたモノクローナル抗体は、ＣＤ２と呼ばれるリンパ球と関連した抗原に対して認識される。ＣＤ２はヒト末梢血液中のリンパ球上の約８０−９０％に、胸腺細胞の９５％以上に、赤血球ロゼットを形成するＴリンパ球の全てに、およびＮＫ 細胞の細胞亜集団に存在する。Ｔ細胞活性化に必要とされる抗原の量を減少させる接着分子としての機能、Ｔ細胞活性化の共刺激分子もしくは直接のプロモータとしての機能など、Ｔ細胞活性化においてＣＤ２は様々な役割を果たしている。さらには、ＣＤ２はアネルギーの誘導、サイトカイン産生の調整、およびＴ細胞のポジティブセレクションの制御などに関与している。

ＣＤ２の自然のリガンドは、構造的に関連したＩｇＳＦ ＣＡＭｓ ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）であり、それらは広く細胞に分布する細胞表面の接着リガンドである。さらに、ＣＤ２はＣＤ４８、ＣＤ５９およびＣＤ１５（Ｌｅｗｉｓ ｘ）関連炭化水素構造と相互作用する。ＣＤ２はＣＤ５８と非常に低い結合力で、また非常に早い解離定数で結合する。ＣＤ２とそのリガンドＣＤ５８の横方向への再分布は細胞の接着力に影響する。ＣＤ２の接着性の制御は、抗原反応性を促進するＣＤ２の能力に影響する。アビジチー(毒素抗毒素反応)制御能力のないＣＤ２細胞株は抗原特異反応において著しい欠如を示す。上昇したＣＤ２アビジチーから起こる接着の強さは、ＣＤ２仲介シグナル伝達とは別に、直接Ｔ細胞反応性に寄与する。

本発明は、ＰＩＦが存在することを検出するために用いられるアッセイ方法、およびそのアッセイ方法を用いて認識されるＰＩＦペプチドに関する。具体的には、本発明はＰＩＦを検出するためのフローサイトメトリーアッセイに関する。本発明は、少なくともある程度は、蛍光標識された抗リンパ球抗体および抗血小板抗体を用いたフローサイトメトリーではＰＩＦの存在下ロゼット形成の増加を示した、という観察に基づく。さらに、本発明は、ＰＩＦの存在下ＣＤ２に結合するモノクローナル抗体が減少したことがフローサイトメトリにより示された、という観察にも基づく。

さらに、本発明は、ＰＩＦペプチドに関することであり、ＰＩＦペプチドがジャーカット細胞培養液に添加されたとき、ＰＩＦペプチドは（ｉ）ジャーカット細胞への抗ＣＤ２抗体の結合を減少させること、（ｉｉ）ジャーカット細胞でのＣＤ２の発現を上昇させること、もしくは（ｉｉｉ）ジャーカット細胞の生存性を減少させること、のいずれかであることが観察される。さらに他の例では、本発明は、抗ＣＤ２抗体のＣＤ２基質へ結合する際の試験試料の影響を決定することにより、ＰＩＦを検出するＥＬＩＳＡアッセイを規定する。

発明を実施するための第１の形態において、本発明は、ある試料において着床前因子が存在するかを決定する工程を規定しており、その試料が抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合を阻害する成分を含むかどうかを検出する工程を有し、抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合阻害能力は着床前因子の存在と正の相関を示す。
たとえば、そのような方法はフローサイトメトリ法、もしくは酵素抗体法において利用され、さもなければ、本分野で知られた技術を用いる。抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合を探知するフローサイトメトリ法の非限定的な例は以下に示すＰＩＦのためのフローサイトメトリアッセイの項で述べる。

本明細書で用いられる抗ＣＤ２抗体とは、ＣＤ２と特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体はＰｈａｒｍｉｇｅｎにより販売されている（下記参照）。

ＣＤ２抗原は精製したＣＤ２抗原の形で存在するか、細胞内に保持される。本発明を実施するための非制限的な形態において、その細胞はジャーカット細胞である。他のＣＤ２発現細胞株も本分野では知られている。

試料は血清試料（たとえば、受精／着床／胚の生存を検査する予定の被験者からの血清）であるか、培養液（たとえば、ＩＶＦに移される前の胚の生存を決定するための）試料であるか、もしくはＰＩＦペプチドの存在を検査されることになっている溶液（たとえば、ＰＩＦ ａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔを精製している間；下記、例：ＰＩＦペプチドの認識の項参照）である。

被験者はヒト（たとえば、妊娠していることが疑われるヒト）であるか、非ヒト被験者（たとえば、家畜もしくは動物園の動物）である。

発明を実施するための第２の形態において、本発明は、ある試料において着床前因子が存在するかを決定する工程を規定しており、その試料がリンパ球、血小板および抗ＣＤ２抗体の間でのロゼット形成を増加させる成分を含むかどうかを、フローサイトメトリを用いて検出する工程を有し、ロゼット形成の増加は着床前因子の存在と正の相関を示す。たとえば、そのようなアッセイは、リンパ球と血小板に対して認識される蛍光標識された抗体を用いて行われ、抗血小板抗体と抗リンパ球抗体に対して異なる標識が用いられるのが好ましい。

本発明は以下の単離されたペプチドを規定する。

（１）以下を含む集団から選択された配列を持つ単離されたペプチド：Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ；Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ；Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ；およびＭｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、もしくはここで述べられたペプチドを有する単離されたペプチドで、抗ＣＤ２抗体と結合し、スポロゾイド周囲たんぱくではないペプチド。

（２）配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを持つ単離されたペプチド、もしくはここで述べられたペプチドを有する単離されたペプチドで、抗ＣＤ２抗体と結合し、ＨＩＶたんぱく質ではないペプチド。

（３）配列Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐを持つ単離されたペプチド、もしくはここで述べられたペプチドを有する単離されたペプチドで、抗ＣＤ２抗体と結合するペプチド。

（４）以下を含む集団から選択された配列を持つ単離されたペプチド、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＴｈｒおよびＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、ここでＸａａはいずれのアミノ酸でも良く、もしくはここで述べられたペプチドを有する単離されたペプチドで、抗ＣＤ２抗体と結合し、ヒトレチノイド およびサイロイドホルモンのサイレンシングメディエータ ではないペプチド。

例：ＰＩＦペプチドの認識
ＰＩＦは限外ろ過、凍結乾燥、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、そしてウエスタンブロットを用いて、大量のＭＥＣＣＭから単離された。ペニシリン、ストレプトマイシン、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび乳酸カルシウムを加え、０．１％ＢＳＡを添加されたＨａｍ’ｓ Ｆ１０培地中で、２細胞胞胚期のマウス胚が数日間培養された。回収されたＭＥＣＣＭは使用されるまで−８０℃で保存した。

１リットルのＭＥＣＣＭがアミコン膜（３ｋＤａ カットオフ；ＹＭ−３ｋＤａ、Ａｍｉｃｏｍ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ，ＵＳＡ）を用いた限外ろ過により精製された。収集されたＭＥＣＣＭはさらに３００ｍＬの精製水を用いて透析ろ過された。さらに、新鮮な培地（ＣＭ、胚は含まない）が同じ方法により処理された。ＭＥＣＣＭ−３ｋＤａ限外ろ過、透析ろ過物のみがＰＩＦ活性を示し、それらは蓄積され、凍結乾燥により濃縮された。

ＰＩＦは抗ＣＤ２モノクローナル抗体（ＭａｂＣＤ２）と結合することができる、ということが確認されている。したがって、まず、ＰＩＦ活性分画が、アガロースーヒドラジドーＭａｂＣＤ２活性化ゲルを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。抗体アフィニティマトリックスは下記のように調整された。１．５ｍｇのＭａｂＣＤ２（ｃｌｏｎｅ ＰＲＡ−２．１０，Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラムを用いて、ｐＨ５．５のカップリングバッファとバッファ交換され、さらに過ヨウ素酸ナトリウムで酸化され、製造元の指示（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ Ｈｉｄｒａｚｉｄｅ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｋｉｔ，ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従い、アガロース―ヒドラジド活性化ゲル２ｍLにカップルされた。そして、ＭＥＣＣＭ―３ｋＤａ限外ろ過−透析ろ過−凍結乾燥粉末はさらにＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィーカラム（１０×２０ｍｍ）を用いて精製された。ＭＥＣＣＭ―３ｋＤａ粉末２ｇは１０ｍＬの精製水に溶解され、ｐＨ中性化され、０．２２ｍシリンジ滅菌フィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．ＮＹ，ＵＳＡ）を通してろ過溶出され、自然流下にてアフィニティクロマトグラフィーを５回行った。そのカラムはベッドボリューム（ｖｏｌｕｍｅ ｂｅｄ）の５倍のｐＨ７．２、１００ｍＭのリン酸食塩水緩衝液を用いて洗い、次にベッドボリュームの５倍の０．５Ｍの塩化ナトリウムを用いて洗った。

結合したＰＩＦは３ｍＬの０．１Ｍ酢酸で溶出された。ＰＩＦ溶出分画は蓄積され、ＰＩＦ活性が測定され、凍結乾燥により濃縮された。

アフィニティクロマトグラフィーによりさらに精製されたＭＥＣＣＭ−３ｋＤａ超ろ過物、合計３００ｍｇが３回に分けてＣｌｉｐｅｕｓ Ｃ１８準備カラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いたＨＰＬＣで流された。準備ＨＰＬＣランニングパラメータは：流速 １５ｍｌ／ｍｉｎ、緩衝液 Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ＝９９．９％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、０．１％ＴＦＡ。勾配：０％Ｂ，５分間、そして０−６０％Ｂ、３０分間、さらに０−１００％Ｂ、３分間。

ＨＰＬＣからの分画はさらに蒸発により濃縮された。ＨＰＬＣ濃縮分画はｐＨ中性化され、ＰＩＦ活性を再び測定された。幾つかの分画は高いＰＩＦ活性を示した（図１Ａ参照）。これらの分画はさらにＶｙｄａｃＣ８分析カラム（４．６×２５０ｍｍ；Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたＨＰＬＣにより精製された。このＨＰＬＣのパラメータは：流速 １ｍｌ／ｍｉｎ、緩衝液 Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ＝９９．９％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、０．１％ＴＦＡ。勾配：０％Ｂ，５分間、０−６０％Ｂ、そして３０分間、さらに０−１００％Ｂ、３分間。幾つかの流出分画はＰＩＦ活性を示し（図１Ｂ）、さらにアミノ酸組成の決定が行われ、分子量（ＭＷ）がマススペクトル法により決定された。

ＭＥＣＣＭから精製されたＰＩＦ活性分画はウエスタンブロット（ＷＢ）により正のシグナルを示した。ＣＭ限外ろ過―凍結乾燥分画からの溶液がＷＢのネガティブコントロールといして用いられた。ＷＢ条件は以下のとおりである。ゲルには、１６．５％のアガロース分解ゲルと４％のアガロース濃縮ゲルを持つ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ事前泳動 ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）が用いられた。そのゲルは１００ｍＭトリス、１００ｍＭトリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３（トリス−トリシン泳動バッファ）で泳動された。１０マイクロリットルのトリシンサンプルバッファ〔２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−ＨＣｌ）ｐＨ６．８、２％ ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、４０％グリセロール、０．０４％ クマシーブルーブリリアント（ＣＢＢ−Ｇ２５０）〕(ＢｉｏＲａｄ) と３０マイクロリットルのＰＩＦ−ＭＥＣＣＭ精製分画から成る試料が５分間９５℃でインキュベートされた。冷却後、そのサンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）のウェルにロードされた。低分子量（ＭＷ）のポリペプチドの分子量を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準物質（ＢｉｏＲａｄ）の１：２０水希釈液１０マイクロリットルが各ゲルのウェルにロードされた。電気分解のために、サンプルと標準物質は５分間１７５Ｖで、そして１時間６０Ｖで泳動された。

そして得られたゲルは、トランスファバッファとして１００ｍＭのＣＡＰＳ〔（３−（シクロヘキシルアミン）１−プロパン硫酸）緩衝液、ｐＨ１１を用いて電気ブロッティングされた。電気ブロッティングは８０ｍＡで１時間、０．２２μｍニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。

そして、ニトロセルロース膜は、室温で、１８時間５％ブロッキング溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）でブロックされ、ＰＢＳ−Ｔ〔リン酸食塩水緩衝液―０．０５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）〕で２０分間、４回洗った。１回目の抗体のインキュベーション用に、ブロックされた膜が、２μｇ／ｍｌのＭａｂＣＤ２（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）−ＰＢＳ−Ｔ溶液と、室温で２時間インキュベートされ、上記のように洗った。２回目の抗体のインキュベーション用に、その膜は抗マウス西洋ワサビ標識（ＰＢＳ−Ｔ中 １：１０００）溶液と、室温で１時間インキュベートされ、ＥＣＬ−化学発行システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化された。図２はＭＥＣＣＭから精製されたＰＩＦペプチドの典型的なウエスタンブロットを示している。

ＰＩＦを測定するためのフローサイトメトリの方法（ＦＣ）は、米国特許番号５，６４６，００３および５，９８１，１９８に示す方法の効率性および生産性を向上させるために開発された。特に、いずれの抗体もＰｈａｒｍｉｇｅｎから入手できるが、ＭａｂＣＤ２もしくはＭａｂＣＤ２−Ｃｙ５（Ｃｙ―クロム標識抗体）、ＭａｂＣＤ４５−ＰＤ（フィコエリスリン標識抗体）およびＭａｂＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシアネイト 標識抗体）を用い、妊娠したヒトの血清、非妊娠のヒトの血清、豚の血清、ＭＥＣＣＭ、ＣＭおよび単離されたＰＩＦ分画でのロゼット形成がＦＣにより評価された。標識されたＰ―Ｌ複合体の割合は、ＣＭに比較してＭＥＣＣＭでは３０−４０％高かった（図３Ａ）。さらに、ＭＥＣＣＭもしくは妊娠血清を、固定化されたＭａｂＣＤ２と事前にインキュベーションすると、そのアッセイにおいてＰ−Ｌ形成を阻害することがわかった。ＭａｂＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原３、すなわちＬＦＡ３）抗体をＬ−Ｐに添加しても、そのアッセイにおいて、ＰＩＦ活性試料の影響によるロゼット形成を完全に阻害しなかった。

ジャーカット細胞（ＪＣ）およびＭａｂＣＤ２−Ｃｙ５を用いたＦＣ−ＰＩＦ量的アッセイが開発された（図３Ｂ）。固定化された白血病細胞株を使うと、バイオアッセイによるＰＩＦ活性の評価のための新鮮な提供血液を必要としなくてすむ。ＪＣ−ＦＣアッセイはヒト血清サンプルでバリデートされ（表１参照）、ＰＩＦ精製の間の分画のＰＩＦ活性を評価するために用いられた。

精製されたＰＩＦ活性分画の分子量は、Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＶｏｙａｇｅｒ−ＲＰ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦワークステーションにて、マススペクトル分析により決定された。サンプルは１％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル：水の１：２混合液から成るマトリックスと混合させた。スペクトルは約２００スキャンの平均であった。ＭＥＣＣＭからのＰＩＦペプチドは６１０−１８４５Ｄａの間の分子量を持つ（図４）。

さらに、ＰＩＦ活性分画をＭａｂＣＤ２と事前にインキュベーションするとＰＩＦ活性を阻害することが評価された。これらのデータによると、ＰＩＦはＣＤ２もしくは相同なペプチドの一部でありうることが示唆された。しかし、精製したＰＩＦペプチドの配列を確認してみると、これらのペプチドはＣＤ２の一部ではなく、それらのアミノ酸配列は特有であることが分かった。

ＪＣ−ＦＣアッセイを用いることにより、ＭＥＥＣＭ−ＰＩＦペプチドが、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ２に対し、３つの異なる影響を持つことが分かった。これらの影響は、ＭａｂＣＤ２のＪＣへの結合の減少；ＪＣによるＣＤ２発現のアップレギュレーション；または、ＪＣの生存性の減少、に関連している。

マウス胚からの、精製されたＰＩＦ活性分画は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｕｌｓｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（モデル４７７Ａ）によりエドマン分解法により配列が確認された。放出されたアミノ酸はフェニルイソチアン酸で派生され、ＰＴＨ―アミノ酸になり、そのシークエンサーと連結するＨＰＬＣにて逆相ＨＰＬＣにより検出されることができるようになる。ＰＩＦ分画の幾つかは特有な配列であるとわかった。幾つかのペプチドはＮ末端の９および１０残基が同じである配列であり、それは、それらのペプチドが共通の分子の様々な不完全な形態であることを示している（表ＩＩ参照）。ＰＩＦペプチドは、胚由来および妊娠に関連した小さなペプチドの、少なくとも３つの特有なファミリーとして認識された。３つのＰＩＦペプチドから成るファミリーのアミノ酸配列はスポロゾイド周囲タンパク（マラリア寄生：熱帯熱マラリア原虫）のある部位と１００％一致した。ＰＩＦペプチドのこのファミリーはＪＣによるＣＤ２発現をアップレギュレートする。あるＰＩＦペプチド（１４アミノ酸）は初めの５アミノ酸だけが今述べたＰＩＦペプチドファミリーと一致し、他のＰＩＦペプチド（１８アミノ酸）は、その１１アミノ酸で、ＨＩＶ−１ＲＮＡディレクティッドＤＮＡポリメラーセ（逆転写酵素、ＥＣ２．７．７．４９）と一致し、またＪＣによるＣＤ２発現をアップレギュレートする。さらに、２つのアミノ酸（９および１３アミノ酸）のファミリーは、１０アミノ酸で、レチノイドおよびサイロイドホルモンレセプター（ＳＭＲＴ）（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ、１９９５）へのサイレンシングメディエータである、ヒトレセプター‐相互作用因子の配列と一致する。このペプチドファミリーのなかでも比較的短いペプチドはＪＣへのＭａｂＣＤ２の結合に対し競合的な影響を示し、比較的長いペプチドはＪＣの生存性を減少させる。核レセプターにより仲介される転写のサイレンシングは発達、分化および発がん性において重要である。

ＰＩＦペプチドは、各アミノ酸のアミノ窒素がＦｍｏｃでブロックされた、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）化学を採用した、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいて、固層ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成された。カップリングは、ジイソプロピルエチルアミンの存在下、３ｍｏｌ／ｍｌの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート／１−ヒドロキシルベンゾトリアゾールを用いた、Ｎ−保護アミノ酸のカルボキシル基の活性化により行われた。活性化されたアミノ酸は続いて初めのペプチドに加えられた。その合成が終了すると、逆相ＨＰＬＣにより最後の精製が行われ、相同性がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルおよびアミノ酸解析により確認された。ＰＩＦ合成ペプチドは、ジャーカット細胞において、ＣＤ２に同様な影響を示し（図６）、またＭａｂＣＤ２により免疫検出された。

ＰＩＦのためのフローサイトメトリアッセイ
原材料
材料は、ジャーカット白血病細胞（ＪＣ）；クローニング培地；フローサイトメトリ測定用のファルコンチューブ；ＭａｂＣＤ２−Ｃｙ５（Ｃｙ−クロム標識抗体、ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ−２．１０，Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；生物学的試料（ＰＩＦ活性のアッセイがされる予定のヒトの血清、もしくは推測、または合成のＰＩＦペプチドの溶液）；ＰＢＳ―２％ＢＳＡ（１００ｍＭ リン酸食塩水緩衝液―２％ウシ血清アルブミン；ネガティブコントロールとして）；トリパン―青染色液；細胞培養のためのＣＯ_２インキュベータ；フローサイトメーター

方法
ＪＣ懸濁液を調製するために、
トリパン青染色液排除染色を用い、ＪＣ培養の生存性を確認する。細胞の生存性は８０−９０％の間であるべきである。
そのＪＣを２度１０ｍＬのＰＢＳ−２％ＢＳＡで洗う。
クローニング培地、または５，０００，０００細胞／ｍｌを含むＰＢＳ―２％ＢＳＡで、ＪＣ懸濁液を調製する。
５０ｍｌのＪＣ懸濁液をファルコンチューブに分配する（２５０，０００細胞／ｍｌ）。

サンプルのインキュベーションのために、
２００μｌの試料、初期の妊娠コントロールからの血清（３つのポジティブコントロール）、またはＰＢＳ―２％ＢＳＡ（ネガティブコントロール）、を加える。
室温で、２０―３０分間インキュベートする。
ＰＢＳ−２％ＢＳＡで１：２００に希薄した、２００μｌのＭａｂＣＤ２−Ｃｙ５を加える。ゆっくり混合する。
室温で、２０―３０分間インキュベートする。

フローサイトメトリによる決定のために、
各チューブの蛍光を測定する（４８８ｎｍレーザー励起波長）。
生存している細胞と、全ての細胞と、全ての死んだ細胞の蛍光（図５参照）を、コントロールと比較する。
ＰＩＦ活性を下記のように計算する。
全ての細胞の蛍光／％死んだ細胞×生存している細胞の蛍光
結果の解釈
ＰＩＦの負の活性は１３０−３４０の範囲になるはずである。
正のＰＩＦサンプルは負の活性の範囲外である。

様々な論文をここでは引用しており、それらの内容は内容を変更することなく参考文献に載せた。

マウス胚条件培地（ＭＥＣＣＭ）からのＰＩＦの精製；（Ａ）ＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィーにより前もって精製されたＭＥＣＣＭ−３ｋＤＡ限外ろ過物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル；（Ｂ）（Ａ）からのＰＩＦ活性分画をさらにＨＰＬＣ精製したときのプロファイル マウス胚条件培地（ＭＥＣＣＭ）からのＰＩＦの精製；（Ａ）ＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィーにより前もって精製されたＭＥＣＣＭ−３ｋＤＡ限外ろ過物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル；（Ｂ）（Ａ）からのＰＩＦ活性分画をさらにＨＰＬＣ精製したときのプロファイル ＭＥＣＣＭから精製された様々なＰＩＦペプチドのウエスタンブロット解析；まず、ＭａｂＣＤ２が抗体として使われ、次に、アンチセンスのマウス西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）―ビオチン ストレプトアビジン複合体が抗体として用いられた。特異的なＰＩＦバンドがＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって認識された。 ＭＥＣＣＭから精製された様々なＰＩＦペプチドのウエスタンブロット解析；まず、ＭａｂＣＤ２が抗体として使われ、次に、アンチセンスのマウス西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）―ビオチン ストレプトアビジン複合体が抗体として用いられた。特異的なＰＩＦバンドがＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって認識された。 ＭＥＣＣＭから精製された様々なＰＩＦペプチドのウエスタンブロット解析；まず、ＭａｂＣＤ２が抗体として使われ、次に、アンチセンスのマウス西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）―ビオチン ストレプトアビジン複合体が抗体として用いられた。特異的なＰＩＦバンドがＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって認識された。 （Ａ）新鮮な培養培地（ＣＭ）、マウス胚条件培地（ＭＥＣＣＭ）およびＭａｂＣＤ２の存在下、リンパ球―血小板のロゼット形成（Ｌ−Ｐ）のフローサイトメトリによる決定。蛍光標識されたＬに特異的な抗体（ＭａｂＣＤ４５−ＰＥ）および蛍光標識されたＰに特異的な抗体（ＭａｂＣＤ４２ａ―ＦＩＴＣ）がＬ−Ｐ複合体の検出に用いられた。ＭＥＣＣＭは培養培地（ＣＭ）に比較して、３０−４０パーセント高いＬ−Ｐ形成を示した。 （Ｂ）ジャーカット細胞（ＪＣ）に結合するＭａｂＣＤ２へＭＥＣＣＭがどのような影響を与えるかのフローサイトメトリの結果。ＪＣは試料とインキュベートされ、さらにＭａｂＣＤ２ Ｃｙ５とインキュベートされた。ＭＥＣＣＭでは、ＣＤ２に結合する抗体はＰＩＦの存在を減少させた。矢印はＰＩＦ活性を示す。 ＭＥＣＣＭから精製されたＰＩＦペプチドのマススペクトル。限外ろ過、透析、ＨＰＬＣ、ＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィー、そしてさらにＨＰＬＣによって精製されたＭＥＣＣＭからのＰＩＦ活性分画の分子量（ＭＷ）がマススペクトルにより決定された。ＰＩＦのＭＷはＡ）６１０−９９５Ｄａ；Ｂ）９６３−１８４８Ｄａ；そしてＣ）１８０７１８４６Ｄａであった。 ＭＥＣＣＭから精製されたＰＩＦペプチドのマススペクトル。限外ろ過、透析、ＨＰＬＣ、ＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィー、そしてさらにＨＰＬＣによって精製されたＭＥＣＣＭからのＰＩＦ活性分画の分子量（ＭＷ）がマススペクトルにより決定された。ＰＩＦのＭＷはＡ）６１０−９９５Ｄａ；Ｂ）９６３−１８４８Ｄａ；そしてＣ）１８０７１８４６Ｄａであった。 ＭＥＣＣＭから精製されたＰＩＦペプチドのマススペクトル。限外ろ過、透析、ＨＰＬＣ、ＭａｂＣＤ２アフィニティクロマトグラフィー、そしてさらにＨＰＬＣによって精製されたＭＥＣＣＭからのＰＩＦ活性分画の分子量（ＭＷ）がマススペクトルにより決定された。ＰＩＦのＭＷはＡ）６１０−９９５Ｄａ；Ｂ）９６３−１８４８Ｄａ；そしてＣ）１８０７１８４６Ｄａであった。 ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ａ）、蛍光へ（Ｂ）、および生存性へ（Ｃ）与えるＰＩＦの負の影響のフローサイトメトリ分析、および、ＭａｂＣＤ２結合へ（Ｄ）、蛍光へ（Ｅ）、および生存性へ（Ｆ）与えるＰＩＦの正の影響のフローサイトメトリ分析。正のサンプルでのＰＩＦはＣＤ２と競合する（矢印はＰＩＦ活性を示す。） ジャーカット細胞における合成ＰＩＦペプチドのＣＤ２発現に与える影響。

Claims (15)

1. 特定の試料において着床前因子が存在するかを決定する方法であって：
   当該試料が、抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合を阻害する成分を含むかどうかを検出する工程を有し：
   前記抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合を阻害する能力は着床前因子の存在と正の関係を示すものである。
2. 請求項１記載の方法において、前記抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合はフローサイトメトリにより検出されるものである。
3. 請求項１の工程において、前記ＣＤ２抗原はある細胞により保持されるものである。
4. 請求項１記載の方法において、前記ＣＤ２抗原は、ジャーカット細胞により保持されるものである。
5. 請求項２記載の方法において、
   前記ＣＤ２抗原はある細胞により保持されるものである。
6. 請求項２記載の方法において、
   前記ＣＤ２抗原はジャーカット細胞により保持されるものである。
7. 請求項１記載の方法において、
   前記抗ＣＤ２抗体のＣＤ２抗原への結合は酵素抗体法により検出されるものである。
8. 以下を含むグループから選択された配列を持つ単離されたペプチド：Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ；Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ；Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ；およびＭｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ。
9. 請求項８記載のペプチドを有する単離されたペプチドであって、
   抗ＣＤ２抗体に結合し、スポロゾイド周囲タンパクではないペプチド。
10. 配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを持つ単離されたペプチド。
11. 請求項１０のペプチドを有する単離されたペプチドにおいて、抗ＣＤ２抗体と結合し、ＨＩＶたんぱく質ではないペプチド。
12. 配列Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐを持つ単離されたペプチド。
13. 請求項１２のペプチドを有する単離されたペプチドであって、抗ＣＤ２抗体と結合するペプチド。
14. 以下を含むグループから選択された配列を持つ単離されたペプチド、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＴｈｒおよびＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸で良い）。
15. 請求項１４のペプチドを有する単離されたペプチドであって、抗ＣＤ２抗体と結合し、ヒトレチノイドおよびサイロイドホルモンのサイレンシングメディエータ ではないペプチド。

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