JP2017534661A

JP2017534661A - がんの治療における使用のための抗−ｃｋ８抗体

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Publication number: JP2017534661A
Application number: JP2017526766A
Authority: JP
Inventors: マリー・アレクサンドラ・アルバレー; ジャン−ジャック・ディアス; イシェム・クロード・マルターニ; ジャン−クリストフ・ソラン; クロディーヌ・ヴェルモ−デロシュ; ボリス・ヴィエルモーズ
Original assignee: インターナショナル−ドラッグ−デヴェロップメント−バイオテック; ウニベルシテクロードベルナールリヨン１; オスピスシヴィルドゥリヨン; サントルナスィオナルドラルシェルシュスィアンティフィク（セ．エン．エル．エス．）; アンスティトゥート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシャルシュ・メディカル・（インセルム）; サントルレオンベラール
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: IL250507A0; WO2016020553A1; EP3189078B1; EP3189078A1; CN107001452A; FR3024731B1; EA201790341A1; KR102478986B1; IL250507B; US20180237508A1; EA036368B1; KR20170082495A; FR3024731A1; CA2959671C; CA2959671A1; CN107001452B; US10533046B2; JP6689847B2

Abstract

本開示は、ヒトCK8抗原ペプチド、CK-8の断片である配列番号29のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体、若しくはその抗体断片、又はヒト化抗体に関する。上記分子は、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質、特に配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の検出及び/又は治療において使用することができる。

Description

本発明は、治療目的で使用することができる抗体の分野に関する。特に、本発明は、抗サイトケラチン-8抗体に関する。これらの抗体は、サイトケラチン-8(CK8)を発現するがん、例えば結腸直腸がんの治療において有用である。

サイトケラチン-8(CK8)は、上皮細胞の細胞骨格の中間径フィラメントのタンパク質成分である。

CK8タンパク質が、各種がん細胞の細胞膜に会合して存在することが、様々な研究により示されている。例えば、Godfroid等(Journal of Cell Science、99: 595〜607頁、1991年)は、培養した乳がん細胞の表面上でのCK8タンパク質の存在について記載した。Hembrough等(Journal of Cell Science、108: 1071〜1082頁、1995年)は、肝細胞、HepG2細胞及び乳がん細胞の表面上でのCK8又はCK8様タンパク質の存在について記載した。

CK8タンパク質はまた、上部消化管がん等の他のがんの癌腫の表面上で検出されている(Gires等、Biochemical and Biophysical Research Communications、328: 1154〜1162頁、2005年)。CK8タンパク質が、結腸直腸がんにおいて、浸潤及び非浸潤腫瘍細胞の表面上で露出されることも示されている(国際公開第2010/136536号)。より詳細には、結腸直腸がんにおいて、浸潤及び/又は転移細胞の出現は、これらの細胞の表面上に露出されたヒトCK8タンパク質の切断を伴うことがわかっている。CK8タンパク質のN末端部分は、結腸腺癌細胞の表面上に露出された状態のままであるのに対して、タンパク質のC末端部分は、これらの細胞の表面から、部分的に又は完全に消失している。

結腸直腸がんは、特に浸潤性のがんである。転移性結腸直腸がん(CRC)患者の治療において、かなりの改善が成されてきたが、このタイプのがんは、依然として著しい世界規模の公衆衛生問題となっている(Weitz等 Lancet 2005年; 365: 153〜65頁)。CRCは、1年当たり推定940,000件の症例を伴う両性別において3番目に多く診断されたがんであり、1年当たり約500,000件の症例を伴うがん死亡の2番目に一般的な原因である(Weitz等 Lancet 2005年; 365: 153〜65頁)。フランスでは、毎年37,000名の新たな患者が、CRCと診断されており、そのうちの約半数が、転移性疾患で死亡する。しかしながら、36,000名の新たな患者のうちの約50%は、すでに診断時に転移を有しているか、又は転移を発症する(Weitz等 Lancet 2005年; 365: 153〜65頁、Cunningham等 Lancet 2010年、Chevreul Eur J Health Econ 2010年)。

より有効な薬物(イリノテカン、オキサリプラチン)の開発により、CRC患者に対する治療を有意に改善することが可能になっている。この10年間はまた、健常細胞に対して腫瘍細胞において過剰発現される特異的な標的(EGF又はVEGF受容体)に対して誘導される分子ベースの療法-モノクローナル抗体(Mab)が登場している。これらの分子は、治療を有意に改善する。

サイトケラチン8は、その特有な構造的特徴に基づいて、例えば、細胞浸潤及び/又は細胞アポトーシスの調節等の多重機能を示す。細胞浸潤に関連して、CK8は、プラスミノーゲン及び組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)に結合して、がん細胞表面上でプラスミノーゲン活性化を促進する(J Protein Chem. 1998年11月;17(8):845〜54頁)。プラスミノーゲン結合部位は、CK8のC末端に位置する。

更に、プラスミノーゲン系を妨害することにより、CK8は、微小環境の変化に応答して、がん細胞の外側から内側へのシグナル伝達の調節に関与し得る(Deryugina及びQuigley、J. Biomed Biotechnol、2012年;2012:564259)。

細胞アポトーシスに関連して、サイトケラチン8/18(CK8/18)細胞骨格ネットワークは、アポトーシス中のカスパーゼ切断に対する初期標的である。近年の報告により、高度に保存され、且つ偏在性のデスエフェクタードメイン含有DNA結合タンパク質(DEDD)は、このCK8/18足場でのプロカスパーゼ-9及び-3の漸増において役割を果たすことが示唆されている。DEDDは、CK8/18中間径フィラメントネットワーク並びにプロカスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-9の両方と相互作用する(Apoptosis(2006年) 11:1561〜1572頁)。CK8/18原線維は、カスパーゼ-3と密接に関連したプロカスパーゼ-9の近接することにより誘発される自己切断及び活性化のための足場を提供し得ることが示唆されている。

ヒトCK8タンパク質への様々なモノクローナル抗体結合について記載されている。特に、Erlandsson等(J. of Molecular Recognition、16:157〜163頁、2003年、Johansson等 Cancer Res 1999年、59、48〜51頁)は、ヒトCK8タンパク質に対して誘導されるモノクローナル抗体TS1、その抗イディオタイプαTS1、及び癌腫を治療するための免疫療法におけるそれらの使用について記載した。Doljak等(Cancer Letters、267:75〜84頁、2008年)は、様々なサイトケラチン間で保存されるVKIALEVEIATYモチーフへのモノクローナル抗体結合について記載した。このモノクローナル抗体は、MCF-7乳がん細胞において、特にCK2、CK8、CK10及びCK18タンパク質に結合する。この抗体は、in vitroでMCF-7細胞上でのプラスミノーゲンの活性化を阻害する。Sigma(登録商標)により販売される抗体M20が、Van Muijen, G.等(Lab. Invest.、57:359頁、1987年、Waseem等 Biochemistry 2004年、43、1283〜1295頁)により記載された。CK8タンパク質に特異的に結合するこの抗体は、in vitro及びin vivoで行われる試験において、結腸直腸がん腫瘍細胞の成長及び浸潤能を阻害することがわかっている(国際公開第2010/136536号)。特に、国際特許出願国際公開第2010/136536号では、この抗体が、結腸腺癌腫瘍細胞の表面上に存在するヒトCK8タンパク質の、切断されていない部分に特異的に結合することが示された。精製抗体M20は、マウス腹水により生産された。ヒト化Mab形式については、この特定の抗体に関する記載はない。

国際公開第2010/136536号欧州特許第0 451 261号欧州特許第0 682 040号欧州特許第0 939 127号欧州特許第0 566 647号米国特許第5,530,101号米国特許第6,180,370号米国特許第5,585,089 米国特許第5,693,761号米国特許第5,639,641号米国特許第6,054,297号米国特許第5,886,152 米国特許第5,877,293号

Godfroid等(Journal of Cell Science、99: 595〜607頁、1991年) Hembrough等(Journal of Cell Science、108: 1071〜1082頁、1995年) Gires等、Biochemical and Biophysical Research Communications、328: 1154〜1162頁、2005年 Weitz等 Lancet 2005年; 365: 153〜65頁 Cunningham等 Lancet 2010年 Chevreul Eur J Health Econ 2010年 J Protein Chem. 1998年11月;17(8):845〜54頁 Deryugina及びQuigley、J. Biomed Biotechnol、2012年;2012:564259 Apoptosis(2006年) 11:1561〜1572頁 Erlandsson等(J. of Molecular Recognition、16:157〜163頁、2003年) Johansson等 Cancer Res 1999年、59、48〜51頁 Doljak等(Cancer Letters、267:75〜84頁、2008年) Van Muijen, G.等(Lab. Invest.、57:359頁、1987年) Waseem等 Biochemistry 2004年、43、1283〜1295頁 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html Tatusova等、「Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」、FEMS Microbiol.、1999年、Lett. 174:247〜250頁 Antibodies(Harlow and Lane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor NY、726頁、1988年) Singer等、J. Immun., 150:2844〜2857頁、1992年 Mountain等、Biotechnol. Genet. Eng. Rev.、10:1〜142頁、1992年 Bebbington等、Bio/Technology、10:169〜175頁、1992年 Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、1989年) Zola等、Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981年; 59:303〜6頁 Essono等、J Immunol Methods. 2003年; 203: 279:25〜66頁 Wang等、Mol Immunol. 1991; 28:1387〜97頁 Sanger等、Nature. 1977年; 265:687〜95年 Kabat等、NIH Publ. 1991年; No. 91-3242, Vol. 1, 647〜669頁 http://imgt.cines.fr

腫瘍細胞の表面上での抗原の同定において、及びがんの発症に関連付けられるメカニズムの理解において進歩がみられ、またこの進歩により、治療を有意に改善することができるモノクローナル抗体の開発が可能となっているが、上記モノクローナル抗体の有効性及び特異性は、更に改善することができる。実際に、標的療法の開発に使用されるタンパク質の多くが、がん細胞で過剰発現されるが、健常組織でも異なるレベルではあるが同様に発現される。したがって、がん組織において細胞表面でより特異的に発現されるタンパク質の重要なエピトープに対する薬物ターゲティングは、抗がん治療のがん特異性を改善するための非常に有望なアプローチとなる。したがって、細胞が、その表面上で、外面化したCK8(eCK8)タンパク質を発現する腫瘍を治療するための、特に、例えば結腸直腸がんを治療するための治療上の手段を開発する必要性が依然としてある。より詳細には、CK8を標的とするだけでなく、細胞浸潤及び細胞アポトーシスに関与するもの等の腫瘍進行の十分に調べられている必須プロセスを調節することにより、細胞の腫瘍形成能を妨害するがん関連エピトープをより特異的に標的とするモノクローナル抗体を開発する必要性が依然としてある。

本発明は、配列番号29のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体、又はその抗体断片に関する。抗体は、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3を含む重鎖であって、
CDR-H1が、配列番号37の配列、又は配列番号37の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2が、配列番号38の配列、又は配列番号38の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3を含む軽鎖であって、
CDR-L1が、配列番号34の配列、又は配列番号34の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む。

本発明はまた、配列番号29のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するヒト化抗体、又はその抗体断片に関する。ヒト化抗体は、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1'、CDR-H2'及びCDR-H3'を含む重鎖であって、
CDR-H1'が、配列番号40の配列、又は配列番号37の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2'が、配列番号41の配列、又は配列番号38の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3'が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1'、CDR-L2'及びCDR-L3'を含む軽鎖であって、
CDR-L1'が、配列番号42の配列、又は配列番号34の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2'が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3'が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む。

本発明の抗体又は抗体断片は、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質、特に配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の治療に使用され得る。

本発明はまた、8〜16個のアミノ酸を有するポリペプチドからなり、かつ配列番号29の配列を含むヒトCK8抗原ペプチド、特に配列番号29の配列からなるヒトCK8抗原ペプチドに関する。

本発明はまた、医薬としてのその使用のための上記ヒトCK8抗原ペプチドに関する。

本発明はまた、特に、がん、自己免疫疾患、炎症性状態、ウイルス感染若しくはウイルス疾患の治療又は防止における、及び/又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するための医薬としてのその使用のための、特に、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質、特に配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の治療におけるその使用のための、本発明による抗体又は抗体断片及び適切な薬学的担体を含む薬学的組成物に関する。

最終的に、本発明は、エピトープに結合することができる分子を含有する容器を含むキットに関し、ここで上記エピトープは、配列番号29の配列との最適なアラインメント後に少なくとも60%、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、及び100%同一性を有する配列を有する。上記キットは、がんを検出するのに使用することができる。

mD-A10 Mabを含む種々の抗CK8抗体を使用したCK8アイソフォームのウェスタンブロットによる検出を示す図である。フローサイトメトリーにより分析される抗CK8抗体の細胞標識に関する非結合型ペプチド1(配列番号1)又は非結合型ペプチド2(配列番号2)の存在における競合のレベルを示す図である。 M20抗体、mD-D6 Mab又はmD-A10 Mabを使用したウェスタンブロットによるCK8タンパク質アイソフォームの検出に関する非結合型ペプチド1(配列番号1)又は非結合型ペプチド2(配列番号2)の存在における競合のレベルを示す図である。 10%ウシ胎児血清(FBS)により誘発されるIsreco-1細胞の浸潤に対するmD-A10 Mabを含む抗CK8抗体(50μg/ml)の影響を示す図である。 Isreco-1細胞増殖に対する抗CK8抗体の影響を示す図である。 Isreco-1腫瘍細胞由来のカスパーゼ3活性化に対する抗CK8抗体のin vivoでの影響を示す図である。マウスにおける腫瘍(Isreco-1)成長に対するmD-A10 Mabを含む抗CK8抗体の影響を示す図である。マウスにおける腫瘍(Isreco-1)成長に対するmD-A10 Mabの濃度の用量依存的影響を示す図である。マウスにおける腫瘍(HCT116)成長に対するmD-A10 Mabを含む抗CK8抗体の影響を示す図である。マウスにおける腫瘍(HCT116)成長に対するmD-A10 Mabの濃度の用量依存的影響を示す図である。ヒトサイトケラチン-8配列(ref.: Uni-ProtKB P05787)におけるペプチド1(配列番号1)、2(配列番号2)、3(配列番号3)及び4(配列番号4)の位置を示す図である。 ELISAによるBSA結合型ペプチド1(配列番号1)、2(配列番号2)、3(配列番号3)、4(配列番号4)又は17(配列番号17)に関するM20抗体又はmD-A10 Mabの反応性を示す図である。 ELISAによる非結合型のコーティングされたペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)に関するmD-A10 Mabの反応性を示す図である。 ELISAによる非結合型のコーティングされたペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)に関するM20の反応性を示す図である。 ELISAによるBSA結合型ペプチド1(配列番号1)のmD-A10 Mab認識に対する非結合型ペプチド1及び5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)の影響を示す図である。 ELISAによるBSA結合型ペプチド17(配列番号17)のmD-A10 Mab認識に対する非結合型ペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)の影響を示す図である。 IMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述とともに、mD-A10 Mabの軽鎖可変(VL)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。 IMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述とともに、mD-A10 Mabの重鎖可変(VH)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。 mD-A10 Mabのヒト化モノクローナル抗体誘導体の重鎖可変(VH)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。 mD-A10 Mabのヒト化モノクローナル抗体誘導体の軽鎖可変(VL)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。 mD-A10 Mabのヒト化モノクローナル抗体誘導体の重鎖定常(CH)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。 mD-A10 Mabのヒト化モノクローナル抗体誘導体の軽鎖定常(CL)領域のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。

定義
「抗体」という用語は、本明細書中の記述で使用する場合、モノクローナル抗体(Mab)又はポリクローナル抗体を指す。抗体は、キメラ、ヒト化又は結合型抗体であり得る。典型的な抗体は、ジスルフィド結合により連結された2つの同一重鎖及び2つの同一軽鎖で構成される。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、定常領域及び可変領域を含有する。可変領域はそれぞれ、「相補性決定領域」(「CDR」)又は「高頻度可変領域」と呼ばれる3つのセグメントを含有し、それらは主に、抗原のエピトープに結合することに関与している。それらは通常、CDR1、CDR2、及びCDR3と称され、N末端から順に番号付けられる。可変領域の最も高度に保存される部分は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。

「モノクローナル抗体」という表現は、本発明の記述で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から生じる抗体を指す。より詳細には、集団の個々の抗体は、最小量で見出され得る数少ない考え得る自然発生的な突然変異を除いて同一である。換言すると、モノクローナル抗体は、一般的に単一種類及びサブクラスの重鎖並びに単一タイプの軽鎖を特徴とする単一細胞クローン(例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした原核生物宿主細胞等)の増殖から生じる均質な抗体からなる。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一抗原に対して誘導される。更に、様々な決定因子又はエピトープに対して誘導される様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体はそれぞれ、抗原の単一エピトープに対して誘導される。

「キメラ抗体」という表現は、本発明の記述で使用する場合、異種の抗体、例えばマウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変部分がグラフトされた所定の種の抗体、例えばヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常部分を含む抗体を指す。

「ヒト化抗体」という表現は、本発明の記述で使用する場合、高頻度可変領域(CDR)が、異種起源、例えばマウス起源の抗体のCDRで置き換えられたヒト抗体を指し、それらは、抗原結合部位を構成する。CDR(FR)に隣接する領域に位置するある特定のアミノ酸が、抗原結合部位の構造において役割を果たすため、ヒト抗体は更に、異種起源の抗体のFRのアミノ酸を含むように修飾されてもよい(CDR)。

「結合型抗体」という表現は、本発明の記述で使用する場合、成分が、抗原を選択的に認識することが可能な抗体と結合させた人工混合分子を指す。これらの成分は、細胞障害性薬物、抗がん剤、毒素、断片及び/又は放射性元素であり得る。

抗体は、多価抗体であってもよく、即ち、それらが所望の生物活性を示す限りは、それらは、2つよりも多い抗原結合部位を含んでもよく、又は多特異性抗体であってもよい。

「抗体断片」という表現は、本発明の記述で使用する場合、抗体の機能的部分(抗体全体とは対照的)、即ち、抗原(抗原結合断片)に結合することが可能な抗体の一部を指す。抗体断片は、参照の抗体の標的(一般に抗原とも称される)に結合する能力を保持することが理解されよう。抗体断片の例として、下記断片:Fv(抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域で構成される)、ScFv(二価単鎖可変断片)、Fab(軽鎖全体及び重鎖の一部で構成される)、F(ab')2(ヒンジ領域により連結される2つのFab断片で構成される)、又はポリ(エチレン)グリコール(「PEG化」)(Fv-PEG、scFV-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG又はFab'-PEGと呼ばれるペグ化断片)(ポリ(エチレン)グリコールに関して「PEG」)等のポリ(アルキレン)グリコールの付加等の化学的修飾により、又はリポソーム中の取込みにより、半減期が増加される任意の断片が挙げられ、上記断片は、本発明による抗体の特徴的なCDRのうちの少なくとも1つを有する。通常、抗体断片は、参照の抗体のエピトープに対する特異性で結合する抗体に対して、それが類似しているか、又は免疫学的特性を有する限りは、任意のサイズ上限を有し得る。例えば、結合体及び軽鎖抗体断片は、抗体断片が、軽鎖抗体サブユニットに関連する場合、少なくとも60個のアミノ酸、約200個未満のアミノ酸、約175個未満のアミノ酸、約150個未満のアミノ酸、又は約120個未満のアミノ酸を有し得る。更に、例えば、結合体及び重鎖抗体断片は、抗体断片が、重鎖抗体サブユニットに関連する場合、約425個未満のアミノ酸、約400個未満のアミノ酸、約375個未満のアミノ酸、約350個未満のアミノ酸、約325個未満のアミノ酸又は約300個未満のアミノ酸を有し得る。

「アポトーシス」という用語は、本明細書の記述で使用する場合、通常、細胞質の凝縮、細胞膜微絨毛の損失、核の細分化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の損失等の1つ又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の秩序ある形態又は制御された形態を指す。カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼの活性化は、アポトーシスの実行において主要な役割を果たす。

「浸潤」という用語は、本明細書の記述で使用する場合、細胞遊走を指し、細胞の、運動性となり、且つ組織内で細胞外マトリックスを通って進むか、又は隣接している組織に侵入する能力を規定する。浸潤性となるがん細胞は、二次部位に散在して、転移を形成し得る。

「アゴニスト」又は「アゴニスト性」という用語は、本発明の記述で使用する場合、CK8生物活性又は活性化を、直接若しくは間接的に、誘発、促進又は増強することが可能である分子を指す。

「アンタゴニスト」又は「アンタゴニスト性」という用語は、本発明の記述で使用する場合、CK8生物活性又は活性化を、直接若しくは間接的に、対抗、低減又は阻害することが可能である分子を指す。

「がん」という用語は、本発明の記述で使用する場合、どんな組織学的性質であっても、全ての悪性腫瘍形成を指す。悪性腫瘍の2つの主なカテゴリーが存在する:上皮起源の癌腫及び結合組織起源(conjunctive origin)の肉腫。悪性腫瘍は、自律的に成長する能力、不正確な描写、隣接組織及び血管を浸潤する能力、並びに転移の生産によって伝播する傾向を一般的に特徴とする浸潤性又は伝播性異型細胞で構成される。

「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明の記述で使用する場合、単鎖DNA若しくはRNAヌクレオチド鎖又はその相補体、或いは二重鎖相補性DNA(cDNA)又はゲノムDNAヌクレオチド鎖を指す。

「エピトープ」という用語は、本発明の記述で使用する場合、パラトープ(抗体の可変部分)により認識することができる分子を指す。

「相同性」という用語は、本発明の記述で使用する場合、ペプチド配列間の類似性を指す。ペプチド配列は、参照ポリペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸の欠失、付加又は置換を有し得る。

2つの核酸又はアミノ酸配列間の「パーセント同一性」という用語は、本発明の記述で使用する場合、2つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、ここで、比較すべき核酸又はアミノ酸配列は、2つの配列間での最適なアラインメントに関して参照配列と比較して、付加又は欠失を有し得る。パーセント同一性は、アミノ酸ヌクレオチド又は残基が、2つの配列間で、好ましくは2つの完全配列間で同一である位置の数を決定すること、同一の位置の数を、アラインメントウィンドウにおける位置の総数で除算すること、及びその結果に100を乗算することにより算出されて、2つの配列間のパーセント同一性を得る。例えば、サイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlで利用可能なBLASTプログラムである「BLAST 2配列」(Tatusova等、「Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」、FEMS Microbiol.、1999年、Lett. 174:247〜250頁)は、デフォルトパラメーターを用いて使用することができ(特に、パラメーター「オープンギャップペナルティ」に関して:5、及び「伸長ギャップペナルティ」に関して:2、選択した行列は、例えばプログラムにより提唱される「BLOSUM 62」行列である)、比較すべき2つの配列間のパーセント同一性は、プログラムにより直接算出される。

マウスモノクローナル抗体D-A10は、本明細書中では「mD-A10 Mab」と称される。

キメラモノクローナル抗体D-A10は、本明細書中では「chD-A10 Mab」と称される。

ヒト化モノクローナル抗体D-A10は、本明細書中では「HzD-A10 Mab」と称される。

配列表
配列番号1は、下記ペプチド:AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-Cを指す。
配列番号2は、下記ペプチド:AEQRGELAIKDANAKLSELE-Cを指す。
配列番号3は、下記ペプチド:AALQRAKQD-Cを指す。
配列番号4は、下記ペプチド:SELEAALQRAKQD-Cを指す。
配列番号5は、下記ペプチド:AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号6は、下記ペプチド:AALQRAKQDを指す。
配列番号7は、下記ペプチド:EAALQRAKQDを指す。
配列番号8は、下記ペプチド:LEAALQRAKQDを指す。
配列番号9は、下記ペプチド:ELEAALQRAKQDを指す。
配列番号10は、下記ペプチド:SELEAALQRAKQDを指す。
配列番号11は、下記ペプチド:LSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号12は、下記ペプチド:KLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号13は、下記ペプチド:AKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号14は、下記ペプチド:NAKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号15は、下記ペプチド:ANAKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号16は、下記ペプチド:DANAKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号17は、下記ペプチド:C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQDを指す。
配列番号18は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALQRAKQを指す。
配列番号19は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALQRAKを指す。
配列番号20は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALQRAを指す。
配列番号21は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALQRを指す。
配列番号22は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALQを指す。
配列番号23は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAALを指す。
配列番号24は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAAを指す。
配列番号25は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEAを指す。
配列番号26は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELEを指す。
配列番号27は、下記ペプチド:AIKDANAKLSELを指す。
配列番号28は、下記ペプチド:AIKDANAKLSEを指す。
配列番号29は、下記ペプチド:LSELEAALを指す。
配列番号30は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。
配列番号31は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号32は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。
配列番号33は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号34は、下記ペプチド:KSLLYSNGNTYを指す。
配列番号35は、下記ペプチド:YMSを指す。
配列番号36は、下記ペプチド:MQSLEYPFTを指す。
配列番号37は、下記ペプチド:GFTFSGFWを指す。
配列番号38は、下記ペプチド:INSDGSAIを指す。
配列番号39は、下記ペプチド:IAHYSGGGFAYを指す。
配列番号40は、下記ペプチド:GFTFSSYWを指す。
配列番号41は、下記ペプチド:INSDGSSTを指す。
配列番号42は、下記ペプチド:KSLLYSNGYNYを指す。
配列番号43は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号44は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号45は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。
配列番号46は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。
配列番号47は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号48は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。
配列番号49は、下記ペプチド:
を指す。
配列番号50は、下記ヌクレオチド配列:
を指す。

発明の詳細な説明
抗体及び抗体断片
本発明者等は、ヒトCK8タンパク質(ref.: Uni-ProtKB P05787)の353位〜360位のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片を開発した。ヒトCK8タンパク質の353位〜360位のアミノ酸配列は、配列番号29に提示される。「特異的に」とは、抗体又は抗体断片が、上記配列を有するヒトCK8ペプチドのみに結合することを意味する。抗体又は抗体断片は、上記配列を含む任意のタンパク質/ペプチド断片に結合することができることが理解されよう。

したがって、本発明は、配列番号29に従うペプチドに特異的に結合する抗体、又は抗体断片に関する。これらの抗体又は抗体断片は、本発明の記述では、「本発明の抗体又は抗体断片」という表現で呼ばれる。

本発明の抗体は、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3を含む重鎖であって、
CDR-H1が、配列番号37の配列、又は配列番号37の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2が、配列番号38の配列、又は配列番号38の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3を含む軽鎖であって、
CDR-L1が、配列番号34の配列、又は配列番号34の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む。

CDR配列は、IMGT(登録商標)、Kabat(登録商標)又はIMGT(登録商標)及びKabat(登録商標)に共通している配列を保持する共通付番方式に従って規定される(実施例の部を参照)。本発明の抗体、特にmD-A10 Mabの抗体のCDRをTable 1(表1)に示す。

定義によれば、これらのCDRは、1つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加により生じる変異CDRを含み、上記変異体は、元のCDRの特異性を保持する。共通付番方式は、短アミノ酸配列を有するCDRの規定又は最小CDRの規定を提供する。

本発明の抗体又は抗体断片(抗CK8抗体又は抗CK8抗体断片)は、in vitroで腫瘍細胞の浸潤能を効率的に阻害して、in vivoで腫瘍成長を有効に阻害する。

発明の抗体又は抗体断片(抗CK8抗体又は抗CK8抗体断片)は、カスパーゼ3媒介性アポトーシスを介して、in vivoでCK8発現がん細胞の死を効率的に誘導する。実際に、本発明の抗体又は抗体断片は、アポトーシスの活性化を証明するカスパーゼ3のin vivoでの切断を誘導することが可能である。

本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。上記モノクローナル抗体は、マウス、キメラ又はヒト化抗体であり得る。それらは、当業者に周知の標準的な方法により得ることができる。

特にマウス起源のモノクローナル抗体は、手引き書Antibodies(Harlow and Lane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor NY、726頁、1988年)に記載される技法に従って調製され得るか、又はハイブリドーマから調製され得る。かかる技法は、当業者に周知である。

或いは、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、配列番号1又は配列番号2を有するペプチドを含むヒトCK8タンパク質断片で免疫化した動物の細胞、及び続く配列番号29を有するペプチドへのモノクローナル抗体結合の、エピトープマッピングによるスクリーニングから得ることができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、事前に配列番号29のペプチドを含むヒトCK8断片が固定化されたアフィニティーカラム上で精製され得る。当業者に周知の他の精製技法を、同時に又は連続的に使用してもよい。

キメラ抗体は、遺伝子組換え技法を使用して調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーター及び非ヒト、特にマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列及びヒト抗体の定常領域をコードする配列を有する組換えDNAをクローニングすることにより生産することができる。かかる組換え遺伝子によりコードされる本発明のキメラ抗体は、例えばマウス-ヒトキメラであり、この抗体の特異性は、マウスDNAに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプは、ヒトDNAに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体を産生する方法は、文献で広く記載されている。

ヒト化抗体は、当業者に公知の技法により調製され得る(例えば、Singer等、J. Immun., 150:2844〜2857頁、1992年、Mountain等、Biotechnol. Genet. Eng. Rev.、10:1〜142頁、1992年、及びBebbington等、Bio/Technology、10:169〜175頁、1992年に記載されるもの等の)。例えば、欧州特許第0 451 261号、欧州特許第0 682 040号、欧州特許第0 939 127号、欧州特許第0 566 647号又は米国特許第5,530,101号、米国特許第6,180,370号、米国特許第5,585,089及び米国特許第5,693,761号、米国特許第5,639,641号又は第6,054,297号、第5,886,152号及び第5,877,293号に記載される「CDRグラフト」技法等の当業者に同様に公知の他のヒト化技法もまた挙げることができる。

抗V領域応答を最低限に抑えるために、モノクローナルヒト化抗体は、特異性決定残基(SDR)、即ちMab及びその抗原の表面相補性に必須である残基のみを、ヒト鋳型上へグラフトすることにより調製されてもよい。その目的で、マウス抗体は、抗原結合性部位(combining site)の完全性に必須であると思われるそれらのマウスフレームワーク残基を保持しながら、それらの相補性決定領域(CDR)を、ヒト免疫グロブリン分子の可変軽(VL)及び可変重(VH)フレームワーク上へグラフトすることによりヒト化され得る。しかしながら、ヒト化抗体の異種CDRは、患者において抗イディオタイプ(抗Id)応答を誘起し得るため、本発明のヒト化抗体又はそれらの断片は、抗Id応答を最低限に抑える技法により調製され得る。これらの技法の例として、特異性決定残基(SDR)、即ち抗体-リガンド相互作用において最も重要であるCDR残基のみの、ヒトフレームワーク上へのグラフトが挙げられる。SDRは、公知の構造の抗原-抗体複合体の三次元構造のデータベースの助けによって、又は抗体結合性部位の突然変異解析により同定される。より多くのCDR残基の保持を含むヒト化への代替的なアプローチは、「略記」CDR、即ち、全てのSDRを含む一連のCDR残基のグラフトに基づく。

本発明の抗体断片は、例えばペプシン又はパパインを用いた酵素消化により、及び/又は化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、本明細書中に記載する抗体から得ることができる。或いは、本発明の抗体断片は、遺伝子組換え技法により、又はペプチド合成により得ることができる。これらの方法は、当業者に周知である。

本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくは最適化された配列を有するマウス、キメラ及びヒト化抗体から選択される抗体又は抗体断片であることが好ましい。

「最適化された配列」という表現は、特に、対象のタンパク質の構成的アミノ酸(例えば、抗体可変ドメイン)をコードするコドンを、専用の細胞型における翻訳機構によるより良好な認識に関して最適化することができることを意味する。これに関して、最適化された配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、最適化されていない配列と同一であるが、ヌクレオチド配列は異なる。

本発明の抗体、又はそれらの抗体断片は、配列番号31若しくは配列番号31の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列及び/又は配列番号33若しくは配列番号33の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含んでもよい。

本発明の抗体、又はそれらの抗体断片は、マウス軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号30)若しくは配列番号30の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列及び/又はマウス重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号32)若しくは配列番号32の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる可変領域を含んでもよい。

配列番号30は、本発明による抗体のマウス軽鎖可変領域のヌクレオチド配列に相当する(図16に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うmD-A10 Mab)。

配列番号31は、本発明による抗体のマウス軽鎖可変領域のアミノ酸配列に相当する(図16に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うmD-A10 Mab)。

配列番号32は、本発明による抗体のマウス重鎖可変領域のヌクレオチド配列に相当する(図17に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うmD-A10 Mab)。

配列番号33は、本発明による抗体のマウス重鎖可変領域のアミノ酸配列に相当する(図17に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うmD-A10 Mab)。

幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、mD-A10 Mabである。

mD-A10 Mabの軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列をTable 2(表2)に示す。

本発明の抗体又は抗体断片は、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片であることが好ましい。

本発明のヒト化抗体は、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1'、CDR-H2'及びCDR-H3'を含む重鎖であって、
CDR-H1'が、配列番号40の配列、又は配列番号40の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2'が、配列番号41の配列、又は配列番号41の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3'が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1'、CDR-L2'及びCDR-L3'を含む軽鎖であって、
CDR-L1'が、配列番号42の配列、又は配列番号42の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2'が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3'が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む。

本発明のヒト化抗体、特にHz-DA-10 MabのCDR配列を、本明細書中で以下のTable 3(表3)に概要する。

本発明のヒト化抗体、又はそれらの抗体断片は、配列番号43若しくは配列番号43の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列及び/又は配列番号44若しくは配列番号44の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含んでもよい。

本発明のヒト化抗体、又はそれらの抗体断片は、マウス軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号45)若しくは配列番号45の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列及び/又はマウス重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号46)若しくは配列番号46の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる可変領域を含んでもよい。

配列番号45は、本発明による抗体のヒト化重鎖可変領域のヌクレオチド配列に相当する(図18に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うHz D-A10 Mab)。

配列番号46は、本発明による抗体のヒト化軽鎖可変領域のヌクレオチド配列に相当する(図18に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うHz D-A10 Mab)。

配列番号43は、本発明による抗体のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列に相当する(図19に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うHz D-A10 Mab)。

配列番号44は、本発明による抗体のヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列に相当する(図19に示すIMGT(登録商標)に従うFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3及びCDR3の記述を伴うHz D-A10 Mab)。

Hz D-A10 Mabの軽鎖及び重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列をTable 4(表4)に示す。

本発明による抗体断片は、F(ab')₂、Fab、Fv又はScFv断片であり得る。

本発明の抗体又は抗体断片は、in vitroで腫瘍細胞の浸潤能を効率的に阻害して、in vivoで腫瘍成長を効率的に阻害する。特に、本発明者等は、mD-A10 Mabが、in vitroでIsreco-1細胞の浸潤能を有効に阻害して(図4)、マウスにおいてIsreco1及びHCT116腫瘍細胞の成長を有効に阻害する(図7〜図10)ことを示している。特に、本発明者等は、mD-A10 Mabが、in vitroでIsreco-1細胞の浸潤能を阻害するのに対して、抗体mD-D6は効果がないことを示している。このアンタゴニスト活性はまた、抗体M20を用いた場合でも観察される(図4)。in vivoで、mD-A10又はM20抗体のみがまた、腫瘍成長を制御する。

アポトーシス中に、細胞は、それらの細胞質及び核細胞骨格構造の完全な再構築に部分的に起因して、完全な形態において劇的な変化を受ける。この破壊プロセスは、十分に組織化されており、カスパーゼの段階的な活性化を含む。細胞骨格成分の幾つかが、アポトーシスの種々の段階中に機能を保持して、その結果として、プロセスのより後期段階でのみ分解される。初期アポトーシス中では、プロカスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-9が、CK8/18中間径フィラメントネットワークへ特異的に標的とされるため、これは、アポトーシス中にサイトケラチン足場の迅速な破壊を説明することができる。

本発明者等は、mD-A10又はM20抗体が、別個の分子メカニズムにより抗腫瘍成長効果を示すことを示している。アポトーシス効率を示すカスパーゼ3の活性化を、処理していないマウス(NT)で、及びmD-A10、M20により、又はmD-D6で処理したマウスで得られる腫瘍において分析した。この実験で分析した腫瘍は、図7に相当する実験で得て、分析したものであった。処理の最後(53日)に、腫瘍を収集して、緩衝ホルマリン中で固定して、パラフィン中に包埋した。組織切片を、ウサギモノクローナル抗切断カスパーゼ3抗体による免疫組織学分析に提出した(図6B)。各腫瘍に関して、カスパーゼ3で活性化された陽性細胞の数を、2mm²の表面上で計数した。図6Aに示すように、カスパーゼ3で活性化された陽性細胞の数は、未処理の動物と、またM20又はmD-D6で処理した動物と比較して、mD-A10 Mabで処理した動物由来の腫瘍において、著しく高い。

この結果は、mD-A10 Mabが、in vivoでIsreco-1アポトーシスに関連したカスパーゼ3切断を誘発することが可能であるのに対して、M20及びmD-D6は、この能力を示さなかったことを明らかに示している。これらの結果により、M20及びmD-A10 Mabが、非常に別個のメカニズムによってそれらの抗腫瘍成長効果を示すことが実証される。mD-A10 Mabの作用様式は、カスパーゼ3切断アポトーシス誘導に依る。類似の効果は、M20の存在下で観察されなかった。

したがって、いくつの側面では、本発明は、カスパーゼ3依存性細胞アポトーシスに関する特異的なアゴニスト活性を示し、また細胞浸潤に関して特異的なアゴニスト活性を示す抗体又は抗体部分に関する。したがって、それは、CK8が関与する疾患の治療に使用され得る。

mD-A10 Mab及びM20はともに、ヒトCK8タンパク質を認識して、アンタゴニスト特性を有する一方で、mD-A10 Mab及びM20は、同じエピトープを認識しないことが示されている(図2、図3、図12)。実際に、M20は、ヒトCK8の338位〜366位(配列番号1)又はヒトCK8の345位〜366位(配列番号17)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドを特異的に認識するが、ヒトCK8タンパク質の338位〜357位(配列番号2)のアミノ酸に相当する配列又はヒトCK8タンパク質の358位〜366位(配列番号3)のアミノ酸に相当する配列又はヒトCK8タンパク質の354位〜366位(配列番号4)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドを検出しないのに対して、mD-A10は、ヒトCK8の388位〜366位(配列番号1)のアミノ酸に相当する配列を有する両方のペプチド、ヒトCK8の354位〜366位(配列番号4)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチド又はヒトCK8の345位〜366位(配列番号17)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドを認識して、ヒトCK8の338位〜357位(配列番号2)のアミノ酸に相当する配列又はヒトCK8の358位〜366位(配列番号3)のアミノ酸に相当する配列のいずれかを有するペプチドを検出しない(図12)。

更に、抗体M20によるヒトCK8タンパク質アイソフォームのフローサイトメトリー(図2)又はウェスタンブロット(図3)のいずれかを使用した検出は、ヒトCK8の338位〜366位(配列番号1)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドにより、またヒトCK8の338位〜357位(配列番号2)のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドにより阻害されないのに対して、mD-A10 MabによるヒトCK8アイソフォームの検出は、配列番号1に従う配列を有するペプチドにより強力に阻害されるが、配列番号2に従う配列を有するペプチドによっては阻害されず、MAb D-D6の検出は、配列番号1及び配列番号2に従う配列を有する両ペプチドにより阻害される。

ヒトサイトケラチン-8配列(ref.: Uni-ProtKB P05787)におけるペプチド1(配列番号1)、2(配列番号2)、3(配列番号3)及び4(配列番号4)の位置を、図11に示す。

図13Aは、N末端及びC末端で区切られる抗CK8ペプチドに対するmD-A10 Mabの反応性について記載している(ペプチド1、ペプチド5〜28、配列番号1、配列番号5〜配列番号28)。mD-A10 Mabは、ペプチド1、5、11〜23に結合する。ペプチド11の353位にあるロイシンは、抗体による認識に必須である。実際に、mD-A10 Mabの、ペプチド10への結合は、ペプチド11の結合と比較して、ほぼ消滅している。ペプチド23の360位にあるロイシンは、抗体による認識に必須である。実際に、mD-A10 Mabの、ペプチド24への結合は、ペプチド23の結合と比較して、ほぼ消滅している。エピトープの配列の353位及び360位にあるロイシンの存在が必須であることは、競合が、それぞれBSA結合型ペプチド1又はペプチド17を用いて実施される場合、ELISA技法を使用すると、mD-A10 Mabによる認識に関して、ペプチド10(配列番号10)及び24(配列番号24)の競合がほぼないことにより確認され(図14及び図15)る。したがって、mD-A10 Mabにより認識されるエピトープは、353位〜360位(配列番号29)のアミノ酸に相当する8アミノ酸配列「LSELEAAL」として設計される。図13Bに示すように、種々のM20プロファイルを、mD-A10 Mabと比較して観察した。対照的に、明らかに、抗体M20は、「LSELEAAL」を認識しない。

ペプチド5〜28(配列番号5及び配列番号28)のアミノ酸配列の組及びmD-A10 Mabによる認識、又は低い認識若しくは認識の不在をTable 8(表8)に提示する。

本発明はまた、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質を発現する、特に、細胞が、その表面上で、配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の治療における使用のための、ヒトCK8タンパク質の353位〜360位のアミノ酸に相当する配列を有するペプチドに特異的に結合する、即ち、配列番号29に示されるような配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片に関する。抗体又は抗体断片は、上述する通りであり得る。

特に、本発明の抗体又は抗体断片を使用して、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんを治療することができる。結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんは、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする。特に、本発明の抗体又は抗体断片を使用して、浸潤性及び/又は転移性の結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんを治療することができる。

好ましくは、治療上使用される抗体又は抗体断片は、ヒト化抗体である。

ペプチド及びそれらの使用
本発明はまた、8〜16個のアミノ酸を有するポリペプチドからなり、かつ配列番号29の配列を含むヒトCK8抗原ペプチドに関する。特に、本発明は、配列番号29に従う配列からなるヒトCK8抗原ペプチドに関する。

かかるペプチドは、特にワクチンにおける治療剤として使用することができる。

本発明はまた、上記ペプチドに特異的に結合する分子を含有する容器を含むキットに関する。キットは、上述するもののような、がん、特に、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とするがんを検出するのに特に使用され得る。

ポリヌクレオチド
本発明はまた、ヒトCK8タンパク質(配列番号29)の353位〜360位のアミノ酸に相当する配列を有するヒトCK8に由来するペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、DNA型、特に二重鎖DNA型を有する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、修飾ポリヌクレオチドも指す。

本発明のポリヌクレオチドは、それらの自然環境から単離又は精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、1989年)により記載される従来の分子生物学技法により、又は化学合成により生産され得る。

本発明はまた、マウス軽鎖可変領域(配列番号30)のヌクレオチド配列及びマウス重鎖可変領域(配列番号32)のヌクレオチド配列を有するmD-A10 Mabの可変領域をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明はまた、下記配列:配列番号30、配列番号32又は配列番号30若しくは配列番号32の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列のうちの1つを含むポリヌクレオチドに関する。

本発明はまた、ヒト化軽鎖可変領域(配列番号46)のヌクレオチド配列及びヒト化重鎖可変領域(配列番号45)のヌクレオチド配列を有するHz DA-10 Mabの可変領域をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明はまた、下記配列:配列番号45、配列番号46又は配列番号45若しくは配列番号46との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列のうちの1つを含むポリヌクレオチドに関する。

薬学的組成物
本発明はまた、本発明の抗体又は抗体断片を含む薬学的組成物又はキットに関する。抗体又は抗体断片は、上述の通りであり得る。特に、抗体又は抗体断片は、Fv、Fab、F(ab')2、scFv、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。

薬学的組成物は、抗体又は抗体断片及び適切な薬学的担体を含んでもよい。適切な薬学的担体の例として、溶媒、ゼラチン、デンプン、ラクトース、硫酸マグネシウム、タルク、アラビアゴム又は類縁体が挙げられる。組成物は、分散剤、湿潤剤、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤、香料増強剤及び/又は甘味料を更に含んでもよい。

キットは、本発明の抗体又は抗体断片を含有する容器を含んでもよい。

キットは特に、上述するもののような、がん、特に、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とするがんを検出するのに特に使用され得る。

組成物は、哺乳動物、特に人への投与用に配合され得る。それらは、経口、舌下、皮下、筋内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与用に配合され得る。したがって、組成物は、所望の投与様式に応じて、全ての適切な形態で供給され得る。したがってそれらは、経口若しくは注射可能な溶液又は液体懸濁液の形態で、或いは固体又は半固体の形態で、粉末、錠剤、軟質カプセル、顆粒、糖衣錠、硬質カプセル、スプレー、サシェ、丸剤、バー(bars)又はペーストの形態で提供され得る。投薬は、治療及び懸念される障害に応じて多様である。

組成物又はキットは、別の抗体及び/又は別の抗がん剤を更に含んでもよい。

本発明はまた、がん、自己免疫疾患、炎症性状態、ウイルス感染若しくはウイルス疾患の治療又は防止における、及び/又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するための医薬としてのその使用のための本発明の薬学的組成物に関する。

本発明はまた、がん、自己免疫疾患、炎症性状態、ウイルス感染若しくはウイルス疾患の治療又は防止に関する方法、及び/又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する方法であって、有効量の本発明による抗体又は抗体断片の、ヒトを含む哺乳動物への投与を含む方法に関する。

がんは特に、上述するもののような、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする。

本発明はまた、本発明によるペプチド及び適切なアジュバントを含むワクチン組成物に関する。ワクチンでは、アジュバントは、1つ又は複数の共投与される抗原に対する免疫応答を増強又は調節することが可能な物質として通常定義される。ワクチンは、通常注射されるが、経口的に、又は鼻スプレーを介して投与されてもよい。

本発明は、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍、特に結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんの防止及び/又は治療のための薬学的又はワクチン組成物に関する。

本発明はまた、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍、特に結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんの治療上の処置及び/又は防止に関する方法であって、有効量の本発明による抗体又は抗体断片の、それらを必要とする個体への投与を含む方法に関する。本発明は、有効量の本発明による抗体又は抗体断片の、それらを必要とする個体への投与により、CK8発現がん細胞死の誘発を介した、特にCK8発現がん細胞におけるアポトーシスの誘発を介したがんの治療方法に関する。抗体又は抗体断片は、上記のようであってもよい。

本発明は、細胞が、その表面上で、CK8タンパク質を発現する腫瘍、特に結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び/又は頭頸部がんを治療又は防止するための薬の製造のための本発明による抗体又は抗体断片の使用に関する。

本明細書において以下で言及するM20抗体は、市販の抗体C5301(Sigma社)であり、1E8抗体は、市販の抗体ab28050(abcam社)である。

抗CK8抗体の調製
CK8に特異的なマウスモノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技法を使用して生産した(Zola等、Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981年; 59:303〜6頁)。2つの異なるCK8関連ペプチドを合成して、マウス免疫化に使用した。ペプチド配列は、下記の通りである:
ペプチド1: AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C(配列番号1)
ペプチド2: AEQRGELAIKDANAKLSELE-C(配列番号2)

免疫化は、3匹のOF1マウスで、KLHに連結されたペプチド1及びペプチド2の混合物を用いて実施した。血清が、CK8関連ELISAにより陽性であると検出されたマウスの脾臓を選択した。脾細胞を、マウス骨髄腫株X63-Ag8.653と融合させた。ハイブリドーマ上清を、ELISAにより、及びCK8陽性細胞株に関する免疫蛍光細胞染色により、CK8結合に関してスクリーニングした。ハイブリドーマクローニング後、mD-A10及びmD-D6と呼ばれる2つのマウスMabを得た。D-A10又はD-D6クローンを、ヌードマウスの腹膜へ注射した。プロテインAカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより、腹水を精製した後、IgGを酸性pHで溶出させて、続いてPBSに移した。濃縮後、IgGを含有するPBS溶液を濾過して、Mab濃度を280nmで決定した。

細胞株
樹立ヒト結腸がん(CC)Isreco-1、Isreco-2、Isreco-3、HCT116+/+、HCT116-/-又はHT29(CLB)を、10%熱失活ウシ胎児血清(FBS)(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)、4nMのL-グルタミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)及び50U/mL、50μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)中で成長させた。

樹立ヒト乳癌細胞MCF-7(ATCC)を、10%熱失活ウシ胎児血清(FBS)(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)、2nMのL-グルタミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)及び100U/mL、100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充した最小必須培地イーグル(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)中で成長させた。

ヒトB-前駆細胞Nalm-6(DSMZ)、バーキットヒトリンパ腫細胞Raji(ECACC)、非ホジキンリンパ腫ヒトRL(DSMZ)、組織球性リンパ腫U937(ECACC)の樹立白血病細胞、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞Cem(DSMZ)、白血病細胞樹立ヒト急性リンパ芽球性Molt4(DSMZ)、ヒト形質細胞Fravel(ECACC)を、10%熱失活ウシ胎児血清(FBS)(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)、4nMのL-グルタミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)及び100U/mL、100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充したRPMI-1640培地(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)中で成長させた。

フローサイトメトリーにより分析される抗体細胞標識
細胞表面でのCK8細胞発現を、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔に述べると、96ウェル当たり2.10⁵個の細胞を、10μg/mLの非結合型抗CK8マウスMabの希釈物とともにインキュベートした後、1/10で希釈した。結合されていない抗体を、1%ウシ血清アルブミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充したPBS(Invitrogen社、Villebon sur Yvette、フランス)で洗い流した。続いて、細胞を遠心分離して(400gで5分)、結合した抗体を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合型ヤギ(Fab')₂ポリクローナル抗マウス(MP Biomedical社、Illkirch、フランス)を用いて、4℃で30分間検出した。検出試薬を洗い流して、細胞を遠心分離して(400gで5分)、PBS 300μL中に懸濁させた。結合された検出抗体を、FACS CAN(BD Biosciences社、Rungis、フランス)で定量化する(FL1チャネル、1回の獲得につき2000回の事象)。

5μg/mLのMAb濃度を用いた場合の実験の結果をTable 5(表5)に示す。結腸又は乳腺がん細胞株等の各種がん細胞株が、CK8を発現した。リンパ腫又は白血病の細胞では、発現は観察されなかった。

mAb競合結合に関するフローサイトメトリー実験
96ウェル当たり2.10⁵個のIsreco-1細胞を、種々の濃度の試験したペプチド1若しくはペプチド2を伴って、又は伴わずに、ビオチン化抗体抗CK8(12.5μg/mL)とともにインキュベートして、4℃で30分間インキュベートした。結合されていない抗体を、1%ウシ血清アルブミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充したPBS(Invitrogen社、Villebon sur Yvette、フランス)で洗い流した。続いて、細胞を遠心分離して(400gで5分)、結合した抗体を、フィコエリトリン結合型ストレプトアビジン(Interchim社、Montlucon、フランス)を用いて、4℃で30分間検出した。検出試薬を洗い流して、細胞を遠心分離して(400gで5分)、PBS 300μL中に懸濁させた。結合された検出抗体を、FACS CAN(BD Biosciences社、Rungis、フランス)で定量化した(FL2チャネル、1回の獲得につき2000回の事象)。実験中、各々のアイソタイプ対照を含ませて、任意の非特異的な結合事象を排除した。実験の結果を図2に示す。ペプチド1の存在は、M20 Mab細胞染色に対していかなる著しい影響も与えずに、mD-D6又はmD-A10 Mabによる細胞標識を阻害する。

ウェスタンブロッティングによるCK8タンパク質のアイソフォームの検出
種々のアイソフォームを、推定分子量(kDa)及びそれらの相当するアミノ酸配列とともに、Table 6(表6)に示す

ウェスタンブロッティング実験(WB)では、Isreco-1結腸直腸がん細胞の溶解物由来のタンパク質5マイクログラムをSDS-PAGEで分離して、ニトロセルロース膜上へ転写した。膜を、5%乳汁を含有するTBS-T(Tris-HCl 20mM pH 7、NaCl 130mM、0.1%のTween 20)の溶液で飽和させた後、2.5%乳汁を含有するTBS-T溶液中に希釈した各種抗CK8抗体とともにインキュベートした。M20(50μg/mL)、1E8(1/500)、mD-A10(1μg/mL)又はmD-D6(1μg/mL)抗体を、膜ともに室温で1時間インキュベートした。一次抗体を、ペルオキシダーゼ(HRP)に連結させた抗マウス二次抗体(ab97040)(Abcam社、フランス)により顕色させた。結果を図1に示す。CK8タンパク質のアイソフォームは、試験した抗体抗CK8に依存して、異なって検出される。CK8タンパク質の完全長形態(CK8-E)は、全ての抗体により検出される。CK8タンパク質のC末端切断型形態(CK8-C)は、mD-A10抗体によってのみ強力に検出され、M20により弱く検出される。1E8又はmD-D6 Mabは、CK8-C型を認識しない。これらの結果により、mD-A10 Mabは、試験した他の抗体抗CK8と比較して、種々のCK8アイソフォームに対して特異的な反応性プロファイルを示すことが明らかに実証される。

CK8ペプチドによるウェスタンブロット競合アッセイ
競合実験に関して、抗体M20(1μg/mL)又はmD-A10(1μg/mL)若しくはmD-D6(1μg/mL)等のマウスモノクローナル抗体を、TBS-T溶液中で1/100の分子比(ペプチド分子100個につき抗体分子1個)でペプチド1又はペプチド2とともに、室温で2時間、プレインキュベートした。次に、抗体-ペプチド混合物を、HRPに連結された抗マウス二次抗体による顕色のため、2.5%乳汁を有するTBS-Tの溶液中で1時間、膜と接触させた。結果を図3に示す。ペプチド2の存在は、mD-D6 Mabによる全てのCK8アイソフォームの認識を減少させて、抗体M20による、及びmD-A10 MabによるCK8アイソフォームの認識を妨げない。逆に、ペプチド1の存在は、mD-A10及びmD-D6 Mabによる全てCK8アイソフォームの認識を強力に減少させるのに対して、それは、抗体M20によるCK8アイソフォームの認識を妨げない。

結腸直腸がんIsreco-1細胞の浸潤能に対するマウスモノクローナル抗体D-A10の影響:細胞インピーダンスのリアルタイム測定によるがん細胞浸潤能のin celluloでの分析(xCELLigence-ACEA Biosciences(商標)システム)
リアルタイム測定機器xCELLigence(ACEA Biosciences(商標))は、微小電極上での細胞固定に比例するインピーダンス値に基づく。細胞の浸潤能を評価するのに使用するシステムは、RTCA DPシステムである。このシステムは、16個のウェルを含有するCIMプレートを使用する。ウェルは、下部チャンバー及び上部チャンバーにより形成される。上部チャンバーは、微小電極を上回る8μM直径の孔を通じて、下部チャンバーと連絡する。Isreco-1浸潤能を評価する場合、下部チャンバーは、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充した培養培地を含有していた。FBSを伴わない培養培地の存在下のIsreco-1細胞(20000個の細胞)は、抗CK8抗体(50μg/mLのM20、mD-A10又はmD-D6)を伴って、又は伴わずに、上部チャンバーに入れる。この上部チャンバーは、その底部でマトリゲル(matrigel(商標)、BD biosciences社)の層により予め覆われていた。浸潤プロセス中、細胞は、下部チャンバーと上部チャンバーとの間で確立されているFBS勾配により引き付けられ、マトリゲルを分解し、それによって、孔を通って遊走することが可能となり、下部チャンバーの微小電極に接触する。細胞接触により発生するこのインピーダンス測定は、70時間中に15分毎に測定され、RTCA DPシステムに連結されるコンピューターにより記録される。細胞の浸潤能の結果を図4に提示する。Isreco-1浸潤能の阻害のパーセントは、3回の別個の実験に相当する標準偏差とともに表される。Isreco-1細胞のFBSにより誘発される浸潤能に対する著しい阻害は、抗体M20又はmD-A10の存在下で観察され、mD-D6を用いた場合にはいかなる影響もなかった。

ATPレベル決定後の細胞生存度測定
CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viabilityアッセイ(Promega社、Charbonnieres les Bains、フランス)を使用して、代謝的に活性な細胞の指標である存在するATPの定量化に基づいて、培養液中の生存細胞の数を決定した。検出は、ルシフェラーゼ反応を使用することに基づき、生存細胞由来のATPの量を測定する。膜完全性の損失の数分後に、細胞は、ATPを合成する能力を失い、内因性ATPアーゼは、任意の残存するATPを破壊し、したがって、ATPのレベルは、急激に下がる。細胞培養物(5.10⁴個の細胞/mL)を、単独で、又は10μg/mlで試験した抗体(B-Z1、B-E4、M20、1E8、D-D6、D-A10)の存在下で72時間インキュベートした後、1/10で希釈した(図5)。アイソタイプ対照Mab(IgG1-B-Z1、IgG2a-B-E4)は、Diaclone社(Besancon、フランス)で購入した。CellTiter-Glo(登録商標)試薬を、試薬50μLの培養培地200μLに対する比で培養液中の細胞へ直接添加した。アッセイプレートを室温で10分間インキュベートして、標準的なマルチウェル蛍光光度計Mithras LB940(Berthold社、Thoiry、フランス)を使用して、生物発光シグナルを記録した。結果を図5に示す。Mab 1E8抗CK8のみが、Isreco-1細胞増殖を阻害する。

免疫組織化学染色によるIsreco-1異種移植片腫瘍におけるカスパーゼ3活性化陽性細胞の蓄積の定量化
30mg/kgのMabにより処理したか、又は処理しないマウスのIsreco-1異種移植片腫瘍から組織を単離した。抗体M20、mD-A10又はmD-D6の、カスパーゼ3活性化を誘発する効力を評価した。染色のため、組織試料を10%緩衝ホルマリン中で固定して、パラフィン中に包埋させた。ホルマリン固定したパラフィン包埋組織の4μm厚の組織切片を、従来の手順に従って調製した。免疫組織化学は、DABmapキットを使用した自動免疫染色機(immunostainer)(Ventana Discovery XT、Roche社、Meylan、フランス)で、製造業者の指示書に従って実施した。緩衝液細胞コンディショニング(CC1)を用いた回復(retrieval)手順後に、切片を、ウサギモノクローナル抗切断カスパーゼ3抗体(1:200で希釈、クローン5A1E、Cell signaling社)とともにインキュベートした。染色は、発色性基質として3,3'-ジアミノベンジジンを有するDAB溶液で可視化させた。最終的に、切片をGillのヘマトキシリンで対比染色させた。1mm²当たりのカスパーゼ3活性化陽性細胞の数の定量化は、顕微鏡可視化後に、カメラに連結させたHistolabソフトウェアで行った。各腫瘍に関して、カスパーゼ3活性化陽性細胞の数の計数は、表面積2mm²上で実現させた。腫瘍の壊死領域及び線維性被膜は、分析から除外した。活性化カスパーゼ3の定量化の結果を図6Aに提示する。カスパーゼ3活性化陽性細胞の数は、1群当たり3匹に相当する標準偏差ともに表す。図6Bでは、免疫組織化学分析の例は、未処理の動物から、及びmD-A10 Mab、M20及びmD-D6 Mabで処理した動物から得られる厚い組織切片に関して示される。図6Aに示されるように、カスパーゼ3活性化陽性細胞の数は、未処理の動物と比較して、mD-A10 Mabで処理した動物由来の腫瘍において、著しく高い。M20で、又はmD-D6 Mabで処理した動物においては、著しい影響は観察されなかった。この結果により、mD-A10が、in vivoでIsreco-1細胞のカスパーゼ3活性化に関連したアポトーシスを誘発することが可能であるのに対して、M20又はmD-D6 Mabは、カスパーゼ切断を誘発しなかったことが明確に分かった。これらの結果により、M20及びmD-A10は、非常に特徴的なメカニズムにより、それらの抗腫瘍成長効果を示すことが実証される。mD-A10 Mabは、カスパーゼ3誘発アポトーシス誘発に関連したアゴニスト性Mabとして定義される一方で、M20 Mabは、この経路に非依存的である。

マウスにおいて皮下移植したIsreco-1結腸直腸がん細胞の腫瘍成長に対する抗体抗CK8の影響
Isreco-1細胞(10×10⁶)を、12匹のSCID CB17マウスに皮下注射した。15日後、腫瘍は、100〜150mm³の体積に達した。この時点で、マウスを3匹の4つの群へ分割した。各群に、腫瘍の反対部分で実施される腹腔内注射による特異的な処理を施したか、又は施さなかった。4週の間、1週間に一度(15日目、22日目、29日目及び36日目)、マウスに、抗体M20、mD-A10 Mab又はmD-D6を用いて30mg/kgの注射を施したか、又は施さなかった(図7)。各マウスに関して、実験全体にわたって、1週間に二度、腫瘍体積を測定した。各マウス群の腫瘍体積の平均値は、1群当たり3匹のマウスに相当する標準偏差とともにグラフ上に表す。図7に示すように、抗体M20又はmD-A10は、マウスにおいて皮下移植したIsreco-1結腸直腸がん細胞の成長を阻害したのに対して、mD-D6は、腫瘍発達を制御しなかった。

マウスに皮下移植したIsreco-1結腸直腸がん細胞の腫瘍成長に対するmD-A10 Mabの用量依存的影響
結腸直腸がん細胞Isreco-1から入手した腫瘍Isreco-1断片を、18匹のSCID CB17マウスに皮下移植した。15日後、腫瘍は、100〜150mm³の体積に達した。この時点で、マウスを3匹の6つの群へ分割した。各群に、腫瘍の反対部分で実施される腹腔内注射による特異的な処理を施したか、又は施さなかった。4週の間、1週間に一度(15日目、22日目、29日目及び36日目)、マウスに、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg又は60mg/kgのmD-A10 Mabの注射を施したか、又は施さなかった。各マウスに関して、実験全体にわたって、1週間に二度、腫瘍体積を測定した。各マウス群の平均腫瘍体積は、1群当たり3匹のマウスに相当する標準偏差とともにグラフ上に表す。結果を図8に提示する。マウスにおいて皮下移植したIsreco-1結腸直腸がん細胞の成長の阻害は、1mg/kgの最低Mab濃度でさえ観察された。

マウスにおいて皮下移植したHCT116結腸直腸がん細胞の腫瘍成長に対するmD-A10 Mabの影響
HCT116細胞(10×10⁶)を、12匹のSCID CB17マウスに皮下注射した。6日後、腫瘍は、100〜150mm³の体積に達した。この時点で、マウスを3匹の4つの群へ分割した。各群に、腫瘍の反対部分で実施される腹腔内注射による特異的な処理を施したか、又は施さなかった。3週の間、1週間に一度(6日目、13日目及び20日目)、マウスに、30mg/kgの抗体抗CK8(M20、mD-A10又はmD-D6)の注射を施したか、又は施さなかった。各マウスに関して、実験全体にわたって、1週間に二度、腫瘍体積を測定した。マウスの各群の平均体積は、1群当たり3匹のマウスに等しい標準偏差とともにグラフに示す。図7に示すように、mD-A10は、抗体M20と比較して、マウスにおいて皮下移植したIsreco-1結腸直腸がん細胞の成長を最高レベルで阻害したのに対して、mD-D6は、腫瘍発達を制御しなかった。

マウスに皮下移植したHCT116結腸直腸がん細胞の腫瘍成長に対するmD-A10 Mabの濃度の用量依存的影響
HCT116細胞(10×10⁶)を、18匹のSCID CB17マウスに皮下注射した。10日後、腫瘍は、100〜150mm³の体積に達した。この時点で、マウスを3匹の6つの群へ分割した。各群に、腫瘍の反対部分に、腹腔内注射による特異的な処理を施したか、又は施さなかった。3週の間、1週間に一度(10日目、17日目及び24日目)、マウスに、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg又は60mg/kgのmD-A10 Mabで処理したか、又は処理しなかった。各マウスに関して、実験全体にわたって、1週間に二度、腫瘍体積を測定した。マウスの各群の平均体積は、1群当たり3匹のマウスに等しい標準偏差とともにグラフに示す。結果を図10に示す。

mD-A10 Mabからのヒト化Mab抗CK8誘導体の調製
従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、抗体をコードするDNAを単離及び配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源として役立つ。

マウスMabの、自然キメラMabへの変換
ハイブリドーマ由来の可変領域に相当するcDNAを、2つのアプローチを使用して入手した。第1のアプローチは、N末端配列決定した後に生成した縮重N末端アミノ酸関連プライマー組のPCRにおける利用で構成された。第2のアプローチは、IMGT(登録商標)プライマーデータベース及びこれまでに記載された(Essono等、J Immunol Methods. 2003年; 203: 279:25〜66頁、Wang等、Mol Immunol. 1991; 28:1387〜97頁)特異的なプライマーにより生成した縮重プライマー組のPCRにおける利用で構成された。N末端可変領域の配列は、Edman分解により決定した。総RNA抽出は、供給業者Sigmaにより記載されるプロトコールに従って、Tri試薬キットを使用して実施した。増幅VL及びVH断片を、ジデオキシ終結方法により配列分析用にTOPO-TAクローニングベクター(Invitrogen社)にクローニングした(Sanger等、Nature. 1977年; 265:687〜95年)。続いて、抗体変異構築物を、PCRにより増幅させて、発現ベクターにクローニングした。

位置は、IMGT(登録商標)、Kabat(登録商標)指数及び共通付番方式(種々の特異性の抗体における同一V領域アミノ酸配列及び配列のセグメント)に従って番号付けられる。VH及びVL遺伝子、ミニ遺伝子及び抗体結合性部位の結合に対する相補性決定領域の相対的寄与を分析した(Kabat等、NIH Publ. 1991年; No. 91-3242, Vol. 1, 647〜669頁)。

キメラD-A10 Mabに関する核酸配列又はアミノ酸配列を配列表に示す:
- mD-A10 Mabの可変マウス軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号30)及びそれ由来のアミノ酸配列(配列番号31)。
- mD-A10 Mabの可変マウス重鎖のヌクレオチド配列(配列番号32)及びそれ由来のアミノ酸配列(配列番号33)。
- chD-A10 Mabの定常ヒト重鎖のヌクレオチド配列(配列番号48)及びそれ由来のアミノ酸配列(配列番号47)。
- chD-A10 Mabの定常ヒト軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号50)及びそれ由来のアミノ酸配列(配列番号49)。

抗体CDR及びFR領域は、IMGT(ImMunoGeneTics Information System(登録商標) http://imgt.cines.fr)、Kabat又は共通付番方式等の各種付番アプローチに従って決定している。しかしながら、所定の抗体に関してCDRであると決定されたIMGTは、他の付番方式により規定されるCDRと必ずしも同一であるとは限らない。可変ドメインCDR及びフレームワーク領域は、IMGT付番方式の結果、本発明者により同定されている。

キメラMabの、ヒト化Mabへの変換
ヒト化H及びL鎖は、PCR法によるCDRグラフトを使用して生成させた。マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体上へグラフトされるヒト化抗体を生成するために、マウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の可変領域との間に高い相同性を得ることが好ましい。したがって、マウス抗ヒトCK8モノクローナル抗体のH鎖及びL鎖のV領域は、ソフトウェアIMGT/DomainGapAlignを使用して、全ての公知のヒト抗体のV領域と比較する。マウス抗体が、従来技術によりヒト化される場合、CDRを支持するマウス抗体のV領域FRの幾つかのアミノ酸配列は、望ましい場合には、ヒトV領域のFR上へグラフトされてもよい。

ヒト化H鎖及びL鎖のV領域の両方に関して、mD-A10のH及びL鎖のV領域及びJ領域と高い相同性を有する、それぞれL及びH鎖のV領域(IGKV2-28^*01、IGHV13-74^*01)及びJ領域(IGKJ2^*01、IGHJ4^*01)を選択することが可能である。Hz D-A10のH及びLの可変領域は、PCRにより増幅されて、ヒトIgG1定常領域を含有する発現ベクターp3Uにクローニングした。

マウスCDRをグラフトされた抗体の場合、結合活性は、ヒト抗体単独におけるCDRのアミノ酸配列のグラフトよりも減少する。この低減を回避するために、ヒト抗体とマウス抗体との間で異なるFRにおけるアミノ酸残基の中で、結合活性に対して影響を有するとみなされるアミノ酸残基を、CDRのアミノ酸配列と一緒にグラフトする。したがって、この実施例では、結合活性に対して影響を有するとみなされるFRにおけるアミノ酸残基を同定することも試みた。

SDRグラフトに続いて、Hz D-A10 MabのVH及びVLに関するCDR配列をTable 3(表3)に示す。

ELISAにより決定されるCK8ペプチドに対するMab反応性
C末端システインのSH基でウシ血清アルブミン(BSA)と連結されたか、又は連結されていないCK8ペプチドを、96ウェルプレートのウェルの底部で、室温で一晩固定化した(それぞれ、0.5μ/ ml又は1μg/ml)。未結合のペプチドは、Tween(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充した精製水で洗い流した。次に、5%BSAを含有する生理リン酸緩衝液(PBS)で、室温で(RT)2時間、ウェルを飽和させる。続いて、Tweenを補充した精製水で、プレートを洗い流す。1%ウシ血清アルブミン(Sigma社、St Quentin Fallavier、フランス)を補充したPBS(Invitrogen社、Villebon sur Yvette、フランス)中で、RTで2時間のインキュベーション後に、コーティングされたペプチドへのMab結合を、種々のMab濃度で試験する。未結合のMabは、Tweenを補充した精製水で洗い流す。続いて、結合Mabは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HPR)に連結されたヤギ抗マウスIgG二次抗体(Biorad、フランス)により顕色させる。吸光度を450nmで読み取り、630nmで補正する。種々の実験に関する特定の要件を以下で詳述する。

種々のヒトCK8ペプチド1(配列番号1)、2(配列番号2)、3(配列番号3)、4(配列番号4)及び17(配列番号17)に対するMAb反応性
C末端システインの付加により修飾されるヒトCK8のペプチド1、2、3又は4を、C末端システインのSH基でBSAに連結させて、96ウェルプレートの底部で固定化した。483個のアミノ酸(aa)を含む完全ヒトCK8配列(ref Uni-ProtKB P05787)を図11に示す。ペプチド1、2、3及び4の配列の位置は、ヒトCK8配列上で灰色及び黒色の矢印で示す:
ペプチド1(配列番号1):AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C(aa338〜aa366)
ペプチド2(配列番号2):AEQRGELAIKDANAKLSELE-C(aa338〜aa357)
ペプチド3(配列番号3):AALQRAKQD-C(aa358〜aa366)
ペプチド4(配列番号4):SELEAALQRAKQD-C(aa354〜aa366)
ペプチド17(配列番号17):C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD(aa345〜aa366)

種々のMab濃度(10μg/mLから、続いて1/10で希釈)を、室温で2時間、ペプチド1、ペプチド2、ペプチド3、ペプチド4又はペプチド17のいずれかとともにインキュベートした。光学密度値(OD)を450nmで読み取り、630nmで補正した。結果を図12に示し、以下のTable 7(表7)で概要する。これらの結果は、M20抗体との比較での、種々のmD-A10反応性プロファイルを明らかに実証した。

コーティングされたBSA結合型ペプチド1、2、3、4又は17を認識するか、又は認識しないMab反応性のレベルはそれぞれ、+++(強)、++(中)、+(弱)又は-(なし)等の符号で示される。

種々のコーティングされた非結合型ヒトCK8関連ペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)のMAb反応性
ヒトCK8の非結合型ペプチド1、5〜28を、96ウェルプレートの底部で固定化した(2μg/ml)。種々のMab濃度(10μg/mLから、続いて1/10で希釈)を、室温で2時間、単独で、又は試験する各ペプチドとともにインキュベートした。光学密度値(OD)を450nmで読み取り、630nmで補正した。結果を図13A(mD-A10に関連)又は図13B(M20に関連)に示す。比較分析を以下のTable 8(表8)で概要する。これらの結果は、試験するペプチドパネルに対するM20抗体との比較での、種々のmD-A10反応性プロファイルを明らかに実証した。

コーティングされた非結合型ペプチドを認識するか、又は認識しないMab反応性のレベルはそれぞれ、+++(強)、++(中)、+(弱)又は-(なし) 等の符号で示される。

コーティングされたBSA結合型ペプチド1又は17へのmD-A10 MAbに対する遊離ペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)に対する影響
種々のCK8ペプチドを用いたmD-A10 Mabの競合アッセイを設定する場合、ペプチド-抗体混合物を、30分間インキュベートした後、ウェルの底部に固定化した、検出しようとするペプチドの存在下に置いた。mD-A10 Mabは、BSA結合型ペプチド1(配列番号1)の認識に関して、又はBSA結合型ペプチド17(配列番号17)の認識に関しては、ペプチド1、5〜28(配列番号1、配列番号5〜配列番号28)のいずれかの存在下に置いた。

C末端位置におけるシステインの付加により修飾されるヒトCK8のペプチド1は、そのC末端システインのSH基でBSAに連結し、96ウェルプレートの底部に固定化した。1ng/mLの濃度のマウスモノクローナル抗体D-A10を、種々の濃度(10、1、0.1又は0.01μg/mL)のペプチド1、5〜28の存在下で30分間インキュベートした。次に、ペプチド-抗体混合物又は抗体単独を添加して、コーティングされたBSA結合型ペプチド1とともに、又はコーティングされたBSA結合型ペプチド17とともに、室温で2時間維持して、ELISAによる検出に使用した。光学密度値(OD)を450nmで読み取り、630nmで補正した。結果は、コーティングされたBSA結合型ペプチド1を用いた場合は図14に、又はコーティングされたBSA結合型ペプチド17を用いた場合は図15に示す。

Claims

配列番号29のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体、又はその抗体断片であって、前記抗体が、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3を含む重鎖であって、
CDR-H1が、配列番号37の配列、又は配列番号37の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2が、配列番号38の配列、又は配列番号38の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3を含む軽鎖であって、
CDR-L1が、配列番号34の配列、又は配列番号34の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む、抗体又は抗体断片。
モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体又は抗体断片。
ヒト化抗体である、請求項1又は2に記載の抗体又は抗体断片。
下記の配列:配列番号31、又は配列番号31の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列、並びに配列番号33、又は配列番号33の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号30、又は配列番号30の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列のマウス軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、及び配列番号32、又は配列番号32の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列のマウス重鎖可変領域のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
配列番号29のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するヒト化抗体、又はその抗体断片であって、前記抗体が、
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-H1'、CDR-H2'及びCDR-H3'を含む重鎖であって、
CDR-H1'が、配列番号40の配列、又は配列番号37の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H2'が、配列番号41の配列、又は配列番号38の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-H3'が、配列番号39の配列、又は配列番号39の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
重鎖、並びに
- 下記の3つのCDR、それぞれCDR-L1'、CDR-L2'及びCDR-L3'を含む軽鎖であって、
CDR-L1'が、配列番号42の配列、又は配列番号34の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L2'が、配列番号35の配列、又は配列番号35の配列との最適なアラインメント後に少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含み、
CDR-L3'が、配列番号36の配列、又は配列番号36の配列との最適なアラインメント後に少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%及び98%同一性を有する配列を含む
軽鎖を含む、抗体又は抗体断片。
細胞が、その表面上で、CK8タンパク質、特に配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の治療における使用のための、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片。
例えば結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、精巣がん、膵臓がん、神経系がん、リンパ節がん、腎臓がん及び頭頸部がんの治療における使用のための、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片。
浸潤がんの治療における使用のための、及び/又は結腸直腸がん、好ましくは浸潤結腸直腸がんの治療における使用のための、請求項8に記載の抗体又は抗体断片。
8〜16個のアミノ酸を有するポリペプチドからなり、かつ配列番号29の配列を含むヒトCK8抗原ペプチド、特に配列番号29の配列からなるヒトCK8抗原ペプチド。
治療薬としての使用のための、請求項10に記載のヒトCK8抗原ペプチド。
請求項1から6に記載の抗体又は抗体断片、及び最終的に、適切な薬学的担体を含む薬学的組成物又は診断用のキット。
前記抗体又は抗体断片が、Fv、Fab、F(ab')2、scFV、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項12に記載の薬学的組成物又はキット。
がん、自己免疫疾患、炎症性状態、ウイルス感染若しくはウイルス疾患の治療若しくは防止における、及び/又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するための医薬としての使用のための、請求項12又は13に記載の薬学的組成物。
細胞が、その表面上で、CK8タンパク質、特に配列番号29に従う配列のペプチドを発現する腫瘍の治療における使用のための、請求項14に記載の薬学的組成物。
別の抗体及び/又は別の抗がん薬を更に含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の薬学的組成物又はキット。
がんを検出するために使用するための、請求項12に記載のキット。
請求項10に記載のペプチドに特異的に結合する分子を含有する容器を含む、キット。
がんを検出するために使用するための、請求項18に記載のキット。