JP2017533731A

JP2017533731A - 合成ペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法

Info

Publication number: JP2017533731A
Application number: JP2017543696A
Authority: JP
Inventors: ユンジョンパク; チョンピョンチョン; ジンスクソ; チュヨンイ; ドンウイ
Original assignee: Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
Current assignee: Nano Intelligent Biomedical Engineering Corp Co Ltd
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2017-11-16
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: KR101906557B1; WO2017022981A9; US20170275594A1; US10066212B2; EP3345999A4; JP6446566B2; KR20170017385A; EP3345999B1; EP3345999A1; WO2017022981A1

Abstract

本発明は、合成ペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法に関し、より詳細にはＮＦ−κＢの活性を阻害して間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を促進させるペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法に関する。本発明に係る合成ペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法は、動物血清または異種細胞との共培養などを要しない無異種感染（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）または無支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）条件で未分化状態の多能性幹細胞を効率的に製造することができるので、臨床適用が可能な幹細胞治療剤開発に非常に有用である。

Description

本発明は、合成ペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法に関し、より詳細にはＮＦ−κＢの活性を阻害して間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を促進させるペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）は、無限に自己再生が可能で、体のあらゆる組織の細胞に分化できる未分化細胞で、再生医学、新薬開発のような細胞治療剤の開発、人体疾患の発病原因および治療などを研究する重要な対象として脚光を浴びている。胚性幹細胞は様々な細胞に分化が可能で、あらゆる器官を作ることができるが、細胞治療剤として卵子を使用しなければならないとの倫理的問題と免疫拒否反応があって臨床への使用が困難である。

このような問題を解決するために、２００６年に分化が進行された体細胞を体外培養過程で逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）およびリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することで胚性幹細胞の特性である自己再生産能および分化多能性を有する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生産する技術が京都大学の山中教授チームによって世界で初めて成功した（ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１２６（４）：６６３−６７６，２００６；ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１３１（５）：８６１−７２，２００７）。逆分化は、すでに分化された細胞が初期未分化状態に戻る状態をいい、このような逆分化現象は一連の厚生学的逆行過程である「リプログラミング」を介して行われる。従って、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、すでに分化した体細胞に外部から人為的な刺激を与えて私たちの体を形成するすべての器官の細胞に分化可能な胚性幹細胞と似た分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を取得した細胞を意味する。

現在まで逆分化因子の細胞内導入は、ウイルスを利用する方法が最も効果的であるが、治療目的のための人工多能性幹細胞を製作するのにウイルスを利用することは、潜在的危険性を抱えていて、細胞内遺伝体の無作為で非常に安定的に入るので、遺伝子の変異のような様々な問題が常に内在している。また、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏＶｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）および動物由来の支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ）のマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＥＦ）などの異種感染物質（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎ）が逆分化誘導過程で必要であるので、人工多能性幹細胞の究極的な目的が人体に移植されることができる組織を生成することであるとした場合、前記のような危険性により臨床に適用するには限界がある。そして、分化されたヒト体細胞を分化多能性を有する人工多能性幹細胞にリプログラミングするために、胚性幹細胞特異的転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４遺伝子群をリプログラミング遺伝子として使用して過発現させる現在の製造手法は、その効率が０．１％程度と非常に低い問題点を有している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１３１：８６１−８７２，２００７）。従って、細胞治療剤として人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を活用するためには、逆分化誘導効率を画期的に改善できる様々なリプログラミング遺伝子の開発およびこれらを逆分化過程で実質的に活用できる後続技術の開発が切に求められる。

近年、ＮＦ−κＢは、上皮細胞−間葉系細胞転移（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）を促進することと（ＨｕｂｅｒＭＡｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎＶｅｓｔ．１１４（４）：５６９−８１，２００４）、間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）は、マウス由来線維芽細胞（ｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）させるのに必須的である（ＬｉＲｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．７（１）：５１−６３，２０１０）ことが報告された。

そこで、本発明者等は、臨床適用に安全な細胞治療剤を開発するために人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の逆分化誘導効率を上げようと鋭意努力した結果、細胞内ＮＦ−κＢタンパク質の活性を阻害する機能性ペプチドを発掘して、前記ペプチドが間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を誘導して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への逆分化を促進させることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、下記の一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含有する分化された細胞で人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物を提供するところにある：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

本発明の他の目的は、（ａ）分化された細胞にリプログラミング遺伝子を導入する段階；および（ｂ）リプログラミング遺伝子が導入された細胞に下記一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを処理して培養する段階を含む分化された細胞から人工多能性幹細胞の製造方法を提供するところにある：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

前記目的を達成するために、本発明は、下記の一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含有する分化された細胞で人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物を提供する：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

本発明はまた、（ａ）分化された細胞にリプログラミング遺伝子を導入する段階；および（ｂ）リプログラミング遺伝子が導入された細胞に下記一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを処理して培養する段階を含む分化された細胞から人工多能性幹細胞の製造方法を提供する：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

逆分化因子が導入されたヒト由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）に機能性ペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）および対照群ペプチド（Ｃ１、Ｃ２）を１０日間、２４時間間隔で処理後、アルカリホスファターゼ染色（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇ，ＡＰ）を介して確認したコロニー染色結果である。図１と同じ方法でペプチドを処理後、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＩＦ）を介して胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＥＳｃｅｌｌ）マーカー（ｍａｒｋｅｒ）のＯｃｔ４発現を確認した結果である。図１と同じ方法でペプチドを処理後、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＡＣＳ）を介して分化した体細胞の逆分化過程である間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）程度をヒト由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）のＴＨＹ１と上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）のＥＰＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）で確認した結果である。

発明の詳細な説明及び実施するための形態

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、ＮＦ−κＢタンパク質の活性を阻害する機能性ペプチドを発掘して、前記ペプチドが、上皮細胞−間葉系細胞転移（ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）を阻害してさらに間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を誘導して逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進させることを確認した。

従って、一観点において、本発明は、下記の一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含有する分化された細胞で人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物に関する：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

他の観点において、本発明は、分化された細胞で人工多能性幹細胞への逆分化を促進させるための下記一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドの新規な用途に関する：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

さらに他の観点において、本発明は、（ａ）分化された細胞にリプログラミング遺伝子を導入する段階；および（ｂ）リプログラミング遺伝子が導入された細胞に下記一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを処理して培養する段階を含む分化された細胞から人工多能性幹細胞の製造方法に関する：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ）またはメチオニン（Ｍ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）である。

本発明において、前記ペプチドは、配列番号１〜３で構成された群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
Ｐ１ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＣＲＲＫＫ（配列番号１）
Ｐ２ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＭＲＲＫＫ（配列番号２）
Ｐ３ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＭＣＲＲＫＫ（配列番号３）

本発明において、ペプチドは０．０１〜１００μＭ濃度であることが好ましく、より好ましくは１０μＭであるが、これに限定されない。また、前記ペプチドは、２４時間間隔で１０日間処理することが好ましいが、これに限定されない。
本発明において、分化された細胞は、体細胞または前駆細胞であることが好ましく、ヒト由来であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明の「体細胞」とは、間充織（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）特徴を有するヒト由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）をいう。
本発明において、体細胞培養にはＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ，ＡＴＣＣ３０−２００３）を使用することが好ましく、ペプチドを処理した以後にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ａ１５１６９−０１）を使用することが好ましいが、これに限定されない。
本発明において、リプログラミング遺伝子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４およびＬｉｎ２８からなる群から選択されたいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃまたはＬｉｎ２８逆分化因子（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｇｅｎｅ）は分化が終わった細胞を再プログラム化させることができる遺伝子を意味して、特にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃは、Ｙａｍａｎａｋａ因子と呼ばれる。

本発明では、公示された方法に従って、前記逆分化因子を各々異なる三つのｅｐｉｓｏｍａｌＶｅｃｔｏｒに分けて製作して、ｐ５３ｓｈＲＮＡを共に発現させて（ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３，ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ，ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ）逆分化幹細胞の確立効率を上げた（ＯｋｉｔａＫｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．８（５）：４０９−１２，２０１１）。

本発明で逆分化因子を分化された細胞に伝達する方法は、リプログラミング遺伝子を分化された細胞の培養液に投与する方法、直接注入する方法または逆分化因子を挿入したウイルスベクターでトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたパッケージング細胞から得たウイルスに分化された細胞を感染させる方法などを使用することが好ましいが、これに限定されない。前記逆分化因子を分化された細胞に直接注入する方法として、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、パーティクル・ガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）等を使用することが好ましいか、これに限定されない。

本発明ではＬｏｎｚａのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ，ＵＳ／Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ，ＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，Ｌｏｎｚａ）機器を利用した電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で逆分化因子を注入して、リプログラミング遺伝子が導入された体細胞は、培養皿で３〜５日ほど培地を毎日取り換えて安定させた後、ペプチドを処理することが好ましい。

本発明は、無異種感染（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）または無支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｆｒｅｅ）条件下で人工多能性幹細胞を製造することによって細胞治療剤で利用が可能である。本発明では、ヒト由来組換えビトロネクチンタンパク質（ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＴＮ−Ｎ）を培養皿の表面にコーティングして、異種細胞である支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｆｒｅｅ）の使用を排除して異種感染物質（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎ）の問題を解決した。逆分化因子が導入された体細胞をビトロネクチンタンパク質がコーティングされた培養皿に培養しながら前記の機能性ペプタイを処理すると、人工多能性幹細胞への逆分化効率も促進させることができる。

本発明において、ペプチドの処理は、細胞培養培地に直接処理するか、培養用バイオマテリアルと混合して処理できて、バイオマテリアルとは、合成高分子または天然高分子をいう。本発明において、合成高分子は、ポロキサマー、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールで構成された群から選択されたいずれか一つであることが好ましく、天然高分子は、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン及び細胞外マトリックスタンパク質で構成された群から選択されたいずれか一つであることが好ましいか、これに限定されない。本発明では天然高分子であるビトロネクチンを使用して、このようなバイオマテリアルは、培養容器にコーティングして使用することが好ましいか、これに限定されない。

また、本発明は、既存人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養時に使用する動物由来の支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ）であるマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＥＦ）に代わることができる培養用バイオマテリアルを使用することによって、ＭＥＦ支持細胞から様々な因子が人工多能性幹細胞に供給されて発生する異種感染物質（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎ）を排除することができる。従って、本発明のペプチドを利用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の製造は、未分化多能性幹細胞を細胞治療剤として使用する際に考慮される異種感染物質（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎ）と逆分化誘導効率問題を共に改善することができる。

本発明において、前記機能性ペプチドは、逆分化因子が導入された体細胞内ＮＦ−κＢタンパク質の核内移動を抑制して、ＮＦ−κＢシグナル機序を阻害することによって、ＮＦ−κＢ活性を抑制することを特徴とする。

本発明において、前記ペプチドを逆分化因子が導入された体細胞に処理すると、ペプチドによってＮＦ−κＢタンパク質の核内移動が阻害されて、上皮細胞−間葉系細胞転移（ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）を抑制して、間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を促進することによってヒト由来体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）効率が増加することを確認した。

本発明では、多能性幹細胞の未分化状態の維持をＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｈＥＲＴ（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）およびＳＳＥＡ−４からなる群で選択される一つ以上の遺伝子発現が増加することで確認した。すなわち、逆分化因子が導入された体細胞に機能性ペプチドを処理してアルカリホスファターゼ染色（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇ，ＡＰｓｔａｉｎｉｎｇ）を介して逆分化段階中コロニーが生成される初期段階を観察しており、またＯｃｔ４抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用してＯｃｔ４の発現を免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＩＦ）で確認した。最後に体細胞の逆分化過程で肝葉細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）程度をヒト由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）であるＴＨＹ１および上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）であるＥＰＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）の抗体を使用してフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＡＣＳ）で確認した。

本発明は、逆分化誘導効率を向上させることができ、このような方法で製造された人工多能性幹細胞は、多能性幹細胞としての特性を正常に示す未分化状態の多能性幹細胞である。そこで、究極的に臨床適用が可能な多能性幹細胞を効果的に製造して、臨床適用が可能な多能性幹細胞資源を確保できる大量培養システムを開発するのに非常に有用である。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：逆分化誘導促進ペプチドの合成
Ｐ１ペプチド（ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＣＲＲＫＫ：配列番号１）を合成装置を利用してＣ末端からＦ−ｍｏｃ固体相化学合成方法で合成した。すなわち、ブロッキンググループ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇｇｒｏｕｐ）でＦｍｏｃ−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）が結合されたＲｉｎｋレジン（０．０７５ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を使用して合成して、合成器に５０ｍｇのＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡレジンを入れた後、ＤＭＦでレジンをスウェリング（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）させた後、Ｆｍｏｃ−ｇｒｏｕｐの除去のために２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ溶液を使用した。Ｃ末端から配列毎に０．５Ｍａｍｉｎｏａｃｉｄ溶液（溶媒：ＤＭＦ）、１．０ＭＤＩＰＥＡ（溶媒：ＤＭＦ＆ＮＭＰ），０．５ＭＨＢＴＵ（溶媒：ＤＭＦ）を各々５、１０、１５当量ずつ入れて窒素気流下で１〜２時間反応させた。前記脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）とカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）段階が終る度にＤＭＦとメタノールで二回ずつ洗浄する過程を経た。最後のアミノ酸をカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させた後にも、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を行ってＦｍｏｃ−ｇｒｏｕｐを除去した。

合成の確認は、ニンヒドリン試験（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎｔｅｓｔ）方法を利用して、試験を経て合成が完了されたレジンは、乾燥させた後、ＲｅａｇｅｎｔＫｃｌｅａｖａｇｅカクテルをレジン１ｇ当たり２０ｍｌの割合で入れて３時間ｓｈａｋｉｎｇさせた後、フィルタリングを介してレジンとペプチドが溶けているカクテルを分離した。フィルターでより分られた溶液をコールドエーテル（ｃｏｌｄｅｔｈｅｒ）をいれてペプチドを固体相で結晶化させてこれを遠心分離して分離した。この時、エーテルで多数回洗浄と遠心分離過程を経てＲｅａｇｅｎｔＫｃｌｅａｖａｇｅカクテルを完全に除去した。このようにして得られたｃｒｕｄｅを蒸溜水に溶かして液体クロマトグラフィーを利用して分離精製して、精製されたペプチドは凍結乾燥した。
Ｐ１ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＣＲＲＫＫ（配列番号１）
また、Ｐ１ペプチド（配列番号１）のＣ末端５番目のシステインをメチオニンで置き換えたＰ２ペプチド（配列番号２）及びＰ１ペプチド（配列番号１）のＣ末端６番目のシステインをメチオニンで置き換えたＰ３ペプチド（配列番号３）を合成装置を利用してＦ−ｍｏｃ個相化学合成方法で合成した。
Ｐ２ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＣＭＲＲＫＫ（配列番号２）
Ｐ３ペプチド：ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＭＣＲＲＫＫ（配列番号３）

比較例１：機能性ペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の対照群Ｃ１ペプチド
前記実施例１と同様の合成装置を利用してＦ−ｍｏｃ個相化学合成方法で合成した。
Ｃ１ペプチド：ＨＲＲＣＮＫＮＮＫＫＲ（配列番号４）

比較例２：機能性ペプチド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の対照群Ｃ２ペプチド
前記実施例１と同様の合成装置を利用してＦ−ｍｏｃ個相化学合成方法で合成した。
Ｃ２ペプチド：ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡ（配列番号５）

実施例２：ヒト由来体細胞の逆分化に対するペプチド別誘導効率検証
２−１：ＡＬＰ染色を介した人工多能性幹細胞コロニー個数確認
ペプチド別逆分化誘導効率を確認するために、ヒト組換えビトロネクチンタンパク質（ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＴＮ−Ｎ）がコーティングされた６−ウェル（ｗｅｌｌ）を利用して１．５×１０^５個／ウェル（ｗｅｌｌ）のヒト由来皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ：ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）に電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）手法でリプログラミング遺伝子ＤＮＡ（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８）を２μｇずつ導入した。前記逆分化因子は公示の方法に従って、各々異なる三つのｅｐｉｓｏｍａｌＶｅｃｔｏｒに分けて製作してｐ５３ｓｈＲＮＡを共に発現させて（ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３，ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ，ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ）逆分化幹細胞の確立効率を上げた（ＯｋｉｔａＫｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．８（５）：４０９−１２，２０１１）。逆分化因子が導入された細胞は、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ，ＡＴＣＣ）培地で培養して、細胞ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙが５０％になる時まで２４時間間隔で培地を取り替えた。Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙが５０％になった時、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地に替えて逆分化誘導促進ペプチドと対照群ペプチドを各々１０μＭ処理して、２４時間毎に培地の取り替えと同時にペプチドを処理した。ペプチドを２４時間間隔で１０日間処理して、胚性幹細胞のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）として知られるアルカリホスファターゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＰ）でペプチド特別な逆分化効率を確認するために、ＡＰ染色キットはＭｉｌｉｐｏｒｅのＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔを購入して使用した。培地を除去して４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を細胞に入れて２分間固定してＮａｐｈｔｈｏｌ／ＦａｓｔＲｅｄＶｉｏｌｅｔ染色剤をウェル（ｗｅｌｌ）に入れて２０分以上暗い空間で室温保管して反応させた後、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で染色剤を洗浄して顕微鏡で染色されたコロニーの個数を確認した。

その結果、図１に示された通り、ペプチドを処理しなかった細胞およびＣ１、Ｃ２ペプチドを処理した対照群に比べてＰ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドを処理した細胞でより多くのコロニーが染色されたことを確認することができた。コロニーの個数をカウントして定量化したグラフでも同様にＰ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドがより逆分化を効率的に誘導することを確認することができた（図１）。

２−２：胚性幹細胞マーカー染色を介した人工多能性幹細胞形成確認
実施例２−１と同様の方法で、ヒト皮膚細胞（ｈｕｍａｎＤｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）に電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔａｉｏｎ）手法で逆分化因子を細胞内に導入してビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）がコーティングされた６−ウェル（ｗｅｌｌ）に分注した。以後、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＩＦ）手法を利用して胚性幹細胞マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であるＯｃｔ４の発現程度を比較した。

１０日間各々のペプチド１０μＭを処理した細胞に４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れて室温で１０分間固定させた後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を入れて１５分間室温で培養して細胞内核まで透過することができるように細胞壁を突き抜けて３％ウシ血清アルブミン（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）が溶解されている緩衝溶液（ＰＢＳ）で３０分間ブロッキングをした。Ｏｃｔ４１次抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１％ウシ血清アルブミンが溶解されている緩衝溶液（ＰＢＳ）に１：１００の割合で希釈して４℃で１６時間反応させて、蛍光染料（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）が結合された２次抗体を１：２００の割合で希釈して室温で１時間反応させた。最後に、核を染色する染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２，ｂｌｕｅ）を常温で１０分間処理して、緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄して共焦点走査電子顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＩＸ７０，ＯｌｙｍｐｕｓＣｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でウェル（ｗｅｌｌ）で最も蛍光発現が鮮明なコロニーを撮影した。

その結果、図２に示された通り、ペプチドを処理しなかった細胞およびＣ１、Ｃ２ペプチドを処理した対照群に比べてＰ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドを処理した細胞でより多くの蛍光が発現したことを確認することができた。これは胚性幹細胞マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であるＯｃｔ４の発現量が多いことであり、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドが逆分化を促進させることが分かる。ＡＰ染色も、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドを処理した群でより鮮明に現れて、機能性Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドが人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の形態であるコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）への逆分化を促進することを確認した（図２）。

２−３：フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用したペプチド別逆分化誘導差確認
実施例２−１と同様の方法で、ヒト皮膚細胞（ｈｕｍａｎＤｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）に電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔａｉｏｎ）手法で逆分化因子を細胞内に導入してビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）がコーティングされた６−ウェル（ｗｅｌｌ）に分注した。細胞が安定化されたペプチド処理１０日後に、スクレーパーを利用して細胞を１５ｍｌパルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎｔｕｂｅ）に集めた後、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、冷たい緩衝溶液（ｃｏｌｄＰＢＳ）を利用して１．５×１０^５個の細胞を各々のチューブに移した。チューブに１０μｇ／ｍｌ濃度のＴＨＹ１（ｃａｔ：ｓｃ−５９３９８）、ＥＰＣＡＭ（ｃａｔ：ａｂ２０１６０）抗体を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に希釈して入れて４℃で３０分間反応させた後、１５００ｒｐｍで５分間３回遠心分離した。冷たい緩衝溶液（ｃｏｌｄＰＢＳ）で洗浄後、ラウンドチューブ（ｒｏｕｎｄｔｕｂｅ）に移してフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＡＣＳ）で分析した。サンプルの測定に先立ち、ＴＨＹ１はヒト由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を使用して、ＥＰＣＡＭはヒト由来乳腺上皮細胞（ｈｕｍａｎｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＨＭＥＣ）を使用してコントロール基準値を固定した。

その結果、Ｃ１、Ｃ２ペプチドを処理した対照群に比べてＰ１、Ｐ２、Ｐ３ペプチドを処理した群で、間充織（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）模様を有する線維芽細胞が明確に上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）模様に変化したことを確認することができた（図３）。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

本発明に係る合成ペプチドを利用した人工多能性幹細胞の製造方法は、動物血清または異種細胞との共培養などを要しない無異種感染（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）または無支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）条件で未分化状態の多能性幹細胞を効率的に製造することができるので、臨床適用が可能な幹細胞治療剤開発に非常に有用である。

Claims

下記の一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含有する、分化した細胞からの人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
（前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ）またはメチオニン（Ｍ）である）。
前記ペプチドは、配列番号１〜３で構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物。
前記分化した細胞は、体細胞または前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物。
前記分化した細胞は、ヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の人工多能性幹細胞への逆分化促進用組成物。
下記段階を含む分化した細胞からの人工多能性幹細胞の製造方法：
（ａ）分化した細胞にリプログラミング遺伝子を導入する段階；および
（ｂ）リプログラミング遺伝子が導入された細胞に下記一般式Ｉのアミノ酸配列で表示されるペプチドを処理して培養する段階：
［一般式Ｉ］ＧＫＣＳＴＲＧＲＫＸ^１Ｘ^２ＲＲＫＫ
（前記Ｘ^１およびＸ^２は、システイン（Ｃ）またはメチオニン（Ｍ）である）。
前記ペプチドは、配列番号１〜３で構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記ペプチドは、０．０１〜１００μＭ濃度であることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記分化した細胞は、体細胞または前駆細胞であることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記分化した細胞は、ヒト由来であることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
無異種感染（ｘｅｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）または無支持細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｆｒｅｅ）条件下で行われることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記リプログラミング遺伝子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４およびＬｉｎ２８からなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記ペプチドは、ＮＦ−κＢ活性を抑制することを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記ペプチドは、間葉系細胞−上皮細胞転移（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＥＴ）を促進することを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記（ｂ）段階において、ペプチドを細胞培養培地に直接処理するか、又はバイオマテリアルと混合して処理することを特徴とする請求項５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記バイオマテリアルとは、合成高分子または天然高分子であることを特徴とする請求項１４に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記合成高分子は、ポロキサマー、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールで構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
前記天然高分子は、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン及び細胞外マトリックスタンパク質で構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。