KR101400668B1 - 펩타이드에 의한 표면활성형 콜라겐 차폐막 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콜라겐에 결합하는 항균 기능성을 가지는 펩타이드가 결합된 차폐막에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 콜라겐 결합 펩타이드와 항균 기능성 펩타이드의 융합 펩타이드가 콜라겐 표면에 고정되어 있는 콜라겐 차폐막에 관한 것이다.
본 발명의 융합 펩타이드 표면에 결합한 표면활성형 콜라겐 차폐막은 생체 내에 이식하였을 때, 국소 체류성이 증가하여 안정하게 결합할 수 있고, 골조직 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 골조직 재생력을 극대화시킬 수 있어 이를 이용한 골유도재생 치료기술의 발전에 유용하다. 또한 융합 펩타이드는 콜라겐으로 제조된 다른 형태의 이식재에도 응용이 가능하고, 융합 펩타이드를 구성하는 콜라겐 결합 펩타이드는 다른 조직에 재생효과가 있는 펩타이드와도 결합하여 합성이 가능하므로, 피부와 같은 다른 목적의 조직재생용 생체재료에 응용이 가능하다.

Description

펩타이드에 의한 표면활성형 콜라겐 차폐막 {Surface Activated Collagen Membrane by Peptide}
본 발명은 콜라겐에 결합하는 항균 기능성을 가지는 펩타이드가 결합된 차폐막에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 콜라겐 결합 펩타이드와 항균 기능성 펩타이드의 융합 펩타이드가 콜라겐 표면에 고정되어 있는 콜라겐 차폐막에 관한 것이다.
치주질환에 의해 손상된 치조골을 재생시키는 방법으로는 자가골이식 (autografting)으로 손상된 부위를 채워 고형을 유도하는 방법이 있다. 또 다른 방법으로는 면역원성을 제거한 사람이나 동물의 뼈를 인위적인 골대체 물질로서 이용하거나 상업적으로 시판되는 수산화 아파타이트를 이용하는 방법이 있다.
최근에는 인공 막을 조직에 도입하여 손상된 치주조직의 치유를 증진시키고, 완전한 치주조직으로의 복원을 꾀하는 동시에 골 이식 결과를 개선시키고 새로운 치조골의 생성을 유도하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다. 이러한 기술에서 사용되는 차폐막은 손상 부위와 그 주위의 결체 조직을 격리 및 차단시켜 새로운 치조골 및 치주 인대조직을 생성시켜 치주조직의 재생이 원활히 일어날 수 있도록 한다. 즉, 차폐막으로 손상된 부위를 다른 주위 환경과 차단시켜 치은 섬유아세포가 침입하지 못하고 조직 중에 있는 골 및 치주 인대 재생력이 있는 세포들이 방해를 받지 않고 새로운 치주조직이 재생될 수 있도록 하는 것이다.
또한, 여러 가지 질병이나 외상으로 인한 골 손상은 인간의 움직임에 중요한 영향력을 미치므로 골격계에서 연속성을 유지하고 기계적으로 신체를 지지할 수 있는 치료가 필요하다. 현재 골 재생 또는 골 대체 치료들이 많이 수행되고 있지만 많은 문제점이 있다.
초기에는 차폐막으로 폴리테트라플루오로에틸렌, 셀룰로오스 아세테이트, 실리콘 고무 및 폴리우레탄과 같은 비분해성 재료를 이용하였으나, 비분해성 재료로 제조된 차폐막은 생체적합성이 크지 않아 치조골이 생성된 후에 다시 차폐막을 제거하기 위한 2차 수술이 필요하고, 이러한 과정에서 불필요한 염증이나 조직 괴사가 일어날 수 있는 부작용이 있다.
최근에는 지방족 폴리에스터나 콜라겐과 같은 생분해성 고분자를 이용한 연구가 보고되고 있는데, 생분해성 차폐막을 이용하면 차폐막을 제거하기 위한 재수술이 필요 없고 비분해성 재료로 제조된 차폐막과 비교하여 조직을 재생하는 데에는 큰 차이가 없는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 지방족 폴리에스터로 제조된 차폐막의 경우 산성 분해물에 의해 이식된 부위에서의 염증반응을 일으킬 수 있다. 따라서 골조직을 구성하는 단백질의 대부분을 차지하는 콜라겐을 이용하여 차폐막을 제조하여 이를 임상시험에 사용되는 것이 보고되었다.
종래의 기술로 한국공개특허 제2003-002224호는 천연 고분자인 키토산과 합성 고분자인 생분해성 고분자를 이용하여 제조된 조직 재생 유도용 차폐막에 관한 것으로, 이는 키토산으로 제조된 부직포, 생분해성 고분자 용액을 상기 부직포 위에 도포하여 고분자 막 형성 및 키토산으로 제조된 부직포를 상기 고분자 막에 적층하는 순서에 따라 제조과정이 진행되므로, 제조공정이 복잡한 단점이 있고, 한국등록특허 제0564366호에 따르면, 일정 강도와 생체 적합성 및 생분해성을 가지는 미세공의 공극 크기 조절이 용이하고, 간단한 제조공정으로 제조할 수 있는 천연고분자와 합성고분자의 혼합물로부터 제조되는 나노섬유가 부직포 형태로 되어 있는 조직 재생용 차폐막에 대해 제시하고 있으나, 이들 고분자 차폐막이나 지지체에 의해서는 조직성장인자가 물리적으로 혼합되어 있는 상태로서 초기 적용시 속방출이 일어나 치료기간 동안 유효 농도의 유지가 어려운 단점이 있다.
또한, 차폐막의 조직재생을 향상시키기 위해 조직성장인자(growth factor) 또는 세포 외기질 유래 물질(Extracellualr matrix)을 차폐막에 도입한 연구가 이루어졌는데, 이들은 단백질이기 때문에, 활성을 유지하기 위해서는 3차 구조를 유지해야 하지만 대부분의 세포 외기질 및 성장인자들은 온도에 영향을 받기 쉬워 생체 내에서도 쉽게 불안정해지는 단점이 있다.
따라서 원하는 치료효과를 얻기 위해서는 조직성장인자 및 세포 외기질 유래 물질을 대용량으로 투여해야 하고, 이로 인한 부작용을 유발할 수 있어, 이를 해결하기 위해 차폐막의 내부 또는 표면에 조직성장인자를 도입하려는 시도가 이루어졌다. 그러나, 조직성장인자를 차폐막에 물리적으로 흡착시키는 경우, 그 결합력이 약하므로 장기간 동안 결합을 유지할 수 없는 반면, 조직성장인자를 차폐막에 공유결합시키는 경우에는 가교제를 사용하여 장기간 동안 안정한 결합을 유지할 수 있다. 그러나 가교제로 인해 조직성장인자의 3차 구조에 변형을 초래하여 그 활성을 감소시킬 가능성이 있는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 항균 기능성을 가진 표면활성형 콜라겐 차폐막을 제조하고자 예의 노력한 결과, 콜라겐에 결합력이 있는 펩타이드에 항균 기능성 펩타이드를 연결한 융합 펩타이드를 콜라겐 차폐막에 결합시키는 경우, 차폐막에 항균 기능성의 표면활성을 부여할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 콜라겐에 결합력이 있는 펩타이드에 항균 기능성 펩타이드를 연결한 융합 펩타이드를 콜라겐 차폐막에 결합시켜 항균 기능성의 표면활성이 부여된 콜라겐 차폐막을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐 결합 펩타이드와 서열번호 25 내지 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드가 결합되어 있는 콜라겐 결합능과 항균 기능성을 가지는 융합 펩타이드 및 상기의 융합 펩타이드가 콜라겐 차폐막 표면에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 기능성을 가지는 콜라겐 차폐막를 제공한다.
본 발명의 융합 펩타이드 표면에 결합한 표면활성형 콜라겐 차폐막은 생체 내에 이식하였을 때, 국소 체류성이 증가하여 안정하게 결합할 수 있고, 골조직 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 골조직 재생력을 극대화시킬 수 있어 이를 이용한 골유도재생 치료기술의 발전에 유용하다. 또한 융합 펩타이드는 콜라겐으로 제조된 다른 형태의 이식재에도 응용이 가능하고, 융합 펩타이드를 구성하는 콜라겐 결합 펩타이드는 다른 조직에 재생효과가 있는 펩타이드와도 결합하여 합성이 가능하므로, 피부와 같은 다른 목적의 조직재생용 생체재료에 응용이 가능하다.
도 1은 콜라겐 차폐막 및 3차원 지지체이다.
도 2는 콜라겐 차폐막의 전자현미경(SEM)의 표면 및 단면을 나타낸 사진이다.
도 3은 콜라겐 차폐막을 공초점 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 사진이다
(A: 펩타이드가 결합되지 않은 콜라겐 차폐막;
B: FITC가 표지된 서열번호 24 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막).
도 4는 FITC가 표지된 콜라겐 차폐막을 가토 두개골 원형 골 결손부에 이식하고, 시간의 변화에 따른 혈액을 채취하여 혈액 내로 유리된 펩타이드를 fluorometer로 측정값을 나타낸 것이다.
도 5는 콜라겐 차폐막을 가토 두개골 원형 골결손부에 이식하고 이식 4주 후 골재생 정도를 관찰한 사진이다
(A: 서열번호 1 펩타이드가 결합된 차폐막;
B: 서열번호 9 펩타이드가 결합된 차폐막; 및
C: 서열번호 24 펩타이드가 결합된 차폐막).
도 6은 콜라겐 차폐막의 대장균에 대한 성장저해 직경을 측정한 것을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 콜라겐 결합 펩타이드와 서열번호 25 내지 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드가 결합되어 있는 콜라겐 결합능과 항균 기능성을 가지는 융합 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 콜라겐 결합 펩타이드는 콜라겐과 결합능을 가지는 펩타이드라면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 콜라겐 결합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 1: GLRSKSKKFRRPDIQYPDA
본 발명의 항균 기능성 펩타이드는 인간 베타 디펜신-2(human beta-defensin-2, hBD-2: 서열번호 25), 인간 베타 디펜신-3(human beta-defensin-3, hBD-3: 서열번호 26), 인간 혈소판 유래 생장인자(human platelet derived growth factor-B, PDGF-B: 서열번호 27) 및 헤파린 결합 표피 성장인자(heparin binding-epidermal growth factor, HB-EGF: 서열번호 28)로 유래되고 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드에서 선택할 수 있다.
상기 펩타이드의 서열번호 25~28의 아미노산 서열은 하기와 같다.
서열번호 25(BD2-2): CPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP
서열번호 26(BD3-3): GKCSTRGRKCCRRKK
서열번호 27(PDGF): RKIEIVRKKPIFKKATVT
서열번호 28(HB-EGF): CKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK
본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 서열번호 1의 콜라겐 결합 펩타이드와 서열번호 26의 항균 기능성 펩타이드를 연결하여 서열번호 29의 콜라겐에 결합하는 항균 기능성 펩타이드를 제작하고, 제작된 펩타이드가 콜라겐에 안정하게 결합하여 항균 기능성이 있는지 세균에 대한 성장저해 정도를 측정하여 확인하였다.
서열번호 29: GLRSKSKKFRRPDIQYPDAGKCSTRGRKCCRRKK
다른 관점에서, 본 발명은 상기의 융합 펩타이드가 콜라겐 차폐막 표면에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 기능성을 가지는 콜라겐 차폐막에 관한 것이다.
본 발명에 따른 콜라겐 결합 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드는 콜라겐에 고정됨으로써, 국소 체류성이 증가하며, 펩타이드에 의한 골재생 효과 및 항균효과가 지속될 수 있으며, 이는 골조직 및 치주조직 재생 치료에 적합한 특징이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생능을 가지는 융합 펩타이드를 제조하기 위하여, 콜라겐에 결합하는 서열번호 1의 펩타이드와 항균기능을 가지는 서열번호 26의 펩타이드를 합성하여 상기와 동일한 방법으로 콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성 융합 펩타이드(서열번호 29)를 제조하였다.
본 발명의 다른 양태에서, 콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성을 가진 융합 펩타이드의 항균력 확인하기 위하여, 서열번호 1의 펩타이드, 서열번호 26의 펩타이드 및 서열번호 29의 펩타이드를 사용하여 콜라겐 차폐막을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 제조하였다. 제조된 콜라겐 차폐막을 PBS에 1시간 방치하여 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 펩타이드의 항균효능을 평가하기 위하여, 아가 확산법에 따라 항균실험을 진행하였다. E. coli를 TSB 배지에서 배양시키고, 620㎚에서 흡광도가 1이 될 때까지 배양한 후 세포를 수거하여 실험에 사용하였고, PBS로 희석하여 ㎖당 105~107 개의 박테리아를 TSA플레이트에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 균이 배양된 플레이트 위에 서열번호 1, 서열번호 26 및 서열번호 29가 결합된 콜라겐 차폐막을 올려놓고, 3일 동안 배양한 후, 균의 성장이 저해되는 직경을 측정하였다. 그 결과, 서열번호 1이 결합된 콜라겐 차폐막은 세척 전후 항균기능성이 없었으며, 서열번호 26가 결합된 콜라겐 차폐막의 경우는 세척하기 전에는 항균기능성이 높았으나, 세척 후에는 항균 기능성이 약 50%정도 감소한 것을 알 수 있었다. 또한, 서열번호 29의 경우 세척 전후 항균 기능성이 유지되었다. 이는 콜라겐 결합 펩타이드와 항균 기능성 펩타이드의 융합 펩타이드가 세척 후에도 콜라겐에 대한 결합력을 유지하였기 때문에, 항균 기능성에 변화가 없었던 것을 알 수 있었다.
본 발명에서 콜라겐에 결합하는 펩타이드는 서열번호 1(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA)이며, 골조직 재생 기능성을 가지는 펩타이드의 N-말단에 화학적으로 부가되어 콜라겐에 대한 결합능을 증가시켜 차폐막 또는 이식재 등에 안정하게 결합할 수 있다.
본 발명에서 골조직 재생 기능성을 가지는 펩타이드는 (a)골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)-2, 4 및 6의 아미노산 서열 중 각각 2-18위치의 아미노산 서열 [BMP-2의 경우(서열번호 2), BMP-4의 경우(서열번호 3) 및 BMP-6의 경우(서열번호 4)]; BMP-2의 16-34위치의 아미노산 서열 (서열번호 5); 47-71위치의 아미노산 서열 (서열번호 6); 73-92위치의 아미노산 서열 (서열번호 7); 88-105위치의 아미노산 서열 (서열번호 8); 298-316위치의 아미노산 서열 (서열번호 9); 335-353위치의 아미노산 서열 (서열번호 10); 370-396위치의 아미노산 서열 (서열번호 11); BMP-4의 74-93위치의 아미노산 서열 (서열번호 12); 293-313위치의 아미노산 서열 (서열번호 13); 360-379위치의 아미노산 서열 (서열번호 14); 382-402위치의 아미노산 서열 (서열번호 15); BMP-6의 91-110위치의 아미노산 서열 (서열번호 16); 407-418위치의 아미노산 서열 (서열번호 17); 472-490위치의 아미노산 서열 (서열번호 18); 487-510위치의 아미노산 서열 (서열번호 19); BMP-7의 98-117위치의 아미노산 서열 (서열번호 20); 320-340위치의 아미노산 서열 (서열번호 21); 400-409위치의 아미노산 서열 (서열번호 22) 및 405-423위치의 아미노산 서열 (서열번호 23)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드에서 선택할 수 있다.
상기 펩타이드의 서열번호 2~23의 아미노산 서열은 하기와 같다.
서열번호 2: VAGTRCLLA LLLPQVLL
서열번호 3: IPGNRMLMV VLLCQVLL
서열번호 4: PGLGRRAQW LCWWWGLL
서열번호 5: VLLGG AAGLVPELGR RKFA
서열번호 6: DEVL SEFELRLLSM FGLKQRPTPS R
서열번호 7: AVVPPYML DLYRRHSGQP GS
서열번호 8: GQP GSPAPDHRLE RAASR
서열번호 9: RHPLYVDFSDVGW NDWIVA
서열변호 10: DHLNST NHAIVQTLVN SVN
서열번호 11: S MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR
서열번호 12: SKSAVIP DYMRDLYRLQ SGE
서열번호 13: SPKHHSQR ARKKNKNCRR HSL
서열번호 14: L VNSVNSSIPK ACCVPTELS
서열번호 15: SMLYLDEYD KV
서열번호 16: RPRPLHGLQ QPQPPALRQQ
서열번호 17: ELKT ACRKHELY
서열번호 18: YVPKPCCAPTKLNAISVLY
서열번호 19: SVLY FDDNSNVILK KYRNMVVRAC
서열번호 20: PGG QGFSYPYKAV FSTQGPP
서열번호 21: ENSSSDQRQAC KKHELYVSFR
서열번호 22: Q LNAISVLYF
서열번호 23: SVLYFD DSSNVILKKY RNM
본 발명의 또 다른 양태에서, 서열번호 1의 콜라겐 결합 펩타이드와 서열번호 9의 골조직 재생 기능성 펩타이드를 연결하여 서열번호 24의 콜라겐에 결합하는 골조직 재생 기능성 펩타이드를 제작하고, 제작된 펩타이드가 콜라겐에 안정하게 결합하는지를 확인 및 상기 차폐막을 골결손부에 이식하여 골 재생력을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생능을 가지는 융합 펩타이드를 제조하기 위하여, N 말단으로부터 순서대로 콜라겐에 결합하는 서열번호 1(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA)의 펩타이드, 골조직 재생 기능성을 가지는 서열번호 9(RHPLYVDFSDVGWNDWIVA)의 펩타이드를 함유하도록 펩타이드 합성장치를 이용하여 F-moc 고상 화학합성 방법을 이용하여 합성하였다. 블로킹 그룹으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 링크레진을 사용하여 합성기에 링크레진을 넣은 뒤, DMF로 레진을 스웰링시킨 후, 20% piperidine/DMFf를 사용하여 Fmoc-group을 제거하였다. 그리고, C 말단으로부터 서열대로 0.5M 아미노산용액(용매: DMF) 00㎖, 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP) 및 0.5M HBTU(용매: DMF)를 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF로 두 번씩 세척하였으며, 마지막 아미노산을 커플링(coupling)시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)하여 Fmoc-group를 제거하여 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성 융합 펩타이드(서열번호 24)를 제조하였다.
서열번호 24: GLRSKSKKFRRPDIQYPDARHPLYVDFSDVGWNDWIVA
본 발명의 또 다른 실시예에서, 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성 융합 펩타이드 합성 확인은 닌하이드린 테스트를 이용하였으며, 테스트를 거치고 합성이 완료된 레진은 DCM으로 건조시킨 후, TFA cleavage cocktail을 레진 에 넣어 3시간 동안 쉐이킹 시키고 필터링을 통해 레진과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기를 이용하여 제거한 후, 콜드 에테르를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail 용액에 직접 콜드 에테르를 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였고, 정제된 펩타이드는 MALDI분석을 이용하여 분자량을 확인하였다. 또한, 체내에서 안정성을 시험하기 위해 서열번호 24의 제조시, N 말단에 FITC(Fluorescein isothicyanate)를 트리에틸아민을 이용하여 결합시켰으며, 이를 MALDI-TOF를 이용하여 합성된 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 콜라겐 결합력 확인하기 위하여, 돼지 피부 유래의 콜라겐을 0.1M HCl에 녹여 1%(w/v)로 만든 후, pH를 중화시키고, 용매를 휘발시켜 4%로 농축하였다. 차폐막을 제조하기 위하여, 60㎝ 지름의 dish에 농축된 콜라겐 용액을 부어 혼합하였고, 3차원 지지체를 제조하기 위하여, 콜라겐 용액을 세포배양용 24 웰 플레이트에 부어 혼합하였다. 이후, 1% 글루탈알데하이드 또는 1% 글리세랄데하이드를 가하여 가교하고, 증류수로 세척하고 동결건조시켰다. 크기 1x1㎝, 두께 250㎛로 제조된 차폐막에 서열번호 24의 융합 펩타이드 10mg/100㎕DW를 적시고 PBS로 세척하고 동결건조하였다. 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막을 PBS에 넣고, 37℃에서 펩타이드 방출 테스트를 하였다. 7일 후, 처음에 넣어준 용출 용매 10㎖를 모두 제거한 후에 다시 새로운 용출 용매 10㎖를 첨가하여 37℃에서 4주 동안 용출시키고, 용출이 종료된 후 차폐막을 수거하여 펩타이드를 함량을 측정하였다. 4주 동안 용출실험을 하여 용출액에서의 펩타이드의 함량을 측정한 결과, Lot No. 1, 2 및 3에서 체류시간 13분에는 펩타이드의 최고점이 관찰되지 않았으나, 용출이 종료된 후, 측정한 펩타이드 함량은 9.2㎎, 9.43㎎ 및 9.68㎎으로, 이는 차폐막에 결합된 펩타이드가 용출액으로 방출되고 펩타이드가 차폐막에 안정하게 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 콜라겐에 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 in vivo 안정성 확인하기 위하여, 콜라겐 차폐막에 FITC를 표지시킨 서열번호 24의 펩타이드를 결합하고, 가토의 두개골 결손부에 이식한 후, 4주 후에 희생한 후, 두개골 결손부에 이식된 차폐막을 공초점 현미경으로 관찰하였다. FITC 표지시킨 서열번호 24의 펩타이드에 결합된 차폐막을 가토의 두개골 결손부에 이식하고, 이식 전, 이식 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 혈액을 채취하여 전신혈로 펩타이드가 유리되는지 여부를 형광광도계(Fluorometer)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 두개골에 이식한 차폐막의 표면에서 펩타이드가 잘 고정되어 있었으며, 주위조직에 퍼져나가지 않은 것을 확인하였고, RFI 값들이 이식 전의 값과 비교하여 차이를 보이지 않아 차폐막에 포함된 펩타이드가 혈액 내에 유리되지 않았다는 것을 확인하고, 펩타이드가 콜라겐 차페막에 잘 고정되었음을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 콜라겐 차폐막에 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 in vivo 골 재생능 확인하기 위하여, 상기 제조된 서열번호 1, 서열번호 9 및 서열번호 24의 펩타이드를 콜라겐 차폐막에 결합시킨 후, 토끼의 두개골 원형골 결손부에서 이식하여 골 재생능을 확인하였다. 마취시킨 토끼의 두개골부위에 직경 8㎜의 원형 골결손부를 형성시키고, 상기 골결손부에 콜라겐 차폐막을 덮고, 골막과 피부를 이중봉합하였다. 이식 4주 후에 동물을 희생시키고, 채취한 표본은 포르말린 용액에 넣어 고정시킨 후, 조직을 포매하여 두께 20㎛의 시편으로 제작하였다. 제작된 시편은 염기성 푹신과 톨루이딘 블루로 염색하여 비탈회 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경으로 관찰하여 사진 촬영을 실시하였다. 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드가 포함된 차폐막에 의한 골재생 효과를 확인한 결과, 서열번호 24의 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막이 서열번호 1 또는 서열번호 9의 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막보다 골 재생력이 증가된 것을 확인하였으며, 이는 콜라겐에 안정하게 결합된 융합 펩타이드의 경우 이식부위에서 안정하게 체류하므로 골조직 재생능이 더 증가하였다는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 제조
콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생능을 가지는 융합 펩타이드를 제조하기 위하여, N 말단으로부터 순서대로 결합하는 콜라겐에 결합하는 서열번호 1(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA)의 펩타이드, 골조직 재생 기능성을 가지는 서열번호 9(RHPLYVDFSDVGWNDWIVA)의 펩타이드를 함유하도록 펩타이드 합성장치를 이용하여 F-moc 고상 화학합성 방법을 이용하여 합성하였다. 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 링크레진(Rink resin, 0.075m㏖/g, 100~200 메쉬, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성기에 50㎎의 링크레진(Rink resin)을 넣은 뒤, DMF로 레진(resin)을 스웰링(swelling)시킨 후, 20% piperidine/DMF 용액 20㎖를 사용하여 Fmoc-group을 제거하였다. 그리고, C 말단으로부터 서열대로 0.5M 아미노산용액(용매: DMF) 5㎖, 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP) 5㎖ 및 0.5M HBTU(용매: DMF) 5㎖를 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF로 두 번씩 세척하였으며, 마지막 아미노산을 커플링(coupling)시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)하여 Fmoc-group를 제거하여 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성 융합 펩타이드(서열번호 24)를 제조하였다.
서열번호 24: GLRSKSKKFRRPDIQYPDARHPLYVDFSDVGWNDWIVA
상기 펩타이드의 합성 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test)를 이용하였으며, 테스트를 거치고 합성이 완료된 레진(resin)은 DCM으로 건조시킨 후, TFA cleavage cocktail을 레진(resin) 1g 당 20㎖의 비율로 넣어 3시간 동안 쉐이킹 시키고 필터링을 통해 레진(resin)과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후, 콜드 에테르(cold ether) 1ℓ를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail용액에 직접 콜드 에테르를 1ℓ 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리하였다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였고, 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결건조하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였고, 정제된 펩타이드는 MALDI분석을 이용하여 분자량 4534를 확인하였다.
또한, 체내에서 안정성을 시험하기 위해 서열번호 24의 제조시, N 말단에 0.3g의 FITC(Fluorescein isothicyanate)를 반응용매(pyridine:DMC:MC=12:7:5) 12㎖에서 결합시켰으며, 이를 MALDI-TOF를 이용하여 분자량 4934로 합성된 것을 확인하였다.
실시예 2: 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 콜라겐 결합력 확인
돼지 피부 유래의 콜라겐 1g을 0.1M HCl 100㎖에 녹여 1%(w/v)로 만든 후, pH를 중화시키고, 용매를 휘발시켜 4%로 농축하였다.
차폐막을 제조하기 위하여, 60㎝ 지름의 dish에 농축된 콜라겐 용액 8㎖를 부어 혼합하였고, 3차원 지지체를 제조하기 위하여, 콜라겐 용액 1㎖를 세포배양용 24 웰 플레이트에 부어 혼합하였다. 이후, 1% 글루탈알데하이드(glutaraldehyde) 또는 1% 글리세랄데하이드(glyceraldehyde)를 가하여 가교하고, 증류수로 세척하고 동결건조시켰다 (도 1).
크기 1x1㎝, 두께 250㎛로 제조된 차폐막 0.038g에 서열번호 24의 융합 펩타이드 10mg/100㎕DW (탈이온수)를 적시고 4℃에서 8시간 동안 방치한 후, PBS로 세척하고 동결건조하였다. 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막을 10㎖ PBS에 넣고, 37℃에서 펩타이드 방출 테스트를 하였다.
7일 후, 처음에 넣어준 용출 용매 10㎖를 모두 제거한 후에 다시 새로운 용출 용매 10㎖를 첨가하여 37℃에서 4주 동안 용출시키고, 용출이 종료된 후 차폐막을 수거하여 펩타이드를 함량을 측정하였다.
4주 동안 용출실험을 하여 용출액에서의 펩타이드의 함량을 측정한 결과, Lot No. 1, 2 및 3에서 체류시간 13분에는 펩타이드의 최고점(peak)이 관찰되지 않았으나, 용출이 종료된 후, 측정한 펩타이드 함량은 9.2㎎, 9.43㎎ 및 9.68㎎이었다 (표 2 및 표 3). 따라서, 이는 차폐막에 결합된 펩타이드가 용출액으로 방출되고 펩타이드가 차폐막에 안정하게 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
<검액제조방법>
펩타이드가 결합된 차폐막 0.038g을 정밀하게 달아 이동 상의 용매 A를 5㎖ 넣고, sonication을 1시간 동안 실시하였다. 이동상의 용매 B를 5㎖ 넣고 혼합한 후, 4500rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액 1㎖을 취하였고, 0.22 미세여과지(millipore filter)로 여과하여 검액으로 사용하였다.
<표준액제조방법>
펩타이드 표준품을 데시케이터(실리카겔)에서 5시간 건조하여 약 10㎎을 이동상의 용매 A를 넣어 녹이고, 10㎖를 표준액으로 하였다.
<시험방법>
검액 및 표준액 10㎕를 다음과 같은 액체크로마토그래프법의 조작조건으로 시험하여 검액 및 표준액의 피크면적 A T 및 A T 를 측정하였다.
펩타이드의 양(㎎) = 펩타이드 표준품의 양 (㎎) X A T /A T
액체크로마토그래프법 분석조건은 하기와 같다.
기기: analytical HPLC (시마쥬사, 일본)
컬럼: C18이 결합된 5um 크기의 실리카겔로 충전되어 있음 (길이 250㎜, 안지름 4.6㎜)
이동상: 0.1% 트리플루오로아세트산/DDW (용매 A), 0.098% 트리플루오로아세트산/아세토나이트릴 (용매 B)
검출기: 자외부흡광광도계 (측정파장 230㎚)
유속: 1㎖/min
컬럼온도: 40℃의 일정한 온도
농도(gradient) 조건
시간(min) B 용매 조성(%)
1 5
35 100
45 100
50 5
60 5
서열번호 24의 펩타이드의 콜라겐 차폐막으로부터 방출결과
Lot No. 일수 Name Ret. Time Area Height ㎎
1 7 RT13 0.000 0 0 0
14 RT13 0.000 0 0 0
28 RT13 0.000 0 0 0
2 7 RT13 0.000 0 0 0
14 RT13 0.000 0 0 0
28 RT13 0.000 0 0 0
3 7 RT13 0.000 0 0 0
14 RT13 0.000 0 0 0
28 RT13 0.000 0 0 0
서열번호 24의 펩타이드의 콜라겐 차폐막에 잔존하는 펩타이드 함량
Lot No. Name Ret. Time Area Height ㎎
1 RT13 RT13 1276751 51132 9.20
2 RT13 RT13 1374499 51711 9.43
3 RT13 RT13 144963 56018 9.68
실시예 3: 콜라겐에 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 in vivo 안정성 확인
콜라겐 차폐막에 FITC를 표지시킨 서열번호 24의 펩타이드를 실시예 2와 같은 방법으로 결합시켰다. 가토의 두개골 결손부에 이식한 후, 4주 후에 희생한 후, 두개골 결손부에 이식된 차폐막을 공초점 현미경(Confocal microscopy, 올림푸스, 일본)으로 관찰하였다. FITC 표지시킨 서열번호 24의 펩타이드 10㎎이 결합된 차폐막을 가토의 두개골 결손부에 이식하고, 이식 전, 이식 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 혈액을 채취하여 전신혈로 펩타이드가 유리되는지 여부를 형광광도계(Fluorometer)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 두개골에 이식한 차폐막의 표면에서 펩타이드가 잘 고정되어 있었으며, 주위조직에 퍼져나가지 않은 것을 확인하였다 (도 3). RFI 값들이 이식 전의 값과 비교하여 차이를 보이지 않아 차폐막에 포함된 펩타이드가 혈액 내에 유리되지 않았다는 것을 확인하고, 펩타이드가 콜라겐 차페막에 잘 고정되었음을 알 수 있었다 (도 4).
실시예 4: 콜라겐 차폐막에 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드의 in vivo 골 재생능 확인
실시예 1에서 제조된 서열번호 1, 서열번호 9 및 서열번호 24의 펩타이드를 각각 실시예 2의 방법으로 콜라겐 차폐막에 결합시킨 후, 토끼의 두개골 원형골 결손부에서 이식하여 골 재생능을 확인하였다. 마취시킨 토끼(Newzealand White rabbit, 종명: cuniculus)의 두개골부위에 직경 8㎜의 원형 골결손부를 형성시키고, 상기 골결손부에 콜라겐 차폐막을 덮고, 골막과 피부를 이중봉합하였다. 이식 4주 후에 동물을 희생시키고, 채취한 표본은 포르말린 용액에 넣어 고정시킨 후, 조직을 포매하여(embedding) 두께 20㎛의 시편으로 제작하였다. 제작된 시편은 염기성 푹신과 톨루이딘 블루로 염색하여 비탈회 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경으로 관찰하여 사진 촬영을 실시하였다.
콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드가 포함된 차폐막에 의한 골재생 효과를 확인한 결과, 서열번호 24의 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막이 서열번호 1 및 서열번호 9의 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막보다 골 재생력이 증가된 것을 확인하였으며, 이는 콜라겐에 안정하게 결합된 융합 펩타이드의 경우 이식부위에서 안정하게 체류하므로 골조직 재생능이 더 증가하였다는 것을 확인하였다 (도 5). 따라서 콜라겐에 특이적으로 결합하는 골조직 재생 기능성을 가진 융합 펩타이드가 고정된 차폐막을 사용할 경우, 골조직 재생 효과가 클 것으로 예상할 수 있다.
실시예 5: 콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성을 가진 융합 펩타이드의 제조
콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성을 가지는 융합 펩타이드를 제조하기 위하여, 콜라겐에 결합하는 서열번호 1(GLRSKSKKFRRPDIQYPDA)의 펩타이드와 항균기능을 가지는 서열번호 26(GKCSTRGRKCCRRKK)의 펩타이드를 합성하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성 융합 펩타이드(서열번호 29)를 제조하였다.
서열번호 29: GLRSKSKKFRRPDIQYPDAGKCSTRGRKCCRRKK
실시예 6: 콜라겐에 특이적으로 결합하는 항균 기능성을 가진 융합 펩타이드의 항균력 확인
서열번호 1의 펩타이드, 서열번호 26의 펩타이드 및 서열번호 29의 펩타이드를 사용하여 콜라겐 차폐막을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 제조하였다. 제조된 콜라겐 차폐막을 PBS 10㎖에 1시간 방치하여 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다.
펩타이드의 항균효능을 평가하기 위하여, 아가 확산법(agar diffusion method)에 따라 항균실험을 진행하였다. E. coli를 TSB 배지(Tryptic soy broth)에서 배양시키고, 620㎚에서 흡광도가 1이 될 때까지 배양한 후 세포를 수거하여 실험에 사용하였고, PBS로 희석하여 ㎖당 105~107 개의 박테리아를 TSA(tryptic soy agar)플레이트에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 균이 배양된 플레이트 위에 서열번호 1, 서열번호 26 및 서열번호 29가 결합된 콜라겐 차폐막을 올려놓고, 3일 동안 배양한 후, 균의 성장이 저해되는 직경을 측정하였다.
그 결과, 서열번호 1이 결합된 콜라겐 차폐막은 세척 전후 항균기능성이 없었으며, 서열번호 26이 결합된 콜라겐 차폐막의 경우는 세척하기 전에는 항균기능성이 높았으나, 세척 후에는 항균 기능성이 약 50%정도 감소한 것을 알 수 있었다. 또한, 서열번호 29의 펩타이드가 결합된 콜라겐 차폐막의 경우 세척 전후 항균 기능성이 유지되었다 (도 6). 이는 콜라겐 결합 펩타이드와 항균 기능성 펩타이드의 융합 펩타이드가 세척 후에도 콜라겐에 대한 결합력을 유지하였기 때문에, 항균 기능성에 변화가 없었던 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 검은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 콜라겐 결합 펩타이드와 서열번호 25 내지 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드가 결합되어 있는 콜라겐 결합능과 항균 기능성을 가지는 융합 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 결합능과 항균 기능성을 가지는 융합 펩타이드.
  4. 제1항 또는 제3항의 융합 펩타이드가 콜라겐 차폐막 표면에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 항균 기능성을 가지는 콜라겐 차폐막.
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