JP2017532330A - 乳酸デヒドロゲナーゼ及びその薬剤の治療的阻害 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年10月10日に出願の「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of Lactate Dehydrogenase by Double−Stranded RNA」(二本鎖RNAによる乳酸デヒドロゲナーゼの特異的阻害に関する方法及び組成物)という表題の米国仮特許出願番号第62/062,424号、及び2015年7月30日に出願の「Therapeutic Inhibition of Lactate Dehydrogenase and Agents Therefor」(乳酸デヒドロゲナーゼ及びその薬剤の治療的阻害)という表題の米国仮特許出願番号第62/199,056号に関する。上述の特許出願全体は、この参照により本明細書に援用される。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、「48292_514001WO_Seq_Listing_9OCT2015」という表題であり、2015年10月9日に作成されたもので、サイズは1.4MBである。配列表の電子形式における情報は、本願の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖が15〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1〜15が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖が36〜80の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜15と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドが第1の鎖と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第1の鎖と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第2の鎖の5’末端が、第1の鎖と対になっていない5〜64の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜64ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜19が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖が25〜80の長さのヌクレオチド残基であり、二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜19と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖の3’末端ヌクレオチドが第2の鎖と対を形成して、平滑末端を形成し、または最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第2の鎖と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第1の鎖の5’末端が、第2の鎖と対になっていない5〜61の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜61ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第2の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;または
第1の鎖及び第2の鎖を含むdsNAであって、第1の鎖及び第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第1の鎖が、第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつヌクレオチドリンカーを含む3’領域を含み、dsNAが第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間に不連続性をさらに含み、第1の鎖または第2の鎖が、dsNAが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第2の鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA。
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するためにリボヌクレオチドまたは第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み;第1の鎖の5’末端及び第2の鎖の3’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングまたは1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングを形成し;第1の鎖の3’末端及び第2の鎖の5’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングまたは1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングを形成し;第1の鎖の24から3’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも1つが、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432の標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み;第2の鎖の24から3’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも1つが、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432の標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖(または第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖(または第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)が36〜80の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)の少なくとも3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第2の鎖(または第1の鎖)の5’末端が、第1の鎖(または第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖(または第2の鎖)の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖(または第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第2の鎖の少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜25が少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖が30〜80の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜25と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖の5’末端が、第1の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432の標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、任意に25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖が24〜80の長さのヌクレオチド残基(任意に30〜80の長さのヌクレオチド残基)であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖の3’末端及び第2の鎖の5’末端が、平滑末端、3’オーバーハングまたは5’オーバーハングを形成し、任意にオーバーハングは1〜6の長さのヌクレオチドであり;第1の鎖の5’末端が、第2の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第2の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432の標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の鎖及び第2の鎖を含むdsNAであって、第1の鎖及び第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第1の鎖が、第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、dsNAが第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間に不連続性をさらに含み、第1の鎖または第2の鎖が、dsNAが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、第1の鎖または第2の鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、dsNA;または
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、dsNAが、dsNAのdicer開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く修飾され、任意にdsNAが、哺乳類細胞中でLDHのmRNA発現を低減できる1つ以上の19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得るために、非dicerヌクレアーゼによって切断される、dsNA。
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossay of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);及びHale&Maham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
1型原発性高シュウ酸尿症(PH1)
原発性高シュウ酸尿症は、シュウ酸塩の排泄の増加をもたらし、シュウ酸塩石が共通である。これらの一般的な状態におけるシュウ酸塩は、栄養源由来であり、または吸収不良に続発する。一方で、原発性高シュウ酸尿症は、遺伝性の遺伝子欠損から得られる代謝欠陥に起因する特定の型の高シュウ酸尿症を指す。PH1は、セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(ヒト中では、AGXT遺伝子によってコードされる酵素)の代謝欠陥に関する原発性高シュウ酸尿症の形態を指す。高シュウ酸尿症の型には、2型原発性(GRHPR関連)、3型原発性(DHDPSL関連)、及び特発性形態の高シュウ酸尿症が含まれる。
LHDは、シュウ酸塩蓄積をもたらす代謝障害を標的とする魅力的な薬物療法である。理論に束縛されるものではないが、PH1及びPH2は、それぞれ、アラニン:グリオキシル酸塩−アミノトランスフェラーゼ(AGT)(Danpure and Jennings,FEBS Lett 1986;201:20−24)及びグリオキシル酸レダクターゼ/ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(GRHPR)(Nephrol.Dial.Transplant.(1995)10(supp8):58−60)の欠損によって引き起こされるグリオキシル酸代謝の遺伝性障害として記載されている。これらの酵素の活性が無いかまたは低下した場合、LDHは、グリオキシル酸塩を過剰な量のシュウ酸塩に変換し得、シュウ酸塩は、分解せずに蓄積する。
LHDAは、腫瘍の開始、維持、及び進行に必要であるため、癌療法に対する魅力的な標的でもある(Shi and Pinto,PLOS ONE January 2014,Volume 9,Issue 1,e86365;Le et al.Proc Natl Acad Sci USA 107:2037−2042)。LDHAの上方調節は、例えば、乳癌、リンパ腫、腎癌(腎細胞の癌腫瘍を含む)、遺伝性平滑筋腫症、膵臓癌、肝臓癌(肝細胞癌を含む)、及び他の形態の癌を含む、多くの癌型の特性である(Goldman RD et al.,Cancer Res 24:389−399.;Koukourakis MI,et al.,Br J Cancer 89:877−885.;Koukourakis MI,et al.,LJ Clin Oncol 24:4301−4308.;Kolev Y,et al.,Ann Surg Oncol 15:2336−2344.;Zhuang L,et al.,Mod Pathol 23:45−53)。
LHDAは、乳酸蓄積をもたらす代謝障害を標的とする魅力的な薬物療法である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)欠損症(本明細書中で、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症とも呼ばれる)は、体内における乳酸の蓄積、及び種々の神経学的問題によって特徴付けられる。代謝形態は、血中乳酸濃度が10mmol/lをしばしば超える重篤な乳酸アシドーシスとして提示される。治療は、一般的に、全身の乳酸蓄積を反転させるかまたは最小限にすることを目的とする(Brown et al.,J Med Genet.31(11):875−879)。LDHAは、ピルビン酸塩の乳酸への変換に触媒作用を及ぼす;したがって、その活性を減少させることは、任意に、他の療法または専門的な食事を併用して、PDH患者に苦痛の軽減をもたらす可能性が高い。
本発明のある特定の態様では、驚くべきことに、本発明の薬剤(例えば、RNAi剤)によるLDHAの標的化が、慢性腎疾患を有する対象に治療効果をもたらし得ることが同定された。理論に束縛されるものではないが、RNAiにより可能な肝臓に特異的な方法でLDHAをノックダウンすることは、LDH活性を失う有害な影響が比較的ない治療効果をもたらし得る可能性が高い。特に、さらに理論に束縛されるものではないが、例えば、LDHBによってもたらされる残留LDH活性により、肝臓におけるLDHAノックダウンが、有害な影響を及ぼさせないと考えられ、そうでなければ、肝臓の全てのLDH活性が排除された場合に考えられる。一方、RNAiが現在アクセスすることができない他の組織は、LDHAのRNAi媒介ノックダウンを施さないことで恩恵を得ると考えられる。
−体液過剰、及びレニン−アンジオテンシン系を介して腎臓によって作製された血管作動性ホルモンの産生によって血圧が上昇し、高血圧症を発症するリスク、及び/またはうっ血性心不全を罹患するリスクが高まる。
−尿素の蓄積は、高窒素血症をもたらし、最終的には尿毒症に至る(症状は、無気力から心膜炎及び脳症までの範囲である)。高い全身循環により、尿素は、高濃度でエクリン汗中で排泄され、汗が蒸発すると皮膚の上で結晶化する(「結晶性尿汗症」)。
−血中のカリウム蓄積(高カリウム血症は、違和感、及び命に関わる可能性のある心不整脈を含む範囲の症状を有する)。高カリウム血症は、通常、糸球体濾過率が20〜25ml/分/1.73m2未満に低下するまで発症せず、その時点で、腎臓はカリウムを排泄する能力が低下する。CKDにおける高カリウム血症は、酸血症(これは、カリウムの細胞外シフトをもたらす)、及びインシュリンの欠如によって悪化し得る。
−エリスロポエチン合成の減少は、貧血を引き起こす。
−流体体積過負荷の症状は、軽度の浮腫から命を脅かす肺水腫にわたる場合がある。
−リン酸排泄の低下による高リン血症は、糸球体濾過の減少を伴う。高リン血症は、心血管リスクの増加と関連し、血管石灰化への直接刺激である。
−1,25−ジヒドロキシビタミンD3欠損による低カルシウム血症は、線維芽細胞増殖因子−23の刺激によって引き起こされる。骨細胞は、FGF23の産生の増加を担い、FGF23は、1−α−ヒドロキシラーゼ酵素(25−ヒドロキシコレカルシフェロールの1,25−ジヒドロキシビタミンD3への変換を担う)の強力な阻害剤である。その後、これは、二次性副甲状腺機能亢進症、腎性骨異栄養症、及び血管石灰化に進行し、心機能をさらに損傷させる。
−代謝性アシドーシス(硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積による)は、酵素に作用する過剰な酸による酵素活性の変化;過剰な酸(酸血症)による高カリウム血症の促進による心膜及び神経細胞膜の興奮性の増加を引き起こし得る。アシドーシスは、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力の低下にもよる。
−鉄欠乏性貧血は、腎機能が低下するにつれて罹患率が高まり、特に、血液透析を必要とする腎機能低下で流行する。多因子が原因であるが、炎症の増加、エリスロポエチンの減少、及び骨髄抑制をもたらす高尿酸血症が含まれる。
僅かに減少した機能;正常または比較的高いGFR(≧90ml/分/1.73m2)を持つ腎損傷。腎損傷は、病理学的な異常として、または血液中もしくは尿検査もしくは画像診断での異常を含む損傷のマーカーとして定義される。
腎損傷がある状態でのGFRの軽度の減少(60〜89ml/分/1.73m2)。腎損傷は、病理学的な異常として、または血液中もしくは尿検査もしくはイメージング研究の異常を含む損傷のマーカーとして定義される。
GFRの中程度の減少(30〜59ml/分/1.73m2)。英国ガイドラインは、スクリーニング及び紹介の目的のために、ステージ3A(GFR45〜59)とステージ3B(GFR30〜44)に区別している。
GFRの深刻な減少(15〜29ml/分/1.73m2)。腎代替療法を準備。
確定された腎不全(GFR<15ml/分/1.73m2)、永続的な腎代替療法、または末期腎疾患。
本発明のある特定の態様では、細胞及び/または対象中のLDHA標的をノックダウンするためにdsNA構造を採用する。例示的なdsNA構造としては、以下のものが挙げられる:
公知のヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼ(乳酸デヒドロゲナーゼAまたはLDHA)cDNA及びポリペプチド配列には、以下のもの:ヒト乳酸デヒドロゲナーゼNM_005566.3及び対応するヒト乳酸デヒドロゲナーゼポリペプチド配列GenBank受託番号第NP_005557.1号;及びマウス野生型乳酸デヒドロゲナーゼ配列GenBank受託番号第NM_001136069.2号(ハツカネズミC57BL/6 Ldha、転写産物バリアント2)及び対応するマウスLdhaポリペプチド配列GenBank受託番号第NP_001129541.2号が含まれる。哺乳類の乳酸デヒドロゲナーゼの他の形態には、LDHB(NM_002300.6及びNM_008492.2;NP_002291.1及びNP_032518.1)及びLDHC(NM_002301.4及びNM_013580.4;NP_002292.1及びNP_030698.1)が含まれる。場合によっては、治療上の利益のために、本発明のある特定のLDHA標的化核酸を、LDHのこれらのさらなる形態の1つ以上を標的とするために使用できることが企図される。さらに、及び/またはあるいは、場合によっては、さらなる治療上の利益のために、本発明のLDHA標的化核酸、及びLDHB及び/またはLDHCの1つ以上の阻害剤の両方を含む組み合わせ療法が企図される。
ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ標的配列のdsRNA媒介阻害を評価する。そのような実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼRNAレベルは、任意に、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼdsRNAの不在に対するそのような抗乳酸デヒドロゲナーゼdsRNAの存在における乳酸デヒドロゲナーゼレベルの比較を介して、当該技術分野で認識される方法(例えば、RT−PCR、ノーザンブロット、発現アレイなど)によって評価することができる。ある特定の実施形態では、非関連標的RNAに対して指向したdsRNAの存在、または任意の治療の不在において、抗乳酸デヒドロゲナーゼdsRNAの存在における乳酸デヒドロゲナーゼレベルを、ビヒクルのみの存在において観察されたものと比較する。
治療薬剤を、選択した動物モデル(複数可)で試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなdsRNA剤(またはそれをコードしている発現ベクターもしくは導入遺伝子)は、前記薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、薬剤(例えば、治療薬剤)を、このような薬剤の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
本発明のdsRNA剤を、インビボにて、例えば、以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のdsRNA剤によって標的化された乳酸デヒドロゲナーゼcDNA内のヌクレオド配列を、上記の乳酸デヒドロゲナーゼ配列中に示す。
総RNAを、例えば、大規模抽出用のAmbion Rnaqueous 4−PCR精製キット、または96−ウェルアッセイ用のPromega SV96を用いて、DsiRNA送達後の細胞から調製する。Taqman解析のために、二重標識化プローブを、例えば、5’末端にて共有結合したレポーター色素FAMまたはVICと3’末端にコンジュゲートしたクエンチャー色素TAMRAで合成する。PCR増幅を、例えば、10uL総RNA、100nMフォワードプライマー、100mMリバースプライマー、100nMプローブ、1×TaqMan PCR反応緩衝液(PE−Applied Biosystems)、5.5mM MgCl2、100uMの各dATP、dCTP、dGTP及びdTTP、0.2U RNase阻害剤(Promega)、0.025U AmpliTaq Gold(PE−Applied Biosystems)及び0.2U M−MLV逆転写酵素(Promega)からなる50uL反応液を用いて、ABI PRISM 7700配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、48℃にて30分間、95℃にて10分間、続いて95℃にて15秒間の40サイクル、及び60℃で1分間からなることができる。標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルの定量を、段階希釈した総細胞RNA(300、100、30、10ng/rxn)から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブTaqMan反応におけるHPRT1 mRNAに対して正規化する。
細胞タンパク質抽出物は、標準マイクロ調製技術を用いて(例えば、RIPA緩衝液を使用して)、または好ましくは、NE−PER核及び細胞質抽出用キット(Thermo−Fisher Scientific)などの方法によって核タンパク質を抽出することで調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Tris−Glycineポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば、5%無脂肪ミルクとの1時間のインキュベーション、続いて4℃にて16時間一次抗体とのインキュベーションにて阻害できる。洗浄後、二次抗体を、例えば、室温にて1時間(1:10,000希釈)適用し、シグナルを、VersaDocイメージングシステム上で検出する。
抗乳酸デヒドロゲナーゼdsRNA剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してもよい。当該技術分野で公知のようなPH1、及び/または、シュウ酸塩蓄積またはLDHA過剰発現に関する疾患、状態、または障害の動物モデルを、抗乳酸デヒドロゲナーゼdsRNAの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。PH1の例示的な動物モデルとしては、例えば、Agxt1ノックアウトマウスが挙げられる。動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織としても使用できる。このようなモデルはまた、治療的使用に向けて乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現の調節における、本発明のdsRNA組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合できる。
ある特定の実施形態では、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼDiRNAは、少なくとも25ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、ある特定の実施形態では、抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNAは、1つのオリゴヌクレオチド配列、少なくとも25の長さのヌクレオチドであり、長くても35、または最大50以上のヌクレオチドである、第1の配列を含む。このRNA配列は、26〜35、26〜34、26〜33、26〜32、26〜31、26〜30、26〜29の長さのヌクレオチドであり得る。この配列は、27または28の長さのヌクレオチドであり得、または27の長さのヌクレオチドであり得る。DsiRNA剤の第2の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第1の配列にアニールする配列であり得る。一般的に、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチドと少なくとも19の相補塩基対を持ち、より典型的には、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチド配列と、21以上の相補塩基対を持ち、または25以上の相補塩基対を持つ。1つの実施形態では、第2の配列は、第1の配列と同一の長さであり、DsiRNA剤は平滑末端である。別の実施形態では、DsiRNA剤の末端は1つ以上のオーバーハングを有する。
ある特定の実施形態では、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA剤は以下の構造を持つことができる:
を含み、式中、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連実施形態では、DsiRNAは、
式中、「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または修飾核酸)である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、及び「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中、「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または修飾核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜15、または任意に1〜8であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する修飾パターン及びDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Dicerがその第一処理後形態として、最低21マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端の最後及び最後から2番目の残基で2つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する(先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の5’末端から少なくとも最後から2番目の2’−O−メチル修飾が示される。例えば、US2007/0223427を参照されたい)。
式中、「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または修飾核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8、または任意1〜10であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する修飾パターン及びDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
表番号:
(2)選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA剤(非対称);
(3)選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA、非修飾の二本鎖(非対称);
(4)ヒト乳酸デヒドロゲナーゼmRNA中のDsiRNA標的配列(21マー);
(5)選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼ「平滑/平滑」DsiRNA;
(6)ヒト乳酸デヒドロゲナーゼmRNA中のDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列;
(7)選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA剤(非対称);
(8)選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA、非修飾の二本鎖(非対称);
(9)マウス乳酸デヒドロゲナーゼmRNA中のDsiRNA標的配列(21マー);
(10)選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼ「平滑/平滑」DsiRNA;
(11)マウス乳酸デヒドロゲナーゼmRNA中のDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列;及び
(12)選択したさらなるヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼDsiRNA剤(非対称)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5’末端より)
LDHA−1287 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5’末端より)
LDHA−370 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5’末端より)
LDHA−402 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5’末端より)
LDHA−723 25/27マーのDsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5’末端より)
25〜35ヌクレオチド、とりわけ25〜30ヌクレオチドのより長いdsRNA種(DsiRNA)が、19〜23マーsiRNA剤と比較して、活性の効力及び持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。dsRNA処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、より長いdsRNA種が細胞の細胞質中のDicer酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに切断することに加えて、Dicerは、切断されたdsRNA由来の一本鎖開裂産物の、標的遺伝子乳酸デヒドロゲナーゼ(または乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子)の、または由来の細胞質RNA(例えば、乳酸デヒドロゲナーゼRNA)の崩壊に関与するRISC複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究(Rossi et al.,米国特許出願第2007/0265220号)は、DicerによるdsRNA種(特に、DsiRNA剤)の開裂性が、dsRNA種の活性の効力及び持続期間の増大と一致することを示した。
二本鎖RNA(「dsRNA」)の効果を阻害する1つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるdsRNA(例えば、siRNA及びDsiRNA)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3’末端の修飾が、分解を防止するために重要である(Eder et al.,1991,Antisense Res Dev,1:141−151)。RNase−Tファミリーヌクレアーゼは同定され、siRNAの制御及び分解に関与する3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を持つERI−1と呼ばれている(Kennedy et al.,2004,Nature 427:645−649;Hong et al.,2005,Biochem J,390:675−679)。この遺伝子はまた、マウスのThex1(NM_02067)またはヒトのTHEX1(NM_153332)として知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し、siRNA中の3’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖RNAを分解しない(Yang et al.,2006,J Biol Chem,281:30447−30454)。したがって、本発明のDsiRNAを含む、dsRNAの3’末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
無細胞系でのRNAiを繰り返すインビトロアッセイを使用して、乳酸デヒドロゲナーゼRNA配列(類)を標的化しているdsRNA構築物を評価し、したがって、dsRNAの乳酸デヒドロゲナーゼ特異的遺伝子阻害活性(また本明細書中で乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を指す)を評価できる。このアッセイには、乳酸デヒドロゲナーゼRNAに対して指向したdsRNA(例えば、DsiRNA)剤との利用に適合した、Tushl et al.,1999,Genes and Development,13,3191−3197及びZamore et al.,2000,Cell,101,25−33によって記述された系が含まれる。合胞体胚盤葉由来のDrosophila抽出物を、インビトロにてRNAi活性を再構築するために使用する。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる選択された乳酸デヒドロゲナーゼ発現プラスミドからのインビトロ転写を介して、または化学合成を介して産出される。センス及びアンチセンスのdsRNA鎖(例えば、各20uM)を、90℃で1分間、ついで37℃で1時間(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウムなどの)緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液(例えば、100mM 酢酸カリウム、pH7.4での30mM HEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウム)中で希釈する。アニーリングをTBE緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニターし、臭化エチジウムで染色できる。Drosophila溶解物を、脱漿膜し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したOregon Rハエ由来の0〜2時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、50%溶解物[vol/vol]、RNA(10〜50pM最終濃度)、及びdsRNA(10nM最終濃度)を含む10%[vol/vol]溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合物はまた、10mMリン酸クレアチン、10ug/mlクレアチンホスホキナーゼ、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/uL RNasin(Promega)、及び100uMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を100mMに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、RNA添加する前に10分間、25℃にてプレインキュベートし、25℃にてさらに60分間インキュベートする。反応を4体積の1.25×Passive Lysis Buffer(Promega)で急冷する。標的RNA開裂をRT−PCR解析または当該技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、dsRNAが反応より除外された対照反応と比較する。
ある特定の実施形態では、本発明は、シュウ酸塩蓄積、PH1及び/または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を有する、またはシュウ酸塩蓄積、PH1及び/または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を発症させるリスクを有する対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、dsRNAは、シュウ酸塩蓄積、PH1及び/または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を制御するための新規治療薬剤として働き得る。本方法は、本発明の医薬組成物を患者(例えば、ヒト)に投与し、それによって、乳酸デヒドロゲナーゼRNAの発現、レベル及び/または活性が低減することを含む。乳酸デヒドロゲナーゼRNAによってコードされたポリペプチドの発現、レベル及び/または活性はまた、dsRNAが乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物の非コード領域に対して指向する場合(例えば、標的化5’UTRまたは3’UTR配列)でさえ、本発明のdsRNAによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のdsRNAは、任意に多型対立遺伝子が個々及び/または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式であっても、細胞及び組織の乳酸デヒドロゲナーゼ配列を特に標的化できる。
本発明のdsRNA剤を、直接細胞に(すなわち、細胞内に)導入してもよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してもよく、経口で導入してもよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してもよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液が、核酸を導入してもよい部位である。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のdsRNA剤を含む医薬組成物を提供する。dsRNA剤試料は、好適に製剤化され、十分な量の試料が、遺伝子サイレンシングを、それが起こるのであれば誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。dsRNAに関する多くの製剤は、当該技術分野で公知であり、dsRNAが標的細胞内に入り、作用することができる限り使用可能である。例えば、米国公開特許出願第2004/0203145 A1号及び同第2005/0054598 A1号を参照されたい。例えば、本発明のdsRNA剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたdsRNA剤の製剤を、dsRNA剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン(米国特許第5,705,188号)などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシン(PCT国際出願第WO97/30731号)などのポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.Boulder,Colo.)、またはFuGene6(Roche)が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書に従って使用できる。
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ(例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物及び/または乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベルの誤調節及び/または上昇)によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくは乳酸デヒドロゲナーゼの選択的標的化を介して治療可能な疾患または障害のリスクのある(または受けやすい)対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
オリゴヌクレオチド合成及び精製
DsiRNA分子は、RNAメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書で記述したRNA配列内の標的配列と相互作用するようにデザインすることができる。本例示の薬剤では、ヒト乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHA)配列を一意的に標的にする相同性に基づいて予測された48のDsiRNA、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ配列を一意的に標的にする相同性に基づいて予測された48のDsiRNA、及びヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼ配列の両方を標的にするように予測されたさらなる24のDsiRNAを評価のために選択した。DsiRNA分子の1つの鎖の配列は、標的乳酸デヒドロゲナーゼ部位配列と相補的であった。DsiRNA分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般的に、DsiRNA構築物を、19〜23マーsiRNAに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した(例えば、Usmanらの米国特許第5,804,683号;同第5,831,071号;同第5,998,203号;同第6,117,657号;同第6,353,098号;同第6,362,323号;同第6,437,117号;同第6,469,158号;Scaringeらの米国特許第6,111,086号;同第6,008,400号;同第6,111,086号を参照されたい)。
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、例えば、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES pH7.5からなる二本鎖緩衝液中100μM濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖及びアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば、50μM二本鎖の最終溶液を得た。試料をRNA緩衝液(IDT)中で5分間100℃まで加熱し、使用前に室温まで冷却した。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを、凍結乾燥または−80℃にてヌクレアーゼ無しの水中で保存した。
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「25/27」は、2−塩基3’−オーバーハングを含む、25塩基センス鎖と、27塩基アンチセンス鎖とを有する非対称二本鎖である。「27/25」は、27塩基センス鎖と25塩基アンチセンス鎖とを有する非対称二本鎖である。
HeLa細胞を得て、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を補充したDMEM(HyClone)中で維持した。RNAトランスフェクションでは、細胞を、リポフェクタミン(商標)RNAiMAX(Invitrogen)を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従って、1nM、0.1nM、または0.03nMの最終濃度でDsiRNAでトランスフェクトした。簡単に言えば、例えば、以下の実施例3の0.1nMのトランスフェクションでは、各DsiRNAのストック溶液の一定分量を、Opti−MEM I(Invitrogen)及びリポフェクタミン(商標)RNAiMAXと、150μL(0.3nM DsiRNAを備える)の体積に達するまで混合した。得られた150μL混合液を、室温にて20分間インキュベートして、DsiRNA:リポフェクタミン(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。20分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり50uLのDsiRNA:RNAiMAX混合物を、96ウェルプレート中の3組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液100μLを各ウェルに加え(最終体積150μL)、プレートを24時間インキュベーター内に配置した。
HPRT及びSFRS9ハウスキーピング遺伝子に対して、及び対照DsiRNA及び/またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して正規化した値を用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子ノックダウンをqRT−PCRによって決定した。
培地を吸引し、総RNAをSV96キット(Promega)を用いて抽出した。総RNAを、製造業者の取扱説明書に従って、SuperscriptII、オリゴdT、及びランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたcDNAを、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子並びにヒト遺伝子HPRT−1及びSFRS9の両方に特異的なプライマーとプローブとを用いて、qPCRによって解析した。ABI7700を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対LDHA RNAレベルを、HPRT1及びSFRS9 RNAレベルに対して正規化し、トランスフェクション対照試料中で得たRNAレベルと比較した。
LDHAを標的としているDsiRNA分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害効果に関してヒトHeLa細胞(あるいは、HepG2または他のヒト細胞を使用できただろう)及び/またはマウスB16−F10細胞中で試験した。トランスフェクションでは、アニールしたDsiRNAを、トランスフェクション試薬(リポフェクタミン(商標)RNAiMAX、Invitrogen)と混合し、室温にて20分間インキュベートした。HeLa(ヒト)またはB16−F10(マウス)細胞(あるいは、マウスHepa1−6または他のマウス細胞を使用できただろう)をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え(100μL/ウェル)、150μlの体積で、1nMの最終DsiRNA濃度を得た。各DsiRNAトランスフェクション混合物を、三重DsiRNA処理のために3つのウェルに加えた。細胞を37℃にて24時間、DsiRNAトランスフェクション混合物の継続存在下、インキュベートした。24時間の時点で、RNAを、処理細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合物を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからRNAを調製した。処理後の標的LDHA RNAレベルを、対照から得られた値に対して正規化した値を用いて、LDHA標的遺伝子に対してqRT−PCRによって評価した。三重のデータを平均し、エラー%を処置ごとに決定した。正規化データを表にしてグラフ化し、対照との比較で、活性DsiRNAによる標的mRNAの減少を決定した(以下の表13及び図3A〜3Jを参照されたい)。
LDHA mRNA及びタンパク質レベルの両方を阻害するためのLDHA標的化DsiRNAの有効性をマウスで調べた。図4A〜4Cに示すように、LDHA標的化DsiRNAは、マウスの肝臓中でmRNA及びタンパク質の発現を強力に阻害した(ヒト−マウス交差反応性DsiRNA:M107/M48修飾を有するLDHA−402、LDHA−723、及びLDHA−370をmRNAノックダウンについて試験した一方で、GAPDH対照に対するLDHA−402タンパク質レベルを図4Aの右パネルに示す)。具体的には、LDHA mRNAレベルのロバストノックダウンは、DsiRNA注入の24時間後に観察された。一方、劇的に減少したLDHAタンパク質レベルが、1mg/kgでの静脈内注射の14日後であっても、LDHA−402 DsiRNAを投与したマウスで観察された。
PH1のマウスモデル内の乳酸デヒドロゲナーゼレベルを低減させる活性乳酸デヒドロゲナーゼ標的化DsiRNAの能力について調べ、AGXT標的化DsiRNAによるマウスの前処置に依存する特定モデルを使用した(図5A〜5Dの上矢印のタイミングで投与した;あるいは、Hernandez−Fernaud and Salido(FEBS Journal 277:4766−74)にて記述したようなAGXTノックアウトマウス、またはPH1もしくは他のシュウ酸塩蓄積疾患の他のモデルを使用することができた)。
PH2のマウスモデルは、GrhprのDsiRNA媒介ノックダウンを介して作製された(Grhprの役割については図6を参照されたい)。PH2モデル系におけるPH2の抗LDHA DsiRNA処置の有効性を調べるため、並びに抗LDHA DsiRNA処置が、グリオキシル酸塩/シュウ酸塩経路の他の成分を標的とするDsiRNAよりもPH2により顕著な影響を及ぼすかどうかを評価するため、抗LDHA DsiRNA注入を、抗PRODH2 DsiRNA注入及び抗HAO1 DsiRNA注入と比較した。図5Hに示すように、LDHA標的化DsiRNAの静脈内注射は、PH2モデルマウスにおける尿中シュウ酸レベルを減少させなかったHAO1−及びPRODH2標的化DsiRNAとは対照的に、PH2モデルマウスにおける尿中シュウ酸レベルを著しく減少させた。したがって、PH2は、抗LDHA DsiRNA処置は、グリオキシル酸塩/シュウ酸塩経路の他の成分を標的とするDsiRNAと比較して特に効果的であった。
上記の実施例で同定された活性DsiRNAの選択を使用して、このようなDicer基質分子の相当するテトラループを有する形態を合成した。図7Aは、このような実験で用いたテトラループ配列及び修飾パターンを示す。4つの修飾及びテトラループを有する構築物の構造のこのミニセットは、HAO1標的化構築物におけるインビボ有効性について確認されている。同定された修飾パターン及びテトラループを有する構築物を、(ヒト、アカゲザル、及びマウスに共通する標的配列を有し、それぞれ、配列番号7214及び7215のテトラループを有するパッセンジャー及びガイド鎖配列を持つ)DsiRNA LDHA−718、(ヒト、アカゲザル、及びマウスに共通する標的配列を有する)LDHA−723、及び(ヒト及びアカゲザルに共通する標的配列を有する)LDHA−1360について合成した。
ヌードマウスにおけるHep3B腫瘍モデル中のLNP製剤化LDHA RNAi剤(とりわけ、LDHA−718−M571/M550 25/27マーDsiRNA)の効果について調べた。
血漿乳酸を処理するための肝臓LDHAの役割を考慮して、肝臓中のLDHAノックダウンが血漿乳酸レベルの有害な蓄積をもたらす可能性があった。LNP製剤化LDHA標的化DsiRNAが毒性を示したかどうかを調べるために(例えば、肝臓中のLDHAの著しいノックダウンが血漿乳酸の蓄積を引き起こした場合に起こり得るため)、野生型マウスに静脈内注射を介して、LNP2185中のLDHA−718−M24/M527 DsiRNAを3mg/kgの濃度で週1回投与した。図11に示したように、LNP製剤化LDHA標的化DsiRNAは、研究の終わりに、肝臓組織中のmRNAの発現を対照レベルの2%未満に減少させることが観察された(図11、左)。一方、処置動物において血漿乳酸レベルの上昇は観察されなかった(図11、中央及び右)。さらに、肝臓酵素、血液化学、体重、及び全身乳酸は、全て正常であると観察された。したがって、LNP製剤化LDHA標的化DsiRNAは、インビボで良好な耐容性を示した。
上記実験(例えば、実施例2〜4)の非対称DsiRNAの選択(Hs LDHAを標的とする24のうち、Mm乳酸デヒドロゲナーゼも標的とするものを選択)を、二次アッセイでも調べた(「フェーズ2」)。特に、上記で試験したものから選択した非対称DsiRNAを、ヒトHeLa細胞の環境中1nM、0.1nM、及び0.03nMにてヒト乳酸デヒドロゲナーゼの阻害に関して評価した。次いで、これらの非対称DsiRNAを、マウスB16−F10細胞の環境中1nM、0.1nM、及び0.03nMにて、マウスLDHAの阻害に関しても評価した。最も非対称なDsiRNAは、HeLa細胞の環境中でアッセイされる際に、サブナノモル濃度で著しいLDHA阻害効果を再現性良く示すことが考えられる。さらに、マウスB16−F10細胞の環境中でアッセイした場合にサブナノモル濃度で著しいマウス乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を有する、選択された数の非対称DsiRNAが同定されることが考えられる。
上記の最初のスクリーニングから選択した(例えば、12〜24)の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化DsiRNAを、上記のような2’−O−メチルガイド鎖及びパッセンジャー鎖修飾パターンで調製する(例示的な修飾としては、「M107」修飾パッセンジャー鎖、及び上記のガイド鎖修飾パターン「M8」、「M17」、「M35」、及び「M48」が挙げられる)。これらのDsiRNA配列の各々に関して、4つのガイド鎖修飾パターンのM8、M17、M35、及びM48の各々を有するDsiRNAを、HeLa細胞の環境において1.0nM、0.1nM、及び0.03nM濃度での、ヒトHeLa細胞中のLDHA阻害についてアッセイする。したがって、DsiRNAがインビトロで著しい乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を保持することができる修飾パターンの同定が達成され、修飾パターンを有するこのような高活性な修飾DsiRNA配列は、このようなDsiRNAを安定化させ、及び/または対象にインビボで治療的に投与した場合にこのようなDsiRNAの免疫原性を低減させることが可能であると考えられる。
上記の実験のさらなるLDHA標的化DsiRNAは、例えば、上に記載されるように、2’−O−メチルパッセンジャー鎖及びガイド鎖修飾パターンで調製される(例えば、パッセンジャー鎖修飾パターン「SM14」、「SM24」、「SM107」、「SM250」、「SM251」、及び「SM252」、及びガイド鎖修飾パターン「M48」、「M8」、及び「M17」が挙げられる)。DsiRNA配列の各々では、6つのパッセンジャー鎖修飾パターンM14、M24、M107、M250、M251、及びM252の各々と、(ガイド鎖修飾パターンM48、M8、及びM17の中から選択される)1つの好適なガイド鎖修飾パターンとを有するDsiRNAを、HeLa細胞の環境中で1.0nM、0.1nM、及び0.03nM(30ピコモル)濃度にてヒトHeLa細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害について評価する。DsiRNAが依然としてインビトロで著しい乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を保持することができる、両方のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の広範囲な修飾を有する二本鎖が同定される。このように同定された高活性の修飾DsiRNA配列は、このようなDsiRNAを安定化させ、及び/または対象にインビボで治療的に投与した場合にこのようなDsiRNAの免疫原性を低減させることが可能であると考えられる修飾パターンを有する。
乳酸デヒドロゲナーゼ研究における本知識体系は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイする方法、並びに研究、診断、及び治療的使用のために乳酸デヒドロゲナーゼ発現を制御できる化合物の必要性を示す。本明細書に記載されるように、本発明の核酸分子をアッセイで使用し、乳酸デヒドロゲナーゼ標的化薬剤によって治療される可能性を有する病態を診断及び/または監視することができる。さらに、核酸分子を使用し、このような病態(例えば、PH1)を治療することができる。
DsiRNA剤の血清安定性を、37℃での様々な時間(最大で24時間)の50%ウシ胎児血清中におけるDsiRNA剤のインキュベーションを介して評価する。血清を抽出し、核酸を20%非変性PAGE上で分離して、Gelstar染色で視覚化できる。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、DsiRNA(任意に修飾し、及び修飾することなく)について評価する。
本発明の大きく肝臓特異的なLDHA標的化薬剤及び製剤を用いて、慢性腎結石形成及び慢性腎疾患の病因について試験した。PH1、PH2、及びPH3を組み合わせたモデル(例えば、PH2/PH3、PH1/PH3、PH1/PH2、及び/またはPH1/PH2/PH3モデル)は、大群のマウスで作成され、モノ−及びジ−カルボン酸代謝の複数の同時及び相互作用の破壊を引き起こした。LNP製剤化LDHA標的化DsiRNA及び対照は、これらの動物で試験し、処置し、調べた各モデルに対してLDHAノックダウンが有益/修正的であることを証明することが期待される。
本発明のDsiRNA分子を、多様な診断用途、例えば、多様な用途における、例えば、臨床、工業、環境、農業、及び/または研究環境における分子標的(例えば、RNA)の同定などで使用することができる。このようなDsiRNA分子の診断的使用は、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を使用する再構成RNAi系を利用することを含む。本発明のDsiRNA分子は、異常細胞内の遺伝的浮動及び変異を試験するための診断ツールとして使用することができる。DsiRNA活性と標的乳酸デヒドロゲナーゼRNAの構造との間の密接な関係によって、標的乳酸デヒドロゲナーゼRNAの塩基対形成及び3次元構造を変化させる、乳酸デヒドロゲナーゼ分子領域内での変異の検出が可能となる。本発明に記載される複数のDsiRNA分子を使用することにより、インビトロの、加えて細胞及び組織中のRNA構造及び機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。DsiRNA分子による標的乳酸デヒドロゲナーゼRNAの開裂を使用して、遺伝子発現を阻害し、PH1または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定義することができる。これらの実験は、併用療法(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のDsiRNA分子、既知の小分子阻害剤と一体になったDsiRNA分子、またはDsiRNA分子及び/または他の化学分子もしくは生体分子の組み合わせによる間欠的治療)の可能性を提供することにより、疾患進行の良好な治療をもたらすだろう。本発明のDsiRNA分子の他のインビトロ使用は、当該技術分野で周知であり、疾患または関連状態に関連するRNAの存在の検出を含む。このようなRNAを、標準的手法、例えば、蛍光共鳴発光移動(FRET)を使用して、DsiRNAによる処理後の開裂産物の存在を決定することにより検出する。
Claims (106)
- 対象における乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害の治療方法であって、
対象の1つ以上の組織中でLDHA遺伝子の発現を低減させる薬剤を、乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を有する前記対象に投与することによって、前記対象における前記乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を治療することを含む、前記方法。 - 前記疾患もしくは障害が、慢性腎疾患またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損である、請求項1に記載の方法。
- 前記疾患もしくは障害が、PH1、PH2、PH3、及び特発性過シュウ酸尿症からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤を脂質ナノ粒子中に投与する、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記1つ以上の組織が、肝臓を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 新生物の治療を必要とする対象におけるその方法であって、
対象の1つ以上の組織中でLDHA遺伝子の発現を低減させる、脂質ナノ粒子中に包まれる薬剤を、新生物を有する前記対象に投与することによって、前記対象における前記新生物を治療することを含む、前記方法。 - 前記新生物が、肝臓腫瘍である、請求項6に記載の方法。
- 前記薬剤の前記投与することが、前記対象の筋肉組織中でLDHA遺伝子発現を低減させない、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤が、前記対象におけるLDHB遺伝子発現と比較してLDHA遺伝子発現を優先的に低減させ、任意に、LDHB遺伝子発現が、前記対象中で低減されない、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記LDHA遺伝子の発現を低減させる前記薬剤が、RNAi分子、任意に、二本鎖核酸(「dsNA」)である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記LDHA遺伝子の発現を低減させる前記薬剤が、ヘアピンまたはテトラループ構造を含むRNAi分子である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記LDHA遺伝子の発現を低減させる前記薬剤が、RNAi分子及び一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記薬剤が、2’−フルオロ(2’−F)、2’−Oメチル(2’−OMe)及び2’−メトキシエトキシ(2’−MOE)糖修飾、反転した脱塩基キャップ、デオキシヌクレオ塩基、及びロックド核酸(LNAを含む)及びENAなどの二環式ヌクレオ塩基類似体からなる群から選択される修飾を任意に含む修飾オリゴヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
- 前記薬剤が、12〜80以上の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記LDHA遺伝子の発現を低減させる前記薬剤が、
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第1の鎖が15〜30の長さのヌクレオチド残基であり、前記5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第1の鎖の位置1〜15が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖が36〜80の長さのヌクレオチド残基であり、前記3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために前記第1の鎖の位置1〜15と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖の少なくとも前記3’末端ヌクレオチドが前記第1の鎖と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが前記第1の鎖と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;前記第2の鎖の前記5’末端が、前記第1の鎖と対になっていない5〜64の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜64ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;前記第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも前記第1の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、前記第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって前記第1の鎖と前記第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、前記5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第2の鎖の位置1〜19が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第1の鎖が25〜80の長さのヌクレオチド残基であり、二本鎖を形成するために前記第2の鎖の位置1〜19と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第1の鎖の前記3’末端ヌクレオチドが前記第2の鎖と対を形成して、平滑末端を形成し、または最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが前記第2の鎖と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;前記第1の鎖の前記5’末端が、前記第2の鎖と対になっていない5〜61の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜61ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;前記第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも前記第2の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、前記第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって前記第1の鎖と前記第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、前記dsNA;及び
第1の鎖及び第2の鎖を含むdsNAであって、前記第1の鎖及び前記第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、前記第1の鎖が、前記第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつヌクレオチドリンカーを含む3’領域を含み、前記dsNAが前記第1の鎖の前記3’末端と前記第2の鎖の前記5’末端との間に不連続性をさらに含み、前記第1の鎖または第2の鎖が、前記dsNAが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第1の鎖または第2の鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
からなる群から選択される構造を含むRNAi剤である、上記請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記ヌクレオチドリンカーが、テトラループを含み、任意に前記ヌクレオチドリンカーが、テトラループである、請求項15に記載の方法。
- 前記LDHA遺伝子の発現を低減させる前記薬剤が、ダイナミックポリコンジュゲート及びGalNAcコンジュゲートからなる群から選択される1つ以上の部分を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 15〜80の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が、前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記核酸。
- 前記オリゴヌクレオチド鎖が、19〜35の長さのヌクレオチドである、請求項18に記載の核酸。
- RNAを含む第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖を含む二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜80の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜80の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記二本鎖核酸。
- 前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドである、請求項20に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドである、請求項20または21に記載のdsNA。
- 少なくとも25の塩基対;19〜21の塩基対及び21〜25の塩基対からなる群から選択される二本鎖領域を含む、請求項10、15、20〜22または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、その3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチド、任意に長さのヌクレオチドを含む、任意に1〜3の長さのヌクレオチド、請求項10、15、20〜23または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項24に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項25に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項25に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドが2の長さのヌクレオチドであり、2’−O−メチル修飾リボヌクレオチドを含む、請求項25に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖がその3’末端に5〜35の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項10、15、20〜23または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記一本鎖ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項29に記載のdsNA。
- 前記一本鎖ヌクレオチドが、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバマート)からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項29に記載のdsNA。
- 前記一本鎖ヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む、請求項29に記載のdsNA。
- 前記一本鎖ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項29に記載のdsNA。
- 前記核酸またはdsNAが、LDHB及びLDHCからなる群から選択される1つ以上の標的遺伝子のmRNA発現も低減させる、請求項18〜33または請求項64のいずれかに記載の核酸またはdsNA。
- 前記核酸またはdsNAが、LDHAのmRNA発現を低減させるが、前記対象におけるLDHB及びLDHCからなる群から選択される1つ以上の遺伝子のmRNA発現を低減させない、請求項18〜33または請求項64のいずれかに記載の核酸またはdsNA。
- 前記第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項20〜35または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項20〜36または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿って標的乳酸デヒドロゲナーゼcDNA配列のGenBank受託番号第NM_005566.3号に相補的である、請求項20〜37または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の前記3’末端での前記第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、位置1、2及び/または3が修飾ヌクレオチドで置換される、請求項20〜38または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1の鎖の前記3’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド及び蛍光分子からなる群から選択される、請求項39に記載のdsNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の前記3’末端の位置1がデオキシリボヌクレオチドである、請求項40に記載のdsNA。
- 前記第1の鎖の前記3’末端及び前記第2の鎖の前記5’末端が平滑末端を形成する、請求項20〜41または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1の鎖が25の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が27の長さのヌクレオチドである、請求項20〜42または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 配列番号361〜432から選択される乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列の前記5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9及び10の間の部位で前記mRNAを切断し、それによって前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減する、請求項20〜43または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖が、配列番号73〜144からなる群から選択される配列を含む、請求項20〜44または61のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1の鎖が、配列番号1〜72からなる群から選択される配列を含む、請求項20〜45または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 表2から選択される一対の第1の鎖/第2の鎖配列を含む、請求項20〜46または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記核酸またはdsNAが修飾ヌクレオチドを含む、請求項18〜47または64のいずれか1項に記載の核酸またはdsNA。
- 前記修飾ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノ及び2’−O−(N−メチルカルバマート)からなる群から選択される、請求項48に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、AS−M1〜AS−M84、AS−M88〜AS−M96、AS−M210、AS−M1*〜AS−M84*、AS−M88*〜AS−M96*及びAS−M210*からなる群から選択される修飾パターンを含む、請求項20〜49または61のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が、SM1〜SM119及びSM250〜SM252からなる群から選択される修飾パターンを含む、請求項20〜50または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記dsNAがDicerにより前記細胞中で内因的に切断される、請求項20〜51または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記細胞の環境中で1ナノモル以下、200ピコモル以下、100ピコモル以下、50ピコモル以下、20ピコモル以下、10ピコモル以下、5ピコモル以下、2ピコモル以下及び1ピコモル以下からなる群から選択される前記dsNA、核酸またはハイブリダイゼーション複合体の量が前記標的遺伝子の発現を低減するために十分である、請求項18〜52または61のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- 前記核酸またはdsNAが、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも80〜90%、少なくとも95%、少なくとも98%、及び少なくとも99%からなる群から選択される量(%により表される)で乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、請求項18〜53または64のいずれか1項に記載の核酸またはdsNA。
- 前記第1の鎖及び第2の鎖が化学的なリンカーにより結合される、請求項20〜54または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第1の鎖の前記3’末端及び前記第2の鎖の前記5’末端が化学的なリンカーにより結合される、請求項20〜55または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2の鎖または第1の鎖のヌクレオチドが、Dicer開裂の配向を方向付ける修飾ヌクレオチドで置換される、請求項20〜56または64のいずれか1項に記載のdsNA。
- 2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロリボヌクレオチド、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノ、2’−O−(N−メチルカルバマート)、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)のヌクレオチド一リン酸塩、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)のヌクレオチド一リン酸塩、4−チオウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−(3−アミノアリル)−ウラシル、2’−O−アルキルリボヌクレオチド、2’−アミノリボヌクレオチド、ロックド核酸及びアンロックド核酸塩基類似体(UNA)からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項18〜57または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- ホスホン酸塩、ホスホロチオエート及びホスホトリエステルからなる群から選択されるリン酸塩骨格修飾を含む、請求項18〜58または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- モルフォリノ核酸及びペプチド核酸(PNA)からなる群から選択される修飾を含む、請求項18〜59または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- 前記薬剤、dsNA、核酸またはハイブリダイゼーション複合体が、ダイナミックなポリコンジュゲート(DPC)に付着する、請求項18〜60または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- 前記薬剤、dsNA、核酸またはハイブリダイゼーション複合体が、DPCと共に投与され、前記dsNA及びDPCが任意に付着していない、請求項18〜61または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- 前記薬剤、dsNA、核酸またはハイブリダイゼーション複合体が、GalNAc部分、コレステロール及びコレステロール標的化リガンドからなる群から選択される部分に付着する、請求項18〜62または64のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体。
- 第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記dsNA;
第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的であり、かつ配列番号361〜432から選択される前記乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列の前記5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9及び10の間の部位で前記mRNAを切断する、前記dsNA;
(a)センス領域及びアンチセンス領域であって、前記センス領域及び前記アンチセンス領域が25〜35塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、前記アンチセンス領域が配列番号361〜432から選択される配列に相補的である配列を含む、前記センス領域及びアンチセンス領域;並びに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである前記3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号361〜432から選択される前記乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列の前記5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9及び10の間の部位で前記mRNAを切断する、前記dsNA分子;
第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖並びに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記dsNA;
第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖並びに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の前記3’末端及び前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の前記5’末端が平滑末端を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼmRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432及び5109〜7122からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼ配列に十分に相補的である、前記dsNA;
19〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記核酸;
15〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖が、前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列とハイブリダイズ可能である、前記核酸;
RNAを含む第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列とハイブリダイズ可能である、前記dsNA;
RNAを含む第1の核酸鎖及び第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が少なくとも35の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号3493〜3499の少なくとも25の長さのヌクレオチドの配列を含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、前記第1の鎖の前記5’末端での前記第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第1の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;前記第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために前記リボヌクレオチドまたは前記第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み;前記第1の鎖の前記5’末端及び前記第2の鎖の前記3’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハング及び1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し;前記第1の鎖の前記3’末端及び前記第2の鎖の前記5’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハング及び1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し;前記第1の鎖の24から前記3’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも1つが、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、前記第2の鎖の前記5’末端での前記第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第2の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;前記第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために前記第2の鎖の位置1〜23の前記リボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖の24から前記3’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも1つが、前記第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第1の鎖(または前記第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、前記5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第1の鎖(または前記第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖(または前記第1の鎖)が36〜66の長さのヌクレオチド残基であり、前記3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために前記第1の鎖の位置1〜23と対を形成する前記位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖(または前記第1の鎖)の少なくとも前記3’末端ヌクレオチドが前記第1の鎖(または前記第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが前記第1の鎖(または前記第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;前記第2の鎖(または前記第1の鎖)の前記5’末端が、前記第1の鎖(または前記第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;前記第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも前記第1の鎖(または前記第2の鎖)の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、前記第2の鎖(または前記第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって前記第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、前記第2の鎖の少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチド残基であり、前記5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第2の鎖の位置1〜25が少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖が30〜66の長さのヌクレオチド残基であり、前記3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために前記第1の鎖の位置1〜25と対を形成する前記位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第2の鎖の前記5’末端が、前記第1の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;前記第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも前記第1の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、前記第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって前記第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、任意に25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、前記5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第1の鎖が24〜66の長さのヌクレオチド残基(任意に30〜66の長さのヌクレオチド残基)であり、前記3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために前記第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)と対を形成する前記位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;前記第1の鎖の前記3’末端及び前記第2の鎖の前記5’末端が、平滑末端、3’オーバーハング及び5’オーバーハングからなる群から選択される構造を含み、任意に前記オーバーハングは1〜6の長さのヌクレオチドであり;前記第1の鎖の前記5’末端が、前記第2の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;前記第1の鎖及び第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも前記第2の鎖の5’末端及び3’末端ヌクレオチドが、前記第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって前記第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;前記第2の鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
第1の鎖及び第2の鎖を含むdsNAであって、前記第1の鎖及び前記第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、前記第1の鎖が、前記第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、前記dsNAが前記第1の鎖の前記3’末端と前記第2の鎖の前記5’末端との間に不連続性をさらに含み、前記第1の鎖または第2の鎖が、前記dsNAが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記第1の鎖または第2の鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA;
5’末端及び3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖並びに5’末端及び3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、前記3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、前記dsNAが、前記dsNAのdicer開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く修飾され、任意に前記dsNAが、哺乳類細胞中でLDHのmRNA発現を低減できる1つ以上の19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得るために、非dicerヌクレアーゼによって切断される、前記dsNA;
外来核酸配列及び配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列を持つ細胞内のインビボハイブリダイゼーション複合体;並びに
外来核酸配列及び配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列を持つ細胞内のインビトロハイブリダイゼーション複合体
からなる群から選択される、組成物。 - 少なくとも25塩基対の二本鎖領域を有し、前記dsNAが、1ナノモル以下の細胞の環境中での有効濃度においてインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現の低減において、同一の前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAの少なくとも19の前記ヌクレオチドを指向した21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項64に記載のdsNA。
- 少なくとも25塩基対の二本鎖領域を有し、前記dsNAが、1ナノモル、200ピコモル、100ピコモル、50ピコモル、20ピコモル、10ピコモル、5ピコモル、2、ピコモル及び1ピコモルからなる群から選択される濃度でインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現の低減において、同一の前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAの少なくとも19の前記ヌクレオチドを指向した21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項64または65に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に対して4以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項20〜66のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に対して3以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項20〜67のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に対して2以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項20〜68のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に対して1つのミスマッチ核酸残基を有する、請求項20〜69のいずれか1項に記載のdsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と完全に相補的である、請求項20〜70のいずれか1項に記載のdsNA。
- 哺乳類細胞中で標的乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の低減方法であって、インビトロで哺乳類細胞を、前記細胞中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現を低減するのに十分な量の請求項20〜71のいずれか1項に記載のdsNAと接触させることを含む、前記方法。
- 標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA発現が、少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で減少する、請求項72に記載の方法。
- 乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから少なくとも8日後において、少なくとも90%の量(%により表される)で減少する、請求項72または73に記載の方法。
- 乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから少なくとも10日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で減少する、請求項72〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳類中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現の低減方法であって、前記哺乳類中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現を低減するために十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- 前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が脂質ナノ粒子(LNP)中で配合される、請求項76に記載の方法。
- 前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記哺乳類/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg、及び0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量で投与される、請求項76または77に記載の方法。
- 前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、1ナノモル以下の細胞の環境中での有効濃度においてインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現の低減において、同一の前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAの少なくとも15または19の前記ヌクレオチドを指向した21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項76〜78のいずれか1項に記載の方法。
- 乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルが、前記dsNAを前記哺乳類に投与してから少なくとも3日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で前記哺乳類の組織中で減少する、請求項76〜79のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織が肝臓組織である、請求項80に記載の方法。
- 前記投与するステップが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮注射、エアロゾル、直腸送達、膣送達、局所送達、経口送達及び吸入送達からなる群から選択される様式を含む、請求項76〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 対象の原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)を治療または予防する方法であって、前記対象のPH1を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
対象の原発性高シュウ酸尿症2型(PH2)を治療または予防する方法であって、前記対象のPH2を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
対象の原発性高シュウ酸尿症3型(PH3)を治療または予防する方法であって、前記対象のPH3を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
対象の特発性過シュウ酸尿症を治療または予防する方法であって、前記対象の特発性過シュウ酸尿症を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
対象の癌を治療または予防する方法であって、前記対象の癌を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
対象のピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損を治療または予防する方法であって、前記対象のピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損を治療または予防するのに十分な量の請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法;
外来核酸を細胞中のmRNAにハイブリダイズする方法であって、外来核酸配列を前記細胞に導入し、前記外来核酸を配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列にハイブリダイズすることを含む、前記方法;
肝臓または肺疾患もしくは障害を有する個体を治療する方法であって、外来核酸配を前記個体の細胞に導入し、前記外来核酸を配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列にハイブリダイズすることを含む、前記方法;
細胞内にインビボハイブリダイゼーション複合体を形成する方法であって、外来核酸配列を前記細胞に導入し、前記外来核酸を配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列にハイブリダイズすることを含む、前記方法;並びに
細胞内のタンパク質への標的mRNAの翻訳を阻害する方法であって、外来核酸配列を前記細胞に導入し、前記外来核酸を配列番号361〜432からなる群から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列にハイブリダイズし、前記外来核酸をRISCと複合体化して、前記mRNAを切断することを含む、前記方法
からなる群から選択される方法。 - 前記対象がヒトである、請求項83に記載の方法。
- 前記外来核酸が、RISCと複合体化する、請求項83または84に記載の方法。
- 前記RISCが前記mRNAを切断する、請求項83〜85のいずれか1項に記載の方法。
- LDHB及びLDHCからなる群から選択される標的遺伝子の阻害剤を投与することをさらに含む、請求項83〜86のいずれか1項に記載の方法。
- LDHB及び/またはLDHCの前記阻害剤がdsNAである、請求項87に記載の方法。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を含む製剤であって、前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で哺乳類細胞内にインビトロで導入される際に、前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルを低減するために有効な量で存在する、前記製剤。
- 前記有効量が、前記細胞の環境中で1ナノモル以下、200ピコモル以下、100ピコモル以下、50ピコモル以下、20ピコモル以下、10ピコモル以下、5ピコモル以下、2、ピコモル以下及び1ピコモル以下からなる群から選択される、請求項89に記載の製剤。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を含む製剤であって、前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、少なくとも10%、少なくとも50%及び少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で哺乳類対象の細胞内に導入される際に、前記薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルを低減するために有効な量で存在する、前記製剤。
- 前記有効量が、1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記対象/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg、及び0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量である、請求項91に記載の製剤。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を含む製剤であって、請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体が、1ナノモル以下の細胞の環境中での有効濃度においてインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAレベルの低減において同一の前記標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNAの少なくとも15または19の前記ヌクレオチドを指向した21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、前記製剤。
- 前記製剤が脂質ナノ粒子を含む、請求項89〜93のいずれか1項に記載の製剤。
- 前記製剤が肝臓または新生物組織を優先的に標的にする、請求項89〜94のいずれかに記載の製剤。
- 前記製剤が筋肉細胞を優先的に標的にする、請求項89〜94のいずれかに記載の製剤。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体を含む哺乳類細胞。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
- LDHB及びLDHCからなる群から選択される1つ以上の遺伝子の阻害剤をさらに含む、請求項98に記載の医薬組成物。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体及びその使用のための説明書を含むキット。
- 請求項18〜71のいずれか1項に記載の薬剤、核酸、dsNAまたはハイブリダイゼーション複合体から本質的になる乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有する組成物。
- 第1の鎖及び第2の鎖を含むdsNAであって、前記第1の鎖が、32〜80の長さの核酸残基であり、かつテトラループを有し、19〜30の長さのヌクレオチドの第2の鎖が、前記第1の鎖にアニールして二本鎖を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記dsNAが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的mRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列と十分に相補的である、前記dsNA。
- 第1の鎖及び第2の鎖配列の対が、配列番号7190及び7191;配列番号7192及び7193;配列番号7196及び7197;配列番号7198及び7199;配列番号7200及び7201;配列番号7202及び7203;配列番号7204及び7205;配列番号7206及び7207;配列番号7208及び7209;配列番号7210及び7211;並びに配列番号7212及び7213からなる群から選択される、請求項102に記載のdsNA。
- 対象における乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害の治療方法であって、
請求項102に記載のdsNAを、乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を有する対象に投与することを含み、前記投与することが、前記対象の1つ以上の組織中の前記LDHA遺伝子の発現を低減させることによって、前記対象における前記乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を治療することである、前記方法。 - 前記乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害が、新生物、任意に、肝臓及び/または膵臓腫瘍(複数可)である、請求項104に記載の方法。
- 前記dsNAをLNP配合、及び/またはGalNAcコンジュゲートする、請求項104または105に記載の方法。
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