JP2017532044A - ポリｄｎａスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅ｄｎａならびにそれらを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

試料中の標的核酸を検出する方法が開示される。本方法は、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの存在下において、配列変換オリゴヌクレオチドと前記試料を接触させることを含む。試料中の標的核酸を検出する方法であって、前記試料がポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの存在下において、配列変換オリゴヌクレオチドおよびシグナル増幅オリゴヌクレオチドと接触させられる方法も開示される。本開示は、このような配列変換およびシグナル増幅オリゴヌクレオチドを含む組成物およびキットも提供する。

Description

配列表
本出願は、配列表を含み、この配列表は、その内容が参照により組み込まれ、「２８２９８ＵＳ０１＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ＴＸＴ」というファイル名のテキストファイルとして本出願の申請と共に提出される。配列表ファイルは２０１４年１２月２２日に作成され、サイズは３，０００バイトである。

資金提供
本明細書で開示される研究の少なくとも一部は、日本政府機関である国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）の補助金による支援を受けた。

試験試料中の標的核酸の検出は、医学および生物学を含むさまざまな分野で重要である。多くの組成物、アッセイプラットホームおよび手順が、特定の核酸分子の検出に利用できる。臨床環境における検出が効率的であるためには、これらの手順は再現性があって正確であるばかりでなく、頑強であって迅速でなければならない。

さまざまな核酸配列の集団から特定の配列を増幅するために一般に使われている方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。代表的なＰＣＲが３つの異なる温度で実行されるので、反応は正確な温度を維持する難しさのような課題を伴う可能性があり、時間損失は繰返し数に比例して増加する。一本鎖への二本鎖鋳型ＤＮＡの変性は（ある程度、特定の配列に依存するが）、多くの場合高い「融解」温度を用いることが必要であり、このことは使用できるＤＮＡポリメラーゼのクラスを非常に熱安定性なものに限定する。その結果、等温増幅プラットホーム技術が、ＰＣＲで用いられるより穏やかな反応条件下で核酸を検出するために開発された。しかし、これらの等温増幅技術では、より速い反応時間を達成することに伴う課題について対処されていない。

以下の開示は、ＰＣＲで用いられる反応条件ほど厳しくない反応条件下において、核酸配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する代替の方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、試料中に低濃度で存在する場合がある核酸分子および／または長さの短い核酸分子の検出を可能にする配列選択性および感度を維持する。本方法および組成物は、反応時間も短縮する。本開示は、他にも態様はあるが、低温、等温条件下において試料中の標的核酸の検出限界を改善することが可能で、反応時間を短くする一方で、試料調製および自動化した検出方法を単純化または改善することが可能な新規方法および核酸分子を提供する。

（発明の要旨）
一態様において、本開示は試料中の標的核酸を検出する方法に関するものであって、前記方法は５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー配列（ＰＤＳ）、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含むオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと前記試料を接触させることを含む。本態様の実施形態において、本方法は、シグナルＤＮＡの存在が試料中の標的核酸の存在を示す、シグナルＤＮＡの有無を決定することも含む。

一態様において、本開示は試料中の標的核酸を検出する方法に関するものであって、前記方法は５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー配列（ＰＤＳ）、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（ＳＣ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一であるまたは異なる場合がある。）、ポリＤＮＡスペーサー配列（ＰＤＳ）（ＳＣ ＤＮＡのＰＤＳと同一であるまたは異なる場合がある。）、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡまたはＳＡ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと前記試料を接触させることを含む。本態様の実施形態において、本方法は、シグナルＤＮＡの存在が試料中の標的核酸の存在を示す、シグナルＤＮＡの有無を決定することも含む。また、本態様の一部の実施形態において、シグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー配列（ＰＤＳ）を持たない。

スペーサーはポリ「核酸」スペーサーであり、例えばポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）、ポリＲＮＡスペーサー（ＰＲＳ）またはそれらの誘導体もしくはアナログ（例えば、人工核酸）である可能性がある。特定の実施形態において、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃまたはそれらのいかなる組合せを含んでよい。ポリＲＮＡスペーサー（ＰＲＳ）配列は、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃまたはそれらのいかなる組合せを含んでよい。さらに、ＰＤＳ配列は、１から２０、１から１５、１から１０、１から８、１から６または１から５塩基長までである可能性がある。

後でさらに詳細に記載されるように、本明細書で開示される方法は、特に試料中の標的ＲＮＡの検出のために有用である。ＳＣ ＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と標的の３’末端と相補的な配列（Ｃ）の間へのポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列の配置は、シグナルＤＮＡが発生する割合を大きく高める。別の態様において、本開示は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二本鎖の下流、上流および／または隣接したエンドヌクレアーゼのニッキング活性の加速または促進に関する。

特定の実施形態において、ポリメラーゼは鎖置換活性を有してよい。さらなる実施形態において、ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損、または３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損および５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損の両方であってよい。一部の実施形態において、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼを含む。

実施形態において、エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドにニックを入れる反応に使用可能なニッキングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼを含んでよい。

本明細書で開示される方法は、代表的ＤＮＡ増幅条件下（例えば、標準ＰＣＲ、反応物濃度、時間サイクルなどに関連した代表的な温度）で実行されてよいが、一部の実施形態において、本方法は、等温条件下または実質的に定温下において実行されてよい。さらなる実施形態において、本方法は標準のＰＣＲ法で用いられる温度より低い温度で実行されてよい。一例として、本方法の一部の実施形態は、標的核酸（Ｔ）およびＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）またはシグナルＤＮＡ（Ｓ）および以下に記載されるＳＡ ＤＮＡの配列（Ｆ）の計算された最適ハイブリダイゼーションもしくはアニーリング温度、または実験的に決定されたハイブリダイゼーションもしくはアニーリング温度以下の温度で実行されてよい。実施形態において、本方法は、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）に結合する標的核酸（Ｔ）またはＳＡ ＤＮＡの配列（Ｆ）に結合するシグナルＤＮＡ（Ｓ）の融解温度より低い温度で実行されてよい。さらに他の実施形態において、本方法は、ポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を可能にする温度で実行されてよい。さらなる実施形態において、本方法は、試料中の標的核酸の検出のための反応混合物に存在するポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの最適反応温度またはこの付近の温度で実行されてよい。

別の態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドに関するものであって、本明細書で「配列変換ＤＮＡ」（または「ＳＣ ＤＮＡ」）と呼ばれてよく、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む。

別の態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドに関するものであって、本明細書で「シグナル増幅ＤＮＡ」（または「ＳＡ ＤＮＡ」）と呼ばれてよく、５’から３’方向に、配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列および配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同の配列（Ｆ）を含む。さらに別の態様において、本開示は、シグナル増幅ＤＮＡに関するものであって、５’から３’方向に、配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）および配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同の配列（Ｆ）を含む。

本開示のＳＣおよび／またはＳＡ ＤＮＡは一般に直鎖状であるが、これらのＤＮＡは環状（すなわちミニサークルＤＮＡ（ｍｃ））であることもできる。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、標的核酸の３’末端がミニサークルＳＣ ＤＮＡへ結合するとすぐに、またはシグナルＤＮＡの３’末端がミニサークルＳＡ ＤＮＡへ結合するとすぐに引き起こされうる。得られたＲＣＡ産物は、数千コピーのＳＣ ＤＮＡまたはＳＡ ＤＮＡを含む長い一本鎖ＤＮＡフラグメントである。

一例においては、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）は、標的核酸（Ｔ）の５’末端に相補的である可能性がある。本態様において、標的核酸（Ｔ）はシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）およびＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の両方と結合する。標的核酸（Ｔ）のＳＣ ＤＮＡへの結合（ＤＮＡリガーゼの存在下において）は、ミニサークルＳＣ ＤＮＡ（ｍｃ ＳＣ ＤＮＡ）の形成およびそれに続くローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の開始をもたらす。得られたＲＣＡ産物は、数千コピーのＳＣ ＤＮＡを含む長い一本鎖ＤＮＡフラグメントである。一実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位は、ヘアピン構造の二本鎖ステム−ループ領域内にあり、したがって、ニッキングエンドヌクレアーゼの存在下において、ニッキング（ステム−ループの３’側で）を受ける。ニッキングエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼの両方の存在下において、シグナルＤＮＡはＲＣＡ産物から直接生成される可能性がある。

本開示の方法およびオリゴヌクレオチドを、他の増幅および／または検出計画と組み合わせて用いることができる。例えば、本明細書で開示される方法によって生じる任意の一つのシグナルＤＮＡが、ローリングサークル増幅反応においてプライマーとしての機能を果たすことができる。一実施形態において、本開示の方法によって生じたシグナルＤＮＡの３’末端は、ミニサークルＤＮＡ鋳型と相補的である可能性があり、ローリングサークル増幅は、シグナルＤＮＡが結合するとすぐに開始されることが可能である。

標的核酸配列は、目的とする任意のヌクレオチド配列でよく、一部の実施形態において、感染性因子またはマイクロＲＮＡに由来する配列を含んでよい。他の実施形態において、標的核酸は、疾患または障害と関連する遺伝子由来の配列を含んでよい。

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列と相補的な配列を含む。他の実施形態において、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列は、エンドヌクレアーゼによって特異的に認識される配列に隣接（下流または上流）している。

さらに別の態様において、本開示は、試料中の標的核酸を検出する組成物に関するものであって、前記組成物は、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含むオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含む。

さらに別の態様において、本開示は、試料中の標的核酸を検出する組成物に関するものであって、前記組成物は、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（ＳＡ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一であるまたは異なる場合がある。）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列（第１のオリゴヌクレオチドのＰＤＳ配列と同一であるまたは異なる場合がある。）、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡまたはＳＡ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含む。本態様の一部の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドまたはシグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。

組成物はポリメラーゼ、および／またはエンドヌクレアーゼ認識部位が二本鎖である場合、第１および第２のオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ認識部位もしくはそれに隣接したところでニックを入れることができるエンドヌクレアーゼを含むこともできる。組成物は、反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチドおよび例えば新規に合成されたＤＮＡの蛍光検出のための蛍光体修飾プローブＤＮＡ（例えば、分子ビーコンプローブ）などのレポーター分子などの他の試薬を含むこともできる。アクリジニウム複合型プローブ（すなわち化学発光技術）を含む、当技術分野において一般に知られたレポーター分子を用いることができる。

さらに別の態様において、本開示は、試料中の標的核酸を検出するキットに関するものであって、前記キットは、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含むオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、キットはポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ認識部位もしくはエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接した部位にニックを入れることができるエンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチド、および例えば、シグナルＤＮＡのような新規に合成されたＤＮＡの蛍光検出のための蛍光体修飾プローブＤＮＡ（例えば、分子ビーコンプローブ）など、レポーター分子のような試薬を含むこともできる。キットは、本明細書で開示される方法のいずれか一つの実施における使用説明書を含むこともできる。

さらに別の態様において、本開示は、試料中の標的核酸を検出するキットに関するものであって、前記キットは、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡまたはＳＣ ＤＮＡ）、５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（ＳＡ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一であるまたは異なる場合がある。）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列（第１のオリゴヌクレオチドのＰＤＳ配列と同一であるまたは異なる場合がある。）、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡまたはＳＡ ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドまたはシグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。一部の実施形態において、キットはポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ認識部位もしくはエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接した部位にニックを入れることができるエンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチド、および例えば、シグナルＤＮＡなど、新規に合成されたＤＮＡの蛍光検出のための蛍光体修飾プローブＤＮＡ（例えば、分子ビーコンプローブ）などのレポーター分子などの試薬を含むこともできる。キットは、本明細書で開示される方法のいずれか一つの実施における使用説明書を含むこともできる。

本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、統合システムプラットホームと組み合わせて用いられてよい。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、ＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴシステムと組み合わせて用いられてよい。本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、例えばｍ２０００ｓｐ試料調製システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）などの試料調製システムプラットホームとともに用いられてよい。同様に、本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、例えばＡｂｂｏｔｔのｉ−ＳＴＡＴポイントオブケアシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）などのポイントオブケアシステムプラットホームとともに用いられてよい。さらに、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、例えば携帯蛍光検出器、マイクロｐＨメータ、マイクロ流体素子、マイクロアレイ、酵素検出システム、免疫クロマトグラフィーストリップおよび側方流動装置など、任意の数の他の機器、検定プラットホームおよび装置とともに用いることができる。

本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットは、非感染性および感染性疾患の診断を含む分子診断法の分野において用いられてよい。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットを用いて血液、尿、唾液、汗および糞便のようなヒト体液中のマイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非翻訳ＲＮＡおよびメチル化ＤＮＡを検出することができる。同様に、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物およびキットを用いて、血液、尿、唾液、汗および糞便のようなヒト体液中の、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ）、ツベルクローシス（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シフィリス（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、マラリア（Ｍａｌａｒｉａ）およびエントアメーバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のような感染性疾患に由来する標的核酸を検出することができる。

本開示の一部の態様において、本明細書で開示されるＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、化学的修飾されたヌクレオチドを含んでよいことは理解される。例えば、本明細書で開示されるＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、ＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＢＮＡ（架橋された核酸）、ＥＮＡ（エチレンで架橋された核酸）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノ核酸およびホスホロチオネートヌクレオチドまたはそれらの組合せおよび／または誘導体を含んでよい。

本開示により提供された追加の態様、実施形態および利点は、後続の記載を見ると明らかになる。

試料中の標的核酸の検出のための配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）の非限定的な例を概略的に例示する図である。ＳＣ ＤＮＡは、５’から３’方向に、シグナル生成配列（Ａ）、ニッキング反応において使用可能なエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸と相補的な配列（Ｃ）を含む。 試料中の標的核酸の検出のためのシグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）の非限定的な例を概略的に例示する図である。ＳＡ ＤＮＡは、５’から３’方向に、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（ＳＣ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一であるまたは異なる場合がある。）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列（ＳＣ ＤＮＡのＰＤＳと同一であるまたは異なる場合がある。）および第１のＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む。一部の実施形態において、シグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。 試料中の標的核酸の検出のための配列変換（ＳＣ）ＤＮＡと標的（Ｔ）核酸の典型的な反応の進行を概略的に例示する図である。配列（Ａ）−（Ｃ）およびＰＤＳは図１Ａに記載され、配列（Ｔ）は標的配列を表し、配列（Ｘ）は配列（Ｃ）に結合した標的（Ｔ）がポリメラーゼによって伸長する時に生じた配列を表し、配列（Ｘ’）はニックを入れられた伸長配列を表し、配列（Ｓ）は最終的に生じたシグナルＤＮＡ配列を表す。 試料中の標的核酸の検出のためのシグナル増幅（ＳＡ）ＤＮＡとシグナルＤＮＡ（Ｓ）の典型的な反応の進行を概略的に例示する図である。配列（Ｄ）−（Ｆ）およびＰＤＳは図１Ｂに記載され、配列（Ｓ）は、図２Ａに記載のＳＣ ＤＮＡと標的（Ｔ）核酸の反応から生じたシグナルＤＮＡであり、配列（Ｙ）は配列（Ｄ）に結合したシグナルＤＮＡ（Ｓ）がポリメラーゼによって伸長する時に生じた配列を表し、配列（Ｙ’）はニックを入れられた伸長配列を表し、配列（Ｓ）は最終的に生じたシグナルＤＮＡ配列を表す。ＳＡシグナル生成配列（Ｄ）はＳＣシグナル生成配列（Ａ）に相同であるので、同一のシグナルＤＮＡ（Ｓ）が生じる。 エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）とＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の間に位置するＰＤＳ配列の存在がシグナルＤＮＡの増幅を加速することを示す、実施例１において実行された反応の結果を示す図である。 エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）とＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の間に位置するＰＤＳ配列の存在がエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）のニッキングを促進することを示す、実施例２において実行された反応の結果を示す図である。

一般的に、本開示は試験試料中の標的核酸の検出に驚くほど効果的である核酸コンストラクトに関する。本明細書で開示されるコンストラクトは、付随する反応速度の上昇と共に、標的核酸の存在下において生成されるシグナルＤＮＡが生じうるようにする核酸配列を含む。本明細書で開示される方法および核酸コンストラクトは、低温および等温条件下において有利に実行される場合がある標的核酸の選択的、高感度、および迅速な検出を可能にする。

一態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドに関するものであって、オリゴヌクレオチドは本明細書で、「シグナル増幅ＤＮＡ」（または「ＳＡ ＤＮＡ」）と呼ばれてよく、５’から３’方向に、既知のシグナルＤＮＡ配列と相補的な第１の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および第１の配列と同一の既知のシグナルＤＮＡ配列と相補的な第２の配列を含む。第１の配列は図１ＢのシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）であり、シグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）はＳＣ ＤＮＡの既知のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である。第２の配列は図１Ｂの配列（Ｆ）であり、配列（Ｆ）は同一のＳＣ ＤＮＡの同一の既知のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である。

本態様において、第１および第２の配列の長さは異なってよいが、一般的に、各々の配列はもう一方とほぼ同じ長さである。実施形態において、配列の長さは、約５から約１００ヌクレオチドまでの範囲であってよいが、より一般的には、約５から約３０、約１０から約３０または約１５から約３０ヌクレオチド長までである。エンドヌクレアーゼ認識部位は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼが認識し、結合し、ニックを入れることが可能な配列を含む。そのような配列は、一般に当技術分野で知られている。エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼ結合部位の５’または３’のいずれか（または５’および３’の両方）へ追加のヌクレオチドを含むことができるが、一般的に長さはほんの１０ヌクレオチドしかない。

本開示は新規配列変換（ＳＣ）およびシグナル増幅（ＳＡ）オリゴヌクレオチドコンストラクトならびにそれらの組合せを提供し、それらは、付随する反応速度の上昇と共に、試料中の標的核酸の検出において有用である。図１Ａの実例となる実施形態によって表されるように、試料中の標的核酸の検出のための配列変換ＤＮＡ（ＳＣ ＤＮＡ）オリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む。

図１Ｂの実例となる実施形態によって表されるように、試料中の標的核酸の検出のためのシグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、５’から３’方向に、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（ＳＣ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一であるまたは異なる場合がある。）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列（ＳＣ ＤＮＡのＰＤＳと同一であるまたは異なる場合がある。）およびＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む。一部の実施形態において、シグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。

図１Ａに図示されるように、本明細書で開示されるＳＣ ＤＮＡは、シグナル生成配列（Ａ）を含む。ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、いかなる所望の核酸配列も含むことができ、いかなる特定の配列によっても制限されない。後でさらに詳細に論じられるように、シグナル生成配列（Ａ）は、シグナルＤＮＡ（例えば、図２の核酸（Ｓ））の鋳型の少なくとも一部となり、シグナルＤＮＡの生成は標的核酸の存在を示す。ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、長さによって制限されない。一部の実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、約５から約１００の核酸塩基であり、５から１００の間の全整数である。実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、約５から約３０の核酸塩基であり、５から３０の間の全整数である。一部の実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、約１０から約３０の核酸塩基であり、１０から３０の間の全整数である。さらにさらなる実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）は、約１５から約３０の核酸塩基であり、１５から３０の間（例えば、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０塩基）の全整数である。

図１Ｂに図示されるように、本明細書で開示されるＳＡ ＤＮＡは、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同なシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、および同一のＳＣ ＤＮＡの同一のシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む。一部の実施形態において、ＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同であるために、配列（Ｄ）および（Ｆ）は、対応するシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と完全に同一である。他の実施形態において、３’末端で、約１から約５または約１から約４または約１から約３または約１から約２または１塩基短いことを除いて、配列（Ｆ）はＳＣ ＤＮＡの対応するシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）と配列が同一である。ＳＡ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）がＳＣ ＤＮＡのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同である場合、同一のシグナルＤＮＡ（Ｓ）が生じ、指数的に増幅されることになる。

ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）をそれぞれ含み、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）は同一であるまたは異なる可能性がある。一本鎖型（例えば、図１Ａおよび１Ｂの構造）において、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）は、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる場合がある配列と相補的な配列を含んでよい。エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列は、エンドヌクレアーゼによって認識される配列から下流または上流の範囲であってよい。適切に、二本鎖の場合、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）は反応に存在する１つ以上のエンドヌクレアーゼによって認識されることが可能であり、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）（またはエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および（Ｅ）に隣接した配列）は二本鎖ＤＮＡの１本の鎖上でのみ切断される場合がある（すなわち、ニックを入れられる。）。後でさらに詳細に記載されるように、標的核酸のＳＣ ＤＮＡの相補的な配列（Ｃ）への結合は、ＤＮＡポリメラーゼを介した複製を引き起こし、エンドヌクレアーゼの認識部位としてすぐに働くことができるエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の活性を有する二本鎖型を生成する（図２Ａ）。新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）または新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｂ）に隣接した部位においてニックを入れるエンドヌクレアーゼは、次いでＤＮＡポリメラーゼを介した複製を引き起こし、シグナルＤＮＡ（Ｓ）（図２Ａ参照）を生じる。図２Ａに図示されるように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）は、ＳＣ ＤＮＡではなく、新しく複製された鎖がニックを入れられるような向きになっている。つまり、新しく複製された鎖が生成される際に、（Ｂ）のエンドヌクレアーゼ認識部位の向きは新しく複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を導く。このように、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列と相補的な配列を含むので、ＳＣオリゴヌクレオチドが反応を通して無傷のままであることが可能になる（すなわち、ＳＣ ＤＮＡはニックを入れられないまたは切断されない。）。

ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を含むこともできる。ＳＣ ＤＮＡにおいて、ＰＤＳ配列は、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）の間に位置する。ＳＡ ＤＮＡにおいて、ＰＤＳ配列は、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）とＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）に実質的に相同な配列（Ｆ）の間に位置する。一部の実施形態において、シグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡのＰＤＳ配列は、同一であるまたは異なる可能性がある。ＰＤＳ配列は、天然の塩基、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣのいずれか１つ以上からなる可能性があり、３から２０、３から１８、３から１６、３から１４、３から１２、３から１０、３から８、３から６または３から５塩基長である可能性がある。以下に図示されるように、本明細書で開示される１つ以上のＳＣまたはＳＡ ＤＮＡにおけるＰＤＳ配列の存在は、本明細書で開示される方法にしたがって実行される反応を、５から６０、５から５０、５から４０、５から３０、５から２０または５から１０分ほど加速することができる。

後でさらに詳細に記載されるように、ＳＣ ＤＮＡのシグナル生成配列（Ａ）から生成されるシグナルＤＮＡ（Ｓ）のＳＡ ＤＮＡの配列（Ｆ）への結合は、ＤＮＡポリメラーゼを介した複製を引き起こし、エンドヌクレアーゼの認識部位として働くことができるＳＡ ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）の活性を有する二本鎖型を生成する（図２Ｂ）。ＳＡ ＤＮＡの新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｅ）または新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位（Ｅ）に隣接した部位においてニックを入れるエンドヌクレアーゼは、次いでＤＮＡポリメラーゼを介した複製を引き起こし、ＳＣ ＤＮＡから生成されたシグナルＤＮＡ（Ｓ）と同一のシグナルＤＮＡ（Ｓ）を生じる（図２Ｂ）。図２Ｂに図示されるように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）は、ＳＡ ＤＮＡではなく、新しく複製された鎖がニックを入れられるような向きになっている。つまり、新しく複製された鎖が生成される際に、Ｅのエンドヌクレアーゼ認識部位の向きは新しく複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性（切断）を導く。このように、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼによってニックを入れられる配列と相補的な配列を含むので、ＳＡオリゴヌクレオチドが反応を通して無傷のままであることが可能になる（すなわち、ＳＡ ＤＮＡはニックを入れられないまたは切断されない。）。

標的ＤＮＡに相補的なＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）は長さによって制限されず、約５から約１００の核酸塩基である可能性があり、５から１００の間の全整数である可能性がある。一部の実施形態において、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）は、約５から約３０の核酸塩基であり、５から３０の間の全整数である。一部の実施形態において、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）は、約１０から約３０の核酸塩基であり、１０から３０の間の全整数である。さらなる実施形態において、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）は、約１５から約３０の核酸塩基であり、１５から３０の間の全整数である。

相補配列は水素結合相互作用を形成して、二本鎖核酸構造（例えば、核酸塩基対）を形成することができる。例えば、第１の配列と相補的である配列は、第１の配列とワトソン−クリック型の塩基対を形成することができる配列を含む。本明細書で使用されるように、「相補的である」という用語は、配列がこの相補鎖の全長にわたって相補的であることを要求せず、別の配列の一部と相補的である配列を含む。したがって、一部の実施形態において、相補配列は、配列の全長にわたってまたはそれらの一部に対して相補的である配列を含む（例えば、配列の長さの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％を超える。）。例えば、２つの配列は、約２から約１００の連続する（隣接する）ヌクレオチドの範囲の長さにわたって互いに相補的である可能性があり、または２から１００の間のいかなる整数である可能性がある。一部の実施形態において、２つの配列は、約１５から約３０の連続する（隣接する）ヌクレオチドの範囲の長さにわたって互いに相補的である可能性があり、または１５から３０の間のいかなる整数である可能性がある。本明細書で使用されるように、いくつかの配列ミスマッチがある配列を含むことができる。例えば、相補配列は、配列の長さの少なくとも約７０％から１００％、好ましくは９５％超と相補的である配列を含むことができる。ある程度のミスマッチにもかかわらず、相補配列には一般に、例えば本明細書で記載されたまたは当業者によって一般に知られている条件のような厳しいおよび非常に厳しい条件などの適切な条件下において、互いに選択的にハイブリダイズする能力がある。

ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、既知の方法によって合成されてよい。例えば、ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、ホスホラミダイト法、ホスホトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはチオホスホネート法を使用して合成することができる。一部の実施形態において、ＳＣおよび／またはＳＡ ＤＮＡは、例えばイオン交換ＨＰＬＣを使用して精製することができる。

ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、一般に当技術分野で知られているような化学的修飾を含んでよい。一部の実施形態において、例えば、ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、化学的修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−Ｏメチル誘導体、ホスホロチオネートなど）、３’末端修飾、５’末端修飾またはそれらのいかなる組合せでも含むことができる。一部の実施形態において、伸長反応がＳＣまたはＳＡ ＤＮＡの３’末端から起こらないように（例えば、ポリメラーゼ伸長のためのプライマーとして働いてしまう可能性がある、標的配列または別の非標的配列に結合した際に）、ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡの３’末端は修飾されてよい。図２Ａに図示されるように、ＤＮＡ複製を開始するのは、標的核酸（Ｔ）の３’末端であってＳＣ ＤＮＡではない。ＳＣまたはＳＡ ＤＮＡの３’末端から開始されるどんな複製でも、結果として検出エラー（例えば、偽陽性）につながる場合がある。さらに、例えばＳＣ ＤＮＡと非標的配列の間の結合、誤った位置におけるＳＣ ＤＮＡと標的配列の間の結合、ＳＣ ＤＮＡとＳＡ ＤＮＡの間の結合、または非鋳型によるデノボもしくはアブイニシオＤＮＡ合成などのイベントから生じるＳＣ ＤＮＡの未修飾の３’末端からの非特異的伸長反応もまた、結果として検出エラーをもたらす場合がある。したがって、実施形態において、ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡは、上述のような望ましくないあらゆる伸長反応の発生を減らすことができるまたは除去することができる３’末端の修飾を含む。３’末端修飾の非限定的な例は、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬおよびＦＡＭを含む。修飾の他の非限定的な例は、例えば、ビオチン標識、フルオロクロム化、リン酸化、チオール化、アミノ化、逆向きヌクレオチドまたは塩基非含有基を含む。

別の態様において、本発明は試料中の標的核酸（Ｔ）を検出する方法を含む。本方法は、一般に、５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列、および標的核酸（Ｔ）の３’末端と相補的な配列（Ｃ）を含む第１のオリゴヌクレオチド（または配列変換ＤＮＡもしくはＳＣ ＤＮＡ）、５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同のシグナルＤＮＡ生成配列（Ｄ）、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）（第１のオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と同一である。）、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列（第１のオリゴヌクレオチドのＰＤＳと同一であるまたは異なる。）、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列（Ａ）に相同な配列（Ｆ）を含む第２のオリゴヌクレオチド（またはシグナル増幅ＤＮＡもしくはＳＡ ＤＮＡ）、ポリメラーゼ、ならびにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと前記試料を接触させることを含む。本態様の実施形態において、本方法は、シグナルＤＮＡの存在が試料中の標的核酸の存在を示す、シグナルＤＮＡの有無を決定することも含む。一部の実施形態において、シグナル増幅ＤＮＡ（ＳＡ ＤＮＡ）は、ポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列を持たない。

本方法は、試料をエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。エンドヌクレアーゼは、ＳＣ ＤＮＡの範囲内でエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と相補的な配列もしくはＳＡ ＤＮＡの範囲内でエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）と相補的な配列にニックを入れることができるまたはニックを入れる際に用いることができるニッキングエンドヌクレアーゼもしくは制限エンドヌクレアーゼであってよい。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡニッキング反応を触媒することができるまたは触媒するために用いることができるニッキングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼを含む。ニッキングエンドヌクレアーゼを提供する実施形態において、二本鎖ＤＮＡの１本の鎖のホスホジエステル結合は、切断されて切断部位の５’側にリン酸基を、３’側にヒドロキシル基を生成する場合がある。ニッキングエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．Ｂｔｓｌ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩおよびＮｔ．ＢｓｍＡＩを含む。

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼであってよい。これらの実施形態において、制限エンドヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡの１本の鎖の上でだけホスホジエステル結合を切断し、二本鎖にニックを生成するように、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は修飾される場合がある。例えば、制限酵素によって切断されない化学的修飾を、二本鎖の核酸の少なくとも１本の鎖に含めるなどの方法または方針を用いて、制限エンドヌクレアーゼの活性を修飾してもよい。このような修飾の１つの非限定的な例は、１本の鎖のホスホジエステル結合の酸素原子を硫黄原子と入れ替えることを含む。

制限エンドヌクレアーゼを提供する実施形態において、二本鎖ＤＮＡの１本の鎖のホスホジエステル結合は、切断されて切断部位の５’側にリン酸基を、３’側にヒドロキシル基を生成する場合がある。制限エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｈｉｎｃ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ａｖａ Ｉ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｔｔｈ１１１ＩおよびＮｃｉＩを含む。

本方法は、試料をポリメラーゼと接触させることを含む。一部の実施形態において、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼであってよい。一部の実施形態において、ポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くまたは５’−３’および３’−５’両方のエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼであってよい。ポリメラーゼは起源が真核生物、原核生物またはウイルスであってよく、遺伝子操作されていることも可能である。一部の実施形態において、ポリメラーゼは、周囲の（例えば、部屋）温度を含むより低い温度で働くものの中から選択される。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼを含む。

本明細書で開示される方法の１つの非限定的な実施形態は、図２Ａおよび２Ｂに図示される。手短に言うと、図２Ａに図示されるように、試料はＤＮＡポリメラーゼおよび、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の二本鎖型（すなわち、相補配列）またはエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の二本鎖型に隣接した部位にニックを入れることができるエンドヌクレアーゼの存在下においてＳＣ ＤＮＡと接触させられる。標的核酸（Ｔ）が試料中に存在するならば、標的核酸（Ｔ）の３’末端配列は、標的と相補的であるＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）にハイブリダイズし、複製（反応混合物に存在するＤＮＡポリメラーゼによる。）を引き起こすまたは開始し、それによって、二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）を含む二本鎖伸長配列（Ｘ）を生成する。新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）の認識（反応混合物に存在するエンドヌクレアーゼによる。）および後続の新しく生成された鎖のニッキング（反応混合物に存在するエンドヌクレアーゼによる。）は、オリゴヌクレオチドシグナル配列（Ｓ）および伸長配列（Ｘ’）を生成する。ニックにおける配列（Ｘ’）の３’−ＯＨは、鎖置換複製の以降の回のための開始部位として働くので、オリゴヌクレオチド（Ｓ）は、反応混合物中でシグナルＤＮＡ（Ｓ）を複製し増幅し続けるＤＮＡポリメラーゼによって、ＳＣ ＤＮＡから取り除かれる。

図２Ｂにさらに図示されるように、シグナルＤＮＡ（Ｓ）の生成から得られたシグナルは、シグナル増幅ＤＮＡ（またはＳＡ ＤＮＡ）の存在によってさらに増幅可能である。手短に言うと、反応に存在するシグナルＤＮＡ（Ｓ）は、ＳＡ ＤＮＡの配列（Ｆ）にハイブリダイズし、複製（反応混合物に存在するＤＮＡポリメラーゼによる。）を引き起こすまたは開始し、それによって、二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）を含む二本鎖伸長配列（Ｙ）を生成する。新しく生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｅ）の認識（反応混合物に存在するエンドヌクレアーゼによる。）および後続の新しく生成された鎖のニッキング（反応混合物に存在するエンドヌクレアーゼによる。）は、オリゴヌクレオチドシグナル配列（Ｓ）および伸長配列（Ｙ’）を生成する。ニックにおける配列（Ｙ’）の３’−ＯＨは、鎖置換複製の以降の回のための開始部位として働くので、オリゴヌクレオチド（Ｓ）は、反応混合物中でシグナルＤＮＡ（Ｓ）を複製し増幅し続けるＤＮＡポリメラーゼによって、ＳＡ ＤＮＡから取り除かれる。

本発明による方法は、試料中の標的核酸の検出のために有用である。特に、本発明の方法は、試料中の標的ＲＮＡの検出のために有用である。以下に例示されるように、ＳＣ ＤＮＡにおいてエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と標的核酸の３’末端と相補的な配列（Ｃ）の間にポリＤＮＡスペーサー（ＰＤＳ）配列が存在することは、シグナルＤＮＡ（Ｓ）の生成を高める。以下にさらに例示されるように、ＰＤＳの存在は、エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）にニックを入れる割合を高める。

本発明による方法は、等温のまたは実質的に定温の条件下において実行されてよい。実質的に定温下で本方法を実行することに関する実施形態において、温度の若干の変動は許される。例えば、一部の実施形態において、実質的に定温は、所望のまたは確認された標的温度の範囲内で（例えば、約＋／−２℃または約＋／−５℃）変動してよい。実施形態において、実質的に定温は、熱サイクルを含まない温度を含んでよい。一部の実施形態において、本方法は等温または実質的に定温、例えば、（１）計算された／予測されたまたは実験的に決定された、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）への標的核酸（Ｔ）の最適ハイブリダイゼーションまたはアニーリング温度以下付近の温度、（２）ＳＣ ＤＮＡと結合する標的核酸（Ｔ）の融解温度以下の温度（一般的に、ハイブリダイゼーションまたはアニーリング温度は、融解温度よりわずかに下にある。）、（３）ＳＡ ＤＮＡと結合するシグナルＤＮＡ（Ｓ）の融解温度以下の温度、または（４）反応混合物中に存在するポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼのために計算された／予測されたまたは実験的に決定された最適反応温度またはこの付近の温度で実行可能である。

本方法は、約２０℃から約４２℃の範囲内に下降するより低い温度を含む、約２０℃から約７０℃の範囲にわたる反応温度を含んでよい。一部の実施形態において、反応温度範囲は、３５℃から４０℃（例えば、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃）である。他の実施形態において、反応温度は、約５５℃、約５０℃、約４５℃、約４０℃または約３０℃より低い温度を含む、６５℃より低い温度である。さらに他の実施形態において、反応温度は約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃または約７０℃であってよい。

本方法は、標的核酸の存在下において検出可能な量のシグナル配列の増幅を可能にするために十分な時間の間、実行されてよい。一部の実施形態において、反応時間は約５分から１６時間まで、または約３分から１６時間までにわたってよい。さらに他の実施形態において、反応時間は約５分から１２０分まで、または約１５分から６０分までにわたってよい。

明細書を通して、オリゴヌクレオチド（Ｓ）はシグナルＤＮＡ（Ｓ）とも呼ばれる。シグナルＤＮＡは標的核酸（Ｔ）の存在下においてのみ生成されるので、本発明による方法は、シグナルＤＮＡの有無を検出することによって、試料中の標的核酸（Ｔ）の有無を検出する。シグナルＤＮＡ（Ｓ）は配列によって制限されず、検出に適するいかなる配列であってもよい。シグナルＤＮＡは、長さによって制限されることもない。好ましくは、シグナルＤＮＡは、約５から約１００の塩基であり、５から１００の間のいかなる整数でもある可能性がある。一部の実施形態において、シグナルＤＮＡは、約５から約３０の核酸塩基であり、５から３０の間の全整数である可能性がある。一部の実施形態において、シグナルＤＮＡは、長さが約１０から約３０の塩基であり、１０から３０の間の全整数である可能性がある。さらにさらなる実施形態において、シグナルＤＮＡは、長さが約１５から約３０の塩基であり、１５から３０の間の全整数である可能性がある。

本開示による方法は、約４から約１０まで、または約７から約９までのｐＨ範囲を含む緩衝液条件下において実行されてよい。緩衝液は、約１０ｍＭから約５００ｍＭまで、または約５０ｍＭから１５０ｍＭまでの塩濃度を含んでよい。一部の実施形態において、本方法は、標的核酸の存在下において、検出可能な量のシグナル配列の増幅を可能にする量のＳＣおよび／またはＳＡ ＤＮＡを用いて実行されてよい。一部の実施形態において、ＳＣおよび／またはＳＡ ＤＮＡ濃度は、約１００ｐＭから約１００μＭまで、約１ｎＭから約１μＭまで、約５ｎＭから約５０ｎＭまでまたは約５ｎＭから約２５ｎＭまでにわたってよい。

シグナルＤＮＡ（Ｓ）の存在は、当技術分野で知られている任意の方法によって検出することができる。例えば、ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドによる染色を用いることができる。また、シグナルＤＮＡの存在は、蛍光偏光法、イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、酵素標識（例えばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えばフルオレセインまたはローダミン）、化学発光、生物発光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはフルオロフォア修飾プローブＤＮＡ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を用いて検出することができる。増幅産物は、例えば、ビオチンでラベルされた標識ヌクレオチドを用いて検出することもできる。このような場合、増幅産物中のビオチンは、例えば、蛍光標識アビジンまたは酵素標識アビジンを用いて検出することができる。増幅産物は、当業者に知られている酸化還元インターカレータを用いて、電極で検出することができる。増幅産物は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）または電気化学的方法（ナノポアセンサを用いた方法を含む。）を用いて検出することもできる。

本発明による方法は、試料中の標的核酸（Ｔ）の有無を検出する。本発明による方法を使って、試験試料中の標的核酸濃度を定量的に測定することもできる。例えば、本開示による方法は、異なる既知の濃度範囲の標的核酸の存在下において実行可能であり、次いで、較正曲線が、当技術分野において一般に行われるように作成され使われることができる。標的核酸（図２の中の（Ｔ））は、いかなる核酸配列でも含むことができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学的修飾された核酸、非天然の核酸、核酸類縁体、またはそれらのいかなるハイブリッドもしくは組合せも含むことができる。したがって、一部の実施形態において、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含んでよく、ＲＮＡは全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含んでよい。一部の実施形態が特定の標的核酸配列に関するものである一方、補助的な核酸配列を含むいかなる核酸配列でも検出される標的核酸配列である可能性がある。核酸が短鎖核酸である場合でも、本開示によって、選択性と感度を伴う標的核酸の検出が可能となる。したがって、ＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）と標的核酸（Ｔ）の間の相補性の程度が、配列間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする（例えば、配列変換ＤＮＡの配列（Ｃ）および標的核酸（Ｔ）配列中の相補的ヌクレオチドの数は、所与の一連の反応条件下において、非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐ。）。

実施形態において、標的核酸配列は、例えば、ゲノムＤＮＡ、発現したｍＲＮＡ、病原体（微生物、ウイルス）由来の核酸配列または治療的な核酸を含む任意の数の供給源からのものであっても、またはそれらに由来するものであってもよい。したがって、本明細書で開示されるＳＣおよびＳＡ ＤＮＡおよび方法は、疾患（例えば、遺伝的原因および感染性の原因から生じる。）の診断と予後予測、汚染物質（例えば、食物性疾病、機器汚染）の同定、個別化医療（例えば、治療のモニタリングおよび／または予後予測）、などのために用いられてよい。例えば、分子診断試験は、次の感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ＨＣＶ（遺伝子型１−６）、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、クラミジア・トラコマチス、ナイセリア・ゴノロエエ、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパルボウイルスに関して実行することができる。

一部の実施形態において、標的核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むことができる。マイクロＲＮＡは、約２２ヌクレオチドの非翻訳ＲＮＡ小分子を含む。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写および転写後調節において働くことが知られている。マイクロＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相補的領域と塩基対形成することによって働き、翻訳抑制または標的の分解を介して遺伝子サイレンシングをもたらすことが知られている。

標的核酸を含む場合がある試料の任意のタイプが、本明細書で開示される方法で使われてよい。このように、標的核酸を含んでいるまたは含んでいると推測される試料は、特に限定されず、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば癌性組織またはリンパ節）、細胞培養（例えば哺乳動物細胞培養または細菌培養）のような生体由来の生体試料、ウイロイド、ウイルス、バクテリア、真菌、酵母、植物および動物のような核酸を含む試料、ウイルスまたはバクテリアのような微生物を含むまたは汚染された場合がある試料（例えば食品および生物学的製剤）、および土、工業プロセスおよび製造機器、ならびに廃水のような生体物質を含む場合がある試料、およびさまざまな水源（例えば、飲料水）に由来する試料を含む。さらにまた、試料は本明細書で開示される方法で使われる核酸を含有する組成物を調製するために、どんな既知の方法によって加工されてもよい。このような調製の例は、細胞破砕（例えば、細胞可溶化物および抽出物）、試料分画、試料中の核酸およびｍＲＮＡ濃縮試料のような特定の核酸分子群を含むことができる。本発明の標的核酸を検出する方法で用いられる試料は、上記のように生物学的製剤および天然物に由来するものに限られず、合成オリゴヌクレオチドを含む試料であってよい。

本発明による方法は、Ａｂｂｏｔｔのｍ２０００ｓｐ試料調製システムと組み合わせて実行することができる。ｍ２０００ｓｐは、核酸を捕捉するために磁性粒子工学を用い、粒子を洗浄して非結合の試料成分を除去する。結合した核酸は溶出され、９６ウエル深型プレートへ移される。Ａｂｂｏｔｔのｍ２０００ｓｐは、本技術による方法を実行するのに必要な任意の試薬を、９６ウエル深型プレートに移された、洗浄された核酸と合わせることもできる。例えば、ＳＣおよびＳＡ ＤＮＡ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、分子ビーコンおよび他のいかなる試薬（例えば、ｄＮＴＰ）も、必要に応じてまたは要望通りに添加することができる。

本発明による方法は、ポイントオブケアプラットホームと連係させることもできる。例えば、伸長するＤＮＡ鎖へのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の取り込みは、共有結合の形成および反応のｐＨに影響を及ぼすピロリン酸および正に荷電した水素イオンの放出を伴う。このように、本発明の方法によるシグナルＤＮＡの合成は、例えば、ポイントオブケアマイクロｐＨメータを用いたｐＨの追跡変化によって検出することができる。例えば、Ａｂｂｏｔｔのｉ−ＳＴＡＴポイントオブケアシステムは、ｐＨの分析のための、微細加工センサ、校正溶液、流体系および廃液容器を含む単回使用の使い捨てカートリッジとともに提供することができる。

本明細書で開示される方法は、追加の試薬を含むことができる。核酸増幅反応で使用可能な他の試薬の一部の非限定的な例は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムおよび硫酸マグネシウムなどの金属塩、ｄＮＴＰ混合物などの基質、およびトリス−ＨＣｌ緩衝液、トリシン緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸カリウム緩衝液などの緩衝溶液を含む。同様に、界面活性剤、酸化剤および還元剤は、本明細書で開示される方法の実施において使用することもできる。さらに、ジメチルスルホキシドおよびベタイン（Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルグリシン）などの試薬、国際公開番号ＷＯ ９９／５４４５５に記載された酸性物質、および陽イオン複合体を用いることができる。

本明細書で提供された方法および核酸構造は、標的核酸の存在下においてシグナルＤＮＡの指数関数的な増幅を可能とする他の方法と組み合わせて使用されてよい。例えば、参照により本明細書に組み込むものとする、「Ｃｏｖｅｒｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ＤＮＡ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題する米国仮特許出願第６１／９２７，７１０号に記載されるように、本開示による方法および組成物を、カバーされた配列変換ＤＮＡと組み合わせて用いてよい。

「約」という用語は、一般に列挙された値（すなわち同一の機能または結果を有する。）に相当すると当業者が考える数の範囲を指す。本明細書で用いられる「約」という用語は、参照された値よりおよそ１０−２０％超えるまたは少ない範囲を指すものとする。一定の状況においては、当業者は、参照された値の特質のために、「約」という用語は、その値から１０−２０％の偏差より多いまたは少ないことを意味する可能性があると認識する。

後続の実施例は、上述の態様および実施形態の実例となることを意図している。上記の開示も下記の実施例も、添付の特許請求の範囲の範囲を制限するものと考えてはならない。当業者は、本開示のさまざまな態様を記載および図示するために用いられる特定の用語によって本開示が制限されないことを認める。

［実施例１］
以下の例は、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）とＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の間に位置するＰＤＳ配列の存在がシグナルＤＮＡの増幅を加速することを示す。反応は、ＳＣ ＤＮＡ １、

およびエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）とＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の間に位置する異なるＰＤＳ配列を有する多数の他のＳＣ ＤＮＡを用いて実行された。
これらのＳＣ ＤＮＡは、

を含む。

反応は、最終濃度が１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ７．９のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）緩衝液２を含む２５μＬの反応体積で３７℃で実行された。反応で使われたニッキングエンドヌクレアーゼはＮｂ．ＢｂｖＣＩであり、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩは０．１ユニット／μＬの濃度で存在した。反応で使われたポリメラーゼはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントであり、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントは０．０８ユニット／μＬの濃度で存在した。ｄＮＴＰは、各々２００μＭの最終濃度で存在した。

ＳＣ ＤＮＡは、２００ｎＭの最終濃度で反応に存在した。標的核酸は、ヒトマイクロＲＮＡ ２４−３ｐ（配列番号５）であり、１ｎＭまたは１００ｐＭのいずれかの濃度で存在した。１００ｎＭの最終濃度で存在する分子ビーコンプローブを用いてシグナルＤＮＡの生成を検出した。蛍光測定は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ リアルタイムＰＣＲシステムＣＦＸ ９６を用いて実行され、結果は図３に示される。図示されるように、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）とＳＣ ＤＮＡの配列（Ｃ）の間に位置するＰＤＳ配列の存在がシグナルＤＮＡの増幅を加速する。

［実施例２］
以下の例は、ＳＣ ＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）と標的核酸と相補的な配列（Ｃ）の間に位置するＰＤＳ配列の存在が、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）のエンドヌクレアーゼニッキングを加速することを示す。

反応は、次のＳＣ ＤＮＡ、

を用いて実行された。

以下を含む、多数の異なる標的核酸が用いられた。

第１の重合反応は、最終濃度が１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ７．９のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）緩衝液２を含む５０μＬの反応体積で３７℃で実行された。反応で使われたポリメラーゼはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントであり、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントは０．０８ユニット／μＬの濃度で存在した。ｄＮＴＰは、各々２００μＭの最終濃度で存在した。配列変換ＤＮＡは、２００ｎＭで存在した。標的核酸（ＤＮＡ ＃１８、ＲＮＡ ＃６、７または８）は、２００ｎＭで存在した。重合反応は、３７℃で１０分間インキュベートされ、続いて８０℃で２０分間のインキュベート後、重合反応は４℃へ移された。

次いで１２．５ｕＬの上記重合反応は、エンドヌクレアーゼ反応に移された。エンドヌクレアーゼ反応は、最終濃度が１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ７．９のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）緩衝液２を含む２５μＬの反応体積において３７℃で実行された。反応で使われたニッキングエンドヌクレアーゼはＮｂ．ＢｂｖＣＩであり、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩは０．１ユニット／μＬの濃度で存在した。反応は、３７℃で０および５分間インキュベートされた。反応は５ｕＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加によって停止され、続いて９５℃でインキュベートされた。分子ビーコンプローブを用いてシグナルＤＮＡの生成を検出し、反応生成物は、１２％のＴＢＥ−ＰＡＧＥで視覚化された（図４参照（矢印はＮｂ．ＢｂｖＣＩエンドヌクレアーゼニッキングから生成するスモールフラグメントの位置を示す。））。図示の通り、ＲＮＡ ＃６が用いられた場合、短いフラグメントが生成されなかった。このことは、ＳＣ ＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）および標的核酸と相補的な配列（Ｃ）の間のＰＤＳ配列の存在が、エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂ）のエンドヌクレアーゼニッキングを加速することを示す。

応用例は特定の態様および実施形態に関して記載されているが、本明細書で提供された本開示に変更がなされてよいことは、当業者によって理解され、均等物は本開示の範囲を逸脱しない範囲で置き換えられてよい。したがって、応用例は開示された特定の態様および実施形態に限定されるべきではないが、添付の特許請求の範囲内に収まるすべての態様および実施形態を含むように理解され、認められなければならない。

明細書の補正
１頁の表題の直後に、次の段落を挿入してください。
本出願は、２０１４年１０月１４日に出願した米国仮出願第６２／０６３，６６６号および２０１４年１２月３０日に出願した米国仮出願第６２／０９８，０６６号の優先権の利益を主張するものである。米国仮出願の両方は、それらの内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

Claims (37)

1. 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
   ５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、
   ５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同のシグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同の配列を含む第２のオリゴヌクレオチド、
   ポリメラーゼ、ならびに
   ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
   と試料を接触させることを含む方法。
2. 第１のオリゴヌクレオチドが３から２０の塩基を含むポリＤＮＡスペーサー配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. 第２のオリゴヌクレオチドが３から２０の塩基を含むポリＤＮＡスペーサー配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. 実質的に定温で実行される、請求項１に記載の方法。
5. 約２０℃から約４２℃の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
6. ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
7. ポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損または両方である、請求項１に記載の方法。
8. ポリメラーゼが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
9. エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩおよびＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される酵素である、請求項１に記載の方法。
10. 標的がマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
11. 標的核酸が感染性因子に由来する、請求項１に記載の方法。
12. 試料中の標的核酸を検出する組成物であって、
    ５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、
    ５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同のシグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同の配列を含む第２のオリゴヌクレオチド
    を含む組成物。
13. 第１のオリゴヌクレオチドが３から２０の塩基を含むポリＤＮＡスペーサー配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 第２のオリゴヌクレオチドが３から２０の塩基を含むポリＤＮＡスペーサー配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
15. ポリメラーゼおよびニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
16. ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１５に記載の組成物。
17. ポリメラーゼが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１５に記載の組成物。
18. エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩおよびＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される酵素である、請求項１５に記載の組成物。
19. 標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項１２に記載の組成物。
20. 標的核酸が感染性因子に由来する、請求項１２に記載の組成物。
21. 試料中の標的核酸を検出するキットであって、
    ５’から３’方向に、シグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および標的核酸の３’末端と相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、ならびに
    ５’から３’方向に、第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同のシグナルＤＮＡ生成配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー、および第１のオリゴヌクレオチドのシグナルＤＮＡ生成配列に相同の配列を含む第２のオリゴヌクレオチド
    を含むキット。
22. キットがポリメラーゼをさらに含む、請求項２１に記載のキット。
23. キットがニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項２１または２２のいずれかに記載のキット。
24. 第１のオリゴヌクレオチドのポリＤＮＡスペーサーが３から２０の塩基を含む、請求項２１に記載のキット。
25. 第２のオリゴヌクレオチドのポリＤＮＡスペーサーが３から２０の塩基を含む、請求項２１に記載のキット。
26. ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項２２に記載のキット。
27. ポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損または両方である、請求項２２に記載のキット。
28. ポリメラーゼが、Ｅ．コリ由来のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２２に記載のキット。
29. エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩおよびＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される酵素である、請求項２３に記載のキット。
30. 標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項２１に記載のキット。
31. 標的核酸が感染性因子に由来する、請求項２１に記載のキット。
32. 使用説明書をさらに含む、請求項２１から３２のいずれかに記載のキット。
33. ５’から３’方向に、既知のシグナルＤＮＡ配列と相補的な第１の配列、エンドヌクレアーゼ認識部位、ポリＤＮＡスペーサー配列、および第１の配列と同一の既知のシグナルＤＮＡ配列と相補的な第２の配列を含む、化学的修飾されたオリゴヌクレオチド。
34. 第２のオリゴヌクレオチドがミニサークルＤＮＡであり、シグナルＤＮＡがミニサークルＤＮＡと結合しローリングサークル増幅を引き起こす、請求項１に記載の方法。
35. 第２のオリゴヌクレオチドがミニサークルＤＮＡである、請求項１２に記載の組成物。
36. 少なくとも１つのシグナル生成配列によって生成される少なくとも１つのシグナルＤＮＡの有無を検出することをさらに含む、請求項１から１１または３４のいずれかに記載の方法。
37. 少なくとも１つのシグナルＤＮＡの存在が検出されると、試料中の標的核酸の存在が示される、請求項３６に記載の方法。

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