JP2017529328A - タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲル - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年8月12日に出願された米国特許仮出願第62/036,431号および2015年3月25日に出願された米国特許仮出願第62/138,110号の優先権を主張するものであり、これらはどちらもすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立科学財団(National Science Foundation)によって与えられた、契約番号CHE1112550の下での連邦政府の支援を得て為された。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲルを作製するための組成物および方法を開示する。具体的には、組成物は、架橋剤を添加した新規トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーを含み、ここでホモポリマーまたはコポリマーは、タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲルを形成する。
本発明の材料および方法を説明する前に、本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定されることも理解されるべきである。
組成物および関連する方法を説明する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定される。
本発明
[タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲル]
AIBN(5.28mg、3.22×10-2mmol)およびスチレニルエーテルトレハロースモノマー(634mg、1.38mmol)をDMF(2.31mL)とH2O(4.61mL)の混合物に溶解した。3サイクルの凍結脱気(freeze−pump−thaw)によって酸素を除去し、75℃で重合を開始させた。8.5時間後に反応物を液体窒素に浸漬することによって重合を停止させた。ポリマーをH2Oに対する透析(MWCO 3,500)によって精製し、Mn=7.0kDaおよびD=1.28(ヒドロゲル溶解実験用)ならびにMn=7.6kDaおよびD=1.33(他のすべての実験用)を有するポリマーを得た。1H NMR(500 MHz in D2O)δ:7.01,6.45,5.05,3.81,3.71,3.59,3.48,3.36,1.50.
AIBN(5.28mg、3.22×10-2 mmol)およびSET(634mg、1.38mmol)をDMF(2.31mL)とH2O(4.61mL)の混合物に溶解した。3サイクルの凍結脱気によって酸素を除去し、75℃で重合を開始させた。8.5時間後に反応物を液体窒素に浸漬することによって重合を停止させた。ポリマーをH2Oに対する透析(MWCO 3,500)によって精製し、7.0kDaのMnおよび1.28のPDIを有するポリマーを得た。1H NMR(500 MHz in D2O)δ:7.01,6.45,5.05,3.81,3.71,3.59,3.48,3.36,1.50.
8アームPEGアミン(400mg、10kDa、4×10-2mmol)および4−ホルミルボロン酸(96mg、6.40×10-1mmol)をMeOH 2.8mLに溶解した。NaBH3CN(18.85mg、3.00×10-1mmol)を添加し、反応物を25℃で撹拌した。5日後、反応溶液をMeOHに対して2日間およびH2Oに対して2日間透析することによって精製した。試料を凍結乾燥し、1H−NMR分析はPEG中のアミン末端基の100%修飾を示した。1H NMR(500 MHz in D2O)δ:7.75(16H),7.41(16H),4.14,3.69,3.18(908H).IR:δ=3390,2869,1699,1456,1410,1348,1297,1247,1079,1041,986,947,839cm-1.
ポリ(SET)および8アームPEGボロン酸(10kDa)をpH7.4のD−PBS緩衝液中に溶解し、それぞれ500mg/mLおよび200mg/mLの濃度にした。ポリ(SET)溶液3μLおよび8アームPEGアミン溶液20.5μLを混合して(1:1=トレハロース単位:ボロン酸単位)、ヒドロゲルを生じさせた。
15の別々に調製したポリ(SET)−ボロン酸ヒドロゲルをpH7.4のD−PBS緩衝液150μL中に1時間浸漬した。ヒドロゲルを15分間空気乾燥し、それらの重量を測定した。次にヒドロゲルの各々をpH7.4のD−PBS緩衝液、pH7.4のD−PBS緩衝液中の1mg/mL、5mg/mL、10mg/mLまたは20mg/mLグルコース溶液のいずれか150μLに浸漬した(各条件につき3つのヒドロゲル)。各時点を、15分間ヒドロゲルを空気乾燥することによって収集し、乾燥ヒドロゲルの重さを量った。
トレハロースポリマー(500mg/mL)およびPEG架橋剤(200mg/mL)原液をD−PBS、pH7.4中で調製した。トレハロースポリマー原液3μLおよびPEG架橋剤原液20.5μLを添加し、室温で30分間インキュベートすることによってゲルを調製した。ゲルをD−PBS中で1時間水和し、その後0、1、5、10または20mg/mLグルコースを含有するD−PBS 5mLに移した。各時点で、ゲルの重さを量り、その後それぞれの緩衝液中に戻した。
インスリン(0.65mg、0.112μmol)およびフルオレセインイソチオシアネート異性体I(FITC)(3.48mg、8.94μmol)を1M重炭酸ナトリウム緩衝液、pH8.3 0.33mL中に溶解することによってインスリンをFITCで標識した。混合物を2時間撹拌し、3,000Daの分子量カットオフ値(MWCO)を有するCentriprep(商標)チューブを使用して膜を介した反復遠心分離によって遊離FITCを除去した。典型的な標識の程度は、紫外吸光度によって測定した場合(Schreiber and Haimovich,1983)インスリンにつき約0.7FITCであった。
FITC標識インスリン(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS、pH7.4またはpH8)中13.22mg/mL)をトレハロースポリマーに添加し、500mg/mLのポリマー濃度を作製した。PEG架橋剤を200mg/mL濃度でD−PBSに溶解した。次に、トレハロースポリマーおよびFITC標識インスリン原液1μLならびにPEG架橋剤原液6.84μLをEppendorf Lo−Bind(登録商標)遠心分離管に添加した。遠心分離管をThermoShaker(Allsheng Instruments,China)にて1,500rpm、21℃で1時間撹拌した。ゲルを、D−PBS 1mLを満たした24ウェルプレートに移し、30分間放置して水和させた。次に、タンパク質吸着を防ぐためにD−PBS中1%wt/volウシ血清アルブミン(BSA)でブロックしておいた、0、5または10mg/mLグルコースを含有するD−PBS 0.3mLを満たした96ウェルプレートにゲルを移した。各時点で、すべての溶液をアリコートに分け、ゲルを含有するウェルには直ちに同じ緩衝液0.3mLを再び満たした。最後の時点後、ウェルを、100mg/mLグルコースを含有するD−PBS 0.3mLで処理し、37℃で5分間インキュベートして、ゲルを完全に溶解した。次に測定のためにすべての溶液を移し、ゲル溶解を測定した後、各時点のアリコートの蛍光および残留インスリン溶液を回収した。
最初にインスリンを1mg/mL濃度でD−PBS、pH7.4に溶解すること、次に3000Daの分子量カットオフ値(MWCO)を有するCentriprep(商標)チューブを使用して膜を介した遠心分離によって濃縮することによって、インスリン原液を調製した。タンパク質濃度を280nmでの紫外吸光度によって定量化し、試料中の最終インスリン濃度が0.5mg/mLになるように溶液を3.93mg/mLに希釈した。トレハロースポリマー原液を、インスリン原液にトレハロースポリマーを500mg/mL濃度で溶解することによって調製した。PEG架橋剤をD−PBS中に200mg/mL濃度で溶解した。インスリンまたはトレハロースポリマー原液1μLおよびPEG架橋剤原液またはD−PBS 6.84μLをEppendorf Lo−Bind(登録商標)遠心分離管に添加し、混合を助けるために管をThermoShakerにて1,500rpm、21℃で1時間撹拌することによって、ゲルを調製した。試料を90℃で30分間加熱し、対照を4℃に保持した。すべての試料を、ヒドロゲルを溶解するために100mg/mLグルコース1mLで処理した。インスリンの量をELISAによって検定し、ELISAは製造者の指示に従って実施した。簡単に説明すると、希釈した試料25μLを、捕捉抗体で予備被覆したウェルに添加した。検出抗体を含有する緩衝液を添加し(100μL)、プレートをロッカー上で室温にて1時間インキュベートした。ELISA、3−4のために使用したホースラディッシュペルオキシダーゼ上の糖部分に残留ボロン酸が結合するのを防ぐため、インキュベーション後にHClで酸性にした脱イオン水(pH=3.5)350μLでウェルを5回洗浄し、次に洗浄緩衝液350μLで6回洗浄した。これらの付加的な洗浄段階は、対照によって確認されたようにELISAの結果に影響を及ぼさない。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)溶液を添加し(200μL)、プレートを室温で15分間インキュベートした後、停止液50μLを添加した。検出されたインスリンの量を、製造者によって供給された標準品と比較して450nmの吸光度によって定量化した。
標本の不等分散を仮定する片側スチューデントt検定を使用して、実験群間の差を検定した。p<0.05の場合、結果を有意に異なると見なした。
現在まで、トレハロースとボロン酸の結合を使用したヒドロゲルはまだ報告されていない。上記データは、我々が以前に報告したトレハロースポリマーとフェニルボロン酸官能基化マルチアームPEGとの間のボロン酸エステル結合を利用することによってヒドロゲルを調製できることを示唆する。ゲル化は生理的条件下で(pH7.4)敏速であった。さらに、生じたヒドロゲルはグルコース応答性であった。グルコースの添加は、フェニルボロン酸に対するグルコースのより高い結合親和性に起因するグルコース−ボロン酸複合体の競合的置換により、トレハロース(ポリマー)とボロン酸(架橋剤)との間のボロン酸エステル結合の脱架橋をもたらした。予想されたように、より高いグルコース濃度の緩衝液はヒドロゲルの溶解速度を増大させた。これは、これらのゲルがインスリン送達適用に利用できることを示唆する。実際に、今後の研究はこれらのゲルからのインスリンの安定化および放出の検討を含む。
本明細書において、我々は、トレハロース側鎖ポリマーおよび8アームボロン酸官能基化PEGを使用したヒドロゲルの調製を説明した。トレハロース単位対ボロン酸単位の1:1比率で、ヒドロゲルが3分以内に形成された。様々な条件下でのインキュベーション後にヒドロゲルの、重量喪失を測定することにより、予想されたようにヒドロゲルの変形が認められた。グルコースの濃度が高いほど、ヒドロゲルがより速く溶解した。我々は、トレハロースポリマーを使用前の貯蔵の間のインスリン安定剤として使用するという利点と共に、このトレハロースベースのヒドロゲルが有効なインビボでのグルコース応答性インスリン送達に使用できると期待する。
我々のグループは以前に、トレハロースグリコポリマーがコンジュゲートまたは賦形剤のいずれかとして凍結乾燥および熱に対するタンパク質の有効な安定剤であることを示した(Lee et al.,2013;Mancini et al.,2012)。我々は、PolyProtek(商標)という名のトレハロースグリコポリマーが、ボロン酸架橋剤と複合体化することによってインスリンを捕捉するのに使用でき、および生じたヒドロゲルはまた、環境ストレッサーに対してインスリンを安定化するという仮説を立てた。この仮説を試験するため、ボロン酸架橋剤を、4−ホルミルフェニルボロン酸および8アームPEGアミンを出発物質として使用して、還元的アミノ化を介して合成した(スキーム1)。フェニルボロン酸でのアミン末端基の完全な修飾を1H NMR分光法によって確認した(図1、下)。次に、8アームPEGボロン酸をポリ(スチレニルエーテルトレハロース)(ポリSET)と、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中でボロン酸対トレハロース単位の1:1モル比で混合することによってトレハロースヒドロゲルを調製した(スキーム2)。2つの成分の溶液を混合した後、即時にゲル化が生じた(ヒドロゲルの画像に関しては図2)。
[pH応答性トレハロースヒドロゲル]
火炎乾燥した反応フラスコに、トレハロース(398mg、1.16mmol)およびDMF(4mL)を添加した。p−TsOH(7.08mg、3.72×10-2mmol)を添加し、反応物を10分間撹拌して、100℃の油浴に浸漬した。反応物に4−ビニルベンズアルデヒドジエチルアセタール(600mg、2.91mmol)を緩やかに添加し、反応物を100℃で2時間撹拌した。反応が完了した後、DMFの80%を減圧下で除去し、残りの溶液をベンゼン中で沈殿させた。沈殿物を飽和NaHCO3でろ過し、H2Oで十分に洗浄した。ろ過ケークを収集し、EtOH:H2O=2:1中で再結晶化させて、白色粉末478.5mgを72%収率で得た。1H NMR(500 MHz in D6DMSO)δ:7.48−7.44(m,8H),6.80−6.74(m,2H),5.84−5.81(d,J=18.15Hz,2H),5.56(s,2H),5.29−5.27(d,J=10.37 Hz,2H),5.10−5.09(m,2H),4.19−4.16(m,2H),4.00−3.97(m,2H),3.93−3.89(m,2H),3.72−3.68(t,J=10.81Hz,2H),3.58−3.53(m,2H),3.47−3.44(m,4H),3.32−3.30(m,2H).ESI−MS(±1.0)実測値(予測値):H+ 571.22(571.22).
SAT(200mg、4.38×10-1mmol)、ビス−SAT(13.16mg、2.31×10-2mmol)およびAIBN(0.72mg、4.38×10-3mmol)をDMF 1mLに溶解した。酸素を3回の凍結脱気サイクルによって除去し、反応フラスコを90℃油浴に浸漬することによって重合を開始させた。30分以内にゲルが形成し始め、6時間後に反応フラスコを液体窒素に浸漬することによって反応を停止させた。ゲルをH2OおよびMeOHで洗浄して未反応モノマーおよび架橋剤を除去した。
SAT(20mg、4.38×10-2mmol)およびビス−SAT(0.5mg、8.76×10-4mmol)をそれぞれH2O(150μL)およびDMF(50μL)に別々に溶解した。溶液に、TEMED(2.25×10-1μL、1.5×10-3mmol)およびAPS(2.28×10-3mg/mLで50μL、5.00×10-4mmol)を添加してゲル化を開始させた。2時間でヒドロゲルが形成され、生じたゲルをH2OおよびMeOHで洗浄することによって精製した。
SET(40.49mg、8.82×10-2mmol)、ビス−SAT(5mg、8.76×10-3mmol)およびAIBN(0.29mg、1.77×10-3mmol)をDMF 0.11mLおよびH2O 0.22mLに溶解した。3サイクルの凍結脱気後、ゲル化を80℃で開始させ、4時間後に液体窒素で冷却することによってゲル化を停止させた。生じたゲルをH2OおよびMeOHで洗浄して精製した。
ポリ(SAT)50mg(33,700g/mol、1.48×10-3mmol)をpH3、pH4、pH5および10%TFA水溶液に溶解した。反応物を25℃で撹拌し、H2O(MWCO 3,500g/mol)に対して3日間透析して、凍結乾燥した。
3つのSETヒドロゲル(各々0.3mg)にpH7.4 D−PBS、pH5 PBSおよび10%TFA溶液500μLを添加した。各々の試料の溶解度を経時的に観測した。
[酵素の安定化のためのトレハロースヒドロゲル]
モノマーおよび架橋剤のためのワンポット反応を、以前に報告された文献の手順(Teramoto and Shibata,2004)を修正することによって実施した。水酸化ナトリウム(NaOH、4.44g、1.11×10-1mol)をジメチルスルホキシド(DMSO、96mL)に添加した。5分間撹拌した後、トレハロース(4.86g、1.42×10-2mol)を反応物に添加した。すべてのトレハロースが溶解した後、4−ビニルベンジルクロリド(0.4mL、2.84×10-3mol)を反応物に緩やかに添加し、25℃で24時間撹拌した。粗生成物を、次に、DCM 2Lに沈殿させ、高修飾トレハロースを除去した。生じた固体を減圧下で乾燥し、さらに精製することなくゲル化に使用した。
先のウィリアムソンエーテル化反応からの粗混合物(3.23g)をH2O(3.23mL)に溶解し、その後テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、16μL、1.07×10-4mol)で処理した。次に、過硫酸アンモニウム(APS、8.07mg、3.54×10-5mol)の10mg/mL水性原液807μLを添加してゲル化を開始させた。溶液は25℃で10分以内にゲル化し始めた。LCMSを用いて、非修飾トレハロースと比べた一置換トレハロースの相対量をゲル化前とゲル化後で比較することにより、変換の度合いを定量化した。LCMS分析は、すべての架橋剤が24時間後に反応していたことを示した。ゲル化後、Soxhlet抽出器を用いてゲルをH2Oで3日間洗浄して、未反応モノマーを除去した。ヒドロゲルを凍結乾燥し、その後微粉末に摩砕した。種々の濃度のフィターゼ溶液10μLを各々の乾燥ゲルに添加し、1:1、1:10および1:40重量当量のフィターゼ:ヒドロゲル比を作製した。ゲルをフィターゼ溶液と共に4℃で24時間インキュベートし、凍結乾燥して、熱負荷試験における検査のための白色粉末を得た。
フィターゼ(2mg、3.57×10-2μmol)およびFITC(0.3mg、7.71×10-1μmol)を50mMホウ酸緩衝液、pH8.5(1mL)に溶解した。混合物を室温で1時間磁気撹拌した。0.5mL遠心分離ろ過チューブを使用して、FITCがろ液中で紫外−可視分光法によって検出されなくなるまで、過剰のFITCを、3,000Da MWCO膜を介した反復遠心分離によって除去した。標識の程度は、紫外吸光度によって測定した場合フィターゼにつき0.28FITCであった(Schreiber and Haimovich,1983)。
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0、10μL)中のFITC標識フィターゼ(74mg/mL)をトレハロースヒドロゲル4mgに添加した。混合物を4℃で24時間インキュベートし、その後凍結乾燥した。ゲルに緩衝液1000μLを添加し、ヒドロゲルからのフィターゼの受動拡散を開始させた。それぞれの時点でアリコート(200μL)を採取し、試料に新鮮緩衝液を直ちに補充した。各時点のアリコートの濃度を、FITC標識フィターゼ検量線を用いて分光蛍光計で測定した蛍光から計算した。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)原液をH2O中75μg/mL濃度で調製した。原液(66.6μL)を乾燥スチレニルエーテルトレハロースヒドロゲル(SETヒドロゲル)に添加し、1:10または1:50のHRP:SETヒドロゲル重量当量試料を作製した。ヒドロゲルを含まない非加熱対照試料は、活性アッセイまで4℃で保存した。HRP−ヒドロゲル混合物を、ヒドロゲルが完全に水和されるまで約2時間4℃でインキュベートした。ヒドロゲルを、MSC−100 Thermo−shaker(Hangzhou Allsheng Instruments,Co.,Ltd.,China)において500rpmで振とうしながら70℃で30分間加熱した。その後直ちに試料を冷却し、4℃の冷蔵庫で一晩インキュベートした。活性アッセイのために、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を基質として使用し、1M H2SO4溶液を停止液として使用した。450nmの吸光度から活性を測定した。試験を合計12回実施した(n=12)。
pH7.4 D−PBS中のホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)溶液(1mg/mL)100μLに、alexa Fluor(登録商標)488 TFPエステル(AF488、1M重炭酸ナトリウム溶液中10μL)を添加した。反応物を25℃で30分間インキュベートし、centriprepチューブ(MWCO 3,000g/mol)を使用して精製した。精製後のHRP−AF488の標識の程度は5.24であった。上記から調製したSETヒドロゲルを4℃で12時間HRP−AF488 100μL中に浸漬し、H2Oで手早く洗浄した後、共焦点顕微鏡画像を撮影した。
対照および熱処理したヒドロゲル(10μL)を、最初に0.2Mクエン酸ナトリウムpH5.5緩衝液10mLに希釈し、希釈試料の0.5mLアリコートを4つの反応チューブ(ブランク1および試料3)の各々に移した。すべての試料チューブに、1%フィチン酸溶液(0.2Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.5)0.5mLを添加し、チューブを37℃で15分間インキュベートした。その後15%トリクロロ酢酸1.0mlの添加によって反応をクエンチングし、フィチン酸0.5mLをブランクチューブに添加した。試料(30μL)を蒸留水で10倍希釈し、希釈溶液(150μL)を、マイクロタイタープレート中の2.5%モリブデン酸アンモニウム:10%硫酸:10%アスコルビン酸の1:3:1溶液150μLで処理した。プレートを50℃水浴中で15分間インキュベートし、4℃で15分間冷却して、個々のウェルの820nm吸光度を測定した。フィターゼ活性(FTU)は、37℃でpH5.5緩衝液中の1%フィチン酸からの1分当たり1.0マイクロモルの無機リン酸塩の放出を触媒する酵素の量と定義される。
標本の不等分散を仮定する片側スチューデントt検定を使用した。p<0.05の場合、結果を有意に異なると見なした。
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中のFITC標識フィターゼ(30mg/mL)をトレハロースヒドロゲル0.5mgに添加し、ゲルを完全に水和させた(ヒドロゲル1mgにつき水25μL)。混合物を室温で12時間インキュベートし、その後緩衝液200μLを添加して、ヒドロゲルからのフィターゼの受動拡散を開始させた。溶液の半分を様々な時点で除去し、新鮮緩衝液を添加した。各時点のアリコートの濃度を、FITC標識フィターゼ検量線を用いて分光蛍光計で測定した蛍光から計算した。
[粗SETの合成]
酵素は、高い選択性で様々な反応を触媒することができ、多くの重要な生物学的過程に関与する。しかし、高温に対する酵素の一般的な不安定性はしばしばそれらの適用を制限する。これに対処するため、我々は、最小限の精製手順を用いて市販の出発物質から2段階でトレハロースベースのヒドロゲルを合成した。単官能性および多官能性トレハロースモノマーをレドックス開始ラジカル重合によって架橋してヒドロゲルを形成した。動物用原料(animal feedstock)中で利用される重要な酵素であるフィターゼを用いて、熱に対してタンパク質を安定化するトレハロースヒドロゲルの有効性を検討した。ヒドロゲルへのフィターゼ溶液の添加は、共焦点顕微鏡検査によって確認されたように酵素の内在化を生じさせた。ヒドロゲル中のフィターゼは、90℃での加熱後、ヒドロゲルが存在しない場合の39%の活性と比較して100%の活性を保持した。酵素はまた、ヒドロゲルから回収することもできた。本明細書で報告したトレハロースヒドロゲル合成は、多種多様な酵素の熱安定化のために容易に拡大可能なはずである。
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Claims (27)
- トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、
a)トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを形成する段階;
b)架橋剤を調製する段階;および
c)前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを前記架橋剤と反応させ、前記トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階
を含む方法。 - 前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーが、
R5−[R1R2C−CR3R4]n−R6
[式中、R1〜R4は、水素または少なくとも1個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、かつ、R1〜R4の少なくとも1つは、−L−トレハロース[ここでLは、トレハロースのヒドロキシル基(−OH)の少なくとも1つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である]を含む側鎖であり、ならびに
R5およびR6は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、−C(CN)(アルキル)2、−S2C−S−アルキル、−C(CO)(アルキル)−(OCH2CH2)n−COO−CH2CH2−CO−アルキル(n=1〜10)および生体分子から成る群より独立して選択される]
の構造を有する、請求項1に記載の方法。 - 前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーが、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール(PEG)誘導体のいずれかである、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋剤がボロン酸ベースの架橋剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋剤が、構造:
- 前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーがポリエチレングリコール(PEG)誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記架橋剤対前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーの比率が1:1である、請求項1に記載の方法。
- 前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーと前記架橋剤との前記反応が、pH7.4でおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中で起こる、請求項1に記載の方法。
- タンパク質を安定化し、送達する方法であって、
a)請求項1から8のいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階;
b)ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかに、前記トレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する段階;および
c)前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの前記複合体に糖溶液を添加するかまたは溶液のpHを低下させて、前記複合体から前記タンパク質を放出させる段階
を含む方法。 - トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間にタンパク質を添加して、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する、請求項9に記載の方法。
- 前記タンパク質がインスリンである、請求項9に記載の方法。
- 前記糖溶液がグルコース溶液である、請求項9に記載の方法。
- トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、
a)トレハロース架橋剤を調製する段階;
b)トレハロースベースのモノマーを調製する段階;および
c)前記トレハロース架橋剤を前記トレハロースベースのモノマーと反応させ、前記トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階
を含む方法。 - 前記トレハロース架橋剤を、前記トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ化学物質を用いて合成する、請求項13に記載の方法。
- 前記トレハロース架橋剤を、前記トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ段階の間に合成する、請求項13に記載の方法。
- 前記段階b)の反応が、レドックス開始剤によって開始されるフリーラジカル重合である、請求項13に記載の方法。
- 前記トレハロース架橋剤が、構造:
- 前記トレハロースベースのモノマーが、構造:
- 前記トレハロース架橋剤が、構造:
- 前記トレハロースベースのモノマーが、構造:
- 前記トレハロースベースのモノマーを精製するHPLC精製工程が必要ない、請求項13に記載の方法。
- タンパク質を安定化する方法であって、
a)請求項13から21のいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階;および
b)ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかに前記トレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する段階
を含み、この段階で前記タンパク質が安定化される方法。 - 前記タンパク質が酵素である、請求項22に記載の方法。
- 前記タンパク質が、熱に暴露された場合に安定化される、請求項22に記載の方法。
- 前記タンパク質が4℃より高い温度で安定化される、請求項24に記載の方法。
- 前記タンパク質が70℃〜90℃で安定化される、請求項25に記載の方法。
- 前記タンパク質が、水で希釈するかまたはpHを低下させることによって前記タンパク質と前記トレハロースベースヒドロゲルとの前記複合体から放出される、請求項22に記載の方法。
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