JP2017529099A - 生存プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの改善された生産方法、及び長い保存可能期間を有する生存プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセル - Google Patents

Abstract

本発明は、非被覆プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの生産方法を提供し、その方法は、非被覆プロバイオティック細菌を少なくとも１つの油と５から１５℃の範囲の温度で緩やかに混合して、軟質ゲルカプセル充填物質を得ること、１１から２８℃の範囲の融点を有するゼラチンから作られた軟質ゲルカプセル中に充填物質を封入すること、及び２５℃以下の温度で０．２５以下の水分活性となるまで、１つ以上の工程で軟質ゲルカプセルを乾燥することを含み、並びにこの方法によって生産された軟質ゲルカプセルも提供する。本発明はさらに、乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルも提供し、ここで、軟質ゲルカプセルは、２５℃で２４ヶ月間の保存後に、少なくともＥ＋０９個の生存細菌を含み、例えば、２５℃で１２ヶ月間の保存後に少なくとも２Ｅ＋０９個の生存細菌を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの分野、及びプロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの改善された製造方法に関する。

プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルにおいて、製造時又は保存期間終了時のプロバイオティック細菌の数に言及することは一般的に行われる。保存可能期間の長い生存プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを生産するための様々な試みが、例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２／０２１４３２号にまとめられているように、先行技術で報告されてきた。

国際公開第２０１２／０２１４３２号には、室温で少なくとも２４ヶ月間安定であるマイクロ封入されたプロバイオティック細菌を含有する軟質ゲルカプセルの製造方法が記載されている。このソリューションは、３５℃から７５℃の融点を有する少なくとも１つの植物性脂質を含んでいる少なくとも１つの被覆を有するプロバイオティック細菌を提供することである。

現在市販されている製品の試験から、分析された製品において全般的に、水分活性レベルが比較的高く、０．３を超えることが示された。多くの場合、アルミニウム／ＰＶＣブリスターを例とする、適用された包装材系の水分バリア性は低く、このことが、活性乾燥剤が存在していないことと組み合わされて、特定の経過時間後に製品中の生存細菌の数に有害な影響を及ぼしている。

カナダ特許第２６７５８９２号には、その内壁に吸収剤及び少なくとも１つのチャネル形成剤（channel former）がその領域の少なくとも一部分にわたって埋設された再封可能容器中に軟質ゲルカプセルを包装することが記載されている。軟質ゲルカプセル中に存在することが好ましい感湿性化合物の例は、ビタミン及びプロバイオティック培養物である。カナダ特許第２６７５８９２号の例は、ビタミンに関するデータしか示していない。

カナダ特許第２６７５８９２号 国際公開第２０１２／０２１４３２号

Karim A.A. and Bhat, Rajeev, "Fish gelatin: properties, challenges, and prospects as an alternative to mammalian gelatins", Food Hydrocolloids 23 (2009) 563-576 Lachmann, L., et al., eds. Lea & Febiger, Philadelphia, PA, pp. 398-412 (1986) Podczeck, Fridrun and Jones, Brian E., Pharmaceutical Capsules, 2004, pp. 195-204 Singh et al., "Microencapsulation: A promising technique for controlled drug delivery", Res Pharm Sci. 2010 Jul-Dec; 5(2): 65-77

上述の文書のいずれも、生存プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの製造方法を記載も提示もしておらず、本発明の生存プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルも提示していない。

本発明は、生産方法を最適化して生産の過程での生存細胞の減少を最小限に抑えることによって改善された、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの製造及び保存方法に関する。この方法は、棚保存中の水分活性を注意深く制御して、２５℃で２４ヶ月間の保存後に少なくとも１Ｅ＋０９個の生存細菌を含む軟質ゲルカプセルを提供することにより、保存中の生存細胞の減少を低減することでさらに改善することができる。

プロバイオティック細菌は、生きた微生物であり、このことが、最終剤形の製造及び製剤の過程での課題であり得る。プロバイオティック細菌は、温度、水分含有量、及び製剤マトリックス中の他の成分に対して特に感受性を有する。

低充填温度、並びにそれに応じて従来よりも低いゲル化点及び融点を有するゼラチンを用いることにより、生産の過程でのプロバイオティック細菌の生存が確保される。ウェッジ温度（wedge temperature）（充填、及びシール補助のため）及びスプレダーボックス温度（spreader box temperature）（ゼラチンをダイロールへの投入に適するシートに成形するため）は、状況に応じて調節される必要がある。機械的ストレスは回避される必要がある。

さらに、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの包装は、保存中の水分活性を注意深く制御することによって最適化されるべきである。
プロバイオティック細菌の生存率が、低水分活性によって改善されることは、当業者に公知である。しかし、軟質ゲルカプセルは、水分活性が低すぎると、脆弱となり、漏れを起こす。従って、最適な水分活性は、プロバイオティック細菌の生存率と無傷の軟質ゲルカプセルとの間の微妙なバランスである。２５℃などの室温での保存の場合、好ましくは、水分活性が０．２以下であるべきであることが見出された。

図１は、トライアル２で生産した軟質ゲルカプセルを、２５℃／６０％ＲＨで１８ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。軟質ゲルカプセルは、３つの異なる包装材系に梱包されている。（■）アルミニウム箔＋シリケートバッグ、◇ブリスターカード、（●）箱＋シリケートバッグ。 図２は、トライアル２で生産した軟質ゲルカプセルを、８〜１２℃で１８ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。軟質ゲルカプセルは、３つの異なる包装材系に梱包されている。（■）アルミニウム箔＋シリケートバッグ、◇ブリスターカード、（●）箱＋シリケートバッグ。 図３は、トライアル４で生産した軟質ゲルカプセルを、模擬バルク包装材系に梱包し、５℃及び２５℃／６０％ＲＨで１２ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。（■）５℃及び（●）２５℃／６０％ＲＨ。 図４は、トライアル４で生産した軟質ゲルカプセルを、乾燥剤ライニング付きプラスチックバイアル中に梱包し、５℃、２５℃／６０％ＲＨ、及び３０℃／７５％ＲＨで１２ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。（■）５℃、（●）２５℃／６０％ＲＨ、及び◇３０℃／７５％ＲＨ。 図５は、トライアル４で生産した軟質ゲルカプセルを、模擬バルク包装材系に梱包し、５℃及び２５℃／６０％ＲＨで２４ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。（■）５℃及び（●）２５℃／６０％ＲＨ。 図６は、トライアル４で生産した軟質ゲルカプセルを、乾燥剤ライニング付きプラスチックバイアル中に梱包し、５℃、２５℃／６０％ＲＨ、及び３０℃／７５％ＲＨで２４ヶ月間まで保存した場合のＣＦＵ値を示す。（■）５℃、（●）２５℃／６０％ＲＨ、及び◇３０℃／７５％ＲＨ。

本発明は、非被覆プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの生産方法に関し、その方法は、非被覆プロバイオティック細菌を少なくとも１つの油と、５〜１５℃の温度範囲で混合して、充填物質を得ること、１１〜２８℃の範囲の融点を有するゼラチンから作られた軟質ゲルカプセル中に充填物質を封入すること、及び１つ以上の工程で、２５℃以下の温度において、軟質ゲルカプセルを０．２５以下の水分活性となるまで乾燥することを含む。

水分活性（ａ_w）は、指定された温度における、ある組成物中の水蒸気分圧を、同じ温度での標準状態の水蒸気分圧で除したものと定義される。従って、水分活性は、組成物中の自由（すなわち、結合されていない）水の量の尺度として機能する。水分活性（ａ_w）は、以下のように算出することができ：
ａ_W＝ｐ／ｐ₀
ここで、ｐは、組成物中の水蒸気分圧であり、ｐ₀は、同じ温度での純水の蒸気圧である。

別の選択肢として、水分活性は、以下のように算出することもでき：
ａ_W＝ｌ_wｘ_w
ここで、ｌ_wは、水の活量係数であり、ｘ_wは、水のモル分率である。

ａ_Wを定義する上記のこれら２つの計算は同等である。
水分活性は、例えばＲｏｔｒｏｎｉｃ Ｈｙｇｒｏｌａｂ機器を適用することにより、当業者に公知の方法によって測定することができる。

軟質ゲルカプセルは、充填物質を取り囲む軟質ゼラチン系シェルとして定義される。「充填物質」の用語は、シェル内に収められた物質全体を意味する。このため、充填物質は、例えば、均一溶液又は懸濁液でもあってよい。

栄養補助食品又は医薬品の送達において、軟質ゲルカプセルは広く使用されている。一般的な軟質ゲルカプセルは、主として、いわゆるロータリーダイ式封入プロセス（Rotary Die Encapsulation process）（Robert Pauli Schererによる発明）によって生産され、この場合、ゼラチン系シェル材料の２つのフラットな半固体リボンが、液体ゼラチン溶液から生産され、次に、この２つのリボンが、一式の回転するダイ（ダイロール）へと一緒に運ばれ、そこでゼラチンリボンが切断されると同時に、２つの部分が互いにシールされる。同時に、充填ウェッジを通して正確な量の液体充填物質が精密に添加されることで、ゼラチンリボンがダイポケット中に拡張され、その後、軟質ゲルカプセルの最終的なシールが行われる。シール後、依然として軟らか過ぎるカプセルは、最適な硬度のシェルを得るために、インラインプロセス中又はトレイ上のいずれかで、調整雰囲気下で乾燥される。

充填物質は、用いられる生産温度では液体であり、また生産条件下では安定である必要があるが、充填物質の組成についての柔軟性は広い。最も一般的で容易である充填物質は、魚油又は油キャリア中の脂溶性ビタミンなど、純粋な油系である。封入の容易性及び製品の安定性は、いずれの充填物質／シェル相互作用にも依存し、すなわち、水溶性である物質は、軟質ゲルシェル中に溶解された水分と相互作用を起こし、シェルの特性を変化させる。油キャリア中の固体の懸濁物も、軟質ゲルに組み込むことが可能であり、活性成分に加えて、均一な分散体を作製するためのキャリア／懸濁剤、油の酸化を防止するための酸化防止剤、及び賦形剤が、適切であると見なされる場合は添加されてよい。懸濁液中の固体の粒子サイズは小さいほうがよく、これは、封入の前に充填物質を粉砕することによって達成することができる。

乾燥プロバイオティック細菌などの特定量の固体が充填物質中に含まれ得るが、充填物質の粘度を、軟質ゲルの製造が可能であるレベルに維持するために、固体の量は、充填物質のおよそ３０％（ｗ／ｗ）まで、好ましくは１０〜２５％、例えば１５〜２０％に限定される。固体の量をさらに増加させる場合、それは、充填物質の量を、従ってカプセルのサイズを増加させることを意味する。これは、ある程度までしか行うことができず、そうでなければ、軟質ゲルカプセルの寸法が、人が飲み込むには非現実的に大きくなってしまう。一般的に、軟質ゲルカプセルは、０．０５〜２．０ｇ、好ましくは、０．５〜１．５ｇ、例えば０．７〜１．０ｇの範囲の重量を有する。最も多くの場合、軟質ゲルカプセルは、サイズで区別される（例：１０ｏｖａｌ、１２ｏｖａｌなど、又はｏｂｌｏｎｇ４、６など）。

従って、保存可能期間の長いプロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを得るためには、製造方法の過程において生存細菌の高度の生存率が確保される必要があり、及びこの高い量が、製造及び最初の１つ以上の乾燥工程の後、棚保存時の軟質ゲルカプセルの水分活性を注意深く制御することによって維持される必要がある。

本発明者らは、従来から用いられていた温度よりも低い充填物質の温度を用いることによって、製造方法を通してのプロバイオティック細菌の減少を最小限に抑える製造方法の実質的な改善が必要であることを認識した。充填物質の作製及び保存は、最も時間を要し、従って、プロバイオティック細菌が最も影響を受けやすい単位操作である。従来から用いられていた温度よりも低い充填温度を用いる場合、より低い充填物質温度に対応するために、方法の残りの部分におけるプロセス条件を調節することも必要であることが認識された。

最も重要なことには、用いられるゼラチンが、低充填物質温度に対応している必要がある。ゼラチンは、低温充填の間を通して充分に軟質状態であるように、従来から用いられるよりも低いゲル化点及び低い融点を有する必要がある。この軟質性は、最終的なダイロールの作用によって適切にシールするために重要であり、シールが不良であると、カプセルの漏れを招くことになる。

本発明者らは、魚ゼラチンが、一般的に、哺乳類ゼラチンよりも低い融点を有することを認識した（Karim et Bhat, 2009）。様々な公知の魚ゼラチンは、一般的に、８から２５℃のゲル化点及び１１〜２８℃の融点を有する。より低い値は、冷水魚ゼラチンに属し、これは、軟質ゲル製造のために充分なブルーム強度を有することはほとんどない。軟質ゲルの生産に一般的に用いられるブルーム強度は、典型的には、１５０〜２００ブルームであるが（Podczeck et Jones, 2004）、本発明者らの経験に基づくと、ブルーム強度は、１００〜３００ブルームであってよい。ブタ及びウシゼラチンに典型的なゲル化点は、２０〜２５℃の範囲であり、典型的な融点は、２８〜３１℃の範囲であり、ブタゼラチンが最も高いゲル化点及び融点を示す。魚ゼラチンは、一般的に、冷水魚（例えば、タラ、ハドック、メルルーサ、ポロック（pollock）、カスク（cusk）、ソール（sole）、フラウンダー（flounder）、ターボット（turbot）、ハリバット（halibut）、プレイス（plaice）、ダンゴウオ、レッドフィッシュ（redfish）、パイク（pike）、トラウト、及びサーモン）又は暖水魚（例えば、ティラピア、シャーク（shark）、又はコイ）から得られる。これらは、そのゲル化点及び融点が異なっており、冷水魚ゼラチン（ＣＷＦＧ）は、多くの場合、１５℃よりも低い、典型的には４〜１２℃のゲル化点、及び２２℃よりも低い、典型的には１２〜１９℃の融点を有し、一方暖水魚ゼラチン（ＷＷＦＧ）は、多くの場合、１５℃よりも高い、典型的には１８〜２４℃のゲル化点、及び２２〜３２℃の範囲の融点を有する。本発明の目的のために、冷水魚は、１８℃以下の水中に主として棲息している魚のいずれの種をも意味するものと見なされてよい。

本発明の方法は、１１〜２８℃の範囲の融点を有するゼラチンを用いる。好ましくは、融点は、１９〜２７℃の範囲であり、さらにより好ましくは、２１〜２６℃の範囲であり、最も好ましくは、２３〜２５℃の範囲である。

本発明の方法は、好ましくは、少なくとも１８０、少なくとも１９０などの１００〜３００、好ましくは、２００〜２８５、又は２００〜２５０ブルームの範囲のブルーム強度を有する魚ゼラチンを用いる。しかし、上記パラメーターを満たす適切なウシゼラチンも、本発明に従う低温軟質ゲルカプセル生産法に用いられるのに必要なパラメーターにそれが対応している場合、適切であり得る。

所望に応じて、１１〜２８℃の範囲の融点を有するゼラチンは、ゼラチン混合物全体が、１１〜２８℃の範囲、好ましくは、１９〜２７℃の範囲、さらにより好ましくは、２１〜２６℃の範囲、最も好ましくは、２３〜２５℃の範囲の融点を、並びに／又は２００〜２８５ブルームなどの１００〜３００の範囲のブルーム強度を維持する限りにおいて、由来の異なるゼラチンの混合物であってもよい（例：冷水魚ゼラチンと暖水魚ゼラチンとの混合物、魚ゼラチンとウシゼラチンとの混合物、又は魚ゼラチンとブタゼラチンとの混合物）。しかし、用いられるゼラチンは、哺乳類ゼラチンを実質的に含んでいないことが好ましく、すなわち、含有量は、全ゼラチン重量に対して１％以下、好ましくは０重量％である。特に好ましくは、ゼラチンは、少なくとも９０重量％、より好ましくは、少なくとも９５重量％、特には、１００重量％の魚ゼラチンである。

上記で述べたように、冷水魚ゼラチンは、ブルーム値が低いか又は存在しない傾向にあり、従って、軟質ゲルの製造に必ずしも適してはいない（例：低い機械強度及び／又は不良な熱安定性に起因して）。しかし、著しい量の冷水魚ゼラチンを含む軟質ゲルカプセルは、ある量の暖水魚ゼラチンも用いられる場合、標準的な封入設備を用いて製造することができる。冷水魚ゼラチンと暖水魚ゼラチンとの適切なブレンドは、その内容が参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０９５６７０号に記載されている。従って、例えば、本発明の方法及びカプセルでは、ゼラチン混合物全体が、１１から２８℃の範囲の融点、及び／又は１００〜３００の範囲のブルーム強度を維持する限りにおいて、ゼラチンは、少なくとも４０重量％、例えば、２０〜８０重量％、３５〜７０重量％、４０〜６５重量％、若しくは少なくとも５５重量％の冷水魚ゼラチン（全ゼラチン重量に対して）を含むゼラチンのブレンドであってよく；又はゼラチンは、９９．９：０．１〜３５：６５、特には、６５：３５〜４０：６０の重量比で冷水魚ゼラチンと暖水魚ゼラチンとを含んでいてもよい。

所望に応じて、本発明で用いられるゼラチンは、さらに、カラゲナン（例：カッパ‐カラゲナン）を、例えば、乾燥固形分基準のゼラチンに対して０．０１〜２重量％、特には、０．０５〜１重量％、特に、０．０６〜０．５重量％の含有量で含んでよい。ゲル化を改善するために、生理学的に許容される金属塩（例：カッパ‐カラゲナンに対する塩化カリウムなどのカリウム塩）が含まれていてもよい。典型的には、そのゼラチン中濃度は、５０ｍＭまで、特には、１０〜３０ｍＭである。

本発明のカプセル及び方法での使用に適するゼラチンは、当然、ブルーム強度及び融点の両方の点で定められてよい。従って、上記ブルーム強度及び融点のいずれの組み合わせを有するゼラチンも考慮され、例えば、１１〜２８℃の範囲の融点及び１００〜３００ブルームのブルーム強度を有するゼラチンである。

軟質ゲルカプセルシェルは、ゼラチンに加えて、可塑剤、水、着色剤、香味剤、乳白剤、及び／又は保存剤などの追加の成分も含有してよく、これらはすべて、当業者に公知の成分である（The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, Lachmann, L., et al., eds. Lea & Febiger, Philadelphia, PA, pp. 398-412 (1986)のStanley, J.P., "Part Two. Soft Gelatin Capsules"も参照）。可塑剤の例としては、グリセロール、ソルビトール、及びこれらの混合物が挙げられる。存在する場合、可塑剤は、ゼラチンに対して３５重量％までの量、例えば５〜３５重量％又は１５〜３０重量％で存在してよい。

プロバイオティック細菌は、適切な量で投与された場合、ホストに健康上の有益性を付与することができる生存微生物として定義される（ＦＡＯ／ＷＨＯ ２００１）。
栄養欠乏条件下では、バチルス属（Bacilli）及びクロストリジウム属（Clostridia）などの特定の細菌は、芽胞、休眠状態の強靭で非増殖性構造を形成することができる。芽胞は、栄養なしに生存することができる。それは、紫外放射線、乾燥、高温、極限的な冷凍、及び化学消毒剤に対する耐性を有する。いくつかのプロバイオティック製品は、バチルス属を含有する。しかし、上記から明らかなように、本発明の方法は、芽胞形成細菌が封入プロセスを生き続ける必要はない。好ましい実施形態では、従って、本発明の軟質ゲルカプセルに用いられる細菌は、非芽胞形成細菌である。

充填物質は、乾燥非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌の少なくとも１つの種を含む。細菌は、本技術分野にて公知の方法に従って乾燥されてよい。そのようなプロバイオティック細菌の例は、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、及びストレプトコッカス属（Streptococcus）であり、より好ましくは、ビフィドバクテリウム属菌種（Bifidobacterium spp.）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ケフィル（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・ビフィドゥス（Lactobacillus bifidus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・クルバトゥス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbreuckii）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）から成る群より選択される少なくとも１つの種である。

特に好ましい菌株は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス、例えば、それぞれＤＳＭ １５９５４（デンマークのクリスチャンハンセン社（Chr. Hansen A/S）からＢＢ‐１２（登録商標）として市販）、ＡＴＣＣ ２７５３６、及びＤＳＭ １０１４０として寄託されている菌株、ラクトバチルス・アシドフィルス、例えば、ＤＳＭ １３２４１（デンマークのクリスチャンハンセン社からＬＡ‐５（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、ラクトバチルス・ラムノサス、例えば、ＡＴＣＣ ５３１０３（デンマークのクリスチャンハンセン社からＬＧＧ（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ、例えば、それぞれＡＴＣＣ５５５４４（デンマークのクリスチャンハンセン社からＬ．ｃａｓｅｉ ４３１（登録商標）として市販）及びＣＣＴＣＣＭ ２０４０１２として寄託されている菌株、ラクトバチルス・ロイテリ、例えば、ＡＴＣＣ ５５８４５（デンマークのクリスチャンハンセン社からＲＣ‐１４（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、ラクトバチルス・ラムノサス、例えば、ＡＴＣＣ ５５８２６（デンマークのクリスチャンハンセン社からＧＲ‐１（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、ラクトバチルス・パラカゼイ、例えば、ＬＭＧ‐Ｐ‐１７８０６（デンマークのクリスチャンハンセン社からＦ１９（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、ストレプトコッカス・サーモフィルス、例えば、ＤＳＭ １５９５７（デンマークのクリスチャンハンセン社からＴＨ‐４（登録商標）として市販）として寄託されている菌株、並びにラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、例えば、ＮＭ０２／３１０７４（デンマークのクリスチャンハンセン社からＰＣＣ（登録商標）として市販）として寄託されている菌株である。

プロバイオティック細菌の複数の種又は菌株、すなわち、上記で挙げた種又は菌株の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５種類、若しくはさらにはそれ以上の組み合わせが用いられてもよい。本発明の好ましい実施形態では、１種類のみ、２、３、４、又は５種類の異なる菌株が、本発明に従う軟質ゲルカプセル中に存在する。

「生存」の用語は、細胞が生きており、混釈播種（pour plating）又は塗抹播種（spread plating）時にペトリ皿にコロニーを形成することができることを意味する。生存プロバイオティック細菌の数は、プロバイオティック菌株の増殖に適する条件下でのインキュベーションを用いた混釈播種法又は塗抹播種法によって、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数として特定される。この方法により、増殖してコロニーを形成することができる細胞がカウントされる。本明細書及び請求項において数が与えられる場合、それは、特に断りのない限り、ＣＦＵ／軟質ゲルカプセルとして理解されるべきである。

微粒子製剤の記載に用いられる専門用語は、場合によっては、この分野に精通していない読み手にとって、一貫性がなく困惑させるものであり得る。「微粒子」の用語は、本明細書で用いられる場合、厳密な内部又は外部構造に関わらず、直径が１〜１０００μｍである粒子を意味し、「マイクロカプセル」のサブカテゴリーが、コアとは明確に異なる物質で取り囲まれたコアを有する微粒子に適用される。コアは、固体、液体、又はさらには気体であってもよい。

マイクロ封入された物質は、コア活性成分を有し、それが、明確に異なる物質で取り囲まれている。物質は、いくつかの理由でマイクロ封入され得る。例としては、反応性物質のその環境からの保護、そうでなければ毒性又は有害である物質の安全で都合の良い取扱い、矯味、制御又は調整放出特性のための手段、液体を固体として取り扱う手段、自由流動性粉末の作製、及び薬物の物理的特性の調整が挙げられ得る。

国際公開第２０１２／０２１４３２号には、マイクロ封入されたプロバイオティック細菌が記載されており、「マイクロ封入された」の用語は、組成物によって被覆された状態として定義されている。本明細書と矛盾することなく、本明細書及び請求項で用いられる「非被覆」の用語は、プロバイオティック細菌が、マイクロ封入も被覆もされていないことを意味する。

被覆工程は、被覆プロセスの過程で細胞の減少を、及び自然の非被覆細胞とは異なる放出プロファイルを充分にもたらし得るものであり、さらに、製剤への被覆材料の添加によって、プロバイオティック細菌の濃度を低下させることにもなる。

本発明の実施例の結果を国際公開第２０１２／０２１４３２号の例の結果と比較すると明らかであるように、本発明は、プロバイオティック細菌の被覆を用いなくても、国際公開第２０１２／０２１４３２号に記載の結果と比較して、室温での長期間の保存時におけるプロバイオティック細菌の生存率の改善を提供する。本発明で用いられる細菌は、従って、非被覆であり、すなわち、マイクロ封入されていない。

例えばプロバイオティック細菌の標準化された濃度のドライブレンドを得る目的で、賦形剤がプロバイオティック細菌に添加されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、ブレンド中におけるプロバイオティック細菌などの１つ以上の活性成分の最終濃度は、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％などの４０〜１００％（ｗ／ｗ）であり、残りの部分は、マルトデキストリンなどの賦形剤である。１００％の濃度（すなわち、乾燥細菌のみ）が、高濃度の細菌を有するために、及び油へ添加されるべき固形分の量を低減するために、本発明において好ましく、添加される固形分が多過ぎると、懸濁液が粘稠となり過ぎる。

充填物質のための乾燥細菌の懸濁液を作製するために、硬化／部分硬化植物性油、そのモノグリセリド、若しくは混合物、レシチン、ワックス、又は二酸化ケイ素を例とする懸濁剤が、全充填物質に対して１．５〜５％（ｗ／ｗ）を例とする１．５〜７．５％などの１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で添加されてよい。懸濁剤を使用することで、細菌が乾燥粉末の形態で添加された場合であっても、プロバイオティック細菌の沈澱を防止することによって、均一な充填物質の作製が補助される。

本質的にすべての食用油が、本発明に適し得る。油は、活性成分又は単なるキャリア油と見なされてよく、ＭＣＴ（中鎖トリグリセリド）、ダイズ油、又はヒマワリ油などである。本発明における使用に特に好ましい油は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、魚油、及びクリル油、並びにＥＰＡ、ＤＨＡ、及びその他のオメガ３脂肪酸の組み合わせなどのオメガ３脂肪酸を含有する油、並びに、ナタネ油、ボラージ油（borrage oil）／マツヨイグサ油、アマニ油、シソ油、又はガーリック油など、例えばＤＨＡ、ＥＰＡ、アルファ‐リノレン酸（ＡＬＡ）、又はオメガリノレン酸（ＧＬＡ）を提供する植物性油である。

ＤＨＡ、ＥＰＡ、及びＡＬＡの入手源としては、限定されないが、魚油、イースト、藻、又はその他の微生物若しくは単細胞源、並びに植物性油、主として、アマニ、ダイズ、及びナタネ油が挙げられる。ＧＬＡの入手源としては、限定されないが、マツヨイグサ油／ボラージ油が挙げられる。

本発明における使用に適する油としては、植物、海洋、又は哺乳類由来のいずれの改質油も挙げられ、限定されないが、硬化油、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、及びこれらの組み合わせなどである。

上記で挙げた油の１、２、３、４つ、又はそれ以上など、少なくとも１つの油が、本発明の方法で用いられてよい。
上記で述べたように、本発明の方法は、非被覆プロバイオティック細菌を、少なくとも１つの油と５〜１５℃の範囲の温度で混合して、充填物質を得ることを含む。従って、油（又は、２つ以上の油が用いられる場合は油混合物）は、５〜１５℃の範囲の温度で液体であるべきである。このことは、油（又は油混合物）が、１５℃以下の融点を有するべきであることを意味しており、例えば、５〜１５℃の範囲の融点、又は好ましくは、５℃未満の融点である。

プロバイオティック細菌に加えて、１つ以上のその他の活性成分、例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ２、Ｃ、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビオチン、ナイアシン、葉酸などのビタミン；亜鉛、セレン、クロム、銅、カルシウム、塩化物などのミネラル；ナタネ油、ボラージ油／マツヨイグサ油、アマニ油、シソ油、ガーリック油などの植物性油、並びにクランベリー抽出物／ジュース、ローヤルゼリーなどの植物抽出物から成る群より選択される１、２、３、４つ、又はそれ以上の活性成分が、軟質ゲルカプセルに含まれてよい。

本発明で好ましい組成物は、ＭＣＴ中のビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチスなどビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチスを唯一の活性成分として；ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス及びＡＬＡ、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス及びＤＨＡ、並びにビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス、ＤＨＡ、及びＥＰＡなどのビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス及び少なくとも１つのオメガ‐３油；さらには、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス、ＤＨＡ、ビタミンＢ６、葉酸、及びビタミンＤ３を例とする他の活性成分との組み合わせを含む。

充填物質の混合及び充填物質の軟質ゲルカプセル中への封入は、低湿度環境中で行われるべきである。本発明の文脈において、「低湿度環境」の語句は、相対湿度（ＲＨ）が５０％未満である環境を意味する。好ましくは、それは、相対湿度が４５％未満である環境を意味する。より好ましくは、相対湿度は、１０％〜４０％の範囲、より好ましくは、２０〜３５％の範囲である。低湿度は、相対湿度を低下させるための当業者に公知であるいかなる方法によって到達されてもよく、乾燥圧縮空気、冷却、空調、及び窒素又はアルゴンを例とする不活性ガスによるパージの使用が挙げられる。不活性ガスによるパージはまた、細菌細胞及び充填物質のその他の成分の両方に対する酸化ストレスも低減する。

軟質ゲルカプセル中の良好な含有量均一性を確保するために、細菌が油中に均一に懸濁されていることを維持することが重要である。例えば温度を低下させることによって得られる緩やかな撹拌及び高い粘度は、細菌の均一な懸濁液を作製する補助となり得る。「緩やか」とは、細菌細胞壁の著しい破壊を引き起こす機械的な力を発生させることなく均一な懸濁液を形成することを補助するのに充分である撹拌を意図している。緩やかな撹拌／混合に適する方法としては、これらに限定されないが、かき回し（stirring）又は循環ポンプが挙げられる。その他の方法は、当業者であれば識別可能である。

表１に、本発明の方法で用いられる条件と本分野で一般的に用いられる条件との間の相違点をまとめる。

充填物質温度の低下には、より低い融点のゼラチンの使用及び製造チェーン全体の変更が必要となる。最も重要なことには、ウェッジ温度（精密な充填及びそれに続くカプセルのシールに関与する）の低下が、カプセルの良好なシールを得るために必要である（ゼラチンを再溶融しない）。スプレダーボックスは、封入プロセスの前に液体ゼラチン物が薄膜へと形成されることを確保する。スプレダーボックス中の温度は、充填物質を加熱するものではなく、温度の上限値は、通常の生産の場合と同様の高さであってよいが、それより低いことが好ましい。

表から明らかなように、従来の方法からの主たる相違は、充填温度が低いことである。実施例１は、従来から用いられている室温から充填物質の温度を低下させることが重要であることを明らかに実証している。本発明の方法によると、充填温度は、５〜１５℃、好ましくは、６〜１４℃、最も好ましくは、７〜１３℃であるべきである。９〜１１℃などの８〜１２℃も実行可能であり得る。

温度は、選択されたゼラチンに依存する。より低い融点の魚ゼラチンの使用により、カプセルのシールプロセスが依然として有効であることが確保されるが、充填物質及びウェッジが低温であるので、ゼラチンは、充填プロセス後、依然として確かなシールを得るのに充分な軟質性である必要がある。スプレダーボックス温度は、より低い室温及び充填温度に対する調節のために４０℃の低さであってもよく、好ましくは、４５〜５５℃の範囲であることが考慮される。実施例で用いた最低スプレダーボックス温度は５１℃であった。

充填材料のいずれの固体成分、すなわち、乾燥プロバイオティック細菌及びマルトデキストリンなどの考え得る賦形剤の粒子サイズも、製品の均一性を確保し、実際の物理的プロセスを可能とするために重要である。プロバイオティック細菌を含む成分の平均粒子径サイズは、約１５０〜２５０ミクロンなどの４００ミクロン未満、好ましくは、２００ミクロン未満であるべきである。円滑な大スケール生産のための粒子サイズは、最適化される必要があり、粉砕又は篩による注意深い粒子サイズ低下によって得ることができる。

しかし、プロバイオティック細菌が繊細な生きた微生物であることに起因して、プロバイオティック細菌へのストレス／エネルギー投入を最小限に抑えることが重要である。従って、細菌の生存数を維持するために、充填物質の固体成分の粉砕などの手順は、可能な限り回避されるべきである。

本発明に従う軟質ゲルカプセルは、堅固であるべきであるが、脆弱又は壊れやすいものであってはならない。乾燥後のカプセルシェルの品質は、最も一般的には、ニュートンとして測定され（シェルの硬度）、この場合、９〜１１Ｎの値が、カプセルの漏れを引き起こすことのないシェル硬度を示す。硬度は、本技術分野にて公知の方法によって特定することができ、例えば、ｄｉｇｉ ｔｅｓｔ ＩＩ Ｇｅｌｏｍａｔ Ｈａｒｔｅｍｅｓｓｇｅｒａｔ（バレイシスプリュフゲレーテバウ社（Bareiss Prufgeratebau GmbH）製）及びその他の類似のデバイスなどの硬度計を用いることによる。

室温（２５℃／６０％相対湿度（ＲＨ））において、軟質ゲルカプセルは、約４〜１０重量％の水分含有量を有する。水分含有量が、例えば過度に乾燥した保存又は乾燥に起因して、これよりも著しく低い場合、これは、カプセルシェルの脆弱化をもたらし、カプセル壁の壊れやすさが増大し、クラックが形成される結果となる。実施形態において、軟質ゲルカプセルは、従って、少なくとも４重量％の水分含有量を有する。

当業者に公知であるように、水分含有量は、合計水分量を意味する。疎水性のカプセル充填物質が水を吸収しないことから、軟質ゲルカプセルの合計水分含有量（自由水＋結合水すなわち細胞及びゼラチンに結合された水分）のほとんどはシェル中に見られる。上記で述べたように、カプセルの合計水分含有量は、４〜１０％の範囲であってよいが、この合計パーセントは、細菌の生存率とは無関係である。例えばシェル中のゼラチンの水和によって強く結合された水分は、細菌による利用は不可能であり、細菌にとって有害にもなり得ず、測定が必要とされるのは、自由に利用される水分のみである（水分活性、ａ_w）。水分活性は、製品中の自由な又は化学的に結合されていない水分として定義され、Ｒｏｔｒｏｎｉｃ Ｈｙｇｒｏｌａｂ機器を適用することにより、軟質ゲルカプセル全体について測定することができる。

プロバイオティック細菌は、休眠状態であり、この状態を維持するためには、０．２以下の水分活性が好ましい。通常、標準的な軟質ゲル条件下で保存される軟質ゲルカプセルは、プロバイオティック細菌が休眠状態を維持するには高過ぎる水分活性（ａ_w）の環境を作り出すことになる。従って、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの乾燥の注意深い制御及び軟質ゲルへ再進入し得る雰囲気中水分に対する注意深い制御が必要である。

乾燥プロセスの過程において、水分含有量、従って水分活性は、乾燥剤が存在する場合は乾燥剤がシェルから水分を除去し、充填物質中のいかなる水分もシェルによって取り込まれるプロセスを通して、平衡状態に達する。シェル、充填物質、及び乾燥剤の間での平衡状態により、シェルが脆弱となり過ぎるリスクを伴うことなく、適正な低い水分活性が確保される。

本発明の方法によると、軟質ゲルカプセルは、０．２５以下の水分活性となるまで、１つ以上の工程で２５℃以下の温度で乾燥される。細菌を含む軟質ゲルカプセルの乾燥には、当業者に公知のいかなる乾燥方法が用いられてもよい。本発明の好ましい実施形態では、カプセルは、例えば約１８〜２３℃で約１０から約４０分間にわたるタンブル乾燥によってまず乾燥され、続いて、約１９〜２２℃、１５〜２２％の湿度で、少なくとも約１又は２日間から約１４日間にわたって、９〜１１Ｎのシェル硬度が得られるまでトレイ乾燥される。上記方法に対する別の選択肢として、インライン乾燥トンネルが用いられてもよい。

初期乾燥プロセスの後、乾燥された軟質ゲルカプセルは選別され、適切に充填されていない、気泡を有する、又は異常なサイズのカプセルは廃棄される。品質チェックが成された軟質ゲルカプセルは、次に、当業者に公知であるように、充分な量の乾燥剤と共に最終包装材中に包装されてよい。

しかし、本発明において、軟質ゲルカプセル全体に対して測定される水分活性（ａ_w）０．２を目的とする水分含有量のさらなるゆっくりした低下を得るために、軟質ゲルカプセルが充分な量の乾燥剤と共に適切な梱包材中にバルクとして保持されるさらなる乾燥工程が追加されることが好ましい。カプセルは、この段階で、最終包装材中に梱包される前の細菌の減少を最小限に抑えるために、２５℃以下の温度で、好ましくは、２〜８℃などの低温で保持される。

上記から明らかであるように、所望される低水分活性は、最終包装材中に梱包される前に到達される必要はないが、最終包装材中への梱包前における適正な水分活性は、最終包装材中の乾燥剤の寿命を延長し、従って、軟質ゲルカプセルの保存期間も延長することになる。好ましくは、最終包装前の水分活性は、０．２５以下であるべきである。

この低ａ_wに到達するのに要する時間は、数日間から数週間、数か月間までの範囲、例えば３か月間であり得るが、カプセルが低温で保持される限りにおいて、安定性は損なわれない。

このバルク梱包に最も適する梱包材は、アルミニウム箔系の梱包材である。ＨＤＰＥポリマー又はその他の高水分バリア性ポリマーなどのその他の梱包材が用いられてもよいが、その場合、水分活性の制御のために、乾燥剤の量を増加させる必要がある。適切な乾燥剤としては、シリカ、シリカ系乾燥剤、モレキュラーシーブ、及びゼオライトなど、適切ないかなる乾燥剤をも挙げられる。

本発明の好ましい実施形態において、軟質ゲルカプセルは、最終再包装後に（すなわち、棚保存中に）、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、又は０．２３など、０．２以下の水分活性（ａ_w）まで乾燥される。

本明細書で述べる方法によって得られた、又は得ることができるカプセルは、本発明のさらなる態様を成す。
別の態様では、本発明は、カプセルシェル及び充填物質を含む軟質ゲルカプセルを提供し、前記カプセルシェルは、１１〜２８℃の範囲の融点及び／又は１００〜３００のブルーム値を有し、前記充填物質は、油中に分散された少なくとも１つの菌株の非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含み、ここで、前記軟質ゲルカプセルの水分活性は、０．２５以下である。

吸収剤及びチャネル形成剤を含み及び最終包装材用に本発明において好ましいポリマーから作製された容器が、例えば、国際公開第９７／３２６６３号、国際公開第０３／０８６９００号、国際公開第２００８／０８６８５２号、欧州特許第１０００８７３号、及び欧州特許第１４２１９９１号に記載されている。それらは、例えば、米国、アラバマ州、マクミランストリートオーバーン（McMillan Street Auburn）２０３９のキャピトルスペシャリティプラスチックス社（Capitol Specialty Plastics Inc.）からＡｃｔｉｖ‐Ｖｉａｌの商品名で、又はドイツ、モースブルク ８５３６８、オステンリーダーストラッセ １５のスドケミー（Sud Chemie）から２ＡＰ Ｍｕｌｔｉｐｏｌｙｍｅｒの商品名で市販されている。

本発明は、乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを提供し、この軟質ゲルカプセルは、２５℃で１２ヶ月間の保存後に、少なくとも２Ｅ＋０９個の生存細菌を、より好ましくは、少なくとも３Ｅ＋０９個の生存細菌を、最も好ましくは、少なくとも４Ｅ＋０９個の生存細菌を、さらにより好ましくは、少なくとも５Ｅ＋０９個の生存細菌を含む。

乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルが本発明の範囲内であり、この軟質ゲルカプセルは、２５℃で２４ヶ月間の棚保存後に、少なくとも１Ｅ＋０９個の生存細菌を、好ましくは、少なくとも２Ｅ＋０９個の生存細菌を、より好ましくは、少なくとも３Ｅ＋０９個の生存細菌を、さらにより好ましくは、少なくとも４Ｅ＋０９個の生存細菌を、最も好ましくは、少なくとも５Ｅ＋０９個の生存細菌を含む。

さらに、本発明は、乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを提供し、この軟質ゲルカプセルは、２５℃で１２ヶ月間の棚保存後に、少なくとも４ＣＦＵ／ｇを、好ましくは、少なくとも５ＣＦＵ／ｇを、より好ましくは、少なくとも６ＣＦＵ／ｇを、さらにより好ましくは、少なくとも７ＣＦＵ／ｇを、最も好ましくは、少なくとも８ＣＦＵ／ｇを含む。

なおさらに、本発明は、乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを提供し、この軟質ゲルカプセルは、２５℃で２４ヶ月間の棚保存後に、少なくとも２ＣＦＵ／ｇを、好ましくは、少なくとも３ＣＦＵ／ｇを、より好ましくは、少なくとも４ＣＦＵ／ｇを、さらにより好ましくは、少なくとも５ＣＦＵ／ｇを、最も好ましくは、少なくとも６ＣＦＵ／ｇを含む。

例で提供される結果から明らかなように、本発明の方法によって作製された軟質ゲルカプセルは、非常に安定である。これらの結果から、軟質ゲルカプセルあたりのＣＦＵ値は、乾燥剤ライニング付きのプラスチックバイアル中、２５℃で６か月間の保存後に６．８Ｅ＋０９、９か月間の保存後に４．０Ｅ＋０９、及び１２か月間の保存後に５．３Ｅ＋０９であることが示される。１２ヶ月間の保存後のＣＦＵ値に基づくと、２５℃で２４ヶ月間保存後に恐らく存在すると思われる生存プロバイオティック細菌の数を、少なくとも３Ｅ＋０９であると外挿することができる。

軟質ゲルカプセルの保存安定性を測定する別の選択肢としての方法は、棚保存中におけるプロバイオティック細菌の対数減少を算出することである。本発明の方法において、棚保存中に得られる対数減少は、２５℃で１２ヶ月間の保存後に、１以下、好ましくは、０．７５以下、より好ましくは、０．５０以下、さらにより好ましくは、０．３３以下、最も好ましくは、０．２５以下である。

実施例から、活性プラスチックバイアル中に保存された軟質ゲルカプセルに対する２５℃で６か月間の保存後の対数減少は、０．１２、１２ヶ月後の対数減少は、０．２３と算出することができることが示される。図４から分かるように、厳密な数にはある程度の経時での変動が存在しており、これは、個々の軟質ゲルカプセル間でのプロバイオティック細菌の分布の変動、及びＣＦＵ法に対する分析上の変動に恐らくは起因すると思われるが、全体としての結果は、本発明に従う軟質ゲルカプセルが、著しく低い対数減少を維持していることを示している。

図３及び４から明らかなように、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルが２から８℃に保持される場合、細胞の減少は、２５℃の場合よりもさらに低くなる。図３はまた、さらに乾燥剤を添加して既にバルクレベルにある水分活性レベルを制御することによって、バルク保存条件を最適化することができることも示している。

図４から明らかなように、プロバイオティック細菌の生存率は、プロバイオティック細菌を含有する軟質ゲルカプセルが２５℃で保存された場合、軟質ゲルカプセルが３０℃で保存された場合の結果と比較して非常に高い。２５℃から３０℃という保存温度の５℃の変化が、細菌の生存率にそのような著しい相違をもたらし得ることは驚くべきことである。本発明における好ましい保存条件は、約２２〜２５℃などの約２０〜約２５℃の温度などの室温での保存であり、好ましくは、約２５℃、すなわち、２５℃±２℃である。

本発明の記述の文脈において（特に、以下の請求項の文脈において）、「１つの（a）」及び「１つの（an）」及び「その（the）」の用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書にて特に断りのない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものとして解釈されるべきである。「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有する」の用語は、特に断りのない限り、非限定的用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書にて特に断りのない限り、その範囲内に含まれる各別々の値を個別に述べることを省略する方法として用いられることを単に意図するものであり、各別々の値は、それが本明細書に個別に列挙されているかのごとく、本明細書に組み入れられる。本明細書で述べる方法はすべて、本明細書にて特に断りのない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、適切ないかなる順序で行われてもよい。本明細書で提供されるすべての例、又は例示的言語（例：「など」）の使用は、単に、本発明をより明らかとすることを意図するものであり、特に請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいずれの言語も、請求されていないいずれの要素も本発明の実践に対して必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。

全般：
すべてのトライアルバッチのバッチサイズは、カプセル６５０００個である。
充填物質：
油及び油溶性成分を、ステンレス鋼製混合容器にバキュームによって投入する。これらの成分を、１２℃で混合し、二酸化ケイ素を添加する。この混合物を、さらに混合し、二酸化ケイ素が分散されるまでホモジナイズする。ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチスをバキュームによって投入し、完全な混合物を混合する（ホモジナイズすることなく）。次に、出来上がった充填物質を、篩開口部が０．７から１．２ｍｍである篩を通して、予備冷却した（１２℃）移送タンクへ排出する。続いて、移送タンクを封入機に接続する。
ゼラチン溶液
ゼラチン溶液のバッチサイズは１００ｋｇである。ゼラチン、グリセロール、及び水を、加熱及び撹拌用の設備を有するステンレス鋼製生産容器中に秤量する。この混合物を、安定した粘度が得られるまで、加熱、撹拌、及び脱気する。次に、ゼラチンを、予備加熱したステンレス鋼製容器へろ過（１５０ミクロン）する。続いて、着色剤を添加し、均一となるまでゆっくり混合する。ゼラチンは、封入の間、５０〜６８℃に保持する。
乾燥
最初の乾燥は、回転タンブル乾燥機により、１９．０〜２０．３℃で行い、ここで、ゼラチンリボンの潤滑剤が、乾燥機中のクリーニングタオルによって除去される。最終乾燥は、トレイ上にカプセルを単一層に広げ、トレイを、１４〜２３％ＲＨの制御湿度及び２１〜２４℃の温度の空調キャビネット中に置くことによって行う。乾燥は、シェル硬度が９〜１１Ｎに到達した時点で停止する。典型的な乾燥時間は、３１〜１３０時間であり、平均１００時間である。
検査及び包装
軟質ゲルカプセルを検査し、選別によって変型カプセル、シール不良カプセル、及びその他の不良品を除去し、プロバイオティック細菌を含有する３５００個の軟質ゲルカプセルのバルクパッケージとして、３０ｇの乾燥剤と共に、アルミニウムバッグに包装し、ヒートシールする。

５つの異なるトライアルで生産したバッチの組成を表２に示す。

最初の２つのトライアルバッチの生産の間、ＣＦＵの数の低下がどこで発生したかを識別するために、封入プロセス全体を通して温度を緊密にモニタリングした。
トライアル１で生産した軟質ゲルは、生産方法を通して生存細胞の著しい減少を示した。プロセス条件を変更してトライアルを繰り返したところ、非常により安定な生産方法が得られた。結果を以下の表３に示す。

充填温度を２０℃から７．５℃に低下させた影響は明らかであり、プロバイオティック細菌の生存率が大きく改善されている。
結果をより詳細に見ると、表３は、トライアル１における封入の過程で、ＣＦＵ／軟質ゲルカプセルの大きな低下を示しており、低充填温度のトライアル２であっても、細胞数が封入プロセスを通して低下していることを示している。乾燥の過程で、ＣＦＵ／カプセルは上昇しているが、その理由は、乾燥の過程において水分が失われ、それによって、細菌の全濃度が上昇しているからである（トライアル２の場合が最も明らか）。

この温度を、充填物質に対する温度にある程度の変動（１２〜１４℃）がある以外は、続いてのトライアルにも用いた。続いてのトライアルでは、最小限の生産時の減少が見られただけであった。例えば、トライアル番号４では、軟質ゲルカプセル生産後にすべての細胞が利用可能であるとした場合の算出された量である３．０Ｅ＋１０ＣＦＵ／軟質ゲルカプセルに対応してプロバイオティック細菌を添加した。安定性実験開始時に見られたＣＦＵ値は、９Ｅ＋０９ＣＦＵ／軟質ゲルカプセルであった。これら２つの値は、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルを改善された方法を適用することで製造した場合に、観察されたプロバイオティック細菌の減少が最小限であることを確認するものである。

トライアル２のバッチを、異なる量の乾燥媒体を有する異なる包装材系に分配し、利用可能性及び安定性実験を異なる温度で開始した。包装材系は、ａ）１００個の軟質ゲルカプセル及び１ｇのシリカバッグを含有するアルミニウム箔バッグ、ｂ）ブリスターカード（ＰＶＣ／ＰＶＤＣ箔、ブリスターカードあたり１０個の軟質ゲルカプセル、及びｃ）６０個の軟質ゲルカプセル及び０．５ｇのシリカバッグを含有するＰＥプラグ及びＡＬＵ／ＰＥライナー付きＰＰキャップを備えたアルミニウムボトルであった。サンプルを、８〜１２℃及び２５℃／６５％ＲＨで１８ヶ月間まで保存した。結果を図１及び２に示す。

図１の結果は、包装材系中に存在する活性乾燥剤を有することが、プロバイオティック軟質ゲルカプセルにとって重要であることを示している。
図２の結果は、保存温度が低く、８〜１２℃の範囲である場合、包装材中に存在する乾燥剤の効果は、プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルのＣＦＵ値にとってそれほど重要ではないことを実証するものである。

トライアル４からの軟質ゲルカプセルを、様々な安定性実験に含めた。図３及び４並びに図５及び６に、結果の一部を提示する。
バルクの軟質ゲルカプセルの安定性について実験した。図３及び５には、模擬バルク包装材系中で５℃及び２５℃で保存した場合の全細胞数を示す（各々３０個の軟質ゲルカプセル及び３．２ｇの乾燥剤を含有するアルミニウム箔パウチ）。軟質ゲルカプセルを２５℃で安定とするためには、軟質ゲルカプセルの数と乾燥剤の量との間のバランスが適切ではない。図から明らかであるように、生存細胞の数は、２５℃で１ヶ月間の保存後に既に低下を開始している。表４には、バルク保存中に測定した水分活性を提示する。

バルク及び最終包装のデータから、軟質ゲルカプセルを可能な限り安定とするために、保存中の軟質ゲルカプセルの水分活性を制御することの重要性が実証される。
最終包装材中の軟質ゲルカプセルの安定性について実験した。３０個の軟質ゲルカプセルを、米国、アラバマ州、マクミランストリートオーバーン ２０３９のキャピトルスペシャリティプラスチックス社製プラスチックバイアル Ａｃｔｉｖｅ Ｖｉａｌ、Ｍ‐３００９‐３３６に、乾燥剤ライニング（４．３ｇのモレキュラーシーブ）と共に梱包した。

保存条件は、５℃、２５℃／６０％ＲＨ、及び３０℃／７５％ＲＨであった。安定性実験は進行中であるが、１２ヶ月間の保存後のＣＦＵ値は、図４に示すように提供可能である。２４ヶ月間の保存後のＣＦＵ値も、図６に示すように提供可能である。５℃又は２５℃／６０％ＲＨで保存したサンプルが低い対数減少を示し、一方３０℃／７５％ＲＨで保存したサンプルの対数減少の方が高いことは明らかである。

保存中に測定した対応する水分活性を表５に提示する。水分活性は、プラスチックバイアル中の乾燥剤ライニングにより、保存の最初の１ヶ月間で低下しており、これが、ＣＦＵ値に対する安定化効果を有する。

Claims (17)

1. ａ）非被覆プロバイオティック細菌を少なくとも１つの油と、５〜１５℃の温度範囲で混合して、軟質ゲルカプセル充填物質を得ること、
   ｂ）１１〜２８℃の範囲の融点を有するゼラチンから作られた軟質ゲルカプセル中に前記充填物質を封入すること、及び
   ｃ）２５℃以下の温度において、１つ以上の工程で、０．２５以下の水分活性となるまで、前記軟質ゲルカプセルを乾燥すること、
   を含む非被覆プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルの製造方法。
2. 前記非被覆プロバイオティック細菌が非芽胞形成性である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記少なくとも１つの油が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、魚油、及びクリル油などのオメガ３から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記少なくとも１つの油が、ナタネ油、ボラージ油／マツヨイグサ油、アマニ油、シソ油、又はガーリック油などの植物性油から成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記充填温度が６〜１４℃の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 前記ゼラチンが、１００〜３００ブルームの範囲のブルーム強度を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記プロバイオティック細菌が、ラクトバチルス属（Lactobacilli）、ラクトコッカス属（Lactococci）、ペディオコッカス属（Pediococci）、ストレプトコッカス属（Streptococci）、若しくはビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）、又はこれらの混合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 前記プロバイオティック細菌が、菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス（Bifidobacterium animalis subspecies lactis）由来である、請求項７に記載の製造方法。
9. 前記軟質ゲルカプセルが、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ２、Ｃ、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビオチン、ナイアシン、葉酸などのビタミン；亜鉛、セレン、クロム、銅、カルシウム、塩化物などのミネラル；並びにクランベリー抽出物／ジュース若しくはローヤルゼリーなどの植物抽出物から成る群より選択される１、２、３、４又はそれ以上の活性成分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 前記軟質ゲルカプセルが、棚保存中に０．２以下のａ_wまで乾燥される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 前記軟質ゲルカプセルが、棚保存中、内壁中／内壁上に、少なくとも１つの吸収剤と共に、少なくとも１つのチャネル形成剤が領域の少なくとも一部分にわたって埋設された再封可能容器中に保存される、請求項１０に記載の製造方法。
12. カプセルシェル及び充填物質を含む軟質ゲルカプセルであって、
    前記カプセルシェルは、１１〜２８℃の範囲の融点及び／又は１００〜３００のブルーム値を有する少なくとも１つのゼラチンを含み、
    前記充填物質は、油中に分散された少なくとも１つの菌株の非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含み、
    ０．２５以下の水分活性を有する軟質ゲルカプセル。
13. 前記油が、１５℃以下の融点を有する、請求項１２に記載の軟質ゲルカプセル。
14. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法によって生産された軟質ゲルカプセル。
15. 乾燥された非被覆非芽胞形成プロバイオティック細菌を含む軟質ゲルカプセルであって、２５℃で２４ヶ月間の棚保存後、少なくとも１Ｅ＋０９個の生存細菌を含む、軟質ゲルカプセル。
16. ２５℃で１２ヶ月間の保存後、少なくとも２Ｅ＋０９個の生存細菌を含む、請求項１５に記載の軟質ゲルカプセル。
17. 栄養補助食品、機能性食品、又は医薬として用いるための請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の軟質ゲルカプセル。

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