JP2017528159A - 植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞保存用組成物および細胞保存方法に関し、より詳しくは、幹細胞または初代培養細胞のような細胞の短期保存において、アニマルフリーおよびゼノフリーを維持しながら、高い細胞生存率を維持し、細胞の形態または表面発現因子の変化なしに安定した、植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物及びそれを用いた細胞保存方法に関する。【選択図】図１【図1】【図2】【図3】【図4】【図5】【図6】【図7】【図8】【図9】【図10】【図11】【図12】【図13】【図14】【図15】【図16】【図17】
Description
本発明は、幹細胞または初代培養細胞の常温または低温での短期保存において、アニマルフリー（Animal-Free）で且つゼノフリー（Xeno-free）を維持する、植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物及びその用途に関する。
近来、動物組織から分離された細胞または幹細胞を用いて多様な疾病の治療に適用する細胞治療剤技術が開発されている。幹細胞（stem cell）とは、未分化状態を維持しながら無限に増殖することができ、一定の環境と条件が与えられる場合、特定機能と形態を有するように分化することができる細胞を言う。ヒト胚性幹細胞は、適当な体外培養条件で自己増殖（self-renewal）が持続的に可能であり、人体を成す全ての種類の細胞に分化することができる全分化能（pluripotency）により、人体の発生、分化及び成長に関する基礎知識を理解するためだけでなく、人体の損傷または多様な疾患の根本的な治療方法である細胞治療剤の開発及び多様な新薬候補物質の薬効検索、疾患の原因究明、治療法の開発など多様な側面でこれを対象とした研究結果の活用範囲が拡大している。
一般的に、ヒト幹細胞を培養するために動物血清（ウシ胎児血清）を含有する培地を利用することになるが、この場合、ウシ胎児血清で培養した細胞を動物血清のない溶液で洗浄しても相当量のウシ胎児血清が細胞内に残留して強力な異種抗原として作用し、狂牛病など動物由来疾患の人体感染可能性などにより、ウシ胎児血清の残留有無が確認されていない状態の細胞に対する人体移植が米国では禁止されている状況である。ヒト骨髄から間葉系幹細胞を分離する技法と、脂肪組職から間葉系幹細胞を分離する技法は、各々Pittengerなど（Science 284:143-147，1997）と vanなど（J Clin Invest.58:699-704，1976）の文献に開示されている。これらでは、細胞培養のためにα−ＭＥＭやＤＭＥＭ培地及び１０〜２０％ウシ胎児血清を使用した。しかし、これら培地に動物血清（ウシ胎児血清）が用いられて人体移植に大きな安全性の問題を発生してきた。これを克服するために、従来は細胞培養培地でウシ胎児血清の代わりにヒト血清を使用する試みがあったが（Kuznetsov SA，et a., Transplantation.2000 Dec 27;70(12):1780-7）、幹細胞の増殖能低下及び分化能減少又は骨細胞への分化が促進されるなど幹細胞としての特性消失により、一般の細胞培養溶液にヒト血清をそのまま使用することが困難であった。最近、グローバル巨大企業を中心にいくつかのゼノフリー培養液が商用化され、多くの研究者及び関係者等の関心を引いている。しかし、依然としてゼノフリー培地の場合、ウシ胎児血清を利用する既存の培地に比べて、細胞成長率が低く、多世代の継代培養において限界を持ち、分化能などの基本的な幹細胞としての特性が低下するという点が克服しなければならない問題として残っている。
これとは別に、最近は組織から初代培養細胞あるいは幹細胞を抽出して人体に直ちに移植する医療関係者主導の医療施術も増加しており、細胞治療剤の開発も活発になされている状況であるため、捕集された細胞を生体内に移植するまで保管する溶液に関する問題も解決しなければならない問題の一つである。既存の場合は、捕集された細胞を基本培地や食塩水あるいは緩衝溶液に浸して低温保管または運送する場合が大部分であったが、このとき、多くの細胞が死滅したり細胞の特性を失うという大きい問題が存在してきた。よって、幹細胞の組織再生能を最適化するために、幹細胞移植時の生存率を増大し、移植の効果を最適化し、これを活性化するための技術開発が必要であるが、これも未だに不十分な状態である。一方、初代培養細胞（primary cell）は、動物組織や器官から直ちに一次培養した細胞であり、生きている生物から直接得た正常の細胞を言う。初代培養細胞は、細胞治療剤として開発されており、生物の実際反応と類似するとの長所を有するため、生物医薬品の生産などに使われている。
このような幹細胞または初代培養細胞を臨床実験及び細胞治療剤などに利用するためには、動物由来因子を使用してはならず、組織から採取された細胞及び幹細胞の生存能力（viability）を維持することができ、未分化状態の成体及びヒト胚性幹細胞の特性を維持することができ、生体投入直前まで優れた保存効果を期待することができる細胞保存剤の開発が強く求められている。また、保存しようとする細胞の種類によって保存用組成物に含まれる成分の種類及び組成比が異なるため、これに対する組成比の研究も必要であるのが実情である。
−１９６℃の極低温で凍結保存することが細胞の生存率、特性維持などの側面で安定的で安全であるため、細胞保存に利用される方法である。必要に応じて、凍結された細胞を急速解凍して生きている細胞を得てきた。しかし、凍結と解凍の過程で必然的に伴う氷結晶の形成とイオン及び浸透圧の不均衡による細胞の損傷を避けることができず、凍結及び解凍過程後に時間の経過につれて細胞の生存率が徐々に低くなる。更に、長期間保存ではなく何時間乃至数日間、細胞の移動及び保管のためにこのような凍結保存方法を利用することは現実的に難しい。
長期間保存のための凍結保存を除き、数時間乃至数日間、細胞の移動及び保管のための方法としては、動物細胞の培養に使用される培地を臨時で保存剤として使用する方法があるが、血清などを除いた基本培地が大部分であるか食塩水または緩衝溶液であることから、一部細胞の死滅が発生して生存率が減少し細胞の変形をもたらす場合もあるため、細胞の常温または低温での保管時、細胞の生存を十分に保障しながら幹細胞または初代培養細胞の安全な保存に特性化された細胞保存剤に関する研究が求められている。よって、本発明では、ゼノフリー及びアニマルフリー成分を有効成分として使用し、幹細胞または初代培養細胞の常温または低温保存に効果的な組成比の保存用組成物を開発することを目的とする。
本発明の目的は、植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記組成物を用いて細胞を保存する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記組成物を用いて細胞を保存する方法を提供することにある。
本発明の組成物及び方法を利用する場合、細胞の常温または低温での短期保存において、動物由来因子の使用なしに細胞生存率を高い水準で維持し、細胞に変形がなく、安定的に常温または低温で保存することができるため、特にアニマルフリー及びゼノフリーが求められる幹細胞または初代培養細胞関連の製薬及び医療産業分野において有用に使用されることができる。
以下、本発明を詳しく説明する。但し、本発明は多様な形態に変更されて具現されることができ、ここで説明する具現例に限定されるものではない。
一側面において、本発明は、植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物に関するものである。
本発明の細胞保存用組成物は、細胞を用いたある実験や施術または処置に使用される前まで使われる細胞を数時間または数日以上保護し保管するための組成物をいう。特定細胞の培養及び増殖に最適化されて使用される一般的な動物細胞培養培地とは構成成分、含量及び使用用途が異なる。すなわち、特定細胞の培養及び増殖には特定細胞ごとに最適化された培地（optimized media）があるため、本発明の細胞保存用組成物は、それ自体を細胞培養培地として使用することには適しておらず、単に細胞の常温または低温保管時の生存率を高め細胞の変形を防止するための保存溶液として使用することに適している。
一具現例で、本発明の細胞保存用組成物は、総組成物１００重量部に対して植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．１重量部乃至２０重量部含有することができ、植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する場合、総組成物１００重量部に対してヒト血清アルブミンを０．１重量部乃至１０重量部、植物性ペプチドを０．１重量部乃至１０重量部含有することができる。より望ましくは、植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．５重量部乃至５重量部及び植物性ペプチドを１重量部乃至５重量部含有することができる。最も望ましくは、植物由来組換えヒト血清アルブミンを１重量部及び植物性ペプチドを５重量部含有することができる。
一具現例で、上記細胞は、幹細胞または初代培養細胞であり得、上記幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cell，ＵＣＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（Adipose derived mesenchymal stem cell，ＡＤＭＳＣ）または骨髄由来間葉系幹細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell，ＢＭＭＳＣ）であり得る。
一具現例で、本発明の細胞保存用組成物は、動物由来成分を含まないため、ゼノフリー及びアニマルフリーであり得る。
本発明の細胞保存用組成物が使用され得る細胞は、動物細胞である。望ましくは幹細胞、より望ましくは成体幹細胞である。本発明の細胞保存用組成物は、動物性因子を使用せず、植物由来の組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを含有してゼノフリー（Xeno-Free）を維持することができるため、幹細胞または初代培養細胞の保存においてプリオンタンパク質などの感染危険が少なく安全に使用することができる。
一具現例で、上記植物由来組換えヒト血清アルブミンはイネ（rice）由来であり得、植物性ペプチドは大豆（soybean）由来であり得る。
本発明の組成物は、無機塩類、ビタミン及び核酸を更に含有することができ、上記無機質とビタミンは、細胞が作り出す毒性物質を除去する役割（例えば、抗酸化作用）に関連して機能を果たし細胞の生存率を高めることができる。
本発明において、用語“植物由来組換えヒト血清アルブミン”は、ヒト血清アルブミンの全体または生物学的活性のあるヒト血清アルブミンの一部分のアミノ酸配列を利用して植物細胞に形質転換して収得したタンパク質を意味する。上記ヒト血清アルブミンは、幹細胞または初代培養細胞の保存において血清と同等であるか、より優れたアニマルフリー代替物（animal-free alternative）として使用されることができ、幹細胞または初代培養細胞保存用組成物に添加されて細胞を安定化させる役割を行う。本発明の一実施例では、植物（イネ）から生産された組換えヒト血清アルブミンを用いて動物性またはウイルス性感染性因子の危険を最小化することができるとの利点を有するため、幹細胞または初代培養細胞の利用、特に治療剤としての利用において有用性を持つ。また、本発明の組成物に含まれた植物由来の組換えヒト血清アルブミンの場合、動物細胞または血清由来のヒト血清アルブミンとは異なり、ロット間変動（lot to lot variation）がほとんどないという長所を有する。
本発明で、用語“植物性ペプチド（plant peptide）”は、植物から抽出したペプチドを意味する。本発明の目的上、上記植物性ペプチドは、細胞保存において細胞の損傷を減少させることができるアミノ酸を含む物質であれば、その種類は特に制限されず、本発明の一実施例では大豆から抽出された植物性ペプチドを使用した。上記植物性ペプチドは、アニマルフリーであるためプリオンタンパク質などの感染危険が少なく、ゼノフリーを維持しながら、細胞の基本エネルギー源として使用され得る必須アミノ酸又は／及び非必須アミノ酸を含むため、保存時に幹細胞または初代培養細胞に栄養成分を供給し活性を高めて細胞生存率を高めることに寄与する。
本発明で、用語“幹細胞”は、自己複製能及び分化増殖能を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力によって、全分化能幹細胞（pluripotent stem cell)、多分化能幹細胞（multipotent stem cell）、単分化能幹細胞（unipotent stem cell）などの亜集団が含まれる。上記全分化能幹細胞は、生体を構成する全ての組織や細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味し、多分化能幹細胞は、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。単分化能幹細胞は、特定の組織や細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。全分化能幹細胞としては、胚性幹細胞（ES Cell）、胚性生殖細胞（EG Cell）、人工多能性幹細胞（iPS cell）などを挙げることができ、多分化能幹細胞としては、間葉系幹細胞（脂肪由来、骨髄由来、臍帯血または臍帯由来など）、造血幹細胞（骨髄または末梢血液などから由来）、神経幹細胞、生殖幹細胞などの成体幹細胞などを挙げることができ、単分化能幹細胞としては、平常は分裂能の低い状態で存在するが活性化以後に旺盛な分裂で単に肝細胞のみを作る前駆細胞（Committed stem cell）などを挙げることができる。本発明の一実施例では、代表的に骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞を用いて、本発明の組成物が幹細胞の常温または低温保存において安全及び安定的に使用されることができることを確認した。
本発明で、用語“初代培養細胞（Primary cell）”は、個体から抽出した組織から遺伝子などの操作なしに分離した細胞で、生体臓器／組織の機能を示す細胞である。皮膚や血管内皮、骨髄、脂肪、軟骨などから初代培養細胞が分離されて、該当組織及び細胞の機能を研究するのに利用されたり、失った組織を復旧するための細胞治療剤として利用されている。
上記幹細胞または初代培養細胞は、本発明の組成物によって安定的に常温または低温保存されることができる細胞ならば特にその由来に制限はなく、その例として、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ由来の細胞がある。上記幹細胞または初代培養細胞は、望ましくはヒト由来の幹細胞または初代培養細胞であるが、これに制限されない。
一側面において、本発明は、本発明の細胞保存用組成物を細胞に処理する段階を含む細胞保存方法に関するものである。
一具現例で、本発明の細胞保存用組成物を細胞に処理して３０℃以下で保存することができ、望ましくは常温または０℃乃至１０℃の低温で、最も望ましくは４℃で保存することができる。
本発明で、用語“常温”は、１８℃乃至２７℃を意味する。
下記実施例を通して本発明をより詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであるだけで、これにより本発明が限定されるわけではない。
発明の実施のための形態
実施例．アニマルフリー及びゼノフリー細胞保存用組成物の製造
幹細胞または初代培養細胞をゼノフリーで安定的に保存することができる常温または低温保存用の細胞保存用組成物を製造するために、イネ（rice）から抽出したヒト組換えアルブミン（rAlbumin ACF，Sheffield Bio-Science，USA）及び大豆（soybean）から抽出した植物性ペプチド（UltraPepTMSoy，Sheffield Bio-Science，USA）を有効成分として利用しフェノールレッドが含有されていない基本培地に混合して細胞保存用組成物を製造し、これをＣＥＦＯ−ｖｉｖｅと名付けた。製造された保存用組成物に、ヒト組換えアルブミンは１重量％使用し、植物性ペプチドは５重量％使用した。上記植物性ペプチドのアミノ酸組成を下記表１に表示した。また、細胞保存用組成物ＣＥＦＯ−ｖｉｖｏの具体的な無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸成分及びその他成分の含量を表２、表３、表４、表５ 及び表６に示した。
実施例．アニマルフリー及びゼノフリー細胞保存用組成物の製造
幹細胞または初代培養細胞をゼノフリーで安定的に保存することができる常温または低温保存用の細胞保存用組成物を製造するために、イネ（rice）から抽出したヒト組換えアルブミン（rAlbumin ACF，Sheffield Bio-Science，USA）及び大豆（soybean）から抽出した植物性ペプチド（UltraPepTMSoy，Sheffield Bio-Science，USA）を有効成分として利用しフェノールレッドが含有されていない基本培地に混合して細胞保存用組成物を製造し、これをＣＥＦＯ−ｖｉｖｅと名付けた。製造された保存用組成物に、ヒト組換えアルブミンは１重量％使用し、植物性ペプチドは５重量％使用した。上記植物性ペプチドのアミノ酸組成を下記表１に表示した。また、細胞保存用組成物ＣＥＦＯ−ｖｉｖｏの具体的な無機塩類、アミノ酸、ビタミン、核酸成分及びその他成分の含量を表２、表３、表４、表５ 及び表６に示した。
実験例１．細胞保存用組成物の細胞生存率の確認
＜幹細胞または初代培養細胞の準備＞
患者から寄贈された臍帯（Umbilical cord）、脂肪組職（adipose）及び骨髄（Bone marrow）から各々ＵＣＭＳＣ（Umbilical cord mesenchymal stem cell）、ＡＤＭＳＣ（adipose derived mesenchymal stem cell）及びＢＭＭＳＣ（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell）を直接抽出した。上記幹細胞の培養液としては、CEFOgroTMUCMSC、CEFOgroTMADMSC及びCEFOgroTMBMMSC 培地（基本培地）を使った。初代培養細胞としては、ヒト皮膚由来線維芽細胞（Human diploid fibroblast，ＨＤＦ）を使い、CEFOgroTMHF培地で培養した。上記細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件の培養器で培養し、３日に一回ずつ培養液を交換して維持した。本発明の全ての実験は、 （株）細胞バイオの器官生命倫理審議委員会の承認を受けて生命倫理及び安全に関する法律による手順及び方法を通して進行された。
＜幹細胞または初代培養細胞の準備＞
患者から寄贈された臍帯（Umbilical cord）、脂肪組職（adipose）及び骨髄（Bone marrow）から各々ＵＣＭＳＣ（Umbilical cord mesenchymal stem cell）、ＡＤＭＳＣ（adipose derived mesenchymal stem cell）及びＢＭＭＳＣ（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell）を直接抽出した。上記幹細胞の培養液としては、CEFOgroTMUCMSC、CEFOgroTMADMSC及びCEFOgroTMBMMSC 培地（基本培地）を使った。初代培養細胞としては、ヒト皮膚由来線維芽細胞（Human diploid fibroblast，ＨＤＦ）を使い、CEFOgroTMHF培地で培養した。上記細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件の培養器で培養し、３日に一回ずつ培養液を交換して維持した。本発明の全ての実験は、 （株）細胞バイオの器官生命倫理審議委員会の承認を受けて生命倫理及び安全に関する法律による手順及び方法を通して進行された。
＜低温保存後の細胞計数＞
幹細胞であるＵＣＭＳＣ、ＡＤＭＳＣ及びＢＭＭＳＣをそれぞれの基本培地で培養した後、トリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集した。捕集したそれぞれの細胞を上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水にそれぞれ入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、保管６日目まで生存細胞数を計数して細胞生存を確認した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、基本培地や生理食塩水とは異なり、保存６日目にも平均７０％以上の細胞生存率を示した（図１、図２及び図３）。また、初代培養細胞であるヒト皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）をCEFOgroTMHF培地で培養し、培養した後にトリプシンを処理して捕集した。捕集した細胞を上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水にそれぞれ入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、保管６日目まで生存細胞数を計数して細胞生存を確認した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、保存５日目にも平均９０％以上の細胞生存率を示したが、基本培地や生理食塩水では保存２日目から細胞生存率が急激に減少することが確認できた（図４）。
幹細胞であるＵＣＭＳＣ、ＡＤＭＳＣ及びＢＭＭＳＣをそれぞれの基本培地で培養した後、トリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集した。捕集したそれぞれの細胞を上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水にそれぞれ入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、保管６日目まで生存細胞数を計数して細胞生存を確認した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、基本培地や生理食塩水とは異なり、保存６日目にも平均７０％以上の細胞生存率を示した（図１、図２及び図３）。また、初代培養細胞であるヒト皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）をCEFOgroTMHF培地で培養し、培養した後にトリプシンを処理して捕集した。捕集した細胞を上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水にそれぞれ入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、保管６日目まで生存細胞数を計数して細胞生存を確認した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、保存５日目にも平均９０％以上の細胞生存率を示したが、基本培地や生理食塩水では保存２日目から細胞生存率が急激に減少することが確認できた（図４）。
＜細胞低温保存後、培養された細胞を観察＞
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水に入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で培養した。細胞培養２４時間以後に顕微鏡を用いて細胞を観察した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、冷蔵保管５日目にも細胞再培養時細胞が培養皿によく付着されて培養されることが確認できたが、この他の基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、冷蔵保管２日目から細胞が培養皿に適応できずそのまま死滅することが確認できた（図５）。
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例の細胞保存用組成物（ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ）、基本培地または生理食塩水に入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で培養した。細胞培養２４時間以後に顕微鏡を用いて細胞を観察した。その結果、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅを使った場合、冷蔵保管５日目にも細胞再培養時細胞が培養皿によく付着されて培養されることが確認できたが、この他の基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、冷蔵保管２日目から細胞が培養皿に適応できずそのまま死滅することが確認できた（図５）。
＜低温保存後、細胞表面因子を確認＞
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例のＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ、基本培地または生理食塩水に入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で４日間培養した。その後、それぞれの細胞を捕集し、間葉系幹細胞の細胞表面因子として知られているＣＤマーカー（ＣＤ３１、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６）の変化をフローサイトメーターを用いて確認した。しかし、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞を除いた基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、４日間培養時、分析に使用できるだけの細胞が得られなかった。よって、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞群でのみフローサイトメトリーを行った。その結果、１日目、２日目、３日目、４日目及び５日目にCD31(-)、CD73(+)、CD105(+)及びCD146(+)と現れ、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで幹細胞を冷蔵保管した場合、細胞の形態や細胞表面タンパク質の発現に変化がないことが確認できた（図６及び７、図８及び９、図１０及び１１、及び図１２及び１３）。
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例のＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ、基本培地または生理食塩水に入れて冷蔵保管（４℃）した後、毎日３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で４日間培養した。その後、それぞれの細胞を捕集し、間葉系幹細胞の細胞表面因子として知られているＣＤマーカー（ＣＤ３１、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６）の変化をフローサイトメーターを用いて確認した。しかし、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞を除いた基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、４日間培養時、分析に使用できるだけの細胞が得られなかった。よって、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞群でのみフローサイトメトリーを行った。その結果、１日目、２日目、３日目、４日目及び５日目にCD31(-)、CD73(+)、CD105(+)及びCD146(+)と現れ、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで幹細胞を冷蔵保管した場合、細胞の形態や細胞表面タンパク質の発現に変化がないことが確認できた（図６及び７、図８及び９、図１０及び１１、及び図１２及び１３）。
＜常温保存後、細胞表面因子を確認＞
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例のＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ、基本培地または生理食塩水に入れて常温保管 （２５℃）した後、１日目または３日目に３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で４日間培養した。その後、それぞれの細胞を捕集し、間葉系幹細胞の細胞表面因子として知られているＣＤマーカー（ＣＤ３１、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６）の変化をフローサイトメーターを用いて確認した。しかし、常温保存の場合も、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞を除いた基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、４日間培養時、分析に使用できるだけの細胞が得られなかった。よって、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞群でのみフローサイトメトリーを行った結果、１日目及び３日目にCD31(-)、CD73(+)、CD105(+)及びCD146(+)と現れ、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで幹細胞を冷蔵保管した場合、細胞の形態や細胞表面タンパク質の発現に変化がないことが確認できた（図１４、図１５、図１６及び図１７）。
ＵＣＭＳＣをCEFOgroTMUCMSCで培養した後にトリプシンを処理して細胞別にそれぞれ捕集し、上記実施例のＣＥＦＯ−ｖｉｖｅ、基本培地または生理食塩水に入れて常温保管 （２５℃）した後、１日目または３日目に３バイアルずつ取り出し、培養皿に接種してCEFOgroTMUCMSC培地で４日間培養した。その後、それぞれの細胞を捕集し、間葉系幹細胞の細胞表面因子として知られているＣＤマーカー（ＣＤ３１、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６）の変化をフローサイトメーターを用いて確認した。しかし、常温保存の場合も、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞を除いた基本培地または生理食塩水を用いた細胞の場合は、４日間培養時、分析に使用できるだけの細胞が得られなかった。よって、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで保存した細胞群でのみフローサイトメトリーを行った結果、１日目及び３日目にCD31(-)、CD73(+)、CD105(+)及びCD146(+)と現れ、ＣＥＦＯ−ｖｉｖｅで幹細胞を冷蔵保管した場合、細胞の形態や細胞表面タンパク質の発現に変化がないことが確認できた（図１４、図１５、図１６及び図１７）。
上記の結果を通して、アニマルフリー及びゼノフリーの植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有する本発明の細胞保存用組成物を利用すれば、常温または低温での細胞保存において細胞生存が保障され、細胞の形態または表面発現因子の変化なしに安定することが分かった。
Claims (10)
- 植物由来組換えヒト血清アルブミン、または植物由来組換えヒト血清アルブミンおよび植物性ペプチドを有効成分として含有する細胞保存用組成物。
- 植物由来組換えヒト血清アルブミンを有効成分として含有し、総組成物１００重量部に対して植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．１重量部乃至２０重量部含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞保存用組成物。
- 植物由来組換えヒト血清アルブミン及び植物性ペプチドを有効成分として含有し、総組成物１００重量部に対して植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．１乃至１０重量部及び植物性ペプチドを０．１重量部乃至１０重量部含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞保存用組成物。
- 上記細胞は、幹細胞または初代培養細胞であることを特徴とする請求項１に記載の細胞保存用組成物。
- 上記幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cell）、脂肪由来間葉系幹細胞（adipose derived mesenchymal stem cell）または骨髄由来間葉系幹細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell）であることを特徴とする請求項４に記載の細胞保存用組成物。
- ゼノフリー（xeno-free）及びアニマルフリー（animal-free）であることを特徴とする請求項１に記載の細胞保存用組成物。
- 上記植物由来組換えヒト血清アルブミンはイネ由来であり、植物性ペプチドは大豆由来であることを特徴とする請求項１に記載の細胞保存用組成物。
- 請求項１〜７のいずれか一項の細胞保存用組成物を細胞に処理する段階を含む細胞保存方法。
- 細胞保存用組成物を細胞に処理して３０℃以下で保存する段階を含む請求項８に記載の細胞保存方法。
- 細胞保存用組成物を細胞に処理して０℃乃至１０℃で保存する段階を含む請求項８に記載の細胞保存方法。
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|---|---|---|---|
| KR1020140102083A KR101668743B1 (ko) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 식물성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 세포 보존용 조성물 |
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