JP2017524363A - アグリコシル化された酵素およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年8月8日に出願された米国仮特許出願第62/035,346号の恩典を主張し;その全内容はこれにより、参照により組み込まれる。
本出願は配列表を含み、これはASCII形式で電子的に提出され、これによりその全体が参照により組み込まれる。2015年8月5日に作成された前記ASCIIコピーはX2002−7000WO_SL.txtと命名され、サイズは76,949バイトである。
本発明は、一般にセロビアーゼ活性を有する組成物および本明細書で記載される組成物を生成させるための方法に関する。本発明はまた、例えば、バイオマス材料を加工処理するためにそのような組成物を使用するための方法を提供する。
別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、発明が属する当分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
グリコシル化は、酵素構造および機能、例えば酵素活性、溶解度、安定性、フォールディング、および/または分泌において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、バイオマスをバイオ燃料および他の生成物に変換するためのプロセスは、セルロースおよび/またはリグノセルロース材料の糖化に使用するための、グリコシル化された酵素、例えば、セロビアーゼの生成および利用に焦点をあてている。糖化に使用するための酵素は典型的には、タンパク質を適正にグリコシル化し、折り畳み、および分泌する真核宿主細胞株、例えばピキア・パストリスにおいて生成される。
本開示は、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを提供する。1つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドはセロビアーゼである。セロビアーゼは、その基質であるセロビオース中のβ−1,4結合を加水分解し、2つのグルコース分子を放出させる酵素である。セロビオースは水溶性のグルコースの1,4−連結二量体である。
MGDSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKISYPSLCLQDGPLGVRYSTGSTAFTPGVQAASTWDVNLIRERGQFIGEEVKASGIHVILGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMGQTINGIQSVGVQATAKHYILNEQELNRETISSNPDDRTLHELYTWPFADAVQANVASVMCSYNKVNTTWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGPALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKPASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGASAARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAVVWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWVVPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVAGSGS
(SEQ ID NO: 1)
本発明はまた、本発明のセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。1つの実施形態では、核酸配列は、本明細書で記載されるアミノ酸配列を有するCel3a酵素またはその機能的断片をコードする。
ATGCGTTACCGAACAGCAGCTGCGCTGGCACTTGCCACTGGGCCCTTTGCTAGGGCAGACAGTCACTCAACATCGGGGGCCTCGGCTGAGGCAGTTGTACCTCCTGCAGGGACTCCATGGGGAACCGCGTACGACAAGGCGAAGGCCGCATTGGCAAAGCTCAATCTCCAAGATAAGGTCGGCATCGTGAGCGGTGTCGGCTGGAACGGCGGTCCTTGCGTTGGAAACACATCTCCGGCCTCCAAGATCAGCTATCCATCGCTATGCCTTCAAGACGGACCCCTCGGTGTTCGATACTCGACAGGCAGCACAGCCTTTACGCCGGGCGTTCAAGCGGCCTCGACGTGGGATGTCAATTTGATCCGCGAACGTGGACAGTTCATCGGTGAGGAGGTGAAGGCCTCGGGGATTCATGTCATACTTGGTCCTGTGGCTGGGCCGCTGGGAAAGACTCCGCAGGGCGGTCGCAACTGGGAGGGCTTCGGTGTCGATCCATATCTCACGGGCATTGCCATGGGTCAAACCATCAACGGCATCCAGTCGGTAGGCGTGCAGGCGACAGCGAAGCACTATATCCTCAACGAGCAGGAGCTCAATCGAGAAACCATTTCGAGCAACCCAGATGACCGAACTCTCCATGAGCTGTATACTTGGCCATTTGCCGACGCGGTTCAGGCCAATGTCGCTTCTGTCATGTGCTCGTACAACAAGGTCAATACCACCTGGGCCTGCGAGGATCAGTACACGCTGCAGACTGTGCTGAAAGACCAGCTGGGGTTCCCAGGCTATGTCATGACGGACTGGAACGCACAGCACACGACTGTCCAAAGCGCGAATTCTGGGCTTGACATGTCAATGCCTGGCACAGACTTCAACGGTAACAATCGGCTCTGGGGTCCAGCTCTCACCAATGCGGTAAATAGCAATCAGGTCCCCACGAGCAGAGTCGACGATATGGTGACTCGTATCCTCGCCGCATGGTACTTGACAGGCCAGGACCAGGCAGGCTATCCGTCGTTCAACATCAGCAGAAATGTTCAAGGAAACCACAAGACCAATGTCAGGGCAATTGCCAGGGACGGCATCGTTCTGCTCAAGAATGACGCCAACATCCTGCCGCTCAAGAAGCCCGCTAGCATTGCCGTCGTTGGATCTGCCGCAATCATTGGTAACCACGCCAGAAACTCGCCCTCGTGCAACGACAAAGGCTGCGACGACGGGGCCTTGGGCATGGGTTGGGGTTCCGGCGCCGTCAACTATCCGTACTTCGTCGCGCCCTACGATGCCATCAATACCAGAGCGTCTTCGCAGGGCACCCAGGTTACCTTGAGCAACACCGACAACACGTCCTCAGGCGCATCTGCAGCAAGAGGAAAGGACGTCGCCATCGTCTTCATCACCGCCGACTCGGGTGAAGGCTACATCACCGTGGAGGGCAACGCGGGCGATCGCAACAACCTGGATCCGTGGCACAACGGCAATGCCCTGGTCCAGGCGGTGGCCGGTGCCAACAGCAACGTCATTGTTGTTGTCCACTCCGTTGGCGCCATCATTCTGGAGCAGATTCTTGCTCTTCCGCAGGTCAAGGCCGTTGTCTGGGCGGGTCTTCCTTCTCAGGAGAGCGGCAATGCGCTCGTCGACGTGCTGTGGGGAGATGTCAGCCCTTCTGGCAAGCTGGTGTACACCATTGCGAAGAGCCCCAATGACTATAACACTCGCATCGTTTCCGGCGGCAGTGACAGCTTCAGCGAGGGACTGTTCATCGACTATAAGCACTTCGACGACGCCAATATCACGCCGCGGTACGAGTTCGGCTATGGACTGTCTTACACCAAGTTCAACTACTCACGCCTCTCCGTCTTGTCGACCGCCAAGTCTGGTCCTGCGACTGGGGCCGTTGTGCCGGGAGGCCCGAGTGATCTGTTCCAGAATGTCGCGACAGTCACCGTTGACATCGCAAACTCTGGCCAAGTGACTGGTGCCGAGGTAGCCCAGCTGTACATCACCTACCCATCTTCAGCACCCAGGACCCCTCCGAAGCAGCTGCGAGGCTTTGCCAAGCTGAACCTCACGCCTGGTCAGAGCGGAACAGCAACGTTCAACATCCGACGACGAGATCTCAGCTACTGGGACACGGCTTCGCAGAAATGGGTGGTGCCGTCGGGGTCGTTTGGCATCAGCGTGGGAGCGAGCAGCCGGGATATCAGGCTGACGAGCACTCTGTCGGTAGCG
(SEQ ID NO:2)
ATGCGTTATCGTACAGCCGCAGCCCTGGCACTGGCCACAGGTCCGTTCGCACGTGCCGATAGTCACAGTACCAGCGGTGCCAGCGCAGAAGCCGTGGTTCCGCCGGCAGGCACACCGTGGGGCACAGCCTATGATAAAGCCAAAGCCGCCCTGGCCAAGCTGAATCTGCAGGATAAAGTGGGCATCGTGAGTGGCGTGGGCTGGAACGGTGGTCCGTGCGTTGGCAACACCAGCCCGGCAAGCAAGATCAGCTATCCGAGCTTATGCCTGCAGGATGGTCCGCTGGGCGTGCGCTATAGCACCGGTAGTACCGCCTTTACACCTGGTGTGCAGGCCGCCAGTACCTGGGACGTTAACCTGATCCGCGAACGTGGCCAATTTATCGGCGAAGAAGTTAAAGCCAGCGGCATTCATGTTATTCTGGGTCCGGTGGCCGGTCCTCTGGGTAAAACCCCGCAGGGCGGCCGTAATTGGGAAGGCTTCGGCGTTGATCCGTATTTAACCGGCATCGCAATGGGCCAGACCATTAATGGCATCCAGAGCGTGGGTGTTCAAGCCACCGCCAAACACTACATATTAAACGAACAGGAACTGAATCGTGAAACCATCAGCAGCAATCCGGATGATCGCACCCTGCATGAGCTGTATACATGGCCTTTTGCCGACGCAGTTCAGGCCAACGTGGCAAGTGTGATGTGTAGCTATAACAAGGTGAACACCACCTGGGCCTGCGAAGACCAGTACACCCTGCAGACCGTTTTAAAAGACCAACTGGGCTTCCCTGGTTACGTGATGACAGATTGGAATGCCCAGCACACAACCGTTCAGAGCGCAAACAGTGGCCTGGATATGAGCATGCCGGGCACCGACTTCAACGGCAATAATCGTCTGTGGGGTCCGGCACTGACCAATGCCGTTAACAGCAACCAGGTGCCGACCAGTCGTGTGGACGATATGGTTACCCGTATTCTGGCCGCCTGGTACCTGACAGGTCAAGACCAGGCCGGCTACCCGAGCTTCAACATCAGCCGCAACGTGCAGGGTAATCACAAGACCAACGTTCGCGCAATCGCACGCGATGGTATCGTGCTGTTAAAGAACGATGCCAACATTCTGCCGCTGAAAAAACCGGCCAGCATCGCCGTTGTTGGTAGCGCAGCCATCATTGGCAACCACGCCCGTAACAGTCCGAGCTGCAATGATAAAGGCTGTGACGACGGTGCCCTGGGCATGGGTTGGGGTAGTGGTGCCGTGAACTACCCGTATTTCGTGGCCCCGTACGACGCCATTAACACCCGTGCAAGTAGCCAGGGTACCCAGGTTACCCTGAGCAACACCGACAACACAAGCAGCGGTGCCAGTGCAGCACGTGGTAAGGATGTGGCCATCGTGTTCATCACCGCCGACAGCGGCGAAGGCTACATTACCGTGGAGGGTAATGCCGGTGATCGCAATAATCTGGACCCGTGGCATAACGGCAACGCCCTGGTTCAGGCAGTGGCAGGCGCAAATAGCAACGTGATCGTTGTGGTGCATAGCGTGGGTGCCATCATTCTGGAGCAGATCCTGGCCCTGCCGCAAGTTAAGGCAGTTGTGTGGGCAGGTCTGCCGAGCCAAGAAAGTGGCAATGCCCTGGTGGACGTTCTGTGGGGCGATGTTAGTCCGAGCGGCAAGCTGGTGTATACAATCGCCAAGAGCCCGAACGACTATAACACCCGCATCGTTAGCGGCGGCAGTGATAGCTTCAGCGAGGGCCTGTTTATCGACTACAAGCATTTCGATGATGCCAATATTACCCCGCGCTACGAATTTGGTTATGGCCTGAGCTATACCAAGTTCAACTACAGCCGCCTGAGCGTTTTAAGTACCGCCAAGAGTGGTCCGGCAACAGGTGCCGTGGTTCCTGGTGGTCCGAGTGATCTGTTTCAGAATGTGGCCACCGTGACCGTGGATATCGCCAACAGTGGTCAGGTTACCGGCGCCGAAGTGGCACAGCTGTACATCACCTATCCGAGCAGTGCACCGCGCACCCCGCCGAAACAGCTGCGTGGCTTCGCCAAATTAAACCTGACCCCGGGCCAGAGCGGTACAGCAACCTTCAATATTCGCCGCCGTGATCTGAGCTATTGGGACACCGCCAGCCAAAAATGGGTGGTGCCGAGCGGCAGCTTTGGCATTAGTGTGGGTGCAAGTAGCCGCGACATTCGCTTAACAAGCACCCTGAGTGTTGCC
(SEQ ID NO:3)
本発明はまた、発現されるポリペプチドの発現、分泌、および/または単離を管理する1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
本発明はさらに、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を提供する。方法は本発明のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することを含む。方法はまた、アグリコシル化されたポリペプチドを組換え宿主細胞から回収することを含み得る。
複数の実施形態では、発現ベクターは融合タグに作動可能に連結された、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、細胞、例えば、細菌宿主細胞において発現されるタンパク質を著しくはグリコシル化しない細胞中に導入され、発現される。組換え宿主細胞はポリペプチドの発現のための条件下で培養され、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドが生成される。アグリコシル化されたポリペプチドは宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
別の実施形態では、本明細書で記載されるように、ポリペプチドがグリコシル化されないように、1つ以上のグリコシル化部位突然変異を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターが宿主細胞において発現され、ここで、宿主細胞は細胞、例えば、酵母または真菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。あるいは、宿主細胞は、細胞、例えば、細菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができない。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。アグリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
本発明は、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを使用して、バイオマスを生成物に変換または加工処理するための方法および組成物を提供する。バイオマスを生成物、例えば糖生成物に変換するための方法は、例えば、米国特許出願2014/0011258号(その内容は、その全体として参照により組み込まれる)に記載されるように、当技術分野で知られている。簡単に言うと、バイオマスは、例えば、不応性を低減させるために、最適に前処理され、被処理バイオマスをバイオマス分解、またはセルロース分解性酵素と共にインキュベートし、糖(例えば、グルコースおよび/またはキシロース)を生成させることを含む糖化プロセスにより糖化される。糖生成物はその後、さらに、例えば、発酵または蒸留により加工処理することができ、最終生成物が生成される。最終生成物としては、アルコール(例えば、エタノール、イソブタノール、またはn−ブタノール)、糖アルコール(例えば、エリスリトール、キシリトール、またはソルビトール)、または有機酸(例えば、乳酸、ピルビン酸(pyurvic acid)、コハク酸)が挙げられる。
本明細書で記載される方法を用いて加工処理されるバイオマスは澱粉質材料および/またはセルロースを含むセルロース材料、例えば、リグノセルロース材料である。バイオマスはまた、ヘミセルロースおよび/またはリグニンを含み得る。バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物、またはそれらの任意の組み合わせの1つ以上を含むことができる。農産物または農業廃棄物は、例えば、栽培され、収穫され、または使用もしくはヒトまたは動物による消費のために加工処理され得る材料、または栽培、収穫、または加工処理法から生成される任意の中間体、副産物、または廃棄物を含む。農産物または廃棄物としてはサトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。紙製品または紙屑は、紙製品を製造するために使用される材料、任意の紙製品、または紙製品の製造または分解から生成される任意の中間体、副産物もしくは廃棄物を含む。紙製品または廃棄物としては、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、段ボール紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。林産物または廃棄物は木材の栽培、収穫、または加工処理により生成される材料、または木材の栽培、収穫、または加工処理から生成される任意の中間体、副産物、もしくは廃棄物を含む。林産物または廃棄物としては、アスペン材、任意の属または種の木由来の木材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一般廃棄物としては、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
不応性が低減されたバイオマスは、上記のバイオマス分解酵素により、一般に、不応性が低減されたバイオマスとバイオマス分解酵素を流体媒質、例えば、水溶液中で合わせることにより処理される。場合によっては、原料は糖化前に、2012年4月26日に公開されたMedoffおよびMastermanによる米国特許出願公開2012/0100577 A1号(その全内容は本明細書に組み込まれる)に記載されるように、熱水中で煮沸され、浸され、加熱処理される。
本発明は、SEQ ID NO:1に対し、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一性を含むグリコシル化されたポリペプチド、およびSEQ ID NO:1に対し、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一性を含むアグリコシル化されたポリペプチドを含む酵素混合物を提供し、ここで、グリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたポリペプチドのどちらもセロビアーゼ活性を有する。セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、例えば、本明細書で記載される方法を使用して生成された、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドのいずれかである。SEQ ID NO:1に対し、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一性を含むグリコシル化されたポリペプチドは、内因的にポリペプチドを発現する微生物から単離または取得することができる。
B2AF03(ポドスポラ・アンセリナ)
MKSSVFWGASLTSAVVRAIDLPFQFYPNCVDDLLSTNQVCNTTLSPPERAAALVAALTPEEKLQNIVSKSLGAPRIGLPAYNWWSEALHGVAYAPGTQFWQGDGPFNSSTSFPMPLLMAATFDDELLEKIAEVIGIEGRAFGNAGFSGLDYWTPNVNPFKDPRWGRGSETPGEDVLLVKRYAAAMIKGLEGPVPEKERRVVATCKHYAANDFEDWNGATRHNFNAKISLQDMAEYYFMPFQQCVRDSRVGSIMCAYNAVNGVPSCASPYLLQTILREHWNWTEHNNYITSDCEAVLDVSLNHKYAATNAEGTAISFEAGMDTSCEYEGSSDIPGAWSQGLLKESTVDRALLRLYEGIVRAGYFDGKQSLYSSLGWADVNKPSAQKLSLQAAVDGTVLLKNDGTLPLSDLLDKSRPKKVAMIGFWSDAKDKLRGGYSGTAAYLHTPAYAASQLGIPFSTASGPILHSDLASNQSWTDNAMAAAKDADYILYFGGIDTSAAGETKDRYDLDWPGAQLSLINLLTTLSKPLIVLQMGDQLDNTPLLSNPKINAILWANWPGQDGGTAVMELVTGLKSPAGRLPVTQYPSNFTELVPMTDMALRPSAGNSQLGRTYRWYKTPVQAFGFGLHYTTFSPKFGKKFPAVIDVDEVLEGCDDKYLDTCPLPDLPVVVENRGNRTSDYVALAFVSAPGVGPGPWPIKTLGAFTRLRGVKGGEKREGGLKWNLGNLARHDEEGNTVVYPGKYEVSLDEPPKARLRFEIVRGGKGKGKVKGKGKAAQKGGVVLDRWPKPPKGQEPPAIERV(SEQ ID NO:9)
CIP1(トリコデルマ・リーセイ)
MVRRTALLALGALSTLSMAQISDDFESGWDQTKWPISAPDCNQGGTVSLDTTVAHSGSNSMKVVGGPNGYCGHIFFGTTQVPTGDVYVRAWIRLQTALGSNHVTFIIMPDTAQGGKHLRIGGQSQVLDYNRESDDATLPDLSPNGIASTVTLPTGAFQCFEYHLGTDGTIETWLNGSLIPGMTVGPGVDNPNDAGWTRASYIPEITGVNFGWEAYSGDVNTVWFDDISIASTRVGCGPGSPGGPGSSTTGRSSTSGPTSTSRPSTTIPPPTSRTTTATGPTQTHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL(SEQ ID NO:10)
CIP2(トリコデルマ・リーセイ)
MASRFFALLLLAIPIQAQSPVWGQCGGIGWSGPTTCVGGATCVSYNPYYSQCIPSTQASSSIASTTLVTSFTTTTATRTSASTPPASSTGAGGATCSALPGSITLRSNAKLNDLFTMFNGDKVTTKDKFSCRQAEMSELIQRYELGTLPGRPSTLTASFSGNTLTINCGEAGKSISFTVTITYPSSGTAPYPAIIGYGGGSLPAPAGVAMINFNNDNIAAQVNTGSRGQGKFYDLYGSSHSAGAMTAWAWGVSRVIDALELVPGARIDTTKIGVTGCSRNGKGAMVAGAFEKRIVLTLPQESGAGGSACWRISDYLKSQGANIQTASEIIGEDPWFSTTFNSYVNQVPVLPFDHHSLAALIAPRGLFVIDNNIDWLGPQSCFGCMTAAHMAWQALGVSDHMGYSQIGAHAHCAFPSNQQSQLTAFVQKFLLGQSTNTAIFQSDFSANQSQWIDWTTPTLS(SEQ ID NO:11)
Cel1a(トリコデルマ・リーセイ)
MLPKDFQWGFATAAYQIEGAVDQDGRGPSIWDTFCAQPGKIADGSSGVTACDSYNRTAEDIALLKSLGAKSYRFSISWSRIIPEGGRGDAVNQAGIDHYVKFVDDLLDAGITPFITLFHWDLPEGLHQRYGGLLNRTEFPLDFENYARVMFRALPKVRNWITFNEPLCSAIPGYGSGTFAPGRQSTSEPWTVGHNILVAHGRAVKAYRDDFKPASGDGQIGIVLNGDFTYPWDAADPADKEAAERRLEFFTAWFADPIYLGDYPASMRKQLGDRLPTFTPEERALVHGSNDFYGMNHYTSNYIRHRSSPASADDTVGNVDVLFTNKQGNCIGPETQSPWLRPCAAGFRDFLVWISKRYGYPPIYVTENGTSIKGESDLPKEKILEDDFRVKYYNEYIRAMVTAVELDGVNVKGYFAWSLMDNFEWADGYVTRFGVTYVDYENGQKRFPKKSAKSLKPLFDELIAAA(SEQ ID NO:12)
Cel3a(トリコデルマ・リーセイ)
MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKISYPSLCLQDGPLGVRYSTGSTAFTPGVQAASTWDVNLIRERGQFIGEEVKASGIHVILGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMGQTINGIQSVGVQATAKHYILNEQELNRETISSNPDDRTLHELYTWPFADAVQANVASVMCSYNKVNTTWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGPALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKPASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGASAARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAVVWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWVVPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA(SEQ ID NO:13)
Cel5a(トリコデルマ・リーセイ)
MNKSVAPLLLAASILYGGAAAQQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTITTSTRPPSGPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNDDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVWFGIMNEPHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTNNIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK(SEQ ID NO:14)
Cel6a(トリコデルマ・リーセイ)
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL(SEQ ID NO:15)
Cel7a(トリコデルマ・リーセイ)
MYRKLAVISAFLATARAQSACTLQSETHPPLTWQKCSSGGTCTQQTGSVVIDANWRWTHATNSSTNCYDGNTWSSTLCPDNETCAKNCCLDGAAYASTYGVTTSGNSLSIGFVTQSAQKNVGARLYLMASDTTYQEFTLLGNEFSFDVDVSQLPCGLNGALYFVSMDADGGVSKYPTNTAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGQANVEGWEPSSNNANTGIGGHGSCCSEMDIWEANSISEALTPHPCTTVGQEICEGDGCGGTYSDNRYGGTCDPDGCDWNPYRLGNTSFYGPGSSFTLDTTKKLTVVTQFETSGAINRYYVQNGVTFQQPNAELGSYSGNELNDDYCTAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKKATSGGMVLVMSLWDDYYANMLWLDSTYPTNETSSTPGAVRGSCSTSSGVPAQVESQSPNAKVTFSNIKFGPIGSTGNPSGGNPPGGNPPGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL(SEQ ID NO:16)
Cel7b(トリコデルマ・リーセイ)
MAPSVTLPLTTAILAIARLVAAQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTKSGGCVAQDTSVVLDWNYRWMHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIEGVDYAASGVTTSGSSLTMNQYMPSSSGGYSSVSPRLYLLDSDGEYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENGSLYLSQMDENGGANQYNTAGANYGSGYCDAQCPVQTWRNGTLNTSHQGFCCNEMDILEGNSRANALTPHSCTATACDSAGCGFNPYGSGYKSYYGPGDTVDTSKTFTIITQFNTDNGSPSGNLVSITRKYQQNGVDIPSAQPGGDTISSCPSASAYGGLATMGKALSSGMVLVFSIWNDNSQYMNWLDSGNAGPCSSTEGNPSNILANNPNTHVVFSNIRWGDIGSTTNSTAPPPPPASSTTFSTTRRSSTTSSSPSCTQTHWGQCGGIGYSGCKTCTSGTTCQYSNDYYSQCL(SEQ ID NO:17)
Cel12a(トリコデルマ・リーセイ)
MKFLQVLPALIPAALAQTSCDQWATFTGNGYTVSNNLWGASAGSGFGCVTAVSLSGGASWHADWQWSGGQNNVKSYQNSQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTAANPNHVTYSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYNGAMQVYSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGSGTLNVASWTASIN(SEQ ID NO:18)
Cel45a(トリコデルマ・リーセイ)
MKATLVLGSLIVGAVSAYKATTTRYYDGQEGACGCGSSSGAFPWQLGIGNGVYTAAGSQALFDTAGASWCGAGCGKCYQLTSTGQAPCSSCGTGGAAGQSIIVMVTNLCPNNGNAQWCPVVGGTNQYGYSYHFDIMAQNEIFGDNVVVDFEPIACPGQAASDWGTCLCVGQQETDPTPVLGNDTGSTPPGSSPPATSSSPPSGGGQQTLYGQCGGAGWTGPTTCQAPGTCKVQNQWYSQCLP(SEQ ID NO:19)
Cel74a(トリコデルマ・リーセイ)
MKVSRVLALVLGAVIPAHAAFSWKNVKLGGGGGFVPGIIFHPKTKGVAYARTDIGGLYRLNADDSWTAVTDGIADNAGWHNWGIDAVALDPQDDQKVYAAVGMYTNSWDPSNGAIIRSSDRGATWSFTNLPFKVGGNMPGRGAGERLAVDPANSNIIYFGARSGNGLWKSTDGGVTFSKVSSFTATGTYIPDPSDSNGYNSDKQGLMWVTFDSTSSTTGGATSRIFVGTADNITASVYVSTNAGSTWSAVPGQPGKYFPHKAKLQPAEKALYLTYSDGTGPYDGTLGSVWRYDIAGGTWKDITPVSGSDLYFGFGGLGLDLQKPGTLVVASLNSWWPDAQLFRSTDSGTTWSPIWAWASYPTETYYYSISTPKAPWIKNNFIDVTSESPSDGLIKRLGWMIESLEIDPTDSNHWLYGTGMTIFGGHDLTNWDTRHNVSIQSLADGIEEFSVQDLASAPGGSELLAAVGDDNGFTFASRNDLGTSPQTVWATPTWATSTSVDYAGNSVKSVVRVGNTAGTQQVAISSDGGATWSIDYAADTSMNGGTVAYSADGDTILWSTASSGVQRSQFQGSFASVSSLPAGAVIASDKKTNSVFYAGSGSTFYVSKDTGSSFTRGPKLGSAGTIRDIAAHPTTAGTLYVSTDVGIFRSTDSGTTFGQVSTALTNTYQIALGVGSGSNWNLYAFGTGPSGARLYASGDSGASWTDIQGSQGFGSIDSTKVAGSGSTAGQVYVGTNGRGVFYAQGTVGGGTGGTSSSTKQSSSSTSSASSSTTLRSSVVSTTRASTVTSSRTSSAAGPTGSGVAGHYAQCGGIGWTGPTQCVAPYVCQKQNDYYYQCV(SEQ ID NO:20)
paMan5a(ポドスポラ・アンセリナ)
MKGLFAFGLGLLSLVNALPQAQGGGAAASAKVSGTRFVIDGKTGYFAGTNSYWIGFLTNNRDVDTTLDHIASSGLKILRVWGFNDVNNQPSGNTVWFQRLASSGSQINTGPNGLQRLDYLVRSAETRGIKLIIALVNYWDDFGGMKAYVNAFGGTKESWYTNARAQEQYKRYIQAVVSRYVNSPAIFAWELANEPRCKGCNTNVIFNWATQISDYIRSLDKDHLITLGDEGFGLPGQTTYPYQYGEGTDFVKNLQIKNLDFGTFHMYPGHWGVPTSFGPGWIKDHAAACRAAGKPCLLEEYGYESDRCNVQKGWQQASRELSRDGMSGDLFWQWGDQLSTGQTHNDGFTIYYGSSLATCLVTDHVRAINALPA(SEQ ID NO:21)
paMan26a(ポドスポラ・アンセリナ)
MVKLLDIGLFALALASSAVAKPCKPRDGPVTYEAEDAILTGTTVDTAQVGYTGRGYVTGFDEGSDKITFQISSATTKLYDLSIRYAAIYGDKRTNVVLNNGAVSEVFFPAGDSFTSVAAGQVLLNAGQNTIDIVNNWGWYLIDSITLTPSAPRPPHDINPNLNNPNADTNAKKLYSYLRSVYGNKIISGQQELHHAEWIRQQTGKTPALVAVDLMDYSPSRVERGTTSHAVEDAIAHHNAGGIVSVLWHWNAPVGLYDTEENKWWSGFYTRATDFDIAATLANPQGANYTLLIRDIDAIAVQLKRLEAAGVPVLWRPLHEAEGGWFWWGAKGPEPAKQLWDILYERLTVHHGLDNLIWVWNSILEDWYPGDDTVDILSADVYAQGNGPMSTQYNELIALGRDKKMIAAAEVGAAPLPGLLQAYQANWLWFAVWGDDFINNPSWNTVAVLNEIYNSDYVLTLDEIQGWRS(SEQ ID NO:22)
スウォレニン(トリコデルマ・リーセイ)
MAGKLILVALASLVSLSIQQNCAALFGQCGGIGWSGTTCCVAGAQCSFVNDWYSQCLASTGGNPPNGTTSSSLVSRTSSASSSVGSSSPGGNSPTGSASTYTTTDTATVAPHSQSPYPSIAASSCGSWTLVDNVCCPSYCANDDTSESCSGCGTCTTPPSADCKSGTMYPEVHHVSSNESWHYSRSTHFGLTSGGACGFGLYGLCTKGSVTASWTDPMLGATCDAFCTAYPLLCKDPTGTTLRGNFAAPNGDYYTQFWSSLPGALDNYLSCGECIELIQTKPDGTDYAVGEAGYTDPITLEIVDSCPCSANSKWCCGPGADHCGEIDFKYGCPLPADSIHLDLSDIAMGRLQGNGSLTNGVIPTRYRRVQCPKVGNAYIWLRNGGGPYYFALTAVNTNGPGSVTKIEIKGADTDNWVALVHDPNYTSSRPQERYGSWVIPQGSGPFNLPVGIRLTSPTGEQIVNEQAIKTFTPPATGDPNFYYIDIGVQFSQN(SEQ ID NO:23)
別の生成物を生成させるために、糖化により生成された糖に対しさらなる加工処理工程が実施され得る。例えば、糖は、水素化され、発酵され、または他の化学薬品で処理され、他の生成物を生成させることができる。
本発明についてさらに、下記実験例を参照することにより詳細に記載する。これらの実施例は説明目的のためだけに提供され、他に特に規定がなければ、限定することを意図しない。よって、本発明は決して、下記実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含するものと解釈されるべきである。
Cel3aの成熟配列(アミノ酸20−744)を合成し、Genewizにより大腸菌発現に対してコドン−最適化した。下記実施例において言及されるCel3a−C’Hisは、8×His(SEQ ID NO:7)タグをC末端に有するCel3aのコドン−最適化成熟配列(aas20−744)を示す。下記プライマーを使用して、Cel3a−C’HisをpET−Duet(Novagen、カタログNo.71146)にクローン化した:
(化1)
順方向5’−CATGCCATGGGCGATAGTCACAGTACCAGC(SEQ ID NO:4)
逆方向3’−CCCAAGCTTTCATTAGTGATGATGATGATGATGATGATGGCTGCCGCTGCCGGCAACACTCAGGGTGC(SEQ ID NO:5)
(NcoIおよびHindIII部位には下線が施されており;開始および終止コドンは太字であり;ポリヒスチジン(8−His(SEQ ID NO:7))タグ;ならびにグリシン−セリン(GSGS)リンカー(SEQ ID NO:8)がイタリックである)
増幅反応を、PfuUltra II Fusion HSポリメラーゼ(Agilent、カタログNo.600672)を使用して実施した。
Cel3A−C’Hisコンストラクトを、大腸菌発現宿主Origami B(DE3)(EMD Millipore、カタログNo.70837)に形質転換させ、LB培地および100μg/mlアンピシリン(Fisher Scientific、カタログNo.BP1760)、15μg/mlカナマイシン(kanamysin)(Fisher Scientific、カタログNo.BP906)および12.5μg/mlテトラサイクリン(Fisher Scientified、カタログNo.BP912)を含むプレート上でストリークさせた。組換えDNAを有するコロニーを2ml種菌の接種のためにプレートから選び取り、一晩37℃で増殖させ、そうしてその後、適切な抗生物質を含むLB培地100mlに接種するために使用した。培養物を37℃でOD600が0.8に達するまで増殖させた。
この実施例では、Cel3aの発現および精製は3リットルおよび5リットルバイオリアクターまで拡大される。当業者は本明細書で記載されるプロセスを容易に使用して、さらに、例えば、3Lおよび7Lバイオリアクターまで拡大することができる。
次のものを含む、EDTAを有する溶解緩衝液を調製した:50mM Tris−HCl pH7.5、0.1%トリトンX−100、1%グリセロール、5mMイミダゾール、1mg/mLリゾチーム、および1mM EDTAを含む脱イオン水。細胞ペレットを5mL体積の、EDTAを有する溶解緩衝液中に再懸濁させた。10μlのリゾナーゼ(DNAse)を試料に添加した。試料をその後、1時間室温でインキュベートした。
N末端にHis−タグを有するCel3a(Cel3a−N’His)を、実施例1〜4において上記と同様の方法を用いて、クローン化し、大腸菌で発現させ、収穫した。Cel3a−N’HisをpET−Duet1ベクターにクローン化させた。発現されたCel3a−N’Hisを、Profinity NiチャージIMACレジンスラリーを含むアフィニティーカラムにより精製し、溶解緩衝液中に200mMイミダゾールを含む溶離緩衝液を使用して溶離した。
−Acquity UPLC H−Class Bio System:BEH300 C4カラム、1.7μm、2.1×150mm(p/n:186004497)
−カラム温度:45℃
−MPA:0.1%FAを含む水
−MPB:0.1%FAを含むACN
−源温度:125℃
−脱溶媒和温度:450℃
−コーン電圧:40V
−較正:Csl(500−5000Da)
−ロックマス:Csl
His−タグ付けされたCel3a(例えば、NまたはC末端にHis−タグを有するCel3a)をIMAC技術を用いて精製した。精製された、His−タグ付けされたCel3aの量(力価)を、Bradfordアッセイおよび/またはnanodropを用いて決定した。nanodrop定量では、モル吸光係数を、標的形態のCel3aのアミノ酸配列をExPASy ProtParamオンラインツールに挿入することにより推定した。
この実施例では、グルコース収率を2つの糖化反応間で比較した。1つの糖化反応では、表1で記載される酵素を含む酵素混合物をバイオマスに添加した。第2の糖化反応では、0.8mg/mlの、大腸菌から精製されたアグリコシル化されたCel3aを表1に記載される酵素を含む酵素混合物に添加し、バイオマスに添加した。糖化反応を本明細書で記載される条件下で実施し、試料を反応の0と80分の間の複数の時間点で入手した。得られたグルコースを当技術分野における方法、例えばYSI機器またはHPLCにより測定し、定量し、図8に示されるように、時間に対してプロットした。これらの結果から、アグリコシル化されたCel3aの添加は糖化反応における糖生成物、例えば、グルコースの収率を増加させたことが示される。
本明細書で引用される各および全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、これにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この発明について特定の態様を参照して開示してきたが、この発明の他の態様および変更は、当業者により、発明の真の精神および範囲から逸脱せずに考案することができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価の変更を全て含むと解釈されることが意図される。
Claims (53)
- SEQ ID NO:1、またはその機能的断片に対して少なくとも90%同一性を含む、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、野生型T.リーセイ由来のCel3A酵素、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項1に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記Cel3A酵素は、前記アミノ酸配列SEQ ID NO:1を含む(例えば、から構成される)、請求項2に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:2を含む(例えば、から構成される)核酸配列によりコードされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは1つ以上のグリコシル化部位の近位、またはその部位に突然変異を含み、前記突然変異は前記1つ以上のグリコシル化部位でのグリコシル化を防止する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記突然変異は、SEQ ID NO:1の、アミノ酸位置78のスレオニン、アミノ酸位置241のスレオニン、アミノ酸位置343のセリン、アミノ酸位置450のセリン、アミノ酸位置599のスレオニン、アミノ酸位置616のセリン、アミノ酸位置691のスレオニン、アミノ酸位置21のセリン、アミノ酸位置24のスレオニン、アミノ酸位置25のセリン、アミノ酸位置28のセリン、アミノ酸位置38のスレオニン、アミノ酸位置42のスレオニン、アミノ酸位置303のスレオニン、アミノ酸位置398のセリン、アミノ酸位置435のセリン、アミノ酸位置436のセリン、アミノ酸位置439のスレオニン、アミノ酸位置442のスレオニン、アミノ酸位置446のスレオニン、アミノ酸位置451のセリン、アミノ酸位置619のセリン、アミノ酸位置622のセリン、アミノ酸位置623のスレオニン、アミノ酸位置626のセリン、またはアミノ酸位置630のスレオニンの1つ以上に存在する、請求項5に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型T.リーセイ由来のグリコシル化されたCel3A酵素と比べて、増加したセロビアーゼ活性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型T.リーセイ由来のグリコシル化されたCel3A酵素と比べて、増加した基質認識、より活性な基質認識部位、または低減された立体障害を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記アグリコシル化されたポリペプチドは、セロビオースなどの炭水化物を1つ以上の単糖、例えば、グルコースに加水分解する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 前記セロビアーゼ活性はセロビオースのβ1,4グリコシド結合の加水分解を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
- 請求項1〜10に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- Cel3A酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列であって、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも90%同一性を含む(例えば、から構成される)、核酸配列。
- 請求項11および12のいずれかに記載の核酸配列を含む、核酸分子。
- さらに、プロモーター、例えば、原核細胞発現、例えば、細菌細胞発現、例えば、大腸菌における発現のためのプロモーターを含む、請求項13に記載の核酸分子。
- 前記プロモーター配列は構成的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、または抑制プロモーター配列である、請求項14に記載の核酸分子。
- 前記プロモーターはT7プロモーターである、請求項14または15に記載の核酸分子。
- さらに、タグ、例えば、検出および/または精製のための、および/または別の分子への連結のためのタグ、例えば、Hisタグをコードする核酸配列を含む、請求項13〜16のいずれか一項に記載の核酸分子。
- さらに、1つ以上のシグナル配列、例えば、分泌シグナル配列をコードする核酸を含む、請求項13〜17のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項11〜18のいずれかに記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
- さらに、選択マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリンマーカーをコードする核酸配列を含む、請求項18に記載の発現ベクター。
- 請求項13〜20のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項13〜20のいずれか一項に記載のベクターを含む、原核細胞または細菌細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する原核細胞または細菌細胞。
- 前記細菌細胞はグリコシル化に対し障害されている、請求項22または24に記載の細菌細胞。
- 前記細菌細胞は大腸菌細胞である、請求項25に記載の細菌細胞。
- 前記大腸菌細胞はorigami大腸菌細胞である、請求項26に記載の細菌細胞。
- 請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法であって、請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することを含み、前記細胞は前記ポリペプチドをグリコシル化しない、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、例えば、origami大腸菌細胞である、方法。
- 請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法であって、SEQ ID NO:1に対して少なくとも90%同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドを脱グリコシル化酵素で処理することを含む、方法。
- 前記脱グリコシル化酵素はPGNaseおよびEndoHから選択される、請求項29に記載の方法。
- 請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞を培養することを含み、前記核酸配列は、コードされるポリペプチドのグリコシル化を防止する1つ以上の突然変異を有する、請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法。
- 請求項1、2、3、4、7、8、9または10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを発現する細胞を、グリコシル化阻害剤、例えば、ツニカマイシンの存在下で培養するための方法。
- SEQ ID NO:1に対して少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むグリコシル化されたポリペプチドおよびSEQ ID NO:1に対して少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含むアグリコシル化されたポリペプチドを含み、前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたペプチドはどちらもセロビアーゼ活性を有する、酵素混合物。
- 前記アグリコシル化されたポリペプチドは請求項1〜10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドである、請求項33に記載の酵素混合物。
- 前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたポリペプチドはどちらも野生型T.リーセイ由来のCel3A酵素を含む、請求項33または34に記載の酵素混合物。
- さらに、微生物に由来する少なくとも1つの追加の酵素を含み、前記追加の酵素は、セルロース系材料のバイオマス分解活性を有する、請求項33〜35のいずれか一項に記載の酵素混合物。
- 前記追加の酵素はリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、およびセロビアーゼから選択される、請求項36に記載の酵素混合物。
- 前記混合物はさらに、1つ以上のリグニナーゼ、1つ以上のエンドグルカナーゼ、1つ以上のセロビオヒドロラーゼ、1つ以上のキシラナーゼを含む、請求項33または34に記載の酵素混合物。
- 前記混合物中の前記アグリコシル化されたポリペプチド対残りの酵素の間の比は少なくとも1:32、例えば、1:32〜1:300である、請求項33〜38のいずれか一項に記載に記載の酵素混合物。
- 前記アグリコシル化されたポリペプチド対グリコシル化されたポリペプチドの比は少なくとも1:32、例えば、1:32〜1:300である、請求項33〜38のいずれか一項に記載の酵素混合物。
- バイオマスから生成物(例えば、水素、糖、アルコール、など)を生成させる(またはバイオマスを生成物に変換させる)方法であって、バイオマスを、例えば、電子ビームによる処理により、請求項1〜10のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドおよび1つ以上のバイオマス分解酵素またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物を生成させる微生物(混合物)と、前記糖生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む、方法。
- バイオマスを、請求項33〜40のいずれか一項に記載の酵素混合物と、前記生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む、バイオマスから生成物(例えば、水素、糖、アルコール)を生成させる方法。
- 前記生成物は糖生成物である、請求項41または42に記載の方法。
- さらに、前記糖生成物を単離することを含む、請求項41〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖生成物の単離は沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および/または抽出を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記糖生成物はグルコースおよび/またはキシロースである、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素混合物は、B2AF03、CIP1、CIP2、Cel1a、Cel3a、Cel5a、Cel6a、Cel7a、Cel7b、Cel12a、Cel45a、Cel74a、paMan5a、paMan26a、スウォレニン、および表1に列挙される酵素からなる群より選択される酵素の少なくとも2つを含む、請求項41〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物の1つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み;ここで:
a)農産物または農業廃棄物は、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み;
b)紙製品または紙屑は紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み;
c)林産物はアスペン材、パーティクルボード,木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み;ならびに
d)一般廃棄物は堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む、請求項41〜47のいずれか一項に記載の方法。 - さらに、前記微生物または前記酵素混合物を導入する前に前記バイオマスを処理して、前記バイオマスの不応性を低減させる工程を含み、前記処理は、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項41〜48のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマス分解酵素を生成する前記微生物は、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムまたはトリコデルマから選択される属の種に由来する、請求項41〜49のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマス分解酵素を生成する前記微生物は、アスペルギルス、ヒュミコラ・インソレンス(スキタリジウム・サーモフィルム)コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペルシシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポルム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウム、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーセイ、またはトリコデルマ・コニンギイから選択される、請求項41〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、前記微生物を誘導バイオマス試料と組み合わせることにより、バイオマス分解酵素を生成するように誘導されている、請求項41〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誘導バイオマス試料は、紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項52のいずれかに記載の方法。
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