JP2017521498A

JP2017521498A - 植物のオリゴペプチドの単離およびその使用

Info

Publication number: JP2017521498A
Application number: JP2017522747A
Authority: JP
Inventors: スコットランド、レベッカ; リュー、シンチ
Original assignee: スコットランド、レベッカ
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2017-08-03
Also published as: US20170156369A1

Abstract

【解決手段】本発明は、マメ科植物、種子、穀物、海洋および他の発芽したまたは発芽していない植物タンパク質単離物に由来する狭い低分子量分布を有する粒状の自由流動性の粉じんを含まないオリゴペプチド単離物を開示し、アプリケーションおよびその製造方法に関する。新規オリゴペプチド単離物は、流動性、分散性、溶解性、感覚特性、相互作用安定性および安全性を有し、一貫しており、適用に適している。水和物の粘度および透明度は、用途に適している。生成物は安定で強力であり、身体に容易に吸収される。オリゴペプチド単離物を製造するために使用される有効な処理方法は、酵素加水分解前の超高温処理、希釈比および加水分解および分離のためのブリックスパラメーター、ナノ濾過および結合流動床およびドラム乾燥プロセスに続くスプレー乾燥を含む。得られた植物または海洋オリゴペプチド富化単離物は、酸性培地の栄養強化のためだけでなく、酸性および非酸性食品の強化などのタンパク質単離物の広範な従来の適用に使用することができる。小児栄養、食品添加物、ペットフード、動物飼料、肥料、抗酸化剤、抗菌剤、化粧品、栄養補助食品、栄養補助食品、栄養補助食品、界面活性剤、接着剤およびバイオ燃料配合物を含む。

Description

本発明は、一般に、植物および海洋タンパク質オリゴペプチドに富む分離株およびそれを製造するための深部加工に関する。より詳細には、本発明は、産業用途への組み込みのための改善された適合性を有する、粒状の自由流動性の粉じんのない低分子量オリゴペプチドを単離する高収率の方法に関する。

新興国の中産階級の増加により、効率的で高品質のタンパク質栄養源の需要が拡大するだろう。これにより、需要と供給のバランスが逼迫すると予測されている。植物および海洋源は、タンパク質栄養素の生態学的負荷の低い源泉を提供する。さらに、改変されていないタンパク質物質は実質的に不溶性である傾向があるので、ペプチド単離物は、様々な用途を有する安定したタンパク質栄養素の濃縮単離物としての役割を果たすことができる。

一般に定義されているように、ペプチド単離物は、主としてアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質からなるタンパク質の酸性、アルカリ性または酵素的加水分解によって得られた物質を含み、主として炭水化物および脂質からなる不純物を生物学的起源の少量の雑多な有機物質とともに含む。ペプチド単離物は、合板接着剤などの用途を含む織物における用途を文書化している。植物の発根、発芽、成長および生涯の延長などの用途を含む、養殖および農業；バイオ燃料；化粧品処方；生物医薬品および吸収性ヒドロゲル製剤；機能性食品および飲料製剤；腸溶性食餌製剤および食物補給；幼児および小児用栄養製品製剤；動物飼料配合物；細胞培養増殖培地および発酵処理；凍結および良好な食感に対する耐性を改善するためのベーキング成分。抗酸化剤、抗凝固剤、抗炎症モジュレーター、抗菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤、熱生成剤、抗癌（結腸および前立腺）、抗骨粗鬆症、細胞増殖および修復調節剤としての生物活性ペプチドの役割に関して、脂質代謝、炭水化物代謝、免疫機能、心臓血管および骨の健康、神経系および脳機能に影響を及ぼす無数のシグナル伝達機能に関与する生物学的シグナル伝達メディエーターに加えて、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤運動中、消化管満腹時および体重管理中に。

これまで、植物ペプチドは、単離されたタンパク質の溶解；酵素加水分解に続いて酵素不活性化；溶媒抽出、遠心分離、限外濾過またはクロマトグラフィーによるペプチドの反応混合物からの分離；殺菌；濃度；凍結乾燥または噴霧乾燥；および脱臭。酵素活性は、ｐＨ、温度およびタンパク質分解酵素混合物を調節することによって調節されている（Ｇａｌｖｅｚ&ｄｅＬｕｍｅｎ、１９９９）。しかし、酵素活性を最適化する金銀のｐＨおよび温度範囲は、タンパク質の折り畳みを最大化する傾向がある。高い立体障害は、溶解性、吸収性、効力、感覚特性および相互作用安定性に悪影響を与える不十分に加水分解されたタンパク質をもたらす。その一方で、より立体障害の少ないポリペプチドは、吸収、効力、感覚特性、分解および相互作用の安定性に悪影響を与える高い遊離アミノ酸濃度をもたらす連続的な酵素加水分解を受ける可能性がある。

ペプチドを反応混合物から分離する最も一般的な技術は、遠心分離であった。得られる生成物は、分散、溶解性、吸収、効力、感覚特性および相互作用安定性に悪影響を与える高分子量ペプチドに向かって偏った広い分子量分布を有する。上記の工程の一般的な手順はよく理解されている。従来の高温のペプチド濃度は、熱的副産物を生成し、溶解性、効力および感覚特性に悪影響を与える。ペプチド単離物の凍結乾燥または噴霧乾燥は、流動性、分散性および溶解性に悪影響を及ぼし、懸濁安定性が低下し、多くの用途で使用するのに適した、不均一な粒径および高塵を有する生成物を生じた。

先行技術は、植物または海洋タンパク質を処理して、低分子量ペプチド富化単離物を高収率で生産するための適切な方法を開示していない。これまで、そのようなペプチド単離物は、広い分子量分布を示していた。得られた溶解度、バイオアベイラビリティー、生物活性効力、相互作用安定性および感覚特性は、用途に限られた生物学的および化学的適合性を示している。さらに、一貫性のない粒子サイズ、流動性および分散特性は、工業的用途に物理的な課題を提示する。

このような本発明は、超高温処理の新規な機能配列によって得られる狭い分子量分布を有する均一で粒状の低分子量のオリゴペプチド富化単離物を生産するための植物および海洋タンパク質単離物を処理するための高収率の方法を開示する酵素加水分解前の処理、加水分解および分離のための希釈比およびＢｒｉｘパラメーター、ナノ濾過、カップリング流動床および噴霧乾燥に続いてドラム乾燥が挙げられる。

本発明は、植物や海洋タンパク質、オリゴペプチド、可溶性明確かつ熱である粒状の、自由流動性、無粉塵、低分子量のオリゴペプチドを単離する高収率の方法で構成される同じものを生産するための分離株と処理を豊かにすることに関する提供します - 酸性水性環境において安定。改変は、本発明の範囲内で可能です。

ペプチド単離のための処理方法は先行技術に記載されているが、酵素最適化技術、分離、濃縮および乾燥操作の方法は、濃縮されたペプチド単離物の溶解性、吸収、効力、望ましい感覚特性および相互作用安定性を低下させ、高分子量ペプチド、不安定および／または分解生成物および一貫性のない粒子サイズおよび高塵に対して偏った広い分子量分布を有し、多くの用途における使用のための適合性が低下する。

本発明は、上記の状況を説明し、生成物の純度および安定性を改善し、生成物分子量範囲の厳密な制御を提供するためのタンパク質単離物の濃縮を具体化する。本発明の目的は、植物および海洋由来タンパク質単離物のための優れたオリゴペプチド単離物生成系を確立するのに有用な手段を提供することである。

上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者らは、工業的用途のための所望の特性と一致して、自由流動性オリゴペプチドを生成する能力に優れた方法を導出しており、本発明を完成するに至りました。

食料品、キャンデー、ゲル、粉末、炭酸水、味付け水、炭酸味付け水、春水、果汁、野菜ジュースまたは蜜柑、コーヒー、カフェイン除去コーヒーから選択される飲料を含むが、これらに限定されない。カカオ茶、ワイン、シャンパン、エール、ラム、ジン、ウォッカ、他の酒、動物から得たミルク、大豆、米、ココナッツミルクまたは他の植物製品から得られる茶、果物および茶製品。このグループから選択される飲料は、スポーツ飲料、飲料濃縮物、低張飲料、清涼飲料、強飲料（ショット）、スポーツ飲料、高張飲料、エネルギー飲料および等張飲料からなる群から選択されるが、これらに限定されない。栄養製剤は、１つまたは複数のアミノ酸、酸化防止剤、脂肪、ビタミン、微量元素、電解質、甘味料、香味料および／またはその混合物、カフェイン、着色剤、乳化剤、フレーバーエンハンサー、食品グレードの酸、ミネラル、微量栄養素、塩類、安定剤、増粘剤、医薬品成分、繊維、プレバイオティクス、プロバイオティクスおよび／またはそれらの組み合わせを含む。

したがって、本発明は、遊離アミノ酸の全割合がより少ない、狭く分布した低分子量ペプチドのより高い割合を含む植物または海洋タンパク質単離物に由来する濃縮オリゴペプチド単離物であり、１３０〜１５０℃の超高温処理、５〜２０℃のＢｘ条件下での加水分解、分離Ｂｒｉｘ（登録商標）の処理を含む、低水分含量の水溶性水和物および４０〜４〜２０°Ｂｘのパラメータ、精密濾過後の１〜１５の比水洗浄、１０〜３５°Ｂｘでの脈流圧力によるナノ濾過、結合流動床および噴霧乾燥、続いてドラム乾燥して濃縮粒状オリゴペプチド単離物を形成する。

本発明によれば、流動性、分散性、溶解性、感覚特性および相互作用安定性を有する植物または海洋タンパク質オリゴペプチド富化単離物を高収率で達成することが可能であり、工業的用途に適している。水和物は酸性および低温条件下では透明のままであり、水和物の粘度は低い。生成物は安定で強力であり、身体に容易に吸収される。本発明の範囲は、その形態で広く使用することができ、医薬、予防健康、栄養補助食品、機能性食品および飲料、小児栄養食品添加物、動物飼料、肥料、抗酸化剤、抗菌剤、化粧品、界面活性剤、接着剤およびバイオ燃料配合物を含む。本発明に記載のオリゴペプチド富化単離物はまた、種々のタイプのスターターまたはプロバイオティック培養物で発酵させることができ、または油、脂肪、乳化剤、炭水化物、果物濃縮物、風味料、着色料、アルコール、酸化防止剤、ハーブまたはハーブエキス、ビタミンや生物活性化合物のような健康促進化合物は、マーケティングのニーズに合った製品を作成します。

図面は、本発明のプロセスをまとめたものである。

本明細書において、ペプチドまたはオリゴペプチドは、ペプチド結合を介して連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖として定義される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、文脈が必要とする場合には交換可能に使用することができる。タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結された３０個を超えるアミノ酸残基（ポリペプチド）を含む１つ以上の鎖からなる。本明細書で使用されるタンパク質加水分解物、加水分解物または加水分解タンパク質は、アミノ酸間のタンパク質ペプチド結合の加水分解によって形成される生成物である。例えば選択されたペプチドが豊富であるか、またはペプチドまたはポリペプチドのサブセットが加水分解物から除去されている、タンパク質加水分解物の画分である濃縮加水分解物。そのため、濃縮された加水分解物は、好ましくは、ペプチドまたはペプチド混合物の混合物である。

低分子量オリゴペプチドの顆粒単離濃縮物の形成方法は、タンパク質単離物から始まる。原材料には、マメ科植物、種子、穀類、海洋植物および他の発芽植物または非発芽植物タンパク質単離物が含まれ得る。エンドウマメ、カゼイン、ジャトロファ、ヤシ、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実油、パーム核、オリーブ油、ベニバナ油、トウガラシ油、トウガラシ油、ごま、亜麻仁および微生物のタンパク質または酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。本発明の目的のために、植物または海洋タンパク質単離体全体は、標準的な、商品化された植物または海洋タンパク質単離物であってもよい。より具体的には、タンパク質源は、食事、フレーク、グリッツおよび小麦粉を含むがこれらに限定されない植物または海洋タンパク質源の処理に由来する全体または任意の製品または副産物であり得る。タンパク質源は、全脂肪形態、部分的に脱脂された形態又は完全に脱脂された形態で使用することができる。タンパク質源がかなりの量の脂肪を含有する場合、一般的に、この工程中に油除去工程が必要である。タンパク質源から回収されたタンパク質は、植物または海洋源において天然に存在するタンパク質であり得るか、またはタンパク質性物質は、遺伝子操作によって修飾されるが天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性特性を有するタンパク質であり得る。

タンパク質の単離は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。種々の植物または海洋起源のタンパク質単離物についての一般的な従来の方法は、先行技術に記載されている。典型的には、処理には、生物体のタンパク質含有部分の単離、フレーキング、脂肪の抽出および不溶性材料、例えば繊維およびセルロースのデカント、その後のｐＨ調整が含まれる。タンパク質単離出発物質がかなりの量の非改変タンパク質物質を含有する場合、本発明の実施形態に進む前にタンパク質単離物の精製が必要とされ得る。具体的には、先行タンパク質の濃縮または加水分解による分離が必要であり、活性炭または吸着樹脂によってさらに精製することができる。好ましくは、出発タンパク質単離物質は、５０％（ｗ／ｗ）を超えるタンパク質、より好ましくは９０％（ｗ／ｗ）タンパク質を含む。タンパク質単離体を出発物質として使用する場合、本発明の実施形態は、出発物質からの工業的用途のための低分子量オリゴペプチドの単離および濃縮を包含する。

２０〜４５℃の飽和アルカリ性溶液でｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液５〜２０重量当量にタンパク質単離物を溶解する。好ましくは、アルカリ性溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウムまたはそれらの混合物のアルカリ性物質を含む。より好ましくは、アルカリ溶液は水酸化ナトリウムを含む。

超高温処理滅菌により、１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理する。溶液の温度を４０〜７０℃に冷却する。

非還元糖で調整することにより、溶液温度を４０〜７０℃に、ブリックスを５〜２０°Ｂｘに維持する。非還元糖の例としては、ラフィノース、スタキオース、スクロースおよびベルバスコースが挙げられるが、これらに限定されない。１〜１５％（ｗ／ｗ）のタンパク質単離物に加水分解剤またはその混合物を添加する。混合物を０．５〜８．０時間撹拌する。本発明の方法において使用するための加水分解剤は、プロテアーゼを含む酵素を含むことができる。加水分解は、好ましくはプロテアーゼ処理によって行われる。ここで、プロテアーゼ動物起源、植物起源、または微生物起源は、原料タンパク質源に基づいて適宜選択することができる。あるいは、異なる供給源生物に由来する酵素の組み合わせは、より効率的に加水分解をもたらし得られたジペプチドおよびトリペプチドのパーセンテージを増加させることができる。適切なプロテアーゼは、バシロリシン、ニュートラゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）（登録商標）、マサザイム（Ｍａｘａｚｙｍｅ）ＮＰＤＳ（登録商標）などのメタロエンドプロテアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン（サブチリシンＢ、サブチロペプチダーゼＢ、サブチロペプチダーゼＣ、ナガース、ナガルゼプロテイナーゼ、ズブチリシンノボ、細菌プロテイナーゼノボスブチリシンＡ、サブチロペプチダーゼＡ、アルカラーゼノボ等のセリンエンドプロテアーゼも同様の酵素が種々のバチルスズブチリスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ、Ｂｉｏｐｌａｓｅ（登録商標）、ＰｒｏｔｅａｓｅＰ（登録商標）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ、Ｂｉｏｐｌａｓｅ（登録商標）パパインまたはブロメラインのようなシステインエンドペプチダーゼ；ストレプトミセス中性プロテアーゼ、アスペルギルス中性プロテアーゼ、サーモアーゼなどの中性プロテアーゼ；ペプシン、アスペルギルス酸プロテアーゼ、ＳｕｍｉｃｈｕｍｕＡＰ（登録商標）などの酸性プロテアーゼ；Ｓｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ＦＰ、ＣｏｒｏｌａｓｅＬＡＰ（登録商標）ペプチダーゼ４３６ＰＰ４３６Ｐおよびペプチダーゼ４３３ＰＰ４３３Ｐ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、Ｗａｌｅｓ、ＵＫ）などのアミノペプチダーゼまたはアスペルギルス以外の他の微生物によって産生される他のアミノペプチダーゼ、例えばＢａｃｉｌｌｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ。ニュートラセ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）（登録商標）は、アミラーゼの副作用のために多少好ましくない。最も好ましくは、加水分解剤はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）である。反応ｐＨ、プロテアーゼ処理の反応温度は、使用するプロテアーゼの特性に合わせて変えることができるが、一般的にｐＨ６〜８、温度４０〜７０℃で反応させることが可能である。加水分解の程度は、酵素的加水分解反応によってペプチド結合が破壊される程度である。最も好ましくは１０〜５０％の加水分解度である。

反応混合物の温度を７５〜９５℃の温度に調整し、１０〜３０分間維持する。

反応混合物を室温に冷却し、０．２〜１．０ｍＰａの脈流圧力を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用するクロスフロー精密濾過によって０．５〜４．０時間処理する。ろ液のブリックスを４〜２０°Ｂｘに保ちます。

濾液を洗浄し、１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める。

濾液を、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用してクロスフローナノ濾過によって処理する。保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持する。

保持液を回収する。

超高温プロセスは、保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する。

保持液を噴霧乾燥させる。好ましくは、内蔵の流動床塔である。より好ましくは、入口温度を１４０〜１８０℃、床温度を６０〜１００℃、排気温度を９０〜１１０℃、圧力を−２０〜−８０Ｐａに維持する。

濃厚物を７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。

材料の比率は、スケールの要求に応じて調整することができる。同様に、システム条件を調整することができる。ブリックスは、他の可溶性固形分によって調節することができる。分子量カットオフは、特定の適用要件を満たすように調整することができる。本明細書に記載の工程は、上記の本発明によるオリゴペプチド濃縮単離物を産生する植物または海洋タンパク質単離物について同じ方法で実施することができる。

タンパク質は身体の器官のすべてを構成し、器官系の適切な機能のために必要とされる。すべてのタンパク質はアミノ酸で構成されていますが、アミノ酸組成と配列の違いはタンパク質の機能を区別します。身体は、アミノ酸を使用して、器官の健康維持における特定の機能のための特定のタンパク質を構築する。しかしながら、身体は多くの必要なアミノ酸の合成のための新たな経路を有していないので、これらの必須アミノ酸は食物タンパク質から得なければならない。体は、機能するのに必要な特定のタンパク質を臓器に供給するために、適切な食物タンパク質を一貫して消化し、吸収し、代謝しなければならない。他にもいくつかの課題があります。完全な食事タンパク質は、しばしば動物起源に由来し、コレステロールを伴い、これは食物摂取の律速因子となり得る。体が老化するにつれて、消化機能が低下して、大量の食物タンパク質の吸収が非効率になる傾向があります。もう一つの難点は、吸収された食物タンパク質が後に代謝される体内に蓄積されないため、特定のタンパク質を構築するために必要な全てのアミノ酸が代謝の間に最適な比率で存在しない場合、タンパク質合成は非効率的である。

しかしながら、適切な食物タンパク質を得ることの課題を克服することができる。タンパク質単離物サプリメントは、タンパク質を体内に効果的に供給することができます。完全なベジタリアン源からタンパク質を単離することによって、コレステロールを排除することができる。食事タンパク質は、タンパク質のより小さなペプチドサブユニットを消費することによって、より容易に消化および吸収され得る。最適化されたアミノ酸バランスを有する食物タンパク質を消費することにより、タンパク質合成をより効率的にすることができる。

先の方法は、上記の課題を克服する植物タンパク質単離物を産生していない。さらに、これらの方法は、産業用途への適合性に制限を課している。

本発明は、産業用途に適した物理的、化学的および生物学的属性を有する植物ペプチド濃縮物を高収率で達成するための解決法を提供する。

本発明の範囲には、医薬品、予防健康、栄養補助食品、機能性食品および飲料、小児栄養物、食品添加物、動物飼料、肥料、抗酸化剤、抗菌剤、化粧品、界面活性剤、接着剤バイオ燃料配合物。

以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであるが、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されない。

収量の確立
（ａ）乾燥単離物の１：１０（ｗ／ｖ）アルカリ溶液を種々の割合で、ｐＨ５〜９に調整したアルカリ溶液を、水酸化ナトリウムを用いて溶解することにより、植物または海洋タンパク質濃縮物を濃縮する方法の確立。２５℃；（ｂ）１３０〜１５０℃の超高温処理処理、（ｃ）スクロースで調整し、４〜６時間加水分解混合物を撹拌することにより４０〜７０℃および５〜２０°Ｂｘで１％Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）による引き続く加水分解；（ｄ）７５〜９５℃に冷却し、温度を２０分間維持する；（ｅ）続いて２５℃に冷却し；（ｆ）次にブリックスパラメータ４〜１５°Ｂｘを有する０．２〜１．０ｍＰａの脈流圧力を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により２時間分離する。（ｇ）濾液を洗浄し、種々の比率の水、１〜１５当量の濾液（ｖ／ｖ）で保持する。（ｈ）濾液を収集し、１０〜３５°Ｂｘで０．３〜０．８ｍＰａの脈流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用してクロスフローナノろ過により処理する工程；（ｉ）保持液を回収し、続いて１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理する；（ｊ）次いで、入口温度が１４０〜１８０℃、床温度が６０〜１００℃、排気温度が９０〜１１０℃、圧力が−２０〜２０℃の内蔵流動床塔で残留物を噴霧乾燥する−８０Ｐａ；（ｋ）濃縮物を最後にドラムで７０〜１００℃で１０〜３０分間乾燥する。収量は乾燥前に全透明性を測定するために６６０ｎｍで全出発原料（ｗ／ｗ）および光学密度（ＯＤ）測定値に対する単離の総収率として測定した。吸光度スコアが低いほど、より明瞭であることを示す。

オリゴペプチドの濃縮
大豆タンパク質単離物は、タンパク質含有量が約９５％のオリゴペプチドを含む生の出発物質として選択された。単離されたタンパク質含量の分子量分布を、本発明に開示された方法を用いて複数のバッチ調製物について評価した。遠心分離による市販の大豆ペプチド生成物の従来の単離方法も、比較のために評価した。種々の単離されたタンパク質材料の乾燥重量に対するタンパク質含量の測定。粗タンパク質質量の重量をＫｊｅｌｄａｈｌ法により測定した。重量％で表した。また、窒素係数は６．２５であった。加水分解物の大豆タンパク質画分の分子量分布は、以下のゲル濾過カラムを用いたＨＰＬＣ法で測定した。ゲルろ過カラムをペプチドとするＨＰＬＣ系に、分子量マーカーを含む公知のペプチドを充填し、分子量間の関係の保持時間における検量線を求めた。単離物をゲル濾過溶媒（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０中の１％ＳＤＳ）で２倍に希釈し、５μＬをＨＰＬＣカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ７．５３００ＧＬ）に適用した。カラム温度は２５℃、流速０．２５ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍであった。単離物中のペプチドおよび遊離アミノ酸の全量に対する分子量のパーセンテージを、時間範囲における全吸光度の面積について計算した。

均一な顆粒
単離された生成物顆粒サイズおよび水分含量を、本発明に開示された方法を用いて複数のバッチ調製物について評価した。均一な顆粒は、生成された粉塵を低減し、噴霧乾燥塔への詰まりを防ぎ、含水量の制御を増加させる。

溶解性
単離した生成物を水（ｗ／ｖ）中１：１０に再構成した。ｐＨ（希釈ＮａＯＨまたはＨＣｌで適切なレベルに調整）および温度を調整し、溶液の透明度を、本発明に開示された方法を用いて複数のバッチ調製物について６１０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定によって評価した。吸光度スコアが低いほど、より明瞭であることを示す。溶解度を、窒素測定によって測定した分散液のタンパク質含量として評価した。１０ｍＬのアリコートを予め秤量した遠心チューブに移し、７，８００ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を沈降させた。上清のタンパク質含量を窒素含量によって測定した。ペレット材料を１００℃に設定したオーブン中で一晩乾燥させ、乾燥ペレット材料の重量を記録した。溶解度（％）は、（上清中の％タンパク質／初期分散中のタンパク質％）×１００によって計算した。

本発明をその好ましい実施形態に関連して説明してきたが、その説明を読むことにより当業者には様々な変更が明らかとなることが理解されるべきである。したがって、本明細書に開示された本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれるそのような改変を包含するように意図されていることが理解されるべきである。

Claims

少なくとも約７５重量％の分子量分布１５０〜１，５００ダルトン、５重量％>３，０００ダルトン未満および５重量％未満の遊離アミノ酸<１５０ダルトンのタンパク質含有量を有する濃縮植物または海洋オリゴペプチド単離物次のものからなる方法によって、
（ａ）ｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液を２０〜４５℃の飽和アルカリ溶液で５〜２０重量当量溶解し；
（ｂ）（ａ）に記載の溶液を超高温処理滅菌により１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理した後、４０〜７０℃に冷却する；
（ｃ）（ｂ）に記載の溶液を４０〜７０℃および５〜２０℃Ｂｘで維持し、タンパク質単離物の１〜１５％（ｗ／ｗ）の加水分解剤またはその混合物で加水分解し、０．５〜８．０時間；
（ｄ）（ｃ）に記載の反応混合物の温度を７５〜９５℃に調整し、１０〜３０分間維持する；
（ｅ）（ｄ）に記載の反応混合物を室温に冷却し、Ｂｒｉｘを維持しながら０．２〜１．０ｍＰａの脈動流圧を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により０．５〜４．０時間処理する。濾液の４〜２０°Ｂｘ；
（ｆ）濾液を洗浄し、（ｅ）から１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める；
（ｇ）保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持しながら、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いてクロスフローナノ濾過により（ｆ）からの濾液を処理する；
（ｈ）（ｇ）からの保持液を回収する；
（ｉ）超高温プロセスは、（ｈ）からの保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する；
（ｊ）（ｉ）からの残留物を噴霧乾燥させ；
（ｋ）濃縮物を（ｊ）から７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。
分離株が約４０〜６０μｍの均一な顆粒サイズを示す、請求項１に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記顆粒が５％未満の含水量を示す、請求項２に記載の濃縮タンパク質単離物。
単離物が、約ｐＨ３．０〜８．５のｐＨ範囲を有する水性環境において９０％を超える溶解度を有する、請求項３に記載の濃縮タンパク質単離物。
少なくとも約８５重量％の分子量分布１５０〜１，５００ダルトン、１重量％>３，０００ダルトンおよび３重量％未満の遊離アミノ酸<１５０ダルトンのタンパク質含量を有する濃縮植物または海洋オリゴペプチド単離物以下のものからなる方法によって調製される：
（ａ）ｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液を２０〜４５℃の飽和アルカリ溶液で５〜２０重量当量溶解し；
（ｂ）（ａ）に記載の溶液を超高温処理滅菌により１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理した後、４０〜７０℃に冷却する；
（ｃ）（ｂ）に記載の溶液を４０〜７０℃および５〜２０℃Ｂｘで維持し、タンパク質単離物の１〜１５％（ｗ／ｗ）の加水分解剤またはその混合物で加水分解し、０．５〜８．０時間；
（ｄ）（ｃ）に記載の反応混合物の温度を７５〜９５℃に調整し、１０〜３０分間維持する；
（ｅ）（ｄ）に記載の反応混合物を室温に冷却し、Ｂｒｉｘを維持しながら０．２〜１．０ｍＰａの脈動流圧を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により０．５〜４．０時間処理する。濾液の４〜２０°Ｂｘ；
（ｆ）濾液を洗浄し、（ｅ）から１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める；
（ｇ）保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持しながら、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いてクロスフローナノ濾過により（ｆ）からの濾液を処理する；
（ｈ）（ｇ）からの保持液を回収する；
（ｉ）超高温プロセスは、（ｈ）からの保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する；
（ｊ）（ｉ）からの残留物を噴霧乾燥させ；
（ｋ）濃縮物を（ｊ）から７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。
分離株が約４０〜６０μｍの均一な顆粒サイズを示す、請求項５に記載の濃縮タンパク質分離物。
前記顆粒が５％未満の含水量を示す、請求項６に記載の濃縮タンパク質単離物。
分離株が、約ｐＨ３．０〜８．５のｐＨ範囲を有する水性環境において９０％を超える溶解度を有する、請求項７に記載の濃縮タンパク質分離物。
少なくとも約９０重量％の分子量分布１５０〜１，５００ダルトン、１重量％>３，０００ダルトン未満および３重量％未満の遊離アミノ酸<１５０のタンパク質含量を有する濃縮植物または海洋オリゴペプチド単離物ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）は：
（ａ）ｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液を２０〜４５℃の飽和アルカリ溶液で５〜２０重量当量溶解し；
（ｂ）（ａ）に記載の溶液を超高温処理滅菌により１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理した後、４０〜７０℃に冷却する；
（ｃ）（ｂ）に記載の溶液を４０〜７０℃および５〜２０℃Ｂｘで維持し、タンパク質単離物の１〜１５％（ｗ／ｗ）の加水分解剤またはその混合物で加水分解し、０．５〜８．０時間；
（ｄ）（ｃ）に記載の反応混合物の温度を７５〜９５℃に調整し、１０〜３０分間維持する；
（ｅ）（ｄ）に記載の反応混合物を室温に冷却し、Ｂｒｉｘを維持しながら０．２〜１．０ｍＰａの脈動流圧を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により０．５〜４．０時間処理する。濾液の４〜２０°Ｂｘ；
（ｆ）濾液を洗浄し、（ｅ）から１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める；
（ｇ）保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持しながら、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いてクロスフローナノ濾過により（ｆ）からの濾液を処理する；
（ｈ）（ｇ）からの保持液を回収する；
（ｉ）超高温プロセスは、（ｈ）からの保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する；
（ｊ）（ｉ）からの残留物を噴霧乾燥させ；
（ｋ）濃縮物を（ｊ）から７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。
分離株が約４０〜６０μｍの均一な顆粒サイズを示す、請求項９に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記顆粒が５％未満の含水量を示す、請求項１０に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記単離物が、約ｐＨ３．０〜８．５のｐＨ範囲を有する水性環境において９０％を超える溶解度を有する、請求項１１に記載の濃縮タンパク質単離物。
少なくとも約９５重量％の分子量分布が１５０〜１５００ダルトン、１重量％>３，０００ダルトン未満、３重量％未満の遊離アミノ酸が１５０未満のタンパク質含量を有する濃縮植物または海洋オリゴペプチド単離物ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）は：
（ａ）ｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液を２０〜４５℃の飽和アルカリ溶液で５〜２０重量当量溶解し；
（ｂ）（ａ）に記載の溶液を超高温処理滅菌により１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理した後、４０〜７０℃に冷却する；
（ｃ）（ｂ）に記載の溶液を４０〜７０℃および５〜２０℃Ｂｘで維持し、タンパク質単離物の１〜１５％（ｗ／ｗ）の加水分解剤またはその混合物で加水分解し、０．５〜８．０時間；
（ｄ）（ｃ）に記載の反応混合物の温度を７５〜９５℃に調整し、１０〜３０分間維持する；
（ｅ）（ｄ）に記載の反応混合物を室温に冷却し、Ｂｒｉｘを維持しながら０．２〜１．０ｍＰａの脈動流圧を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により０．５〜４．０時間処理する。濾液の４〜２０°Ｂｘ；
（ｆ）濾液を洗浄し、（ｅ）から１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める；
（ｇ）保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持しながら、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いてクロスフローナノ濾過により（ｆ）からの濾液を処理する；
（ｈ）（ｇ）からの保持液を回収する；
（ｉ）超高温プロセスは、（ｈ）からの保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する；
（ｊ）（ｉ）からの残留物を噴霧乾燥させ；
（ｋ）濃縮物を（ｊ）から７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。
分離株が約４０〜６０μｍの均一な顆粒サイズを示す、請求項１３に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記顆粒が５％未満の含水量を示す、請求項１４に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記単離物が、約ｐＨ３．０〜８．５のｐＨ範囲を有する水性環境において９０％を超える溶解度を有する、請求項１５に記載の濃縮タンパク質単離物。
少なくとも約９７重量％の分子量分布１５０〜１，５００ダルトン、１重量％>３，０００ダルトンおよび<２．５重量％の遊離アミノ酸<１５０ダルトンのタンパク質含量を有する濃縮植物または海洋オリゴペプチド単離物以下のものからなる方法によって調製される：
（ａ）ｐＨ５〜９に調整されたアルカリ溶液を２０〜４５℃の飽和アルカリ溶液で５〜２０重量当量溶解し；
（ｂ）（ａ）に記載の溶液を超高温処理滅菌により１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間処理した後、４０〜７０℃に冷却する；
（ｃ）（ｂ）に記載の溶液を４０〜７０℃および５〜２０℃Ｂｘで維持し、タンパク質単離物の１〜１５％（ｗ／ｗ）の加水分解剤またはその混合物で加水分解し、０．５〜８．０時間；
（ｄ）（ｃ）に記載の反応混合物の温度を７５〜９５℃に調整し、１０〜３０分間維持する；
（ｅ）（ｄ）に記載の反応混合物を室温に冷却し、Ｂｒｉｘを維持しながら０．２〜１．０ｍＰａの脈動流圧を有する３００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いたクロスフロー精密濾過により０．５〜４．０時間処理する。濾液の４〜２０°Ｂｘ；
（ｆ）濾液を洗浄し、（ｅ）から１〜１５当量の水で保持し、濾液を集める；
（ｇ）保持液のブリックスを１０〜３５°Ｂｘに維持しながら、室温で０．３〜０．８ｍＰａの脈動流圧力を有する１５０〜３００ダルトンの分子量カットオフ膜を用いてクロスフローナノ濾過により（ｆ）からの濾液を処理する；
（ｈ）（ｇ）からの保持液を回収する；
（ｉ）超高温プロセスは、（ｈ）からの保持液を１３０〜１５０℃で１５〜６０秒間滅菌する；
（ｊ）（ｉ）からの残留物を噴霧乾燥させ；
（ｋ）濃縮物を（ｊ）から７０〜１００℃で１０〜３０分間ドラム乾燥させる。
単離物が約４０〜６０μｍの均一な顆粒サイズを示す、請求項１７に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記顆粒が５％未満の含水量を示す、請求項１８に記載の濃縮タンパク質単離物。
前記単離物が、約ｐＨ３．０〜８．５のｐＨ範囲を有する水性環境において９０％を超える溶解度を有する、請求項１９に記載の濃縮タンパク質単離物。