JP2017514474A - 大量のトランスフェクションのためのデバイス及び方法 - Google Patents
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Abstract
細胞懸濁液を保持する内部空間４０を備えるチャンバを備える、懸濁液に電界を印加するためのデバイスであって、内部空間は少なくとも２つのセグメント４１、４２を備え、各セグメントは少なくとも１つの電極４３、４４を備え、近傍の電極４３、４４同士は、少なくとも部分的に絶縁材料４６で満たされた少なくとも１つの間隙４７によって互いに分離され、内部空間内で互いに面する電極４３、４４のエッジが丸められている、デバイスに関する。近傍の電極に面する電極のエッジを丸めることにより、結果として、電界勾配が大幅に低減し、このため、さらにはアークのリスクが大幅に低減する。本発明はさらに、電圧が少なくとも１つの活性電極４３、４４に印加される一方で、活性電極４３、４４の隣及び／又は反対側にある電極４３、４４、４５又は電極セグメントは接地電位に設定される、方法に関する。【選択図】図５ａ
Description
本発明は、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するためのデバイスであって、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液を保持するための少なくとも１つの内部空間を備える少なくとも１つのチャンバを備え、内部空間は少なくとも２つのセグメント（区分）を備え、各セグメントは少なくとも１つの電極を備え、近傍の電極同士は、少なくとも部分的に絶縁材料で満たされた少なくとも１つの間隙によって互いに分離される、デバイスに関する。さらに、本発明は、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するための方法であって、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液を保持するための少なくとも１つの内部空間を備える少なくとも１つのチャンバの電極に電圧が印加され、内部空間は少なくとも２つのセグメントを備え、各セグメントは少なくとも１つの電極を備える、方法に関する。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質のような生物活性分子の生細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞への導入は、例えば、これらの分子の生物学的機能を調べる役割を果たし、さらに、例えば、遺伝子治療における、これらの分子の治療的使用の成功のための重要な前提条件である。外部分子を細胞内に導入するための好ましい方法は、電気穿孔と呼ばれ、これは、化学的方法と異なり、標的細胞の構造及び機能の望ましくない変化を制限する。電気穿孔では、外部分子は、短い電流フロー、すなわち、例えば、細胞膜を外部分子に対して一時的に透過性にする放電キャパシタのパルスを介して、細胞又は細胞培養液に特に適した緩衝液であることが好ましい水溶液から細胞内に導入される。細胞膜に形成される一時的な「孔」は、生物的に活性な分子が、まず、これらの分子が既に自身の機能を果たしているか、又は検査対象の任意の治療作用を行使している場合がある細胞質に到達することを可能にし、次に、一定の条件下で、例えば、遺伝子治療用途において必要とされるように、細胞核に到達することも可能にすることができる。
強力な電界、すなわち、高い電流密度を有する短いパルスの短い印加に起因して、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞は融合される場合もある。このいわゆる電気融合において、細胞は、例えば、最初に、不均一な交番電界によって密に膜と接触する。電界パルスのその後の印加によって、膜部間の相互作用がもたらされ、最終的に融合が生じる。電気穿孔に用いられるデバイスに匹敵するデバイスを電気融合にも用いることができる。
細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の少量の懸濁液は、通常、比較的単純なベッセル内でバッチプロセスにおいて処理される。しばしば、溶液又は細胞懸濁液はそれぞれ、キュベット、すなわち上部が開いた狭いベッセル内に位置し、キュベットは、底部付近に、電圧を印加する役割を果たす、外壁内の２つの対向する平行な電極を有する。一方、そのようなベッセルは、電気的処理に利用可能な反応空間が電極間の限られた最大距離によって制限されているので、大量を処理するのに不適切である。このため、大量の電気穿孔又は電気融合の場合、細胞又は小胞の懸濁液が電極間の反応空間を連続的に又は非連続的に通されるフロースループロセスが多くの場合に用いられる。
国際公開第２０１１／１６１０９２号は、容器の底部に成長する接着細胞に電界を印加するための電極アセンブリを開示している。電極アセンブリは、容器内に挿入されるように設計され、各々が次の電極の対応する表面の反対側に配置される面を有する複数の電極を備える。これらの表面間の間隙は絶縁材料で完全に満たされ、処理される細胞の領域に電界が集中するようにされ、それによって電圧パルス、又は電圧パルスによって生成された電流が細胞を通って流れる。
米国特許出願公開第２００７／０１２８７０８号は、分割されたチャンバ内に生体細胞又は小胞を保有する比較的大量の液状媒体を電気穿孔するためのスケーリング可能なデバイスを開示する。各セグメントは２つの電極を含む。チャンバの有効な容量は、チャンバの長手方向軸に沿ってプランジャを動かすことによって変更することができる。このため、選択されるボリュームは、電気穿孔される試料の量に直接関係している。試料は、チャンバの端壁に配設されたポートを通じて、チャンバに吸引され、チャンバから除去される。チャンバ内の試料は、チャンバの個々のセグメントの電極対に電圧パルスを順番に印加することによって処理される。
一方、高電圧が分割電極に印加される場合に特に、アークのリスクが増大すること、及び電界線が活性電極セグメントを逸れて領域内に拡散する可能性があることが従来技術によるデバイス及び方法の欠点である。
したがって、本発明の目的は、電流を低電流に保つために、分割電極を用いて細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞を処理するためのデバイス及び方法であって、このデバイス及び装置により、アークのリスクが低減され、電界が活性電極セグメント付近の領域に留まる、デバイス及び方法を提供することである。
目的は、最初に特定されたような、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するためのデバイスによって満たされ、このデバイスを用いて、内部空間内で互いに面する電極のエッジが丸められる。電圧が電極に印加される場合、アークのリスクは、鋭い輪郭変化（エッジ）の領域において、又は電界の不均一性が活性セグメントの電極表面に非常に近接して生じるときに、大幅に増大する。驚くべきことに、近傍の電極に面する電極のエッジを丸めることにより、結果として、そのような電界勾配が大幅に低減し、このため、さらにはアークのリスクが大幅に低減する。本発明によれば、チャンバの内部空間内、及び特に電極セグメント間の間隙の領域内の電極表面の近くにおける電界の均一化が、内部空間のルーメンに面する第１の電極表面から、第１の電極表面に対し直交する第２の電極表面への平滑な形状遷移を与えることによって達成され、この平滑な形状遷移によって第２の電極表面は電極間隙に面する。特に、平滑な形状遷移は、湾曲した電極表面、すなわち、より大きなフィレット半径からより小さなフィレット半径まで（例えば、幾つかの接線方向に連結した円セグメント又はスプライン）によって与えられる。
さらに、電界勾配の低減及び電界の均一化の結果として、内部空間内の電界の散乱も減少する。したがって、チャンバの内部空間内の互いに面する電極の丸められたエッジは、高い電界密度が回避されるという驚くべき効果を有する。
本発明の例示的な実施形態によれば、電極の丸められたエッジのフィレット半径は最大にされる。驚くべきことに、丸められたエッジのフィレット半径を最大にすることによって、電界の不均一性を低減することにより、結果としてアークの尤度が大幅に減少することがわかった。すなわち、丸められたエッジの半径が大きいほど、アークのリスクが低くなる。
本発明の別の例示的な実施形態では、間隙の幅及び／又は２つの近傍の電極間の距離は最小にされる。細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞は間隙の周りの内部空間内で十分に処理されないので、間隙（すなわち、２つの近隣の電極間の距離）は可能な限り小さくするべきである。したがって、間隙の幅が小さくなると、処理の効率が高くなる。
例えば、本発明によるデバイスの設計は、フィレット半径と間隙の幅との最適な比を求めることによって最適化することができる。すなわち、電極の丸められたエッジのフィレット半径は最大にされなくてはならない一方、間隙の幅は最小にされなくてはならない。理想的な設計により、アークの非常に低いリスク及び非常に高い処理効率が確保される。
多くの用途に適した例示的な実施形態では、電極のうちの少なくとも１つの電極の丸められたエッジのフィレット半径は約０．３ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲内にある。例えば、半径は、約０．３〜１．８、０．３〜１．６、０．３〜１．４、０．３〜１．２、０．３〜１．０、０．５〜２．０、０．７〜２．０、０．９〜２．０、１．０〜２．０、０．４〜１．９、０．５〜１．８、０．６〜１．７、０．７〜１．６、０．８〜１．５、０．９〜１．４、又は１．０〜１．２の範囲内にすることができる。
同様に多くの用途に適した同じ又は別の例示的な実施形態において、間隙の幅及び／又は２つの近傍の電極間の距離は約０．５〜２．０ｍｍの範囲内にある。例えば、幅は、０．５〜１．８、０．５〜１．６、０．５〜１．４、０．５〜１．２、０．５〜１．０、０．６〜２．０、０．７〜２．０、０．９〜２．０、１．０〜２．０、０．６〜１．９、０．７〜１．８、０．８〜１．７、０．９〜１．６、１．０〜１．５、１．１〜１．４、又は１．１〜１．３の範囲内にすることができる。
本発明の別の例示的な実施形態では、内部空間に面する絶縁材料の表面は、少なくとも１つの電極の表面を適切な角度で留め継ぎする。絶縁材料の表面を、電極の表面に対して垂直に配置されるように設計することによって、電界の等電位線は、電極の表面に直交し、偏向されない。結果として、チャンバ内で電界の残りの不均一性を回避するか、又は少なくとも、絶縁材料の領域に動かすか若しくは活性セグメントの電極表面から離れるように動かし、アークの尤度がさらに低減されるようにすることができる。さらに、活性電極の近くの最大電界密度が減少する。
同じ又は別の例示的な実施形態において、本発明によるデバイスの設計は、チャンバの内部空間のルーメンに面する電極表面の半径を最大にするために電極の曲率半径を変動させ、同時に間隙の幅を最小にすることによって最適化することができる。すなわち、例示的な実施形態では、内部空間のルーメンに面する電極表面の半径は、間隙の絶縁材料に面する電極表面の半径よりも大きくすることができる。
特に、例示的な実施形態では、内部空間のルーメンに面する電極表面の半径は、約１．０ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲内にあり、間隙の絶縁材料に面する電極表面の半径は、０．３ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲内にある。この実施形態のさらなる態様として、内部空間に面する絶縁材料の表面は、厳密に電極表面曲率の半径変化の位置で、又はこの位置の近傍で、少なくとも１つの電極の表面を適切な角度で留め継ぎする。
２つの近傍の電極間の間隙内の絶縁材料は、例えば、ポリカーボネートを含むか又はポリカーボネートからなることができる。
本発明の別の例示的な実施形態では、電極のうちの少なくとも１つは他の電極よりも大きい。例えば、より大きな電極は、より小さな電極の反対側に配置される対電極又は接地電極とすることができる。この実施形態では、より小さな電極は、高電圧に設定された活性電極又は接地電位に設定された電極のいずれかとすることができる。
多くの用途に適した例示的な実施形態では、少なくとも１つの電極は、５ｍｍ〜２０ｍｍの幅を有し、少なくとも１つの電極は２０ｍｍ〜８０ｍｍの範囲の幅を有する。
本発明の別の例示的な実施形態では、間隙は、少なくとも１つの電極の一部が上記間隙の反対側に配設されるように配置される。この有利な配置では、各間隙は、別の間隙の反対側に配置されるのではなく、代わりに電極の反対側に配置されるので、効率的な処理に十分な電界に曝されないチャンバの内部空間内の領域は最小にされるか又はさらには除去される。結果として、この手段によって全体的な処理効率が効果的に増大する。
本発明のさらに別の例示的な実施形態では、各セグメントには少なくとも１つの第１の電極及び少なくとも１つの第２の電極が設けられ、第２の電極は、少なくとも２つのセグメントの共通電極である。そのような構成は、本発明によるデバイスの構築及び組み立てを容易にし、複雑な配線をさらに回避する。
例えば、本発明によるデバイスのチャンバは、互いに取り付けることができる対応する構成要素を備えることができる。すなわち、本発明によるデバイスは、例えば、２つの構成要素を互いに取り付けることによって組み立てることができ、各構成要素は、他の構成要素の凹部に対応する凹部を備える。これらの２つの構成要素が互いに取り付けられている場合、これらの構成要素の位置合わせされた凹部がチャンバの内部空間を形成する。内部空間内で電界を生成することができるように、各凹部に少なくとも１つの電極を設けることができる。電極のうちの少なくとも幾つかを分割することができる。例えば、（対称軸の一方の側にある）電極の半分を分割することができる一方、（対称軸の他方の側にある）電極の他方の半分は、対電極として用いることができる単一の非分割電極とすることができる。有利な実施形態では、２つの構成要素は同一であり、それによってコスト効率の良い生成が確保される。同一の構成要素は回転対称であるので、構成要素を互いに取り付けることによる容易な組み立てが確保される。
本発明の例示的な実施形態では、少なくとも１つのセグメントは、約１０μｌ〜５００μｌ又は２０μｌ〜４００μｌ又は３０μｌ〜３００μｌ又は５０μｌ〜２００μｌの範囲内の容量を有する。
同じ又は別の例示的な実施形態では、チャンバの内部空間のルーメンは、少なくとも５００μｌ又は少なくとも８００μｌ又は少なくとも１ｍｌの容量を有する。
本発明はさらに、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するためのデバイス、例えば、実施形態で説明したような本発明によるデバイスを生成するための方法であって、懸濁液を保持するための少なくとも１つの内部空間を備える少なくとも１つのチャンバが設けられ、内部空間は少なくとも２つのセグメントを備え、各セグメントは少なくとも１つの電極を備え、近傍の電極を互いに分離する少なくとも１つの間隙内に、絶縁材料が少なくとも部分的に満たされ、内部空間内で互いに面する電極のエッジは、これらのエッジが丸められるように機械加工される、方法に関する。この有利な設計により、電圧が電極に印加される場合のアークのリスクが大幅に低減される。
この方法の例示的な実施形態によれば、電極の丸められたエッジのフィレット半径が最大にされる。本発明の別の例示的な実施形態では、間隙の幅及び／又は２つの近傍の電極間の距離が最小にされる。例えば、本発明によるデバイスの設計は、フィレット半径と間隙幅との最適な比を求めることによって最適化することができる。すなわち、電極の丸められたエッジのフィレット半径は最大にされる一方、間隙の幅は最小にされなくてはならない。最適な設計は、アークの非常に低いリスク及び非常に高い処理効率を確保する。
本方法の別の例示的な実施形態では、内部空間に面する絶縁材料の表面は、少なくとも１つの電極の表面を適切な角度で留め継ぎするように形成される。絶縁材料の表面を、電極の表面に対し垂直に配置されるように形成することによって、電界の等電位線は、電極の表面に直交し、偏向されない。結果として、チャンバ内で電界の残りの不均一性を回避するか、又は少なくとも、絶縁材料の領域に、及び／若しくは活性セグメントの電極面から離れるように動かし、アークの尤度がさらに低減されるようにすることができる。さらに、活性電極の近くの最大電界密度が減少する。
本発明のさらに別の例示的な実施形態では、デバイス内に統合された電極のうちの少なくとも１つは、他の電極よりも大きい。例えば、より大きな電極は、より小さな電極の反対側に配置される対電極又は接地電極として用いることができる。そのような実施形態では、より小さな電極は、高電圧に設定された活性電極又は接地電位に設定された電極のいずれかとすることができる。この実施形態では、各セグメントには少なくとも１つの第１の電極及び少なくとも１つの第２の電極が設けられ、第２の電極は、少なくとも２つのセグメントの共通電極である。そのような構成は、本発明によるデバイスの構築及び組み立てを容易にし、デバイスの製造中の複雑な配線をさらに回避する。
本発明のさらに別の例示的な実施形態では、間隙は、少なくとも１つの電極の一部が上記間隙の反対側に配設されるように配置される。この有利な配置では、各間隙は、別の間隙の反対側に配置されるのではなく、代わりに電極の反対側に配置されるので、効率的な処理に十分な電界に曝されないチャンバの内部空間内の領域は最小にされるか又はさらには除去される。結果として、全体的な処理効率はこの基準によって効率的に増大される。
目的は、最初に特定されたような、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するための方法であって、電圧が少なくとも１つの活性電極に印加される一方で、活性電極の隣及び／又は反対側にある電極又は電極セグメントは接地電位に設定される、方法によってさらに満たされる。活性電極を取り囲む近傍の電極を接地電位に設定することにより、結果として、内部空間内の電界の散乱が減少し、それによって電気的に活性の領域が局所的に制限され、電界線が、活性電極の付近で収束され、このため、特に、分割されたチャンバ内で多くの量が処理される場合に、プロセスの制御が向上する。
本発明の例示的な及び有利な実施形態では、電圧は、１つのみの活性電極に印加される一方、内部空間内の全ての他の電極又は電極セグメントは接地電位に設定される。活性電極を除くチャンバの内部空間内の全ての電極を接地電位に設定することによって、電界線が活性電極の近くの内部空間内に、このためチャンバの活性セグメント内にのみ収束され、近傍の電極に向けて局所的にフェードアウトすることが確保される。
本発明の別の例示的な実施形態では、内部空間内の少なくとも２つの電極又は電極セグメントに電圧が順番に印加される。チャンバの内部空間の各セグメントを個々に電気的にアドレス指定し、チャンバ内の電界の制御された生成を厳密に達成することができるようにすることが本発明の利点である。例えば、アーク及び／又は懸濁液の望ましくない加熱を回避するために、電圧パルスは異なるセグメントに順番に印加することができる。このために、各セグメントには、個々にアドレス指定することができる少なくとも１つの電極が設けられ、電圧パルスをチャンバのセグメントに順番に印加することができるようにされる。
例えば、チャンバの出口ポートに最も近いセグメントが、第１のセグメントとして処理され、続いて、近傍セグメントが処理され、このシーケンスの最終セグメント、すなわち、出口ポートから最も遠いセグメントが処理されるまで続く。すなわち、電圧は、まず、チャンバの出口ポートに最も近いセグメントに印加され、続いて、近傍セグメントに印加され、このシーケンスの最終セグメント、すなわち、出口ポートから最も遠い前記セグメントに電圧が印加されるまで続く。本発明のこの例示的な実施形態では、出口ポートに最も近いセグメントが、第１のセグメントとして処理され、続いて、近傍セグメントが処理され、このシーケンスの最終セグメント、すなわち、出口ポートから最も遠いセグメントが処理されるまで続く。この処理シーケンスは、細胞懸濁液に高い電圧を印加する間に発生する気泡が、未処理の試料を出口方向及び／又は出口外に推進せず、処理済みの試料のみを推進することを確実にする。
本発明のさらに別の例示的な実施形態では、各セグメントには、少なくとも１つの第１の電極及び少なくとも１つの第２の電極が設けられ、電圧は、第１の電極に印加され、第２の電圧は、少なくとも２つのセグメントの共通電極である。したがって、デバイスの内部空間内の電極数は、処理の制御が容易になるように大幅に低減することができる。
本明細書において用いられるとき、「丸められた」という用語は、平坦な領域から別の平坦な領域への形状遷移が接線方向である湾曲した均一な表面を指す。
本明細書において用いられるとき、「活性電極」という用語は、電圧が印加されるが接地電位に設定されない電極を指す。例えば、「活性電極」は、高い電圧電位に設定された電極とすることができる。
本明細書において用いられるとき、「電極セグメント」という用語は、分割電極、すなわち、複数の部分に分けられた電極の、別々の部分を指し、分割電極の別々の部分は、互いに電気的に結合されない。
本明細書において用いられるとき、「セグメント」という用語は、少なくとも１つの電極又は電極セグメントを含むチャンバの内部空間の領域を指す。
本明細書において用いられるとき、「活性セグメント」という用語は、少なくとも１つの活性電極を含むチャンバのセグメントを指す。
本発明は、図面を参照して詳細にさらに例示的に説明される。
図１ａ及び図１ｂは、本発明によるデバイス１の個々の構成要素の例示的な実施形態を示す。デバイス１は、４つの電極４、５を設けられた湾曲凹部３を有する基板部材２を備える。これらの電極のうちの３つはセグメント電極４である一方、１つの電極は対電極５である。基板部材２は、互いに取り付けられた２つの構成要素から組み立てられたデバイス１の１つの構成要素を表し、これらの構成要素の少なくとも内側は同一である。すなわち、同一の内側を有する基板部材２及び第２の基板部材（図３に示す基板部材３０）は互いに取り付けられ、それによって、凹部３及び第２の基板部材の対応する凹部が、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液を保持するためのチャンバ６を形成するようになっている。このチャンバ６において、例えば、核酸又はタンパク質等の生物学的に活性な分子を、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞内に移動させるために、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞に電界を印加することができる。このために、基板部材２の電極４、５及び第２の基板部材の対応する電極は、電極対を確立し、基板部材２のセグメント電極４及び反対側に配置された第２の基板部材の対電極が３つの電極対を確立する一方で、基板部材２の対電極５及び３つの反対側に配置された第２の基板部材のセグメント電極も３つの電極対を確立する。この構成において、基板部材２の対電極５及び第２の基板部材の対電極はそれぞれ３つのセグメントの共通電極であり、チャンバ６が６つのセグメントを含むようになっており、各セグメントには、１つのセグメント電極と、１つの共通対電極の領域とが設けられる。
２つのポート７、８がチャンバ６の一方の端部９に配設され、２つのポート１０、１１がチャンバ６の反対の端部１２に配設される。上側ポート７、８のうちの一方のポートは、チャンバ６に充填するための入口ポートとして用いることができ、ポート７、８のうちの他方のポートは、チャンバ６から放出するための出口ポートとして用いることができる。同様に、下側ポート１０、１１のうちの一方のポートは、チャンバ６に充填するための入口ポートとして用いることができ、ポート１０、１１のうちの他方のポートは、チャンバ６から放出するための出口ポートとして用いることができる。したがって、各端部９、１２には、２つのポート７、８、１０、１１が設けられ、これらのポートを通じて、チャンバ６のそれぞれの区画を懸濁液で満たすことができ、及び／又はこれらのポートを通じて、この区画から懸濁液を除去することができる。この構成により、チャンバ６の充填及びチャンバからの放出を同時に行うことが可能になり、それによって、懸濁液の変更に必要な時間が最小になり、このため、懸濁液の２つの後続の電気的処理間のタイムラグが最小になる。チャンバ６の反対側の端部９、１２にポート７、８、１０、１１を設けることにより、プッシュプルメカニズムを容易に確立することが可能になり、ここで、懸濁液は、チャンバ６の一方の端部９における１つの区画への充填と、チャンバ６の反対側の端部１２における別の区画からの放出を同時に行うように、チャンバ６の２つの端部９、１２間で動くことができる。したがって、デバイス１はフロースルーデバイスではなく、プッシュプルメカニズムによってチャンバ６の充填及びチャンバ６からの放出とを同時に行うことを可能にするデバイスであり、液体は常に、チャンバに入った側と同じ側でチャンバから出る。
電界によって既に処理された懸濁液を、処理される懸濁液と分離するために、分離要素１３が設けられる。分離要素１３は、チャンバ６内で２つの端点１４、１５間を動かされることが可能であり、図１ｂ及び図２ｃに示されるように２つの端点１４、１５の間の位置にある場合、チャンバ６を２つの区画に分ける。図１及び図２に示す例示的な実施形態では、分離要素１３は、互いに離間され、圧縮性材料を含む内側空間１８の側面に位置する２つの部品１６、１７を含む。２つの離間された部品１６、１７は、ワイパ状の指部であり、分離部材１３が、端点１４、１５（図１ｂ及び図２ｃ）間の位置にある場合に、チャンバ６の異なる区画間の液体障壁及び／又は気体障壁をもたらす封止部材であるようになっている。このために、分離要素１３は、可撓性及び／又は弾性材料から作成することができ、それによって、チャンバ６内での圧力ピークを補償することも可能である。分離要素１３は、チャンバ６を最適に清掃するためのシールリップをさらに備えることができる。内部空間１８を満たす圧縮性材料は、チャンバ６内に有効な圧力補償を提供するための、空気若しくは任意の他の気体、又は圧縮性の発泡材料若しくは細胞物質とすることができる。したがって、分離要素１３も、チャンバ６内の圧力変動の平衡をとる一種のクッションとして動作する。
分離要素１３は、分離要素１３を操作及び／又は制御する調整要素１９に結合される。すなわち、分離要素１３は、調整要素１９によって、チャンバ６内で動かすことができる。調整要素１９は、チャンバ６の外側に配設され、チャンバ６の各区画が、デバイス１の機能に影響を及ぼし得る一切の干渉要素を欠くようにする。調整要素１９は、分離要素１３の離間された部分１６、１７と連動する回転可能な本体２０を備える。この例示的な実施形態では、回転可能な本体２０は、分離要素１３が両方向矢印２１に沿って回転運動を行うことができるように分離要素１３を動かす、回転子状の要素である。この実施形態は、湾曲したチャンバ６内の分離要素１３の厳密な制御及び一定の運動を確保する。回転可能な本体２０は、チャンバ６に対し調整要素１９を封止するガスケット２２によって包囲される。ここで、回転可能な本体２０は、弾性材料から作製されるスポーク２３を介してガスケット２２に接続される。
デバイス１は、上記で説明したガスケット２２の反対側のチャンバ６の外面に沿って延在し、チャンバ６の区画２６及び２７を互いに対して封止する封止インレイ２４をさらに備える。封止インレイ２４は、弾性及び圧縮性の材料、例えば、発泡シリコーン又は同様の不活性材料から作製され、それによって、チャンバ内の圧力補償が可能になる。
デバイス１は、チャンバ６の外側で分離要素１３を固定する手段を備え、それによって、スケーリング可能なチャンバ６は、図２ｄに示すような固定の容量を有する静的チャンバ６に容易に変換することができることが有利である。このために、分離要素１３は、調整要素１９によってパーキング部位２５まで動かされ、このパーキング部位で固定され、バッチプロセスにおける懸濁液の処理のためにチャンバ６の容量全体を提供する。
図２ａ〜図２ｄは、図１によるデバイス１の分離要素１３の様々な位置を示す。本発明による方法は、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液を電気的に処理するためのスケーリング可能なプロセスである。図２ａ）において、分離要素１３は、下側の端点１５の位置にセットされる。分離要素１３が上側の端点１４（図２ｂ））の位置まで回転する場合、懸濁液の第１のアリコートが下側ポート１０、１１のうちの一方に注入され、このためチャンバ６内に充填される。次に、第１のアリコートは、懸濁した細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞に電界を印加することによってチャンバ６内で処理される。その後、処理された第１のアリコートは、分離要素１３を下側端点１５の位置に戻るように回転させることによって、下側ポート１０、１１のうちの１つを通って放出され、同時に、懸濁液の第２のアリコートが上側ポート７、８のうちの一方に提供され、このため、チャンバ６内に充填される。次に、第２のアリコートは、懸濁した細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞に電界を印加することによって、チャンバ６内で処理される。その後、処理された第２のアリコートが、分離要素１３を上側の端点１４の位置に戻るように回転させることによって、上側ポート７、８のうちの一方を通じて放出され、同時に、懸濁液の第３のアリコートが下側ポート１０、１１のうちの一方に注入され、このため、チャンバ６内に充填される。次に、第３のアリコートは、懸濁した細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞に電界を印加することによってチャンバ６内で処理される。懸濁液の同時の充填及び放出を用いたこのプッシュプルメカニズムは、懸濁液全体が処理されるまで繰り返すことができる。
分離要素１３は、端点１４、１５（図２ｃ））間の位置にある場合、チャンバ６を２つの区画２６、２７に分離する。ここで、チャンバ６の各区画２６、２７は、懸濁液を保持するように設計され、チャンバ６の充填又はチャンバ６からの放出のための２つのポート７、８及び１０、１１を備える。各区画２６、２７は、ポート７、８及び１０、１１を通じてチャンバ６の内外に移動可能な懸濁液のアリコートを受容及び保持することができる。区画２６、２７は、各々が、それぞれの区画２６、２７を懸濁液で満たすことができる１つのポート７、１０と、懸濁液をこの区画２６、２７から除去することができる１つのポート８、１１とを設けられる。分離要素１３が回転されると、チャンバ６の１つの区画２６、２７が試料のアリコートで満たされる一方、試料の別のアリコートが他の区画２６、２７から放出され、押し出される。到来する試料のための容器は、上側及び下側の入口ポート７、１０に接続することができ、上側及び下側の出口ポート８、１１は、処理済みの試料のためのリザーバに接続することができる。図２から明らかとなるように、デバイス１は、フロースルー形式で機能するのではなく、プッシュプル方式で機能し、注入される試料は、処理後に、充填されたのと同じ側で放出される。チャンバ６は、６つの電極セグメントを処理し、そのうちの１つは、常に分離要素１３によって覆われ、このため使用可能でない。例えば、チャンバ６は、サイクルあたり８３４μｌを取得することができる。このため、この場合、完全な１サイクルで１６６８μｌを処理することができる。
本発明の有利な実施形態では、分離要素は、厳密に１つ又は複数のセグメント電極を覆うように調整され、他の各電極セグメント内で同じ電気パラメータを確立することができるようにされる。
デバイス１の静的変形形態は、分離要素１３が回転することを可能にしない。代わりに、図２ｄに示されるように、分離要素１３は、チャンバ６の外側でバーキング部位２５に固定され、電極セグメントを一切覆わない。この変形形態では、６つ全ての電極セグメントを用いることができ、このため、１０００μｌの試料を処理することができる。例えば、試料は、デバイス１の下側又は上側入口ポート７、１０において注入することができ、下側出口ポート１１において収集することができる。反復して満たすことは、デバイス１のこの状態では可能でない。
図３は、図１によるデバイス１の外側の斜視図を示す。デバイス１は、基板部材３０を備え、基板部材３０の内側（不可視）は、図１による基板部材２の内側と同一である。基板部材３０は、互いに取り付けられた２つの構成要素（基板部材２及び３０）から組み立てられたデバイス１のさらなる構成要素を表す。この外側において、基板部材３０には、図１及び図２によるチャンバ６のポート７、８、１０、１１に導管を接続するためのコネクタ３１が設けられる。懸濁液が処理されるための１つ又は複数の容器、及び処理済みの懸濁液のための１つ又は複数のリザーバを、適切な導管を介してコネクタ３１に接続することができる。懸濁液は、ポンプ要素、例えば、真空ポンプ又は蠕動ポンプ等によってチャンバ内に充填及びチャンバから放出されることが可能であり、真空及び又は蠕動ポンプは、容器／リザーバとコネクタ３１との間のサスペンション回路に接続することができる。デバイス１を共通の導管及びポンプシステムに適合させるために、コネクタ３１は、ルアースリップコネクタ又はルアーロックコネクタとすることができる。
デバイス１の調整要素１９は、ウォームギヤ、スパーギヤ、ベベルギヤ、ギヤロッド、ベルトドライブ、角棒鋼、又は同様のギヤメカニズム又はパワー伝達要素（図示せず）を介して、電源ユニット（図示せず）、例えば電気モータに接続することができる。
基板部材３０は、チャンバ内の電極に電気接続を提供するための多数の導電領域３２をさらに備える。導電領域３２は、導電ポリマー、特に、導電材料をドープされたポリマー又は生来から導電性を持つポリマーを含むことができる。導電領域３２は、電極と、少なくとも１つの電気接点３３との間の電気的接続を提供するように設計される。この実施形態では、導電領域３２は、基板部材３０内の穴であり、少なくとも部分的に、導電性材料で満たされている。導電性領域３２は、少なくとも１つの導電性経路、例えば、基板部材（図示せず）の層上の銅トラックを介して、少なくとも１つの電気接点３３に電気的に結合されている。電気接点は、電源に対し直接の又は間接的な電気接続を提供するために、少なくとも１つの電気接点によって接触することができる。
図４の（ａ）及び（ｂ）は、図３による基板部材３０の異なるビューを示す。基板部材３０の内面３４が図４の（ａ）に示されている。電極４、５は内面３４に取り付けられている。これらの電極４、５のうちの３つがセグメント電極４であるのに対し、これらの電極４、５のうちの１つはより大きな対電極５である。電極４、５は、基板部材３０の内面３４から外面３５に延在する導電領域３２に取り付け及び接続される。例えば、導電領域３２内の電極４、５及び導電材料は、同じ材料、例えば、導電ポリマー、特に、上記で説明されたような、導電材料をドープされたポリマー又は生来から導電性を持つポリマーから作製される。ポリマーは、基板部材３０の内面３４及び導電領域３２の上に成形され、図５ａ）に詳細に示すように、導電領域３２の穴を通じて延在することができる。導電領域３２は、少なくとも１つの導電性パス（図示せず）を介して少なくとも１つの電気接点３３と電気的に結合されている。電気接点３３は、電源に対し直接の又は間接的な電気接続を提供するために、少なくとも１つの電気接点によって接触することができる。本発明の有利な実施形態では、基板部材３０はプリント回路基板（ＰＣＢ）である。
図５ａは、本発明による例示的なデバイスの内部空間４０の一部の例示的な実施形態を示す。例えば、内部空間４０は、図１及び図２によるデバイス１のチャンバ６の一部とすることができる。内部空間４０は、各々が電極４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４を備える８つのセグメント４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４を備える。２つのさらなる電極４５．１及び４５．２が、それぞれ電極４３．１、４３．２、４３．３、４３．４及び４４．１、４４．２、４４．３、４４．４の反対側に配設される。近傍にある電極同士は、電極４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４を取り囲み、近傍にある電極間の各間隙４７．１〜４７．８を満たす、絶縁材料４６によって互いに分離されている。絶縁材料４６は、例えば、ポリカーボネート、ＦＲ４機材若しくは他の絶縁材料からなるか、又は少なくともこれらを含むことができる。電極４３．２及び４３．３のエッジの特性、並びに間隙４７．２の特性は、図５ｂを参照して詳細にさらに説明される。以下で説明されるこれらの特性は、他の電極４３．１、４３．４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４及び間隙４７．１、４７．３〜４７．８にも適用することができる。
図５ｂは、各々が電極４３．２、４３．３を含む２つのセグメント４１．２、４１．３を含む、図５ａによる内部空間４０の一部を示す。さらなる電極４５．１が電極４３．２、４３．３の反対側に配設される。近傍にある電極４３．２、４３．３同士は、電極４３．２、４３．３を取り囲み、近傍にある電極４３．２、４３．３間の各間隙４７．２を満たす、絶縁材料４６によって互いに分離されている。望ましくないアークを回避するために、内部空間４０内の互いに面した電極４３．２、４３．３のエッジ４８、４９は丸められている。丸められたエッジ４８、４９は、電界勾配の擾乱を大幅に低減することを確保する。電界勾配は、不要に高い局所電界密度を生成し、このため、望ましくないアークのリスクを増大させる。さらに、内部空間４０内、特に電極４３．２、４３．３の表面に隣接した電界の均質化は、平坦な電極表面から湾曲した電極表面への、すなわち、より大きなフィレット半径からより小さなフィレット半径への平滑な形状遷移を与えることによって達成することができる。そのような電極設計のさらなる結果として、電界線が電極４３．２、４３．４の付近に集束するように、内部空間４０内の電界の散乱が減少する。
本発明によるデバイスの設計は、各丸められたエッジ４８、４９の半径と、間隙４７．２の幅との最適な比を求めることによって最適化することができる。この最適化は、電極４３．２、４３．３の丸められたエッジ４８、４９のフィレット半径を最大にし、同時に、間隙４７．２の幅を可能な限り小さく保つことによって達成される。最適な設計により、非常に低いアークのリスク及び非常に高い処理効率が確保される。例えば、電極４３．２、４３．３のうちの少なくとも１つの電極の丸められたエッジ４８、４９のフィレット半径は、約０．３ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲とすることができる一方、間隙４７．２の幅、すなわち、近傍にある電極４３．２、４３．３間の距離は、約０．５ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲とすることができる。
内部空間４０に面する絶縁材料４６の表面５０は、この表面が、電極４３．２、４３．４の各々の表面を適切な角度で留め継ぎするように形成及び位置合わせすることができる。結果として、絶縁材料４６の表面５０が、それぞれ電極４３．２及び４３．３の表面に対し垂直に配設される。この好ましい設計に起因して、内部空間４０内の電界の等電位線は、電極４３．２、４３．３の表面に直交し、したがって偏向されない。したがって、電界の電位不均一性を回避するか、又は少なくとも絶縁材料４６内の領域に移し、アークの尤度がさらに低減されるようにすることができる。
電極４３．２、４３．３に面している電極４５．１は、近傍の電極４３．２、４３．３よりも大きく、間隙４７．２の反対側に配設されている。すなわち、間隙４７．２の付近の領域が効率的な処理に十分な電界に曝されるように、間隙４７．２の反対側に他の間隙は配設されていない。したがって、全体的な処理効率が効果的に増大する。電極４５．１は、双方のセグメント４１．２及び４１．３の長さ全体にわたって延在し、このため、双方のセグメント４１．２、４１．３の共通電極である。例えば、より大きな電極４５．１は対電極又は接地電極とすることができる一方で、より小さな電極４３．２、４３．３は、高い電圧に設定された活性電極、又は接地電位にも設定された電極とすることができる。近傍の電極４３．３及び対電極４５．１が接地電位に設定されている間、例えば電極４３．２（活性電極）に電圧を印加することができる。活性電極４３．２を取り囲む電極４３．３及び４５．１を接地電位に設定することにより、結果として内部空間４０内の電界の散乱が減少し、それによって、電界線が活性電極４３．２の付近に集束し、このため、プロセスの制御が向上する。
例えば、電極４３．２、４３．３のうちの少なくとも１つが、５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲の幅を有することができる一方、より大きな電極４５は、２０ｍｍ〜８０ｍｍの範囲の幅を有することができる。
本発明によるデバイスの動作中、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液が、内部空間４０内で電界を生成することによって処理されるとき、懸濁液と接している近傍の電極４３．２、４３．３の平坦な（又は代替的に、僅かに湾曲及び／又は凸状に隆起している）表面５１、５２は、プロセスのための主要な活性表面である。平坦な表面５１、５２は、接地電位に設定された対電極として用いることができる、より大きな電極４５．１と対向する。例えば、高電圧が電極４３．３に印加され、近傍の電極４３．２が接地電位に設定される場合、高電界強度を有する電界は、平行な電極表面間、すなわち、電極４３．３の平坦な表面５２と、反対側に配置された電極４５．１の平坦な（又は代替的に、僅かに湾曲及び／又は凸状に隆起している）表面５３との間のセグメント４１．３において生成される（図６）。本発明によるデバイスの有利な設計に起因して、この領域内の等電位線は均一に分散し、それによってアークのリスクが非常に低くなる。基本的に、以下の原理が有効である。等電位線の分散が均一であるほど、アークのリスクが低減する。したがって、電極４３．３の平坦な表面５２から丸められた表面４９への遷移の領域において、不均一性及び電界勾配を回避しなくてはならない。このために、本発明によれば、第１の、より大きなフィレット半径を有する第１の丸みと、第２の、より小さなフィレット半径を有する第２の丸みとを設けることによって、平滑で一定の形状の遷移が確保される。第２のフィレット半径は、電極４３．３の表面を、対向する電極４５．１から離れるように動かし、これによって、電界強度が局所的に低減する。上記で説明したような、電極４３．３の丸められたエッジ４９、及び絶縁材料４６の表面５０の設計によって、結果としてアークのリスクが大幅に低減する。さらに、電界は、電極４３．３の平坦な表面５２と、電極４５．１の反対側に配置された平坦な表面５３との間のセグメント４１．３内に集束される。同じことは、電極４３．２に高い電圧が印加され、電極４３．３が後続の電圧パルス中に接地電位に設定される場合の近傍の電極４３．２にも当てはまる。
図６から明らかとなるように、間隙４７．２の付近の領域は、依然として、効率的な処理に十分な電界に曝されている。後続の電圧パルスが電極４３．２に印加されるときに、懸濁液の量は２回処理されるので、間隙４７．２と対向する電極４５．１との間の領域内の中程度の電界強度が望ましい。したがって、間隙４７．２の幅、すなわち、近傍の電極４３．２、４３．３間の距離が最適化される。
間隙の幅が過度に大きくなる場合、絶縁間隙領域の中央の細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞が、最大電界強度の半分よりも低い電界強度に曝される（例えば、図７に示す電極５５、５６間の間隙５４）。このため、この領域において２回処理される材料は、理想的に処理されない。
本発明によるデバイスの理想的な設計は、非常に高い電界勾配を有する、起こり得る「ホットスポット」を、電極の表面／角から離れるように動かす。従来の電極及び間隙設計（すなわち、図８に示すような、真っ直ぐな長方形の電極５７、５８）では、電極の付近の高い電界勾配は、低いアーク閾値に相関し、このため、アーク事象のはるかに高い尤度に相関する。
Claims (16)
- 前記細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液を保持するための少なくとも１つの内部空間（４０）を備える少なくとも１つのチャンバ（６）を備える、前記懸濁液に電界を印加するためのデバイス（１）であって、前記内部空間（４０）が少なくとも２つのセグメント（４１、４２）を備え、前記セグメント（４１、４２）の各々が少なくとも１つの電極（４３、４４、４５）を備え、近傍の前記電極（４３、４４）同士が、少なくとも部分的に絶縁材料（４６）で満たされた少なくとも１つの間隙（４７）によって互いに分離される、デバイスにおいて、
前記内部空間（４０）内で互いに面する前記電極（４３、４４）のエッジ（４８、４９）が丸められていることを特徴とする、デバイス。 - 前記電極（４３、４４）の前記丸められたエッジ（４８、４９）のフィレット半径が最大にされている、請求項１に記載のデバイス。
- 前記間隙（４７）の幅及び／又は近傍の電極（４３、４４）間の距離が最小にされている、請求項１又は２に記載のデバイス。
- 前記電極（４３、４４）のうちの少なくとも１つの電極の前記丸められたエッジ（４８、４９）のフィレット半径が、約０．３ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲内にある、請求項２又は３に記載のデバイス。
- 前記間隙（４７）の幅及び／又は前記近傍の電極（４３、４４）間の距離が、約０．５ｍｍ〜２．０ｍｍの範囲にある、請求項２〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記内部空間（４０）に面する前記絶縁材料（４６）の表面（５０）が、少なくとも１つの電極（４３、４４）の表面（５１、５２）を適切な角度で留め継ぎされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記電極のうちの少なくとも１つが他の電極よりも大きい、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
- 少なくとも１つの電極（４３、４４）が５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲の幅を有し、少なくとも１つの電極（４５）が２０ｍｍ〜８０ｍｍの範囲の幅を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記間隙（４７）が、少なくとも１つの電極（４５）の一部が前記間隙（４７）の反対側に配設されるように配置されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記セグメント（４１、４２）の各々に少なくとも１つの第１の電極（４３、４４）及び少なくとも１つの第２の電極（４５）が設けられ、前記第２の電極（４５）が、少なくとも２つのセグメント（４１、４２）の共通電極である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記チャンバ（６）の前記内部空間（４０）のルーメンが、少なくとも５００μｌの容量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
- 細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び／又は小胞の懸濁液に電界を印加するための方法であって、前記懸濁液を保持するための少なくとも１つの内部空間（４０）を備えるチャンバ（６）の電極（４３、４４）に電圧が印加され、前記内部空間（４０）が少なくとも２つのセグメント（４１、４２）を備え、各セグメント（４１、４２）が少なくとも１つの電極（４３、４４、４５）を備える、方法において、
前記電圧が少なくとも１つの活性電極（４３、４４）に印加され、前記活性電極（４３、４４）の隣及び／又は反対側にある前記電極（４３、４４、４５）又は電極セグメントは接地電位に設定されることを特徴とする、方法。 - 前記電圧は、１つのみの活性電極（４３、４４）に印加される一方、前記内部空間（４０）内の全ての他の電極（４３、４４、４５）又は電極セグメントが接地電位に設定される、請求項１２に記載の方法。
- 前記電圧が、前記内部空間（４０）内の少なくとも２つの電極（４３、４４）又は電極セグメントに順番に印加される、請求項１２又は１３に記載の方法。
- 前記チャンバの出口ポートに最も近い前記セグメントが、第１のセグメントとして処理され、続いて、近傍のセグメントが処理され、このシーケンスの最終セグメント、すなわち、前記出口ポートから最も遠い前記セグメントが処理されるまで続く、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 各セグメント（４１、４２）には、少なくとも１つの第１の電極（４３、４４）及び少なくとも１つの第２の電極（４５）が設けられ、前記電圧が、前記第１の電極（４３、４４）に印加され、前記第２の電極（４５）が、少なくとも２つのセグメント（４１、４２）の共通電極である、請求項１２〜１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
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