JP2017514464A - 好アルカリ菌を使用するl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
予期せぬことに、コリネバクテリウム属の好アルカリ菌は、L−アミノ酸の製造に適していることが判明した。
Description
本発明は、L−アミノ酸の製造方法であって、好アルカリ菌、特にCorynebacterium humireducens株を使用する方法に関する。
コリネバクテリウム属に属する細菌(コリネバクテリウム属菌)を使用するL−アミノ酸の製造方法が知られている。
多くのコリネバクテリウム属菌が知られているが、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)(C.グルタミカム)はL−アミノ酸を製造するために特に有利であることが判明しており、上記方法において一般的に使用されている。
本発明の目的は、少なくとも1種のL−アミノ酸を有意に過剰産生させ、C.グルタミカムの代替株としてL−アミノ酸の製造に直接的に有用であるか、少なくとも新規なL−アミノ酸産生株を開発するための有望な開始株であると考えられる新規な菌株を提供することにある。
新規なL−アミノ酸産生株を開発するための開始株としては、L−アミノ酸の過剰産生が比較的わずかであっても十分である。すなわち、そのような開始株からの、関連アミノ酸の産生に対する有益又は有害な作用を有することが知られている遺伝子又は酵素の過剰発現又は減衰並びに任意の非特異的な突然変異生成(undirected mutagenesis)により、L−アミノ酸の収率を増加させることができる。
予期せぬことに、好アルカリ菌であるCorynebacterium humireducens(C.humireducens)は、L−アミノ酸であるL−アラニン、L−グルタミン酸及びL−バリンを大量に過剰産生していることが判明した。
また、AEC並びに必要に応じてトレオニンを含む培地で培養することにより、大量のL−リシンを産生するC.humireducens株を得ることができた。
従って、C.humireducensは、さらなるL−アミノ酸産生株を製造するための適当な開始点でもある。すなわち、細菌代謝の対応する転換により、上述したL−アミノ酸の過剰産生をその他の所望のL−アミノ酸の過剰産生に変化することができる。
L−アラニンの天然の過剰産生は、C.humireducensにおいて見出された特に効率的なアラニンデヒドロゲナーゼによるものであると思われる。アラニンデヒドロゲナーゼに関しては、その他の数種類のコリネバクテリウム属菌についてのみこれまで報告されており、野生型細胞内においてL−アラニンを蓄積させる活性アラニンデヒドロゲナーゼについては報告されていない。
L−グルタミン酸の天然の過剰産生は、特に効率的なヒスチジン利用遺伝子(histidine utilization gene(hut遺伝子))によるものであると思われる。hut群(hut遺伝子群)は、ウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU)、イミダゾロンプロピオナーゼ(hutI)、ヒスチジンアンニモアリアーゼ(hutH)及びホルミミドイルグルタマーゼ(formimidoylglutamase)(hutG)からなる。hut遺伝子に関しては、その他の数種類のコリネバクテリウム属菌についてのみこれまで報告されており、野生型細胞内においてL−グルタミン酸を蓄積させる活性hut遺伝子については報告されていない。
従って、本発明は、L−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好アルカリ菌、好ましくは好アルカリコリネ型細菌、特に好アルカリコリネバクテリウム、特に好ましくはC. humireducensを使用することを特徴とする方法に関する。
本発明に係る好アルカリ菌は、好ましくは耐塩及び/又はフミン酸還元細菌である。
本発明に関連して使用する「好アルカリ菌」という用語は、8.5〜11のpHにおいて成長することができる細菌を意味する。好ましくは、本発明に関連して使用する「好アルカリ菌」という用語は、9〜10.5のpHにおいて成長することができる細菌を意味する。
本発明に関連して使用する「耐塩菌」という用語は、0.6〜0.98の水分活性において成長することができる細菌を意味する。好ましくは、本発明に関連して使用する「耐塩菌」という用語は、0.75〜0.9の水分活性において成長することができる細菌を意味する。
本発明に関連して使用する「L−アミノ酸」という用語は、特にタンパク質を構成するL−アミノ酸を意味する。
この場合、L−アミノ酸は、好ましくは、L−アラニン、L−バリン、グルタミン酸系のL−アミノ酸、特に、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン及びL−アルギニン、アスパラギン酸系のL−アミノ酸、特に、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−メチオニン、L−リシン、L−イソロイシン及びL−トレオニンから選択される。L−アミノ酸は、特に好ましくは、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸、L−メチオニン、L−リシン及びL−トレオニン、特にL−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸及びL−リシンから選択される。
C.humireducens株は、Wu et al.(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2011),61,882−887)によって初めて報告された。C.humireducens株は、受託番号DSM45392としてDSMZに寄託されており、その16S rRNAは、登録番号GQ421281としてEMBLに寄託されている。開始株は、耐塩性かつ好アルカリ性のフミン酸還元細菌である。
C.humireducensに関するさらなる情報は、Wu et al.(Microb.Biotechnol.(2013),6(2),141−149)及びLin et al.(Bioresour.Technol.(2013),136,302−308)に記載されている。
また、本発明は、配列番号72で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするアラニンデヒドロゲナーゼ(Ald)に関する。
また、本発明は、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。配列番号71で表される配列の位置301〜1365の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド及び/又は配列番号71で表される配列の位置301〜1365の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが好ましい。
また、本発明は、以下の酵素から選択されるhut群の酵素に関する。
a)配列番号190で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU);
b)配列番号192で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするイミダゾロンプロピオナーゼ(hutI);
c)配列番号194で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするヒスチジンアンモニアリアーゼ(hutH);
d)配列番号196で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするホルミミドイルグルタマーゼ。
a)配列番号190で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU);
b)配列番号192で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするイミダゾロンプロピオナーゼ(hutI);
c)配列番号194で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするヒスチジンアンモニアリアーゼ(hutH);
d)配列番号196で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするホルミミドイルグルタマーゼ。
また、本発明は、本発明に係るhut群の遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。この場合、以下のポリヌクレオチドが好ましい。
a)ウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU)をコードし、配列番号189で表される配列の位置301〜1983の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号189で表される配列の位置301〜1983の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
b)イミダゾロンプロピオナーゼ(hutI)をコードし、配列番号191で表される配列の位置301〜1509の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号191で表される配列の位置301〜1509の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c)ヒスチジンアンニモアリアーゼ(hutH)をコードし、配列番号193で表される配列の位置301〜1851の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号193で表される配列の位置301〜1851の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
d)ホルミミドイルグルタマーゼ(hutG)をコードし、配列番号195で表される配列の位置301〜1209の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号195で表される配列の位置301〜1209の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
a)ウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU)をコードし、配列番号189で表される配列の位置301〜1983の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号189で表される配列の位置301〜1983の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
b)イミダゾロンプロピオナーゼ(hutI)をコードし、配列番号191で表される配列の位置301〜1509の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号191で表される配列の位置301〜1509の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c)ヒスチジンアンニモアリアーゼ(hutH)をコードし、配列番号193で表される配列の位置301〜1851の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号193で表される配列の位置301〜1851の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
d)ホルミミドイルグルタマーゼ(hutG)をコードし、配列番号195で表される配列の位置301〜1209の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有する配列を有する、及び/又は配列番号195で表される配列の位置301〜1209の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明に関連して使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、1×SSCの塩濃度の0.1重量% SDSで80℃で洗浄する条件を意味する。
また、本発明は、本発明に係るコーディングポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクター、特にクローニング及び発現ベクターに関する。これらのベクターは、微生物、特にコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属又は腸内細菌科、特にエスケリキア属に適宜導入することができる。
また、コードされた遺伝子の発現のために、本発明に係るポリヌクレオチドを、微生物のゲノム、特にコリネ型細菌のゲノム、特にコリネバクテリウム属菌のゲノム又は腸内細菌科菌のゲノム、特にエスケリキア属菌のゲノムに導入することもできる。
また、本発明は、対応する組み換え微生物、好ましくは細菌、特にコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特に好ましくはC.humireducens又はC.グルタミカム並びに腸内細菌、特にエスケリキア属菌であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は本発明に係るhut群の酵素の1種以上(好ましくは全て)及び/又は本発明に係るポリヌクレオチドの1種以上及び/又は本発明に係るベクターを含む組み換え微生物に関する。
本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクターを含む、組み換えコリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens及びC.グルタミカムが好ましい。
また、hut群の酵素の少なくとも1種(好ましくは全て)及び/又は前記酵素をコードするポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクターを含む、組み換えコリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens及びC.グルタミカムも好ましい。
また、本発明は、組み換え微生物、好ましくは細菌、特にコリネ型細菌、特にC.humireducensを除くコリネバクテリウム属菌、特にC.グルタミカムであって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は本発明に係るhut群の酵素の1種以上(好ましくは全て)及び/又は本発明に係るポリヌクレオチドの1種以上及び/又は本発明に係るベクターを含む組み換え微生物に関する。
本発明に関連して使用する「組み換え微生物」又は「組み換え細菌」という用語は、少なくとも1種の遺伝子操作が行われた微生物又は細菌を意味する。遺伝子操作は、標的又はランダム突然変異、外来遺伝子の導入及び/又は宿主遺伝子又は外来遺伝子の過剰発現又は減衰であってもよい。本発明に係る組み換え微生物又は本発明に係る組み換え細菌は、好ましくは少なくとも1種の遺伝子の過剰発現又は減衰によって特徴付けられる。特に好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は本発明に係る細菌は、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの過剰発現によって特徴付けられる。別の特に好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は本発明に係る細菌は、本発明に係るhut群の酵素の少なくとも1種、特に本発明に係るhut群の酵素の全て又はこれらの酵素をコードする対応するポリヌクレオチドの過剰発現によって特徴付けられる。
本発明においては、コリネバクテリウム属菌としては、基準株DSM44549等のコリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)、基準株ATCC13032又は株R等のコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium グルタミカム)、基準株ATCC6871等のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、株DSM 45392等のCorynebacterium humireducens、株CGMCC No.5361等のCorynebacterium pekineseが好ましい。
これらのうち、コリネバクテリウム・グルタミカム及びCorynebacterium humireducensが特に好ましい。本願明細書においてCorynebacterium humireducensに言及する場合には、好ましくは株DSM 45392又は株DSM 45392に由来する株を意味する。
コリネバクテリウム・グルタミカムは別の名称でも知られている。それらの例としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)(ATCC13870)、コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)(DSM20137)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)(ATCC17965)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)(ATCC14067)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)(ATCC13869)及びブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)(ATCC14020)が挙げられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムはミクロコッカス・グルタミカス(Micrococcus glutamicus)とも呼ばれている。コリネバクテリウム・エフィシェンスは、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)(FERM BP−1539等)としても知られている。
コリネ型細菌株の分類に関する情報は、Seiler(Journal of General Microbiology 129,pp.1433−1477(1983))、Kinoshita(1985,Glutamic Acid Bacteria,pp.115−142:Demain and Solomon(ed),Biology of Industrial Microorganisms.The Benjamin/Cummins Publishing Co.,London,UK),Kampfer and Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42,pp.989−1005(1996))、Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41,pp.255−260(1991))、Fudou et al.(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52,1127−1131(2002))及び米国特許第5,250,434号に記載されている。
「ATCC」と記載されている株は、American Type Culture Collection(米国バージニア州マナサス)から入手することができる。「DSM」と記載されている株は、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(German Microorganism and Cell Culture Collection)(DSMZ)(ドイツ・ブラウンシュヴァイク)から入手することができる。「NRRL」と記載されている株は、Agricultural Research Service Patent Culture Collection(ARS)(米国イリノイ州ピオリア)から入手することができる。「FERM」と記載されている株は、国立研究開発法人産業技術総合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST))(茨城県つくば市東1−1−1中央第6)から入手することができる。「CGMCC」と記載されている株は、China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)(中華人民共和国・北京市)から入手することができる。
また、本発明は、L−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は本発明に係るhut群の酵素の少なくとも1種、好ましくは本発明に係るhut群の酵素全て及び/又は本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも1種及び/又は本発明に係る組み換え微生物、好ましくは本発明に係る組み換え細菌、特に本発明に係る組み換えコリネ型細菌、特に好ましくは本発明に係る組み換えコリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカムであるコリネバクテリウム属菌を使用することを特徴とする方法に関する。本発明の好適な実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも1種又は前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを過剰発現された状態で使用する。
この場合、本発明は、好ましくは、L−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は前記酵素をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクター及び/又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼを含む組み換えコリネバクテリウム属菌、好ましくはC.humireducens又はC.グルタミカム及び/又は前記酵素をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクターを使用することを特徴とする方法に関する。
従って、本発明は、L−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るhut群の酵素の少なくとも1種、好ましくは本発明に係るhut群の酵素の全て及び/又は前記酵素をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチド、好ましくは本発明に係るhut群の酵素の全てをコードするポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクター及び/又は本発明に係るhut群の酵素の少なくとも1種、好ましくは本発明に係るhut群の酵素の全てを含む組み換えコリネバクテリウム属菌、好ましくはC.humireducens又はC.グルタミカム及び/又は前記酵素をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチド、好ましくは本発明に係るhut群の酵素の全てをコードするポリヌクレオチド及び/又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも1種のベクターを使用することを特徴とする方法に関する。
この場合、本発明を使用して製造するL−アミノ酸は、好ましくは、L−アラニン、L−バリン、グルタミン酸系のL−アミノ酸、特に、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン及びL−アルギニン、アスパラギン酸系のL−アミノ酸、特に、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−メチオニン、L−リシン、L−イソロイシン及びL−トレオニン、特に好ましくは、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸、L−メチオニン、L−リシン及びL−トレオニン、特に、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸及びL−リシンから選択される。
本発明に係る製造方法に使用されるコリネバクテリウム属菌は、好ましくは、C.humireducens及びC.グルタミカムから選択される。
本発明に関連してL−アミノ酸について使用する「過剰産生」という用語は、微生物が必要に応じてL−アミノ酸を産生し、細胞内におけるL−アミノ酸の濃度が上昇するか、L−アミノ酸が培養液に分泌され、蓄積されることを意味する。この場合、微生物は、L−アミノ酸が、細胞内又は培養液内において、120時間以内、96時間以内、48時間以内、36時間以内、24時間以内又は12時間以内に、少なくとも0.25g/l、少なくとも0.5g/l、少なくとも1.0g/l、少なくとも1.5g/l、少なくとも2.0g/l、少なくとも4g/l又は、少なくとも10g/lの濃度となるような濃度上昇又は蓄積能力を有することが好ましい。
好適な実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド及び/又は本発明に係る本発明に係るベクターを導入する本発明に係る組み換え微生物は、本発明に係るポリヌクレオチド及び/又は本発明に係る本発明に係るベクターの導入前に、L−アミノ酸を過剰産生させる能力を有する。開始株は、突然変異生成及び選別、遺伝子組み換え技術又はこれらの組み合わせによって生成された株であることが好ましい。
なお、本発明に係る組み換え微生物は、言うまでもなく、本発明に係るポリヌクレオチド及び/又は本発明に係る本発明に係るベクターが存在するか、導入された野生型株において製造することができ、その後の遺伝子操作により、L−アミノ酸を産生させるか、L−アミノ酸の産生量を増加させることができる。
また、本発明は、C.humireducensに由来するその他のポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに関する。関連するポリヌクレオチド又はポリペプチドの過剰発現により、ある種のL−アミノ酸のアミノ酸生産に良い影響を与えることができる。
また、本発明は、以下の酵素等に関する。
a)配列番号106で表される配列及び配列番号106で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンデヒドラターゼ(IlvA、EC 4.3.1.19)、
b)配列番号98で表される配列及び配列番号98で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニット(IlvB)、
c)配列番号100で表される配列及び配列番号100で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソメロレダクターゼ(isomer reductase)(IlvC、EC 1.1.1.86)、
d)配列番号102で表される配列及び配列番号102で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(IlvD、EC 4.2.1.9)、
e)配列番号104で表される配列及び配列番号104で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトランスアミナーゼ(IlvE、EC 2.6.1.42)、
f)配列番号122で表される配列及び配列番号122で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素(IlvH、EC 2.2.1.6)、
g)配列番号118で表される配列及び配列番号118で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(PanB、EC 2.1.2.11)、
h)配列番号120で表される配列及び配列番号120で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するパントテン酸合成酵素(PanC、EC 6.3.2.1)、
i)配列番号124で表される配列及び配列番号124で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Gdh)、
j)配列番号126で表される配列及び配列番号126で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ1)、
k)配列番号128で表される配列及び配列番号128で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ2)、
l)配列番号130で表される配列及び配列番号130で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼ、
m)配列番号132で表される配列及び配列番号132で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
n)配列番号134で表される配列及び配列番号134で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼ、
o)配列番号136で表される配列及び配列番号136で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ、
p)配列番号138で表される配列及び配列番号138で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアミノペプチダーゼC(PepC)、
q)配列番号140で表される配列及び配列番号140で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
r)配列番号142で表される配列及び配列番号142で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ1)、
s)配列番号144で表される配列及び配列番号144で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ2)、
t)配列番号146で表される配列及び配列番号146で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するエノラーゼ、
u)配列番号148で表される配列及び配列番号148で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する2,3−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(GpmA)、
v)配列番号150で表される配列及び配列番号150で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk)、
w)配列番号152で表される配列及び配列番号152で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ1)、
x)配列番号154で表される配列及び配列番号154で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ2)、
y)配列番号156で表される配列及び配列番号156で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼ(TpiA)、
z)配列番号158で表される配列及び配列番号158で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼ、
aa)配列番号160で表される配列及び配列番号160で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する1−ホスホフルクトキナーゼ、
bb)配列番号162で表される配列及び配列番号162で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する6−ホスホフルクトキナーゼ、
cc)配列番号4で表される配列及び配列番号4で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、
dd)配列番号22で表される配列及び配列番号22で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CBS、CysK)、
ee)配列番号26で表される配列及び配列番号26で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼ(AecD)、
ff)配列番号28で表される配列及び配列番号28で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd、EC 1.2.1.11)、
gg)配列番号30で表される配列及び配列番号30で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット(BrnE)、
hh)配列番号32で表される配列及び配列番号32で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット(BrnF)、
ii)配列番号34で表される配列及び配列番号34で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)、
jj)配列番号36で表される配列及び配列番号36で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CysK)、
kk)配列番号38で表される配列及び配列番号38で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のH−タンパク質(GcvH)、
ll)配列番号40で表される配列及び配列番号40で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のP−タンパク質(GcvP)、
mm)配列番号42で表される配列及び配列番号42で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のT−タンパク質(GcvT)、
nn)配列番号44で表される配列及び配列番号44で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)、
oo)配列番号46で表される配列及び配列番号46で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom、EC 1.2.1.11)、
pp)配列番号48で表される配列及び配列番号48で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipA)、
qq)配列番号50で表される配列及び配列番号50で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipB)、
rr)配列番号52で表される配列及び配列番号52で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(Lpd)、
ss)配列番号94で表される配列及び配列番号94で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼ(LplA)、
tt)配列番号96で表される配列及び配列番号96で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(GcvL)、
uu)配列番号54で表される配列及び配列番号54で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC、EC 2.7.2.4)、
vv)配列番号56で表される配列及び配列番号56で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼ(MetB)、
ww)配列番号58で表される配列及び配列番号58で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)、
xx)配列番号60で表される配列及び配列番号60で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(MetX)、
yy)配列番号62で表される配列及び配列番号62で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するO−アセチルホモセリンリアーゼ(MetY)、
zz)配列番号64で表される配列及び配列番号64で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc、EC 6.4.1.1)、
aaa)配列番号66で表される配列及び配列番号66で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerA)、
bbb)配列番号68で表される配列及び配列番号68で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼ(SerB)、
ccc)配列番号70で表される配列及び配列番号70で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(SerC)、
ddd)配列番号74で表される配列及び配列番号74で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、
eee)配列番号76で表される配列及び配列番号76で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(CysH)、
fff)配列番号78で表される配列及び配列番号78で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼ(CysI)、
ggg)配列番号80で表される配列及び配列番号80で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するNADPH依存性グルタミン酸シンテターゼβ鎖(CysJ)、
hhh)配列番号82で表される配列及び配列番号82で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼの大サブユニット(CysN)、
iii)配列番号84で表される配列及び配列番号84で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼ(CysY)、
jjj)配列番号86で表される配列及び配列番号86で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸トランスポーター(CysZ)、
kkk)配列番号88で表される配列及び配列番号88で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、
lll)配列番号90で表される配列及び配列番号90で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1(PtH1)、
mmm)配列番号92で表される配列及び配列番号92で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2(PtH2)、
nnn)配列番号202で表される配列及び配列番号202で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(Ddh、EC 1.4.1.16)、
ooo)配列番号164で表される配列及び配列番号164で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(LysA、EC 4.1.1.20)、
ppp)配列番号166で表される配列及び配列番号166で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AaT、EC 2.6.1.1)、
qqq)配列番号168で表される配列及び配列番号168で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するL−リシンエクスポーター(LysE、リシン透過酵素(lysine efflux permease)、
rrr)配列番号170で表される配列及び配列番号170で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼ(DapB、EC 1.3.1.26)、
sss)配列番号172で表される配列及び配列番号172で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)、
ttt)配列番号186で表される配列及び配列番号186で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのZwfサブユニット(Zwf、EC 1.1.1.49)、
uuu)配列番号188で表される配列及び配列番号188で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのOpcAサブユニット(OpcA、EC 1.1.1.49)、
vvv)配列番号174で表される配列及び配列番号174で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd、EC 1.1.1.44)。
a)配列番号106で表される配列及び配列番号106で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンデヒドラターゼ(IlvA、EC 4.3.1.19)、
b)配列番号98で表される配列及び配列番号98で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニット(IlvB)、
c)配列番号100で表される配列及び配列番号100で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソメロレダクターゼ(isomer reductase)(IlvC、EC 1.1.1.86)、
d)配列番号102で表される配列及び配列番号102で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(IlvD、EC 4.2.1.9)、
e)配列番号104で表される配列及び配列番号104で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトランスアミナーゼ(IlvE、EC 2.6.1.42)、
f)配列番号122で表される配列及び配列番号122で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素(IlvH、EC 2.2.1.6)、
g)配列番号118で表される配列及び配列番号118で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(PanB、EC 2.1.2.11)、
h)配列番号120で表される配列及び配列番号120で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するパントテン酸合成酵素(PanC、EC 6.3.2.1)、
i)配列番号124で表される配列及び配列番号124で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Gdh)、
j)配列番号126で表される配列及び配列番号126で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ1)、
k)配列番号128で表される配列及び配列番号128で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ2)、
l)配列番号130で表される配列及び配列番号130で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼ、
m)配列番号132で表される配列及び配列番号132で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
n)配列番号134で表される配列及び配列番号134で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼ、
o)配列番号136で表される配列及び配列番号136で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ、
p)配列番号138で表される配列及び配列番号138で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアミノペプチダーゼC(PepC)、
q)配列番号140で表される配列及び配列番号140で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
r)配列番号142で表される配列及び配列番号142で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ1)、
s)配列番号144で表される配列及び配列番号144で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ2)、
t)配列番号146で表される配列及び配列番号146で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するエノラーゼ、
u)配列番号148で表される配列及び配列番号148で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する2,3−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(GpmA)、
v)配列番号150で表される配列及び配列番号150で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk)、
w)配列番号152で表される配列及び配列番号152で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ1)、
x)配列番号154で表される配列及び配列番号154で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ2)、
y)配列番号156で表される配列及び配列番号156で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼ(TpiA)、
z)配列番号158で表される配列及び配列番号158で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼ、
aa)配列番号160で表される配列及び配列番号160で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する1−ホスホフルクトキナーゼ、
bb)配列番号162で表される配列及び配列番号162で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する6−ホスホフルクトキナーゼ、
cc)配列番号4で表される配列及び配列番号4で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、
dd)配列番号22で表される配列及び配列番号22で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CBS、CysK)、
ee)配列番号26で表される配列及び配列番号26で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼ(AecD)、
ff)配列番号28で表される配列及び配列番号28で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd、EC 1.2.1.11)、
gg)配列番号30で表される配列及び配列番号30で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット(BrnE)、
hh)配列番号32で表される配列及び配列番号32で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット(BrnF)、
ii)配列番号34で表される配列及び配列番号34で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)、
jj)配列番号36で表される配列及び配列番号36で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CysK)、
kk)配列番号38で表される配列及び配列番号38で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のH−タンパク質(GcvH)、
ll)配列番号40で表される配列及び配列番号40で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のP−タンパク質(GcvP)、
mm)配列番号42で表される配列及び配列番号42で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のT−タンパク質(GcvT)、
nn)配列番号44で表される配列及び配列番号44で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)、
oo)配列番号46で表される配列及び配列番号46で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom、EC 1.2.1.11)、
pp)配列番号48で表される配列及び配列番号48で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipA)、
qq)配列番号50で表される配列及び配列番号50で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipB)、
rr)配列番号52で表される配列及び配列番号52で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(Lpd)、
ss)配列番号94で表される配列及び配列番号94で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼ(LplA)、
tt)配列番号96で表される配列及び配列番号96で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(GcvL)、
uu)配列番号54で表される配列及び配列番号54で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC、EC 2.7.2.4)、
vv)配列番号56で表される配列及び配列番号56で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼ(MetB)、
ww)配列番号58で表される配列及び配列番号58で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)、
xx)配列番号60で表される配列及び配列番号60で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(MetX)、
yy)配列番号62で表される配列及び配列番号62で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するO−アセチルホモセリンリアーゼ(MetY)、
zz)配列番号64で表される配列及び配列番号64で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc、EC 6.4.1.1)、
aaa)配列番号66で表される配列及び配列番号66で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerA)、
bbb)配列番号68で表される配列及び配列番号68で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼ(SerB)、
ccc)配列番号70で表される配列及び配列番号70で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(SerC)、
ddd)配列番号74で表される配列及び配列番号74で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、
eee)配列番号76で表される配列及び配列番号76で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(CysH)、
fff)配列番号78で表される配列及び配列番号78で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼ(CysI)、
ggg)配列番号80で表される配列及び配列番号80で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するNADPH依存性グルタミン酸シンテターゼβ鎖(CysJ)、
hhh)配列番号82で表される配列及び配列番号82で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼの大サブユニット(CysN)、
iii)配列番号84で表される配列及び配列番号84で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼ(CysY)、
jjj)配列番号86で表される配列及び配列番号86で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸トランスポーター(CysZ)、
kkk)配列番号88で表される配列及び配列番号88で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、
lll)配列番号90で表される配列及び配列番号90で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1(PtH1)、
mmm)配列番号92で表される配列及び配列番号92で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2(PtH2)、
nnn)配列番号202で表される配列及び配列番号202で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(Ddh、EC 1.4.1.16)、
ooo)配列番号164で表される配列及び配列番号164で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(LysA、EC 4.1.1.20)、
ppp)配列番号166で表される配列及び配列番号166で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AaT、EC 2.6.1.1)、
qqq)配列番号168で表される配列及び配列番号168で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するL−リシンエクスポーター(LysE、リシン透過酵素(lysine efflux permease)、
rrr)配列番号170で表される配列及び配列番号170で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼ(DapB、EC 1.3.1.26)、
sss)配列番号172で表される配列及び配列番号172で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)、
ttt)配列番号186で表される配列及び配列番号186で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのZwfサブユニット(Zwf、EC 1.1.1.49)、
uuu)配列番号188で表される配列及び配列番号188で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのOpcAサブユニット(OpcA、EC 1.1.1.49)、
vvv)配列番号174で表される配列及び配列番号174で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd、EC 1.1.1.44)。
また、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含むベクター及び上述した酵素及び/又はポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む組み換え微生物に関する。好適な実施形態では、関連するポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドが過剰発現された状態で微生物中に存在する。組み換え微生物は、好ましくは、コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカムである。
本発明は、上述したポリヌクレオチドの少なくとも1種、好ましくは2種、3種又は4種が過剰発現された状態で存在する、L−アラニン、L−バリン、グルタミン酸系のL−アミノ酸、特に、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン及びL−アルギニン、アスパラギン酸系のL−アミノ酸、特に、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−メチオニン、L−リシン、L−イソロイシン及びL−トレオニン、特に好ましくは、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸、L−メチオニン、L−リシン及びL−トレオニン、特にL−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸及びL−リシンから選択されるL−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好ましくは、コリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカムに対して実施される方法に関する。
また、本発明は、C.humireducensに由来するその他のポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに関する。関連するポリヌクレオチド又はポリペプチドの失活又は減衰により、ある種のL−アミノ酸のアミノ酸生産に良い影響を与えることができる。
また、本発明は、以下の酵素等に関する。
a)配列番号108で表される配列及び配列番号108で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンシンターゼ(ThrC、EC 4.2.3.1)、
b)配列番号110で表される配列及び配列番号110で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuA、EC 2.3.3.13)、
c)配列番号112で表される配列及び配列番号112で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(LeuB、EC 1.1.1.85)、
d)配列番号114又は116で表される配列及び配列番号114又は116で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット(LeuCD、EC 4.2.1.33)、
e)配列番号198又は200で表される配列及び配列番号198又は200で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するスクシニル−CoAリガーゼのサブユニット(SucCD、EC 6.2.1.5)、
f)配列番号2で表される配列及び配列番号2で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するHTH tetRのDNA結合ドメイン(McbR)、
g)配列番号4で表される配列及び配列番号4で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、
h)配列番号6で表される配列及び配列番号6で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi、EC 5.3.1.9)、
i)配列番号8で表される配列及び配列番号8で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck、EC 4.1.1.32)、
j)配列番号10で表される配列及び配列番号10で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−メチオニン結合リポタンパク質(MetQ)、
k)配列番号12で表される配列及び配列番号12で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニントランスポーター(MetP)、
l)配列番号14で表される配列及び配列番号14で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するATP依存性メチオニントランスポーター(MetN)、
m)配列番号16で表される配列及び配列番号16で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するS−アデノシルメチオニンシンターゼ(MetK)、
n)配列番号18で表される配列及び配列番号18で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素(MetI)、
o)配列番号20で表される配列及び配列番号20で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA、EC 4.3.3.7)、
p)配列番号24で表される配列及び配列番号24で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼ、
q)配列番号176で表される配列及び配列番号176で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼ(Mqo、EC 1.1.99.16)、
r)配列番号178で表される配列及び配列番号178で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pサブユニット(AceE、EC 1.2.4.1)、
s)配列番号180で表される配列及び配列番号180で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ(GltA、EC 4.1.3.7)、
t)配列番号182で表される配列及び配列番号182で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh、EC 1.1.1.37)、
u)配列番号184で表される配列及び配列番号184で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するUDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼ(MurE、EC 6.3.2.13)。
a)配列番号108で表される配列及び配列番号108で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンシンターゼ(ThrC、EC 4.2.3.1)、
b)配列番号110で表される配列及び配列番号110で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuA、EC 2.3.3.13)、
c)配列番号112で表される配列及び配列番号112で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(LeuB、EC 1.1.1.85)、
d)配列番号114又は116で表される配列及び配列番号114又は116で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット(LeuCD、EC 4.2.1.33)、
e)配列番号198又は200で表される配列及び配列番号198又は200で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するスクシニル−CoAリガーゼのサブユニット(SucCD、EC 6.2.1.5)、
f)配列番号2で表される配列及び配列番号2で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するHTH tetRのDNA結合ドメイン(McbR)、
g)配列番号4で表される配列及び配列番号4で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、
h)配列番号6で表される配列及び配列番号6で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi、EC 5.3.1.9)、
i)配列番号8で表される配列及び配列番号8で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck、EC 4.1.1.32)、
j)配列番号10で表される配列及び配列番号10で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−メチオニン結合リポタンパク質(MetQ)、
k)配列番号12で表される配列及び配列番号12で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニントランスポーター(MetP)、
l)配列番号14で表される配列及び配列番号14で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するATP依存性メチオニントランスポーター(MetN)、
m)配列番号16で表される配列及び配列番号16で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するS−アデノシルメチオニンシンターゼ(MetK)、
n)配列番号18で表される配列及び配列番号18で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素(MetI)、
o)配列番号20で表される配列及び配列番号20で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA、EC 4.3.3.7)、
p)配列番号24で表される配列及び配列番号24で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼ、
q)配列番号176で表される配列及び配列番号176で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼ(Mqo、EC 1.1.99.16)、
r)配列番号178で表される配列及び配列番号178で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pサブユニット(AceE、EC 1.2.4.1)、
s)配列番号180で表される配列及び配列番号180で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ(GltA、EC 4.1.3.7)、
t)配列番号182で表される配列及び配列番号182で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh、EC 1.1.1.37)、
u)配列番号184で表される配列及び配列番号184で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するUDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼ(MurE、EC 6.3.2.13)。
また、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含むベクター及び上述した酵素及び/又はポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む組み換え微生物に関する。好適な実施形態では、関連するポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドが失活又は減衰された状態で微生物中に存在する。組み換え微生物は、好ましくは、コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカム、特にC.humireducensである。
本発明は、上述したポリヌクレオチドの少なくとも1種、好ましくは2種、3種又は4種が失活又は減衰された状態で存在する、L−アラニン、L−バリン、グルタミン酸系のL−アミノ酸、特に、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン及びL−アルギニン、アスパラギン酸系のL−アミノ酸、特に、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−メチオニン、L−リシン、L−イソロイシン及びL−トレオニン、特に好ましくは、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸、L−メチオニン、L−リシン及びL−トレオニン、特にL−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸及びL−リシンから選択されるL−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好ましくは、コリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカムに対して実施される方法に関する。好適な実施形態では、上述したポリヌクレオチドの少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、3種又は4種が過剰発現された状態で同時に存在する。
好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、C.humireducens又はC.グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るL−バリン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は3つ、特に好ましくは少なくとも4つ又は5つを有する。
a)トレオニンデヒドラターゼ(IlvA、EC 4.3.1.19)、好ましくは、配列番号106で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvA遺伝子)、
b)アセト乳酸合成酵素のサブユニット(IlvB)、好ましくは、配列番号98で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvB遺伝子)、
c)アセト乳酸合成酵素の好ましくはフィードバック阻害耐性を有するサブユニット(IlvN、EC4.1.3.18)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvN遺伝子)、
d)イソメロレダクターゼ(IIvC、EC 1.1.1.86)、好ましくは、配列番号100で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソメロレダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvC遺伝子)、
e)ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(IIvD、EC 4.2.1.9)、好ましくは、配列番号102で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvD遺伝子)、
f)トランスアミナーゼ(IIvE、EC 2.6.1.42)、好ましくは、配列番号104で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトランスアミナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvE遺伝子)、
g)アセト乳酸合成酵素(IIvH、EC 2.2.1.6)、好ましくは、配列番号122で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvH遺伝子)、
h)ホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、好ましくは、配列番号4で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrB遺伝子)、
i)トレオニンシンターゼ(ThrC、EC 4.2.3.1)、好ましくは、配列番号108で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrC遺伝子)、
j)任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom、EC 1.2.1.11)、好ましくは、配列番号46で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(hom遺伝子)、
k)任意にフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuA、EC 2.3.3.13)、好ましくは、配列番号110で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuA遺伝子)、
l)イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(LeuB、EC 1.1.1.85)、好ましくは、配列番号112で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuB遺伝子)、
m)イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット(LeuCD、EC 4.2.1.33)、好ましくは、配列番号114又は116で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuCD遺伝子)、
n)3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(PanB、EC 2.1.2.11)、好ましくは、配列番号118で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(panB遺伝子)、
o)パントテン酸シンターゼ(PanC、EC 6.3.2.1)、好ましくは、配列番号120で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するパントテン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(panC遺伝子)。
a)トレオニンデヒドラターゼ(IlvA、EC 4.3.1.19)、好ましくは、配列番号106で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvA遺伝子)、
b)アセト乳酸合成酵素のサブユニット(IlvB)、好ましくは、配列番号98で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvB遺伝子)、
c)アセト乳酸合成酵素の好ましくはフィードバック阻害耐性を有するサブユニット(IlvN、EC4.1.3.18)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvN遺伝子)、
d)イソメロレダクターゼ(IIvC、EC 1.1.1.86)、好ましくは、配列番号100で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソメロレダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvC遺伝子)、
e)ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(IIvD、EC 4.2.1.9)、好ましくは、配列番号102で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvD遺伝子)、
f)トランスアミナーゼ(IIvE、EC 2.6.1.42)、好ましくは、配列番号104で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトランスアミナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvE遺伝子)、
g)アセト乳酸合成酵素(IIvH、EC 2.2.1.6)、好ましくは、配列番号122で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ilvH遺伝子)、
h)ホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、好ましくは、配列番号4で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrB遺伝子)、
i)トレオニンシンターゼ(ThrC、EC 4.2.3.1)、好ましくは、配列番号108で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrC遺伝子)、
j)任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom、EC 1.2.1.11)、好ましくは、配列番号46で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(hom遺伝子)、
k)任意にフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuA、EC 2.3.3.13)、好ましくは、配列番号110で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuA遺伝子)、
l)イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(LeuB、EC 1.1.1.85)、好ましくは、配列番号112で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuB遺伝子)、
m)イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット(LeuCD、EC 4.2.1.33)、好ましくは、配列番号114又は116で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド(leuCD遺伝子)、
n)3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(PanB、EC 2.1.2.11)、好ましくは、配列番号118で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(panB遺伝子)、
o)パントテン酸シンターゼ(PanC、EC 6.3.2.1)、好ましくは、配列番号120で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するパントテン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(panC遺伝子)。
また、本発明は、L−アミノ酸、特にL−バリンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、C.humireducens又はC.グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るL−グルタミン酸過剰産生株は、特に好ましくは本発明に係るhut遺伝子の少なくとも1種の過剰発現、特に本発明に係るhut遺伝子の全ての過剰発現と共に、以下の特徴の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は3つ、特に好ましくは少なくとも4つ又は5つを有する。
a)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Gdh)、好ましくは、配列番号124で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gdh)、
b)グルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ1)、好ましくは、配列番号126で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
c)グルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ2)、好ましくは、配列番号128で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
d)グルタミン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号130で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
e)イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号132で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
f)アコニット酸ヒドラーゼ、好ましくは、配列番号134で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
g)クエン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号136で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
h)アミノペプチダーゼC(PepC)、好ましくは、配列番号138で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアミノペプチダーゼCをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pepC)、
i)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号140で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
j)ピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ1)、好ましくは、配列番号142で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
k)ピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ2)、好ましくは、配列番号144で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
l)エノラーゼ、好ましくは、配列番号146で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するエノラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
m)2,3−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(GpmA)、好ましくは、配列番号148で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸ムターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gpmA)、
n)ホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk)、好ましくは、配列番号150で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pgk)、
o)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ1)、好ましくは、配列番号152で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
p)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ2)、好ましくは、配列番号154で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
q)トリオースホスフェートイソメラーゼ(TpiA)、好ましくは、配列番号156で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(tpiA)、
r)フルクトース二リン酸アルドラーゼ、好ましくは、配列番号158で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
s)1−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号160で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する1−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
t)6−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号162で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する6−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
u)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、好ましくは、配列番号6で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pgi)、
v)スクシニル−CoAリガーゼのサブユニット(SucCD、EC 6.2.1.5)、好ましくは、配列番号198又は200で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するスクシニル−CoAリガーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド(sucCD)。
a)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Gdh)、好ましくは、配列番号124で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gdh)、
b)グルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ1)、好ましくは、配列番号126で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
c)グルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ2)、好ましくは、配列番号128で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
d)グルタミン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号130で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
e)イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号132で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
f)アコニット酸ヒドラーゼ、好ましくは、配列番号134で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
g)クエン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号136で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
h)アミノペプチダーゼC(PepC)、好ましくは、配列番号138で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアミノペプチダーゼCをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pepC)、
i)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号140で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
j)ピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ1)、好ましくは、配列番号142で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
k)ピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ2)、好ましくは、配列番号144で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
l)エノラーゼ、好ましくは、配列番号146で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するエノラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
m)2,3−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(GpmA)、好ましくは、配列番号148で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸ムターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gpmA)、
n)ホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk)、好ましくは、配列番号150で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pgk)、
o)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ1)、好ましくは、配列番号152で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
p)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ2)、好ましくは、配列番号154で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
q)トリオースホスフェートイソメラーゼ(TpiA)、好ましくは、配列番号156で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(tpiA)、
r)フルクトース二リン酸アルドラーゼ、好ましくは、配列番号158で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
s)1−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号160で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する1−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
t)6−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号162で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する6−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
u)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、好ましくは、配列番号6で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pgi)、
v)スクシニル−CoAリガーゼのサブユニット(SucCD、EC 6.2.1.5)、好ましくは、配列番号198又は200で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するスクシニル−CoAリガーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド(sucCD)。
また、本発明は、L−アミノ酸、特にL−グルタミン酸を過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、C.humireducens又はC.グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るL−アラニン過剰産生株は、特に好ましくは本発明に係るald遺伝子の過剰発現と共に、以下の特徴の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は3つ、特に好ましくは少なくとも4つ又は5つを有する。
a)アラニンデヒドロゲナーゼ(AlaD)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(alaD)、
b)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GapA)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gapA)、
c)L−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するL−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(IdhA)、
d)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(Ppc)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(ppc)、
e)アラニンラセマーゼ(Alr)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンラセマーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(alr)。
a)アラニンデヒドロゲナーゼ(AlaD)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(alaD)、
b)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GapA)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gapA)、
c)L−乳酸デヒドロゲナーゼ(LdhA)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するL−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(IdhA)、
d)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(Ppc)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(ppc)、
e)アラニンラセマーゼ(Alr)、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンラセマーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(alr)。
また、本発明は、L−アミノ酸、特にL−アラニンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、C.humireducens又はC.グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、L−メチオニン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は3つ、特に好ましくは少なくとも4つ又は5つを有する。
a)HTH tetRのDNA結合ドメイン(McbR)、好ましくは、配列番号2で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するDNA結合ドメインをコードする減衰ポリヌクレオチド(mcbR)、
b)ホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、好ましくは、配列番号4で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrB遺伝子)、
c)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi、EC 5.3.1.9)、好ましくは、配列番号6で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(pgi)、
d)ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck、EC 4.1.1.32)、好ましくは、配列番号8で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(pck)、
e)D−メチオニン結合リポタンパク質(MetQ)、好ましくは、配列番号10で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−メチオニン結合リポタンパク質をコードする減衰ポリヌクレオチド(metQ)、
f)メチオニントランスポーター(MetP)、好ましくは、配列番号12で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド(metP)、
g)ATP依存性メチオニントランスポーター(MetN)、好ましくは、配列番号14で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するATP依存性メチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド(metN)、
h)S−アデノシルメチオニンシンターゼ(MetK)、好ましくは、配列番号16で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するS−アデノシルメチオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(metK)、
i)メチオニン輸送系透過酵素(MetI)、好ましくは、配列番号18で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素をコードする減衰ポリヌクレオチド(metI)、
j)4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA)、好ましくは、配列番号20で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(dapA)、
k)システインシンターゼ(CBS、CysK)、好ましくは、配列番号22で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(CBS、cysK)、
l)カルボン酸−アミンリガーゼ、好ましくは、配列番号24で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド、
m)シスタチオニンβ−リアーゼ(AecD)、好ましくは、配列番号26で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(aecD)、
n)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd)、好ましくは、配列番号28で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(asd)、
o)5−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetH、EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metH)、
p)分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット(BrnE)、好ましくは、配列番号30で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(brnE)、
q)分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット(BrnF)、好ましくは、配列番号32で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(brnF)、
r)セリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)、好ましくは、配列番号34で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysE)、
s)システインシンターゼ(CysK)、好ましくは、配列番号36で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysK)、
t)グリシン開裂系のH−タンパク質(GcvH)、好ましくは、配列番号38で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するH−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvH)、
u)グリシン開裂系のP−タンパク質(GcvP)、好ましくは、配列番号40で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するP−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvP)、
v)グリシン開裂系のT−タンパク質(GcvT)、好ましくは、配列番号42で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するT−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvT)、
w)セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)、好ましくは、配列番号44で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(glyA)、
x)任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom)、好ましくは、配列番号46で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(hom)、
y)リポイルシンターゼ(LipA)、好ましくは、配列番号48で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lipA)、
z)リポイルトランスフェラーゼ(LipB)、好ましくは、配列番号50で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lipB)、
aa)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(Lpd)、好ましくは、配列番号52で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lpd)、
bb)リポ酸−タンパク質リガーゼ(LplA)、好ましくは、配列番号94で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lplA)、
cc)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(GcvL)、好ましくは、配列番号96で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvL)、
dd)好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC)、好ましくは、配列番号54で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysC)、
ee)シスタチオニンγ−シンターゼ(MetB)、好ましくは、配列番号56で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metB)、
ff)5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)、好ましくは、配列番号58で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metF)、
gg)ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(MetX)、好ましくは、配列番号60で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metX)、
hh)O−アセチルホモセリンリアーゼ(MetY)、好ましくは、配列番号62で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するO−アセチルホモセリンリアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metY)、
ii)ピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc)、好ましくは、配列番号64で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pyc)、
jj)任意にフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerA)、好ましくは、配列番号66で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serA)、
kk)ホスホセリンホスファターゼ(SerB)、好ましくは、配列番号68で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serB)、
ll)ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(SerC)、好ましくは、配列番号70で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serC)、
mm)硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、好ましくは、配列番号74で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysD)、
nn)アデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(CysH)、好ましくは、配列番号76で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysH)、
oo)亜硫酸レダクターゼ(CysI)、好ましくは、配列番号78で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysI)、
pp)(CysJ)、好ましくは、配列番号80で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する(CysJ)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysJ)、
qq)硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、好ましくは、配列番号82で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysN)、
rr)シスタチオニンβ−シンターゼ(CysY)、好ましくは、配列番号84で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysY)、
ss)推定上の硫酸トランスポーター(CysZ)、好ましくは、配列番号86で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸トランスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysZ)、
tt)5−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、好ましくは、配列番号88で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するタンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metE)、
uu)ペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1(PtH1)、好ましくは、配列番号90で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ptH1)、
vv)ペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2(PtH2)、好ましくは、配列番号92で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ptH2)。
a)HTH tetRのDNA結合ドメイン(McbR)、好ましくは、配列番号2で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するDNA結合ドメインをコードする減衰ポリヌクレオチド(mcbR)、
b)ホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、好ましくは、配列番号4で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(thrB遺伝子)、
c)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi、EC 5.3.1.9)、好ましくは、配列番号6で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(pgi)、
d)ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck、EC 4.1.1.32)、好ましくは、配列番号8で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(pck)、
e)D−メチオニン結合リポタンパク質(MetQ)、好ましくは、配列番号10で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−メチオニン結合リポタンパク質をコードする減衰ポリヌクレオチド(metQ)、
f)メチオニントランスポーター(MetP)、好ましくは、配列番号12で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド(metP)、
g)ATP依存性メチオニントランスポーター(MetN)、好ましくは、配列番号14で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するATP依存性メチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド(metN)、
h)S−アデノシルメチオニンシンターゼ(MetK)、好ましくは、配列番号16で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するS−アデノシルメチオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(metK)、
i)メチオニン輸送系透過酵素(MetI)、好ましくは、配列番号18で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素をコードする減衰ポリヌクレオチド(metI)、
j)4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA)、好ましくは、配列番号20で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド(dapA)、
k)システインシンターゼ(CBS、CysK)、好ましくは、配列番号22で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(CBS、cysK)、
l)カルボン酸−アミンリガーゼ、好ましくは、配列番号24で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド、
m)シスタチオニンβ−リアーゼ(AecD)、好ましくは、配列番号26で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(aecD)、
n)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd)、好ましくは、配列番号28で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(asd)、
o)5−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetH、EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metH)、
p)分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット(BrnE)、好ましくは、配列番号30で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(brnE)、
q)分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット(BrnF)、好ましくは、配列番号32で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(brnF)、
r)セリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)、好ましくは、配列番号34で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysE)、
s)システインシンターゼ(CysK)、好ましくは、配列番号36で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysK)、
t)グリシン開裂系のH−タンパク質(GcvH)、好ましくは、配列番号38で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するH−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvH)、
u)グリシン開裂系のP−タンパク質(GcvP)、好ましくは、配列番号40で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するP−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvP)、
v)グリシン開裂系のT−タンパク質(GcvT)、好ましくは、配列番号42で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するT−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvT)、
w)セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)、好ましくは、配列番号44で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(glyA)、
x)任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom)、好ましくは、配列番号46で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(hom)、
y)リポイルシンターゼ(LipA)、好ましくは、配列番号48で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lipA)、
z)リポイルトランスフェラーゼ(LipB)、好ましくは、配列番号50で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lipB)、
aa)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(Lpd)、好ましくは、配列番号52で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lpd)、
bb)リポ酸−タンパク質リガーゼ(LplA)、好ましくは、配列番号94で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lplA)、
cc)ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(GcvL)、好ましくは、配列番号96で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gcvL)、
dd)好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC)、好ましくは、配列番号54で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysC)、
ee)シスタチオニンγ−シンターゼ(MetB)、好ましくは、配列番号56で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metB)、
ff)5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)、好ましくは、配列番号58で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metF)、
gg)ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(MetX)、好ましくは、配列番号60で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metX)、
hh)O−アセチルホモセリンリアーゼ(MetY)、好ましくは、配列番号62で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するO−アセチルホモセリンリアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metY)、
ii)ピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc)、好ましくは、配列番号64で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pyc)、
jj)任意にフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerA)、好ましくは、配列番号66で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serA)、
kk)ホスホセリンホスファターゼ(SerB)、好ましくは、配列番号68で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serB)、
ll)ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(SerC)、好ましくは、配列番号70で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(serC)、
mm)硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、好ましくは、配列番号74で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysD)、
nn)アデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(CysH)、好ましくは、配列番号76で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysH)、
oo)亜硫酸レダクターゼ(CysI)、好ましくは、配列番号78で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysI)、
pp)(CysJ)、好ましくは、配列番号80で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する(CysJ)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysJ)、
qq)硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、好ましくは、配列番号82で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysN)、
rr)シスタチオニンβ−シンターゼ(CysY)、好ましくは、配列番号84で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysY)、
ss)推定上の硫酸トランスポーター(CysZ)、好ましくは、配列番号86で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸トランスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(cysZ)、
tt)5−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、好ましくは、配列番号88で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するタンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metE)、
uu)ペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1(PtH1)、好ましくは、配列番号90で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ptH1)、
vv)ペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2(PtH2)、好ましくは、配列番号92で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ptH2)。
また、本発明は、L−アミノ酸、特にL−メチオニンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
別の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、C.humireducens又はC.グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るL−リシン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ又は3つ、特に好ましくは少なくとも4つ又は5つを有する。
a)ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA、EC 4.2.1.52)、好ましくは、配列番号20で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapA)、
b)好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC、EC 2.7.2.4)、好ましくは、配列番号54で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysC)、
c)ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(Ddh、EC 1.4.1.16)、好ましくは、配列番号202で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ddh)、
d)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd、EC 1.2.1.11)、好ましくは、配列番号28で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(asd)、
e)ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(LysA、EC 4.1.1.20)、好ましくは、配列番号164で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysA)、
f)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AaT、EC 2.6.1.1)、好ましくは、配列番号166で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(aat)、
g)L−リシンエクスポーター(LysE、リシン透過酵素)、好ましくは、配列番号168で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するL−リシンエクスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysE)、
h)ピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc、EC 6.4.1.1)、好ましくは、配列番号64で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pyc)、
i)ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(DapF、EC 5.1.1.7)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapF)、
j)ジヒドロピコリン酸レダクターゼ(DapB、EC 1.3.1.26)、好ましくは、配列番号170で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapB)、
k)グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号172で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
l)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのZwfサブユニット(Zwf、EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号186で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するZwfサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(zwf)、
m)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのOpcAサブユニット(OpcA、EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号188で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するOpcAサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(opcA)、
n)ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd、EC 1.1.1.44)、好ましくは、配列番号174で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gnd)、
o)リンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼ(Mqo、EC 1.1.99.16)、好ましくは、配列番号176で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(mqo)、
p)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pサブユニット(AceE、EC 1.2.4.1)、好ましくは、配列番号178で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するE1pサブユニットをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド、
q)クエン酸シンターゼ(GltA、EC 4.1.3.7)、好ましくは、配列番号180で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(gltA)、
r)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh、EC 1.1.1.37)、好ましくは、配列番号182で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(mdh)、
s)UDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼ(MurE、EC 6.3.2.13)、好ましくは、配列番号184で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する酵素をコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(murE)。
a)ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA、EC 4.2.1.52)、好ましくは、配列番号20で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapA)、
b)好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC、EC 2.7.2.4)、好ましくは、配列番号54で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysC)、
c)ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(Ddh、EC 1.4.1.16)、好ましくは、配列番号202で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ddh)、
d)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd、EC 1.2.1.11)、好ましくは、配列番号28で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(asd)、
e)ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(LysA、EC 4.1.1.20)、好ましくは、配列番号164で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysA)、
f)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AaT、EC 2.6.1.1)、好ましくは、配列番号166で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(aat)、
g)L−リシンエクスポーター(LysE、リシン透過酵素)、好ましくは、配列番号168で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するL−リシンエクスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(lysE)、
h)ピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc、EC 6.4.1.1)、好ましくは、配列番号64で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(pyc)、
i)ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(DapF、EC 5.1.1.7)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapF)、
j)ジヒドロピコリン酸レダクターゼ(DapB、EC 1.3.1.26)、好ましくは、配列番号170で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapB)、
k)グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号172で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
l)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのZwfサブユニット(Zwf、EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号186で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するZwfサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(zwf)、
m)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのOpcAサブユニット(OpcA、EC 1.1.1.49)、好ましくは、配列番号188で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するOpcAサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(opcA)、
n)ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd、EC 1.1.1.44)、好ましくは、配列番号174で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド(gnd)、
o)リンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼ(Mqo、EC 1.1.99.16)、好ましくは、配列番号176で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(mqo)、
p)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pサブユニット(AceE、EC 1.2.4.1)、好ましくは、配列番号178で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するE1pサブユニットをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド、
q)クエン酸シンターゼ(GltA、EC 4.1.3.7)、好ましくは、配列番号180で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(gltA)、
r)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh、EC 1.1.1.37)、好ましくは、配列番号182で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(mdh)、
s)UDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼ(MurE、EC 6.3.2.13)、好ましくは、配列番号184で表される配列に対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する酵素をコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド(murE)。
また、本発明は、L−アミノ酸、特にL−リシンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
上述した本発明に係る方法に使用するポリヌクレオチド及びポリペプチドは、コリネバクテリウム属菌、特にC.humireducens又はC.グルタミカム、特に好ましくはC.humireducensに由来することが好ましい。
本発明に関連して使用する「過剰発現」という用語は、開始株(親株)又は野生型株と比較した場合の、微生物内において対応するDNAによってコードされたリボ核酸、タンパク質(ポリペプチド)又は酵素の細胞内濃度又は活性の上昇を通常は意味する。開始株(親株)とは、過剰発現を生じさせる手段が実施された株を意味する。
濃度又は活性の上昇は、例えば、少なくとも1回の複製により、対応するコーディングポリヌクレオチドの複製数を染色体的又は染色体外的に増加させることによって達成することができる。
複製数を増加させる方法としては、対応するコーディングポリヌクレオチドをベクター、好ましくはプラスミドに導入し、微生物、特にコリネ型細菌から複製する方法が広く使用されている。ベクターとしては、トランスポゾン、挿入因子(IS element)又はファージを使用することができる。多くの適当なベクターが先行技術に記載されている。
染色体遺伝子を増幅する方法も過剰発現を実施する方法として広く使用されている。このような方法では、対象となるポリヌクレオチドの少なくとも1つの複製をコリネ型細菌の染色体に挿入する。そのような増幅方法は、例えば、国際公開第03/014330号又は国際公開第03/040373号に記載されている。
また、過剰発現は、機能的な方法(作動的な連結)により、対応する遺伝子又は対立遺伝子をプロモーター又は発現カセットに連結することによって行うことができる。コリネバクテリウム・グルタミカムのための適当なプロモーターは、例えば、Patek et al.(Journal of Biotechnology 104(1−3),311−323(2003))(図1)、「Handbook of Corynebacterium glutamicum」(Eds.:Lothar Eggeling and Michael Bott,CRC Press,Boca Raton,US(2005))、「Corynebacteria,Genomics and Molecular Biology」(Ed.:Andreas Burkovski,Caister Academic Press,Norfolk,UK(2008))に記載されている。また、例えば、Vasicova et al.(Journal of Bacteriology 181,6188−6191(1999))に記載されているdapAプロモーターの変異体(プロモーターA25)も使用することができる。さらに、コリネバクテリウム・グルタミカムのギャッププロモーター(EP 06007373)を使用することができる。また、Amann et al.(Gene 69(2),301−315(1988))及びAmann and Brosius(Gene 40(2−3),183−190(1985))に記載されている周知のプロモーターT3、T7、SP6、lac、tac及びtrcも使用することができる。そのようなプロモーターは、例えば、関連する遺伝子の上流(通常は開始コドンから約1〜500核酸塩基の距離)に挿入することができる。
過剰発現手段により、対応するポリペプチドの活性又は濃度が、過剰発現手段を実施する前の株におけるポリペプチドの活性又は濃度と比較して、少なくとも10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%又は500%(好ましくは1000%又は2000%以下)上昇することが好ましい。
タンパク質の濃度は、一次元及び二次元タンパク質ゲル分画を実施した後、適切な評価ソフトウェアによってゲル中におけるタンパク質濃度を光学的に同定することによって測定することができる。通常行われているコリネ型細菌のタンパク質ゲルの調製方法及びタンパク質の同定方法は、Hermann et al.(Electrophoresis,22:1712−23(2001))に記載されている。また、タンパク質の濃度は、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットハイブリダイゼーション(Sambrook et al.,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)を実施した後、対応する濃度測定用ソフトウェアを使用する光学的評価(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32−39;Lottspeich,Angewandte Chemie 38:2630−2647(1999))を実施することによって測定することもできる。活性は、適当な酵素アッセイによって測定することができる。
本発明に関連して使用する「減衰」という用語は、開始株(親株)又は野生型株と比較した場合の、微生物内において対応するDNAによってコードされたリボ核酸、タンパク質(ポリペプチド)又は酵素の細胞内濃度又は活性の低下を意味する。開始株(親株)とは、減衰を生じさせる手段が実施された株を意味する。
減衰は、例えば、弱いプロモーター又は活性が低下したポリペプチドをコードする対立遺伝子を使用して、ポリペプチドの発現を減少させることによって実施することができる。なお、上記手法は組み合わせて使用することもできる。また、減衰は、例えば、コード遺伝子を失活させることにより、ポリペプチドの発現を完全に防止することによって実施することもできる。
減衰手段により、対応するポリペプチドの活性又は濃度が、減衰手段を実施する前の株におけるポリペプチドの活性又は濃度と比較して、少なくとも10%、25%、50%又は75%(好ましくは100%以下)低下することが好ましい。好適な実施形態では、関連するポリペプチドの発現を完全に失活させることによって減衰を実施する。
アミノ酸の産生に関連するフィードバック阻害耐性を有する酵素とは、野生型と比較して、産生されるL−アミノ酸及び/又はその類似体による阻害に対して低い感度を有する酵素を通常は意味する。
特に、フィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysCFBR)とは、野生型と比較して、リシンとスレオニンの混合物又はアミノエチルシステイン(AEC)とトレオニンの混合物又はリシン単独又はAEC単独による阻害に対して低い感度を有するアスパラギン酸キナーゼを意味する。リシンの産生では、そのようなフィードバック阻害耐性を有するか、感度を低下させたアスパラギン酸キナーゼを含む対応する株を使用することが好ましい。
例えば、A279T、A279V、S301F、S301Y、T308I、T311I、R320G、G345D及びS381Fが、C.グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼとして知られている。C.グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼに関しては、特開1993−184366号、特開1994−062866号、特開1994−261766号、特開1997−070291号、特開1997−322774号、特開1998−165180号、特開1998−215883号、米国特許第5,688,671号、欧州特許第0387527号、国際公開第00/63388号、米国特許第3,732,144号、日本国特許第6261766号及びJetten et al.(1995;Applied Microbiology Biotechnology 43:76−82)も参照されたい。C.グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼは、登録番号05108E、06825E、06826E、06827E、08177E、08178E、08179E、08180E、08181E、08182E、12770E、14514E、16352E、16745E、16746E、I74588、I74589、I74590、I74591、I74592、I74593、I74594、I74595、I74596、I74597、X57226、L16848及びL27125としてNCBI GenBankに寄託されている。
本発明では、D274Y、A279E、S301Y、T308I、T311I及びG359Dを、C.humireducensに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼとして使用することが好ましい。
トレオニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(HomFBR)を含む株を使用することが好ましい。
イソロイシンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するアセト乳酸合成酵素を含む株を使用することが好ましい。
ロイシンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuAFBR)を含む株を使用することが好ましい。
プロリンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するグルタミン酸−5−キナーゼ(ProBFBR)を含む株を使用することが好ましい。
アルギニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgFFBR)を含む株を使用することが好ましい。
セリンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerAFBR)を含む株を使用することが好ましい。
メチオニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerAFBR)及び/又はフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ(PycFBR)を含む株を使用することが好ましい。
トリプトファンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するホスホ−2−デヒドロ−3−デオキシヘプトネートアルドラーゼ(AroGFBR又はAroHFBR)を含む株を使用することが好ましい。
本発明に関連して使用する、L−アミノ酸過剰産生C.humireducens株のその他の好ましい特性については、上述したWu et al.(2011)及びその他の刊行物を参照されたい。
本発明に係る微生物、特にコリネバクテリウム属菌は、L−アミノ酸を製造するために、例えば国際公開第05/021772号に開示されているように連続的に培養するか、回分処理(回分培養又は回分法)又は流加培養又は反復流加培養処理によって非連続的に培養することができる。公知の培養方法の概要は、Chmiel(Bioprozesstechnik 1,Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1,Introduction to Bioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))又はStorhas(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))に記載されている。
使用する培地又は発酵培地は、特定の株に関する要件を適切に満たしていなければならない。様々な微生物に使用する培地については、「Manual of Methods for General Bacteriology」,American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)に記載されている。なお、「培地」及び「発酵培地」という用語は、互いに置き替え可能である。
使用する炭素源としては、糖及び糖質、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、砂糖大根又はサトウキビの製造によって得られるスクロース含有溶液、でんぷん、でんぷん加水分解物、セルロース、油脂、例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナツ油(coconut fat)、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えば、グリセリン、メタノール及びエタノール、有機酸、例えば、酢酸及び乳酸が挙げられる。
使用する窒素源としては、ペプトン等の有機含窒素化合物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム等の無機化合物が挙げられる。これらの窒素源は、単独又は混合物として使用することができる。
使用するリン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
培地は、増殖に必要な、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄等の金属の塩化物又は硫酸塩等の塩、例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄をさらに含む。上述した物質に加えて、増殖に必須の物質、例えば、アミノ酸、例えば、ホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン又はパントテン酸を使用することができる。
上述した物質は、単一の混合物として培地に添加するか、培養時に適当な方法で添加することができる。
培養物のpHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水等の塩基性化合物又はリン酸又は硫酸等の酸性化合物を使用して制御することができる。pHは、通常は6.0〜9.0、好ましくは6.5〜8に調節する。発泡の発生を制御するために、脂肪酸ポリグリコールエステル等の消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、抗生物質等の適当な選択的作用物質を培地に添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は含酸素気体混合物(空気等)を培養物に導入する。過酸化水素を含む液体を使用することもできる。必要に応じて、例えば、0.03〜0.2MPa等の加圧下で発酵を実施する。培養物の温度は、通常は20〜45℃、好ましくは25〜40℃である。回分処理を実施する場合には、所望のL−アミノ酸の産生が最大となるまで培養を継続する。この場合、培養時間は通常は10〜160時間である。連続処理では、培養時間をさらに長くしてもよい。細菌の活性により、発酵培地及び/又は細菌細胞中のL−アミノ酸の濃度(蓄積)が上昇する。
適当な発酵培地の例は、米国特許第5,770,409号、米国特許第5,840,551号、米国特許第5,990,350号及び米国特許第5,275,940号に開示されている。
発酵時における一回以上の濃度決定のためのL−アミノ酸の分析は、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーと、ニンヒドリンを使用するポストカラム誘導体化によるL−アミノ酸の分離によって実施することができる(Spackman et al.(Analytical Chemistry 30:1190−1206(1958))を参照)。ニンヒドリンの代わりに、オルトフタルジアルデヒドをポストカラム誘導体化に使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーについては、Pickering(LC・GC(Magazine of Chromatographic Science) 7(6),484−487(1989))を参照されたい。
また、例えば、オルトフタルアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートを使用してプレカラム誘導体化を実施し、逆相クロマトグラフィー(RP)(好ましくは高速液体クロマトグラフィー(HPLC))によって得られたアミノ酸誘導体を分離することもできる。そのような方法は、例えば、Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51:1167−1174(1979))に記載されている。
検出は光分析(吸収率、蛍光)によって行う。
アミノ酸分析に関するレビューは、「Bioanalytik」,Lottspeich and Zorbas(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)に記載されている。
また、本発明は、L−アミノ酸の製造方法であって、(a)本発明に係る微生物、特にコリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム属菌、特に好ましくはC.humireducens又はC.グルタミカムを適当な培養液中で発酵させる工程と、(b)前記培養液及び/又は前記細菌の細胞内において前記L−アミノ酸を蓄積させる工程と、を実施することを特徴とする方法に関する。
次に、液体又は固体としてL−アミノ酸を含む生成物を製造又は回収する。
発酵により、関連するL−アミノ酸を含む発酵液が得られる。
発酵液とは、微生物を所定の時間にわたって所定の温度で培養した発酵培地又は培養液を意味する。発酵時に使用する発酵培地又は培地は、微生物の増殖及び所望のL−アミノ酸の生成を可能とするあらゆる物質又は成分を含む。
発酵によって得られる発酵液は、以下の成分を含む。
a)微生物の細胞の増殖によって生成された微生物の細胞集団。
b)発酵時に生成されたL−アミノ酸。
c)発酵時に生成された有機副生成物。
d)発酵によって消費されなかったビオチン等のビタミン又は硫酸マグネシウム等の塩等の、発酵培地の成分又は出発材料。
a)微生物の細胞の増殖によって生成された微生物の細胞集団。
b)発酵時に生成されたL−アミノ酸。
c)発酵時に生成された有機副生成物。
d)発酵によって消費されなかったビオチン等のビタミン又は硫酸マグネシウム等の塩等の、発酵培地の成分又は出発材料。
有機副生成物は、所望のL−アミノ酸と共に、発酵に使用した微生物によって生成され、任意に分泌された物質を含む。例えば、トレハロース等の糖が有機副生成物に含まれる。
発酵液を培養容器又は発酵容器から取り出し、必要に応じて回収し、液体又は固体のL−アミノ酸含有製品を調製するために使用する。この場合にも、「L−アミノ酸含有製品を回収する」という表現を使用する。最も単純な場合には、回収される製品は、L−アミノ酸含有発酵液そのものである。
以下の群から選択される1以上の手段により、発酵液からL−アミノ酸を濃縮又は精製することができる。
a)水の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%又は≧99%)な除去。
b)(必要に応じて非活性化させた)細胞集団の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%又は≧99%)な除去。
c)発酵時に生成した有機副生成物の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%又は≧99.7%)な除去。
d)発酵時に消費されなかった発酵培地の成分又は原料の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%又は≧99.7%)な除去。
これにより、所望のL−アミノ酸含有量を有する製品を単離することができる。
a)水の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%又は≧99%)な除去。
b)(必要に応じて非活性化させた)細胞集団の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%又は≧99%)な除去。
c)発酵時に生成した有機副生成物の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%又は≧99.7%)な除去。
d)発酵時に消費されなかった発酵培地の成分又は原料の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%又は≧99.7%)な除去。
これにより、所望のL−アミノ酸含有量を有する製品を単離することができる。
水の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)又はほぼ完全(≧80%〜<100%)な除去(手段a))は、「乾燥」ということができる。
水、細胞集団、有機副生成物及び消費されなかった発酵培地の成分を完全又はほぼ完全に除去することにより、純粋(≧80重量%又は≧90重量%)又は非常に純粋(≧95%重量、≧97重量%又は≧99重量%)なL−アミノ酸を得ることができる。手段a)、b)、c)及びd)に関しては、多くの技術的な説明が存在する。
実施例1:L−アラニン及びL−バリンに関するアッセイ
L−アラニン及びL−バリンに関するアッセイでは、基準株C.humireducens(DSM 45392)を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株を予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、20gの硫酸アンモニウム、0.4gのMgSO4*7H2O、0.6gのKH2PO4及び10gの酵母抽出物を750mlのH2Oに溶解させて調製した。20%NH4OHを使用して溶液のpHを7.8に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、0.25g/lのビタミンB1,50mg/lのシアノコバラミン、25mg/lのビオチン及び1.25g/lのピリドキシンを含む、4mlのビタミン溶液(pH7(NH4OHを使用))を添加した。また、140mlの無菌濾過50%グルコース溶液及び50gの乾燥オートクレーブ処理CaCO3を添加した後、培地を1lとした。
L−アラニン及びL−バリンに関するアッセイでは、基準株C.humireducens(DSM 45392)を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株を予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、20gの硫酸アンモニウム、0.4gのMgSO4*7H2O、0.6gのKH2PO4及び10gの酵母抽出物を750mlのH2Oに溶解させて調製した。20%NH4OHを使用して溶液のpHを7.8に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、0.25g/lのビタミンB1,50mg/lのシアノコバラミン、25mg/lのビオチン及び1.25g/lのピリドキシンを含む、4mlのビタミン溶液(pH7(NH4OHを使用))を添加した。また、140mlの無菌濾過50%グルコース溶液及び50gの乾燥オートクレーブ処理CaCO3を添加した後、培地を1lとした。
培養後、並行して培養した4種類の培養物の上清をHPLCによって分析し、アラニン及びバリンの含有量を測定した(検出限界:≧0.01g/l)。
基準株C.humireducensを振盪フラスコ内で培養(37℃、200rpm、48時間)することにより、約0.81g/lのアラニン(正味収率:0.011galanine/gglucose)及び約1.6g/lのバリン(正味収率:0.022gvaline/gglucose)が得られた(表1)。
実施例2:グルタミン酸に関するアッセイ
グルタミン酸に関するアッセイでは、基準株C.humireducens(DSM 45392)を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株を予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、20gの硫酸アンモニウム、0.4gのMgSO4*7H2O、0.6gのKH2PO4及び10gの酵母抽出物を750mlのH2Oに溶解させて調製した。20%NH4OHを使用して溶液のpHを7.8に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、0.25g/lのビタミンB1,50mg/lのシアノコバラミン、25mg/lのビオチン及び1.25g/lのピリドキシンを含む、4mlのビタミン溶液(pH7(NH4OHを使用))を添加した。また、140mlの無菌濾過50%グルコース溶液及び50gの乾燥オートクレーブ処理CaCO3を添加した。次に、5mlの400mM無菌濾過トレオニン原液を添加し、培地を1lとした。
グルタミン酸に関するアッセイでは、基準株C.humireducens(DSM 45392)を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株を予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、20gの硫酸アンモニウム、0.4gのMgSO4*7H2O、0.6gのKH2PO4及び10gの酵母抽出物を750mlのH2Oに溶解させて調製した。20%NH4OHを使用して溶液のpHを7.8に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、0.25g/lのビタミンB1,50mg/lのシアノコバラミン、25mg/lのビオチン及び1.25g/lのピリドキシンを含む、4mlのビタミン溶液(pH7(NH4OHを使用))を添加した。また、140mlの無菌濾過50%グルコース溶液及び50gの乾燥オートクレーブ処理CaCO3を添加した。次に、5mlの400mM無菌濾過トレオニン原液を添加し、培地を1lとした。
培養後、並行して培養した4種類の培養物の上清をHPLCによって分析し、グルタミン酸の含有量を測定した(検出限界:≧0.01g/l)。
基準株C.humireducensを振盪フラスコ内で培養(37℃、200rpm、48時間)することにより、1.8(±0.6)g/lのL−グルタミン酸が得られた。培地中のL−グルタミン酸の初期濃度は0.78(±0.1)g/lだった。
実施例4:AECスクリーニング
振盪フラスコを使用し、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、野生型株C.humireducens(DSM 45392)を一晩培養した(37℃、200rpm)。次に、100μlの培養物を、25mM S−2−アミノエチル−L−システイン(AEC)(MW=164g/mol)を含む最少寒天培地に入れ、37℃で3日間培養した。培地は、5gの(NH4)2SO4、2gのKH2PO4、2gのK2HPO4及び10gのMOPSを750mlのH2Oに溶解させて調製した。1M KOHを使用して培地のpHを7.6に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。残った成分を別々に滅菌濾過した。具体的には、20mlの50%(w/v)グルコース、1mlの1%(w/v)CaCl2、1mlの1M MgSO4、1mlの0.02%ビオチン及び1mlの微量元素溶液(1gのFeSO4×7H2O、1gのMnSO4×7H2O、0.1gのZnSO4×7H2O、0.021gのCuSO4×5H2O、0.002gのNiCl2×6H2O(H2O 100mlに対しての量)を培地に添加し、無菌H2Oを使用して1000mlとした。15g/l寒天(Merck社製)を培地に添加して固形培地プレート上で培養を行った。
振盪フラスコを使用し、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、野生型株C.humireducens(DSM 45392)を一晩培養した(37℃、200rpm)。次に、100μlの培養物を、25mM S−2−アミノエチル−L−システイン(AEC)(MW=164g/mol)を含む最少寒天培地に入れ、37℃で3日間培養した。培地は、5gの(NH4)2SO4、2gのKH2PO4、2gのK2HPO4及び10gのMOPSを750mlのH2Oに溶解させて調製した。1M KOHを使用して培地のpHを7.6に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。残った成分を別々に滅菌濾過した。具体的には、20mlの50%(w/v)グルコース、1mlの1%(w/v)CaCl2、1mlの1M MgSO4、1mlの0.02%ビオチン及び1mlの微量元素溶液(1gのFeSO4×7H2O、1gのMnSO4×7H2O、0.1gのZnSO4×7H2O、0.021gのCuSO4×5H2O、0.002gのNiCl2×6H2O(H2O 100mlに対しての量)を培地に添加し、無菌H2Oを使用して1000mlとした。15g/l寒天(Merck社製)を培地に添加して固形培地プレート上で培養を行った。
目視可能な各コロニーを、25mM AEC及び12.5mMトレオニンを含む最少寒天培地に分画標本として入れ、37℃で3日間培養した。次に、振盪フラスコを使用し、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内に単一クローンを播種し、一晩培養(37℃、200rpm)した後、10%グリセリンで処理し、参考サンプルとして−80℃で保管した。
lysC配列領域の配列分析
単離した各クローンのlysC配列領域を分析するために、プライマー(lysC_for:5 fAGACGAAAGGCGGCCTACAC3 f、lysC_rev:5 fTCCAGGATCGAGCGCATCAC3 f)及びPCR法を使用してlysCの関連遺伝子領域を増幅した。ソフトウェア「Clone Manager」を使用して、得られたDNA配列を分析した。単離したAEC+トレオニン耐性C.humireducensクローンのlysC配列を分析することにより、以下に示す点突然変異を特定した。
単離した各クローンのlysC配列領域を分析するために、プライマー(lysC_for:5 fAGACGAAAGGCGGCCTACAC3 f、lysC_rev:5 fTCCAGGATCGAGCGCATCAC3 f)及びPCR法を使用してlysCの関連遺伝子領域を増幅した。ソフトウェア「Clone Manager」を使用して、得られたDNA配列を分析した。単離したAEC+トレオニン耐性C.humireducensクローンのlysC配列を分析することにより、以下に示す点突然変異を特定した。
実施例5:L−リシンに関するアッセイ
基準株C.humireducens及びAEC+トレオニンスクリーニングによって単離した各クローンを振盪フラスコ内で培養し、リシン合成に関するアッセイを実施した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株及び単離した各AEC+トレオニン耐性C.humireducensクローンを予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、7.5gのコーンスティープリカー(50%)、20gのモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、25gの(NH4)2SO4、0.1gのKH2PO4、1gのMgSO4×7H2O、0.01gのCaCl2×2H2O、0.01gのFeSO4×7H2O及び0.005gのMnSO4×H2Oを750mlのH2Oに溶解させて調製した。アンモニア水を使用して培地のpHを7.0に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。次に、25gの乾燥オートクレーブ処理したCaCO3を添加した。残った成分を別々に滅菌濾過した。90mlの50%(w/v)グルコース及び10mlの30mg/lビタミンB1及び20mg/lビオチン溶液を培地に添加し、無菌H2Oを使用して1000mlとした。
基準株C.humireducens及びAEC+トレオニンスクリーニングによって単離した各クローンを振盪フラスコ内で培養し、リシン合成に関するアッセイを実施した。具体的には、10mlのBHI(Brain Heart Infusion)液体媒体(Merck社製)(H2O:37g/l)内において、C.humireducens株及び単離した各AEC+トレオニン耐性C.humireducensクローンを予備培養した(37℃、200rpm、24時間)。振盪フラスコ内の培地(10ml)を0.2のOD660で播種し、培養した(37℃、200rpm、48時間)。培地は、7.5gのコーンスティープリカー(50%)、20gのモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、25gの(NH4)2SO4、0.1gのKH2PO4、1gのMgSO4×7H2O、0.01gのCaCl2×2H2O、0.01gのFeSO4×7H2O及び0.005gのMnSO4×H2Oを750mlのH2Oに溶解させて調製した。アンモニア水を使用して培地のpHを7.0に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。次に、25gの乾燥オートクレーブ処理したCaCO3を添加した。残った成分を別々に滅菌濾過した。90mlの50%(w/v)グルコース及び10mlの30mg/lビタミンB1及び20mg/lビオチン溶液を培地に添加し、無菌H2Oを使用して1000mlとした。
培養後、並行して培養した2種類の培養物の上清をHPLCによって分析し、L−リシンの含有量を測定した(検出限界:≧0.01g/l)。リシン力価及び培養物の収率を表3に示す。
Claims (15)
- 配列番号72で表される配列に対して少なくとも85%の配列相同性を有することを特徴とするアラニンデヒドロゲナーゼ。
- 以下のポリヌクレオチドからなる群から選択される、アラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
a)請求項3に記載のアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号71で表される配列の位置301〜1365の配列に対して少なくとも75%の配列相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド;
c)(a)又は(b)に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。 - 以下の酵素から選択される、hut群の酵素。
a)配列番号192で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU);
b)配列番号194で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするイミダゾロンプロピオナーゼ(hutI);
c)配列番号196で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするヒスチジンアンモニアリアーゼ(hutH);
d)配列番号198で表される配列に対して、少なくとも85又は90%、好ましくは少なくとも92、94、96又は98%、特に好ましくは100%の配列相同性を有することを特徴とするホルミミドイルグルタマーゼ。 - 以下のポリヌクレオチドから選択される、hut群の酵素をコードするポリヌクレオチド。
a)請求項5の(a)に記載のウロカニン酸ヒドラターゼ(hutU)をコードし、配列番号191で表される配列の位置301〜1983の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有するポリヌクレオチド;
b)請求項5の(b)に記載のイミダゾロンプロピオナーゼ(hutI)をコードし、配列番号193で表される配列の位置301〜1509の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有するポリヌクレオチド;
c)請求項5の(c)に記載のヒスチジンアンニモアリアーゼ(hutH)をコードし、配列番号195で表される配列の位置301〜1851の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有するポリヌクレオチド;
d)請求項5の(d)に記載のホルミミドイルグルタマーゼ(hutG)をコードし、配列番号197で表される配列の位置301〜1209の配列に対して、少なくとも70又は75%、好ましくは少なくとも80又は85%、より好ましくは少なくとも90又は95%、特に好ましくは100%の配列相同性を有するポリヌクレオチド;
e)(a)〜(d)に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のアラニンデヒドロゲナーゼの少なくとも1種及び/又は請求項2に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1種を含むことを特徴とする組み換え微生物。
- 請求項1に記載のアラニンデヒドロゲナーゼ及び/又は請求項2に記載のポリヌクレオチドが過剰発現された状態で存在することを特徴とする、請求項5に記載の組み換え微生物。
- 請求項3に記載のhut群の酵素の少なくとも1種、好ましくは全て及び/又は請求項4に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1種、好ましくはhut群の全ての酵素をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組み換え微生物。
- 請求項3に記載のhut群の酵素の少なくとも1種、好ましくは全て及び/又は請求項4に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1種、好ましくはhut群の全ての酵素をコードするポリヌクレオチドが過剰発現された状態で存在することを特徴とする、請求項7に記載の組み換え微生物。
- コリネバクテリウム属菌、好ましくはC.humireducens又はC.グルタミカムであることを特徴とする、請求項5〜9のいずれか1項に記載の組み換え微生物。
- 微生物内でL−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、請求項1又は3に記載のポリペプチド及び/又は請求項2又は4に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項5〜9のいずれか1項に記載の組み換え微生物を使用することを特徴とする方法。
- L−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好アルカリ菌を使用することを特徴とする方法。
- 前記好アルカリ菌が、好アルカリコリネ型細菌、特に好アルカリコリネバクテリウム属菌、好ましくはC.humireducensであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 過剰産生させる前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリン、グルタミン酸系のL−アミノ酸、特に、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン及びL−アルギニン、アスパラギン酸系のL−アミノ酸、特に、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−メチオニン、L−リシン、L−イソロイシン及びL−トレオニンから選択されることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 過剰産生させる前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリン、L−グルタミン酸及びL−リシンから選択されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 以下の酵素からなる群から選択される酵素。
a)配列番号106で表される配列及び配列番号106で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンデヒドラターゼ(IlvA、EC 4.3.1.19)、
b)配列番号98で表される配列及び配列番号98で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニット(IlvB)、
c)配列番号100で表される配列及び配列番号100で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソメロレダクターゼ(IlvC、EC 1.1.1.86)、
d)配列番号102で表される配列及び配列番号102で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(IlvD、EC 4.2.1.9)、
e)配列番号104で表される配列及び配列番号104で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトランスアミナーゼ(IlvE、EC 2.6.1.42)、
f)配列番号122で表される配列及び配列番号122で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素(IlvH、EC 2.2.1.6)、
g)配列番号108で表される配列及び配列番号108で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトレオニンシンターゼ(ThrC、EC 4.2.3.1)、
h)配列番号110で表される配列及び配列番号110で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ(LeuA、EC 2.3.3.13)、
i)配列番号112で表される配列及び配列番号112で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(LeuB、EC 1.1.1.85)、
j)配列番号114又は116で表される配列及び配列番号114又は116で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット(LeuCD、EC 4.2.1.33)、
k)配列番号118で表される配列及び配列番号118で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(PanB、EC 2.1.2.11)、
l)配列番号120で表される配列及び配列番号120で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するパントテン酸合成酵素(PanC、EC 6.3.2.1)、
m)配列番号124で表される配列及び配列番号124で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Gdh)、
n)配列番号126で表される配列及び配列番号126で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ1)、
o)配列番号128で表される配列及び配列番号128で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ(グルタミンシンテターゼ2)、
p)配列番号130で表される配列及び配列番号130で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼ、
q)配列番号132で表される配列及び配列番号132で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
r)配列番号134で表される配列及び配列番号134で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼ、
s)配列番号136で表される配列及び配列番号136で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ、
t)配列番号138で表される配列及び配列番号138で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアミノペプチダーゼC(PepC)、
u)配列番号140で表される配列及び配列番号140で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
v)配列番号142で表される配列及び配列番号142で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ1)、
w)配列番号144で表される配列及び配列番号144で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ(ピルビン酸キナーゼ2)、
x)配列番号146で表される配列及び配列番号146で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するエノラーゼ、
y)配列番号148で表される配列及び配列番号148で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する2,3−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(GpmA)、
z)配列番号150で表される配列及び配列番号150で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk)、
aa)配列番号152で表される配列及び配列番号152で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ1)、
bb)配列番号154で表される配列及び配列番号154で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ2)、
cc)配列番号156で表される配列及び配列番号156で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼ(TpiA)、
dd)配列番号158で表される配列及び配列番号158で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼ、
ee)配列番号160で表される配列及び配列番号160で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する1−ホスホフルクトキナーゼ、
ff)配列番号162で表される配列及び配列番号162で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する6−ホスホフルクトキナーゼ、
gg)スクシニル−CoAリガーゼのサブユニット(SucCD、EC 6.2.1.5)をコードする減衰ポリヌクレオチド(sucCD)、
hh)配列番号2で表される配列及び配列番号2で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するHTH tetRのDNA結合ドメイン(McbR)、
ii)配列番号4で表される配列及び配列番号4で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ(ThrB、EC 2.7.1.39)、
jj)配列番号6で表される配列及び配列番号6で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi、EC 5.3.1.9)、
kk)配列番号8で表される配列及び配列番号8で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(Pck、EC 4.1.1.32)、
ll)配列番号10で表される配列及び配列番号10で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するD−メチオニン結合リポタンパク質(MetQ)、
mm)配列番号12で表される配列及び配列番号12で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニントランスポーター(MetP)、
nn)配列番号14で表される配列及び配列番号14で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するATP依存性メチオニントランスポーター(MetN)、
oo)配列番号16で表される配列及び配列番号16で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するS−アデノシルメチオニンシンターゼ(MetK)、
pp)配列番号18で表される配列及び配列番号18で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素(MetI)、
qq)配列番号20で表される配列及び配列番号20で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する4−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(DapA、EC 4.3.3.7)、
rr)配列番号22で表される配列及び配列番号22で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CBS、CysK)、
ss)配列番号24で表される配列及び配列番号24で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼ、
tt)配列番号26で表される配列及び配列番号26で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼ(AecD)、
uu)配列番号28で表される配列及び配列番号28で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Asd、EC 1.2.1.11)、
vv)5−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetH、EC 2.1.1.13)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(metH)、
ww)配列番号30で表される配列及び配列番号30で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット(BrnE)、
xx)配列番号32で表される配列及び配列番号32で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット(BrnF)、
yy)配列番号34で表される配列及び配列番号34で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ(CysE)、
zz)配列番号36で表される配列及び配列番号36で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシステインシンターゼ(CysK)、
aaa)配列番号38で表される配列及び配列番号38で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のH−タンパク質(GcvH)、
bbb)配列番号40で表される配列及び配列番号40で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のP−タンパク質(GcvP)、
ccc)配列番号42で表される配列及び配列番号42で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグリシン開裂系のT−タンパク質(GcvT)、
ddd)配列番号44で表される配列及び配列番号44で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(GlyA)、
eee)配列番号46で表される配列及び配列番号46で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ(Hom、EC 1.2.1.11)、
fff)配列番号48で表される配列及び配列番号48で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipA)、
ggg)配列番号50で表される配列及び配列番号50で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポイルシンターゼ(LipB)、
hhh)配列番号52で表される配列及び配列番号52で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(Lpd)、
iii)配列番号94で表される配列及び配列番号94で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼ(LplA)、
jjj)配列番号96で表される配列及び配列番号96で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(GcvL)、
kkk)配列番号54で表される配列及び配列番号54で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ(LysC、EC 2.7.2.4)、
lll)配列番号56で表される配列及び配列番号56で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼ(MetB)、
mmm)配列番号58で表される配列及び配列番号58で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)、
nnn)配列番号60で表される配列及び配列番号60で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(MetX)、
ooo)配列番号62で表される配列及び配列番号62で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するO−アセチルホモセリンリアーゼ(MetY)、
ppp)配列番号64で表される配列及び配列番号64で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyc、EC 6.4.1.1)、
qqq)配列番号66で表される配列及び配列番号66で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するD−3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(SerA)、
rrr)配列番号68で表される配列及び配列番号68で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼ(SerB)、
sss)配列番号70で表される配列及び配列番号70で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(SerC)、
ttt)配列番号74で表される配列及び配列番号74で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysD)、
uuu)配列番号76で表される配列及び配列番号76で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ(CysH)、
vvv)配列番号78で表される配列及び配列番号78で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼ(CysI)、
www)配列番号80で表される配列及び配列番号80で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するNADPH依存性グルタミン酸シンターゼβ鎖(CysJ)、
xxx)配列番号82で表される配列及び配列番号82で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット(CysN)、
yyy)配列番号84で表される配列及び配列番号84で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼ(CysY)、
zzz)配列番号86で表される配列及び配列番号86で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する硫酸トランスポーター(CysZ)、
aaaa)配列番号88で表される配列及び配列番号88で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有する5−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、
bbbb)配列番号90で表される配列及び配列番号90で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ1(PtH1)、
cccc)配列番号92で表される配列及び配列番号92で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するペプチジル−tRNAヒドロラーゼ2(PtH2)、
dddd)ジアミノピメリン酸dehrogenase(Ddh、EC 1.4.1.16)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(ddh)、
eeee)配列番号164で表される配列及び配列番号164で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(LysA、EC 4.1.1.20)、
ffff)配列番号166で表される配列及び配列番号166で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AaT、EC 2.6.1.1)、
gggg)配列番号168で表される配列及び配列番号168で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するL−リシンエクスポーター(LysE、リシン透過酵素(lysine efflux permease)、
hhhh)ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(DapF、EC 5.1.1.7)をコードする過剰発現ポリヌクレオチド(dapF)、
iiii)配列番号170で表される配列及び配列番号170で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼ(DapB、EC 1.3.1.26)、
jjjj)配列番号172で表される配列及び配列番号172で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)、
kkkk)配列番号186で表される配列及び配列番号186で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのZwfサブユニット(Zwf、EC 1.1.1.49)、
llll)配列番号188で表される配列及び配列番号188で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼのOpcAサブユニット(OpcA、EC 1.1.1.49)、
mmmm)配列番号174で表される配列及び配列番号174で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd、EC 1.1.1.44)、
nnnn)配列番号176で表される配列及び配列番号176で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸:キノンオキシドレダクターゼ(Mqo、EC 1.1.99.16)、
oooo)配列番号178で表される配列及び配列番号178で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pサブユニット(AceE、EC 1.2.4.1)、
pppp)配列番号180で表される配列及び配列番号180で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ(GltA、EC 4.1.3.7)、
qqqq)配列番号182で表される配列及び配列番号182で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Mdh、EC 1.1.1.37)、
rrrr)配列番号184で表される配列及び配列番号184で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも90、95又は98%、好ましくは100%の配列相同性を有するUDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼ(MurE、EC 6.3.2.13)。
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