JP2017513634A - 生物医学的応用における使用のためのシクロデキストリンを組み入れたコラーゲンマトリクスを含む組成物 - Google Patents

Abstract

本願の発明者等は、生物模倣コラーゲンに基づくマトリクス組成物の作成のためにプロテオグリカンの代用品としてシクロデキストリンを利用した。本発明のコラーゲン組成物において得られたシクロデキストリンの組み込みは、コラーゲンの熱安定性を増加し、コラーゲンの線維形成を低減した。結果として、厚く、透明で機械的強度に優れたコラーゲンに基づく組成物が形成された。このシクロデキストリン−コラーゲン組成物は角膜修復のための治療的アイパッチとして使用されうる可能性を有している。これら組成物の発明の製造方法及びそれらの使用も提供される。

Description

優先権主張

関連出願に対する参照
本出願は、２０１４年４月２５日に出願された米国仮特許出願番号６１／９８４，３２８の利益を主張し、それが本明細書に完全に記載されたように全ての目的のために参照により援用する。

政府の利益の陳述
本発明は、米国陸軍により授与された契約書番号Ｗ８１ＸＷＨ−０９−２−０１７３のもと政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

細胞外基質（ＥＣＭ）は、タンパク質、プロテオグリカン及び他の可溶性分子から構成される高分子の混合物である。動物においてもっとも豊富なタンパク質であるコラーゲンは、種々の生物学的応用において広く利用されている。しかしながら、大量の精製プロテオグリカンを抽出することが困難なことから、コラーゲンとプロテオグリカンとから構成されるＥＣＭ骨格の作製はほとんど試みられてこなかった。天然の角膜において、プロテオグリカンはコラーゲン原線維の直径と間隔とを制御することにより角膜の透明度に重要な役割を果たしている。したがって、生体模倣型のコラーゲンに基づくＥＣＭを開発するためにプロテオグリカンの代替物を見出すことは、角膜再生などの臨床的な応用に関連する挑戦的問題を解決するための新しいテンプレートを提供する有望な一連の研究である。

シクロデキストリン（ＣＤ）は、６個から８個のグルコース分子から構成される環状オリゴマーファミリーである。これらの環状分子は、小分子又は大分子の一部と複合体を形成しうる内側疎水性コア及び外側親水性環を特徴とする。天然シクロデキストリンの溶解度は極めて乏しく、当初はこれが効果的な錯化剤となることの妨げとなっていた。１９６０年代後半、２、３及び６位の水酸基部位での化学的置換が溶解度を大きく向上させることが見出された。化学的置換の程度と置換に使用される基の特質とが、水媒体におけるシクロデキストリンの最終最大濃度を決定する。最も化学的に修飾されたシクロデキストリンは、水中で５０％（重量／体積）濃度に達することができる。

１つ又は複数の実施態様に従って、発明者は天然組織中のプロテオグリカンと同様に、コラーゲンマトリクス中にシクロデキストリンを組み入れることでコラーゲンの三重らせん構造を保ちながらコラーゲンの線維形成を制御できると仮定した。無定形なコラーゲンネットワークから構成される透明ゲルが機械的強度に乏しい一方、線維状構造物を有する伝統的な合成Ｉ型コラーゲンマトリクスは不透明である。シクロデキストリンはコラーゲンマトリクスにプロテオグリカンの代替物として加えられることができ、角膜再生のための光学的及び機械的特性の両方を最適化する支援となることが期待される。

実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分はコラーゲンを含み、前記第二構成成分はシクロデキストリンを含む、組成物を提供する。

他の実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分はコラーゲンを含み、前記第二構成成分はシクロデキストリンを含み、さらに少なくとも１つの生理活性物質を含む、組成物を提供する。

さらなる実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルの製造方法であって、前記第一構成成分はコラーゲンを含み、前記第二構成成分はシクロデキストリンを含み、ａ）コラーゲンの水溶液を得るステップ、ｂ）シクロデキストリンの水溶液を得るステップ、ｃ）前記ａ）の溶液と前記ｂ）の溶液とを混合するステップ、及びｄ）前記ｃ）の混合溶液がガラス化するのに十分な時間、前記ｃ）の混合溶液を脱水するステップ、を含む製造方法を提供する。

さらに他の実施態様に従って、本発明は上述した組成物を哺乳類の組織を修復するためのマトリクスとして使用することを提供する。

他の実施態様に従って、本発明は上述した組成物を哺乳類の目の角膜を修復するためのマトリクスとして使用することを提供する。

図１は、通常のコラーゲンビトリゲル（ＣＶ）、本発明のα―ＣＤ−ｃｏｌ組成物、及び架橋ＣＶを含む３つのコラーゲンに基づく膜を、示差走査熱量測定（DSC）した第一加熱曲線を図示する。 図２は、本発明のα―ＣＤ−ｃｏｌ組成物が５５０ｎｍで９６％もの透過率で表される優れた透明度を示すことを図示するグラフである。図中の挿入図は、印刷された文字「ｅｙｅ」上に配置された湿潤な膜の写真を示す。 図３は、本発明の５２０μｍと１７０μｍとの厚さである２つのα―ＣＤコラーゲン組成物それぞれに対する負荷対移動の縫合可能性試験を図示するグラフである。図中の挿入図は、５．６ｍｍを超えて伸長した後の厚い方の膜の写真を示す。 図４は、本発明の組成物に対する負荷試験で使用した装置の写真である。 図５は、ウシの角膜実質細胞を初代培養したときの細胞突起解析及び異なるガラス質ゲル組成物コラーゲン密度の効果を表した図表を示す。 図６は、ウシの角膜実質細胞を初代培養したときの３個の異なる遺伝子マーカーの遺伝子発現度が、本発明のビトリゲル組成物の原線維のナノ構造により影響を受けることを図示する。 図７は、種々のシクロデキストリンの構造及びそれらがどのように溶液中のコラーゲン原線維と相互作用するかを示した図表である。シクロデキストリン分子内の空間は、水不溶性薬剤と生理活性物質との薬剤リザーバーとして使用されうる。

１つ又は複数の実施態様に従って、発明者は生体模倣型のコラーゲンに基づくマトリクス組成物を作製するためにシクロデキストリンをプロテオグリカンの代替物として使用した。本発明のコラーゲン組成物において生じたシクロデキストリンの組み入れによりコラーゲンの熱安定性が増加し、コラーゲンの線維形成が低減した。結果として、厚く透明で機械的に強度なコラーゲンに基づく組成物が形成された。このシクロデキストリン−コラーゲン組成物は角膜修復のための治療的なアイパッチとして使用できる大きな可能性を有している。

実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含む、組成物を提供する。

本明細書において使用されるように、用語「ガラス化」又は「ビトリゲル」は、組成物が１つ又は複数のコラーゲンと１つ又は複数のシクロデキストリンとの混合物の水溶液から構成され、ヒドロゲルを形成できることを意味する。ある実施態様においては、組成物のゲル化は３７度でなされる。ヒドロゲルが形成された後、例えばガラス化が起こりうる特定の期間、特定の温度と湿度とで加熱することなどの、脱水によりガラス化される。ある実施態様においては、ガラス化は３５〜４５℃、相対湿度３０％〜５０％でなされる。実施態様においては、ガラス化は４０℃、相対湿度４０％でなされる。組成物のガラス化に必要な時間は数日から数週間で変動しうる。実施態様において、組成物のガラス化時間は約１〜２週間である。

「ゲル」は、液体と固体との間の物質の状態を指し、一般的に液状媒体中で膨張した架橋ポリマーネットワークとして定義される。通常、ゲルは固体と液体とを両方含有する２相コロイド分散であり、そこでの固体の量は、「ゾル」として定義される２相コロイド分散中の固体の量よりも多い。そのように、「ゲル」は一部の液体特性（すなわち、形状は弾性を有し変形可能である）及び一部の固体特性（すなわち、形状は二次元表面上で三次元を維持するのに十分離散的である）を有する。

「ヒドロゲル」は、水を吸収して弾性ゲルを形成しうる水膨張性ポリマーマトリクスを意味し、「マトリクス」は共有結合性又は非共有結合性の架橋によって結合した高分子の三次元ネットワークである。水性環境に配置すると、乾燥したヒドロゲルは液体を吸収することによって、架橋度によって許容される程度に膨張する。

本発明の組成物はコラーゲンを含む。第一構成成分であるコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンからなる群より選択される。実施態様においては、前記組成物の前記第一構成成分として使用されるコラーゲンはＩ型コラーゲンである。当業者は、前記組成物及び方法において使用されるコラーゲンが複数の型のコラーゲンを含みうることを理解するだろう。

本発明の組成物は、シクロデキストリンも含む。第二構成成分であるシクロデキストリンは、α―シクロデキストリン、β―シクロデキストリン及びγシクロデキストリンからなる群より選択される。実施態様において、前記組成物の前記第二構成成分として使用されるシクロデキストリンは、α―シクロデキストリンである。当業者は、前記組成物及び方法において使用されるシクロデキストリンが複数の型のシクロデキストリンを含みうることを理解するだろう。

本明細書において使用されるように、本発明のガラス化組成物は使用前に水和される。

本発明のガラス化組成物は、光学的に透明であり様々な用途に適している。実施態様において、ガラス化組成物は５５０ｎｍで約９６％の光透過性を有する。

本発明のガラス化組成物は、組織の代替物又は組織の充填剤としての使用に適したいかなる特定の形状にも成型又は形成されうることが理解されるだろう。本発明は、組織欠損を望みの形状にするように成型でき、生来の細胞修復を刺激することによって組織の成長を促進するように成型でき、低侵襲性注入による移植の可能性がある、スキャフォールドなどを形成するための生体外での重合技術を提供する。

ある実施態様において、本発明のガラス化組成物は、患者の人工角膜としての使用のために成形されうる。

別の実施態様において、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物を提供し、ここで前記第一構成成分はコラーゲンを含み、前記第二構成成分はシクロデキストリンを含み、さらに少なくとも１つの生理活性物質を含む。

本明細書において、「活性物質」及び「生理活性物質」は区別しないで使用され、望みの薬理学的及び／又は生理学的効果を誘発する化学的又は生物学的物質を指すものであり、ここでその効果は予防的であっても治療的であってもよい。この用語は、本明細書において具体的に言及された活性物質の薬学的に許容されうる薬理学的に活性な誘導体を含み、限定されるものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝生成物、類縁体などを含む。用語「活性物質」、「薬理学的に活性な物質」及び「薬剤」を使用するとき、本発明は薬学的に許容されうる、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝生成物、類縁体などと同様に、活性物質自体を含むことが理解されるべきである。

「組み入れた」、「被包された」および「封入された」は、治療薬、色素又は他の物質及び本発明の組成物のようなポリマー組成物に関して使用するときに、当該技術分野において承認される。ある実施態様においては、これらの用語は、所望の応用において前記薬剤を徐放可能にする組成物内に前記薬剤を組み込むこと、処方すること又はそうでなければ含有することを含む。この用語は、前記マトリクス全体に分散する、（インターカレーション又は他の結合性相互作用によって）マトリクスの表面に付加する、マトリクス内部に被包されるなどを含む、治療薬又は他の物質をマトリクス内に組み込むいかなる方法を意図してもよい。用語「同時取り込み」又は「同時被包化」は、治療薬又は他の物質と少なくとも１つの他の治療薬又は他の物質を対象となる組成物中に組み込むことを指す。

本発明の一側面において、ガラス化組成物と１つ又は複数の生理活性物質とを含む組成物を調製してもよい。生理活性物質は、組成物に意図される目的によって幅広く変化してもよい。用語「活性の」は、当該技術分野において承認され、被験者で局所的に又は全身的に作用する、生物学的に、生理学的に、又は薬理学的に活性な物質である全ての部分を指す。「薬剤」として言及されうる、生理活性物質の例は、「メルクインデックス」、「医師用卓上参考書」、及び「治療薬の薬理学的基礎」などの周知の文献参照に記載され、制限なく、薬剤、ビタミン、ミネラルサプリメント、病又は疾病の治療、予防、診断、治癒又は軽減のために使用される物質、身体の構造又は機能に影響する物質、又は生理的環境に配置された後生物学的に活性になるかより活性になるプロドラッグを含む。被験者に投与した時、ガラス化組成物により、例えば隣接する組織又は流体へ、放出可能な様々な形状の生理活性物質が使用されてもよい。ある実施態様において、生理活性物質は例えば目と併せて、例えば疾病や症状を治療、回復、抑制、又は防止するために使用されうる。

生理活性物質の非限定的な例は以下、アドレナリン受容体遮断薬、同化剤、アンドロゲンステロイド、制酸剤、抗喘息薬、抗アレルギー材料、抗コレステロール血症及び抗脂質薬、抗コリン作用及び交感神経作動薬、抗凝固剤、抗痙攣薬、抗下痢、制吐剤、抗高血圧剤、抗感染薬、ステロイドなどの抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症剤、抗マラリア薬、抗躁病薬、制嘔吐剤、抗腫瘍薬、抗肥満薬、抗パーキンソン剤、解熱剤及び鎮痛剤、抗けいれん薬、抗血栓薬、抗尿酸血症薬、抗狭心症薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、食欲抑制剤、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、生物製剤、心臓作用薬、大脳拡張薬、冠動脈拡張薬、うっ血除去薬、利尿薬、診断薬、エリスロポエチン製剤、エストロゲン、去痰剤、胃腸鎮静剤、薬剤、高血糖薬、睡眠薬、血糖降下剤、イオン交換樹脂、下剤、ミネラルサプリメント、有糸分裂阻害剤、粘液溶解薬、成長因子、神経筋薬、栄養物質、末梢血管拡張薬、プロゲステロン作用薬、プロスタグランジン、精神賦活薬、向精神薬、鎮静薬、覚せい剤、甲状腺及び抗甲状腺薬、精神安定剤、子宮弛緩薬、ビタミン、抗原性物質及びプロドラッグを含む。

様々な形態の生理活性物質が使用されうる。これらは、制限なく、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミド、プロドラッグ形態などであり、被験者に移植、注入又はそうでなければ配置されたときに生物学的に活性化される。

ビトリゲル組成物は、良好な医療行為と合致した方法で処方、服用、投与される。この文脈で考慮すべき要因は、治療されるべき特定の疾患、治療されるべき特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師により知られている他の要因を含む。投与されるべき生体高分子の「治療上有効な量」は、上記検討事項により影響され、関心のある疾患を防止、回復又は治療するのに必要な最小量とすることができる。本明細書において、用語「有効量」は治療（例えば予防薬又は治療薬）の総量を示すフレーズと等価であり、その総量は疾患の重症度及び／又は持続期間を低減し、その１つ又は複数の症状を回復し、疾患の進行を防止するか疾患の退縮を引き起こすのに十分であるか、疾患やその１つ又は複数の症状の発生、再発、開始または進行の予防をもたらすか、疾患を治療するのに有用な他の療法（例えば他の治療薬）の予防的及び／又は治療的効果を増強するか改善するのに十分である。

ある実施態様において、損傷組織の修復は、開腹手術及び腹腔鏡技法を含む、組織への接近と組織の修復を可能とするいかなる標準的な外科的プロセスの状況内でなされてもよい。損傷組織へ接近したら、必要であれば、外科的に許容しうる全てのパッチやインプラントに沿って本発明のビトリゲル組成物を損傷組織に接触して配置する。

さらなる実施態様に従って、本発明は第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルの製造方法であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含み、ａ）コラーゲン水溶液を得るステップ、ｂ）シクロデキストリン水溶液を得るステップ、ｃ）ａ）の溶液及びｂ）の溶液を混合するステップ、ｄ）ｃ）の混合溶液をガラス化するのに十分な時間脱水するステップ、を含む製造方法を提供する。

本明細書において使用されるように、コラーゲンの水溶液は適切な緩衝液に溶解された全てのコラーゲン溶液である。コラーゲンの濃度は可変であるが、本発明の方法では１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するコラーゲン溶液を使用することができる。実施態様において、水溶液中のコラーゲン濃度は約５ｍｇ／ｍｌである。

本明細書において使用されるように、シクロデキストリンの水溶液は適切な緩衝液に溶解された全てのシクロデキストリン溶液である。シクロデキストリンの濃度は可変であるが、本発明の方法では２．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するシクロデキストリン溶液を使用することができる。

本発明の方法に従って、本発明の組成物の脱水及びガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を約５〜４０℃で約３０〜５０％間の相対湿度で約３〜２８日間乾燥させるステップを含む。実施態様において、本発明の組成物のガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を３９°Ｃで約７日間加熱するステップ、を含む。他の実施態様においては、本発明の組成物のガラス化は、コラーゲン溶液とシクロデキストリンとを含む溶液を３９°Ｃで１４日間加熱するステップ、を含む。

用語「キャリア」は、治療薬が本発明のビトリゲル組成物を伴って供給される希釈液、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような生理的キャリアは水並びにピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油及び同様のものなどの石油、動物、植物又は合成起源のものを含む、油などの無菌液体とすることができる。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるとき、適切なキャリアである。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液のための、液体キャリアとして利用することができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。必要であれば、この組成物は少量の湿潤剤或いは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。

緩衝液、酸及び塩基はｐＨを調製するためにこの組成物に包含されてもよい。この組成物から放出される薬剤の拡散距離を増加するための薬剤を含むこともできる。

緩衝剤によりｐＨを生理的条件に近付けた範囲に維持することができる。緩衝液は、好ましくは約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度範囲である。本発明で使用するための適切な緩衝剤は、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−１ナトリウムクエン酸塩の混合物等）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸１ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などの、有機及び無機酸の両方並びにその塩を含む。Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及び他の公知の緩衝液などのリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、トリメチルアミン塩緩衝液を使用することができる。

微生物の増殖を遅らせるために防腐剤を添加してもよく、０．２％〜１％（重量／体積）の範囲の量で添加してもよい。本発明での使用に適した防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、塩化アンモニウムオクタデシルジメチルベンジル、ベンザルコニウムハロゲン化物（ｂｅｎｚｙａｃｏｎｉｕｍ ｈａｌｉｄｅｓ）（例えば、塩化物、臭化物及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールを含む。

本発明の液体組成物の生理的等張性を保証する等張化剤が存在し、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの、三価又はより高価な糖アルコールである、多価糖アルコール（ｐｏｌｈｙｄｒｉｃ ｓｕｇａｒ ａｌｃｏｈｏｌｓ）を含む。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、重量で約０．１％〜２５％間、好ましくは１％〜５％の量で存在することができる。

希釈剤の例は、リン酸緩衝の生理食塩水、ショ糖を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）などの膀胱での胃酸に対する緩衝のための緩衝液、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）単独、又はアスコルビン酸、ラクトース、もしくはアスパルテームを含む重炭酸緩衝液を含む。キャリアの例は、例えば脱脂乳中に見られるタンパク質、ショ糖などの糖、又はポリビニルピロリドンを含む。通常これらのキャリアは約０．１〜９０％（重量／体積）の濃度で使用されうるが、１〜１０％の範囲での使用が好ましい。

生体内投与のために使用される製剤は、滅菌される必要がある。それは、例えば滅菌濾過膜でろ過することにより達成することができる。例えば、本発明の製剤は、ろ過により滅菌されてもよい。

実施例
異なるシクロデキストリンが組み込まれたＩ型コラーゲンに基づく膜を以下のゲル化、ガラス化及び再水和の３段階の順序で調製した。３種類のシクロデキストリン、すなわちα−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤを試験して比較した。

初めに、Ｉ型コラーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＤを含む２％ＨＥＰＥＳ溶液（２．５〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で）と１：１体積／体積比で素早く完全に混合した。混合溶液を３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で２時間ゲル化した。

次に、ＣＤ−コラーゲン（ＣＤ−ｃｏｌ）ゲルを約３９°Ｃ、相対湿度約４０％の加湿機中で一週間ガラス化した。

第３に、これらのｃｏｌ−ＣＤ膜を、使用前に水又は緩衝液中で少なくとも２時間再水和した。２つのコラーゲン膜、すなわちコラーゲンビトリゲル及び架橋ビトリゲル、を、前述した手順（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４（２０１３）９３６５−９３７２）に従って対照として調製した。通常のビトリゲルと比較して、架橋ビトリゲルではゲル化工程の前にコラーゲン媒体混合物中に０．６％の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．６％のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加して製作した。コラーゲンとＣＤとの間の特異的な相互作用は示差走査熱量測定（ＤＳＣ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して評価された。ＣＤ−ｃｏｌ膜の吸収は、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して測定された。膜の縫合可能性は、１０−０ナイロン縫合糸によりＥｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ３２００試験装置（Ｂｏｓｅ，Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を使用して試験した。

角膜実質細胞は、連続的なコラーゲン分解酵素（２型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）による消化を使用して全層角膜から分離された。消化された細胞は、回収され、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。細胞のペレットは再懸濁され、通常の組織培養プレート（ＴＣＰ）又はＣＶ被覆プレート上で３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で培養された。無血清培地または血清ベースの培地が使用された。無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１％の１０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．５％の１．２５ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からなる。血清ベースの培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、１％の１０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、及び０．５％の１．２５ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢを含む。細胞は、無血清培地を使用して５０００細胞／ｃｍ^２の濃度で、一方血清に基づく培地を使用して１０００細胞／ｃｍ^２の濃度でプレーティングされた。画像解析及び遺伝子発現解析の前に、角膜実質細胞は無血清培地中で３週間を超えて又は血清に基づく培地中で６日を超えて培養された。角膜実質細胞の形態は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色することによって試験された。インドメタシンは、一定期間０．１％インドメタシン点眼薬にガラス化膜を浸漬することによりビトリゲル内に被包された。ビトリゲルからのインドメタシンの溶出は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定された。遊離溶液は、５１：４９（ｖ／ｖ）のアセトニトリル：水の移動相、Ｃ１８カラム及び３１８ｎｍに設定されたＵＶ／ＶＩＳ検出器を用いて試験された。

実施例１
全ての３つのシクロデキストリン、特にα−ＣＤは、透明で機械的に強度のあるＣＤ−ｃｏｌ膜の形成につながる、Ｉ型コラーゲントリプルへリックスとの強い相互作用を示した。図１に示されるように、通常のビトリゲルは熱流中５５°Ｃで大きく幅の広い吸熱ピークを示し、このことによりコラーゲン膜は４０．８Ｊ／ｇのエンタルピーで熱変性を引き起こすことが示された。対照的に、架橋ビトリゲルの対照試料においては認識できるピークが見られず、架橋反応によるコラーゲン膜の熱変性が示唆された。通常のビトリゲルと比較して、コラーゲン膜にα‐ＣＤを加えることにより、増強された熱安定性を示す、熱変性温度の増加が引き起こされた。α−ＣＤ−ｃｏｌにおいては、単独のより狭いピークのみが観察され、これはマトリクスが均質な構造を有することを意味する。もしエンタルピーの全てがコラーゲントリプルへリックスの熱転移に由来すると仮定すると、α−ＣＤ−ｃｏｌの変性エンタルピーは通常のビトリゲル由来のエンタルピーの７０．１％であり、コラーゲン線維形成の減少を示唆している。同様の結果はβ−ＣＤ−ｃｏｌ及びγ−ＣＤ−ｃｏｌでも観察された。

実施例２
従来のコラーゲン膜と比較して、ＣＤ−ｃｏｌ膜は非常に増強された透明度を示し（図２）、これはコラーゲン線維形成の減少により説明されうる。

実施例３
本発明の組成物は優れた機械的特性を実証した。その厚さがヒトの角膜の厚さと比較可能な時（すなわち、〜５００μｍ）、縫合のために十分な強度になった。図３に示すように、ナイロン縫合糸は厚さが５２０μｍであるα−ＣＤ−ｃｏｌ膜における穴を通して引っ張っていた。縫合糸の応力の元、その厚みのある膜における穴は、厚さが１７０μｍである薄い膜において観察されたような膜を通しての引き裂き（図４）ではなく、引き延ばされただけであった。

実施例４
コラーゲンのナノ構造は、細胞応答を特徴づける。ウシ角膜実質細胞の初代培養は低密度及び高密度のコラーゲンを有するビトリゲル組成物上でなされた。図５に示されるように、本発明の組成物のコラーゲン密度により、通常のビトリゲル対照と比較したとき、角膜実質細胞は培地中でより大きな突起領域を有した。さらに、本発明のビトリゲル組成物のコラーゲン密度の関数が増加することに応じて、角膜実質細胞の細胞突起の総数は著しく増加した（図５）。

実施例５
角膜実質細胞の遺伝子発現は、原線維の構造に依存する。角膜実質細胞は、対照ビトリゲル上で又は５℃又は３９℃で脱水された本発明のビトリゲル組成物と共に培養された。血清ベースの培地中で６日間の増殖後、細胞は回収され、ケラトカン、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）及びビグリカンの遺伝子発現を解析した。これらの遺伝子の発現は、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して培養した角膜実質細胞から全ＲＮＡを分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｃＤＮＡへ逆転写し、それからＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でリアルタイムＰＣＲ反応を使用してｃＤＮＡを試験することにより解析した。図６に示されるように、対照と比較した時、細胞を高温で脱水したビトリゲル組成物で増殖した時、ケラトカン及びＡＬＤＨの遺伝子発現は大いに増加した。低温と高温との両方で対照と比較した時、ビグリカンの発現はビトリゲル組成物において減少した。

実施例６
本発明のビトリゲル組成物は、生理活性物質を送達するために使用されうる。ビトリゲル組成物は上述のように調製され、ビトリゲルを水和した後市販の点眼薬製剤の０．１％インドメタシンエタノール溶液を２滴使用して１０分間又は１ｍＬの点眼薬に浸漬させて一晩のいずれかでこの組成物に添加し、ＨＰＬＣを用いて遊離速度式を試験した。ビトリゲル組成物が５時間を超えて、ビトリゲル組成物からインドメタシンを遊離することが見出された。

角膜再生のための最適化した光学的及び機械的特性を備えた本発明のＩ型コラーゲン−ＣＤ組成物が、開発された。いかなる特定の理論に限定されるものではないが、これらの特性はおそらくシクロデキストリンが組み込まれたコラーゲン組成物における制御されたコラーゲン線維形成に起因する（図７）。これらの本発明の組成物は、角膜修復及び角膜治療のための治療的アイパッチとして使用されうる大きな可能性がある。本明細書において開示された組成物及び方法は軟骨組織、皮膚及び血管などの線維形成コラーゲン由来の他の結合組織の再生にも有用である可能性がある。

本明細書において引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照は、各参考文献が個々にかつ具体的に参照により組み入れられることが示されて、その全体が本明細書に記載されているように同程度に参照により組み込まれる。

本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）使用は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を含めると解釈されるべきである。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、特に断りのない限り開放用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」の意味）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略な方法として機能することを意図するだけであり、各個別の値は本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、いかなる適切な順序で実施されてもよい。本明細書において提供される任意の及び全ての実施例又は例示的文言（「ｓｕｃｈ ａｓ」など）の使用は、単に本発明を容易に理解させることを意図したものであり、特に断らない限り本発明の範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であると主張されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本発明の好ましい実施態様は、発明者に知られている最良の実施態様を含め、本明細書において記載されている。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読めば当業者に明らかになるだろう。発明者は、当業者がこのような変形を適切に利用することを期待し、発明者は本発明が本明細書において具体的に記載されたのとは異なる方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、関連法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および等価物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、それらのすべての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。

Claims (16)

1. 第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルを含む組成物であって、前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含む、組成物。
2. 前記第一構成成分の前記コラーゲンが、１型、２型、３型、及び４型コラーゲンから構成される群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記第二構成成分の前記シクロデキストリンが、α―シクロデキストリン、β―シクロデキストリン、及びγ―シクロデキストリンから構成される群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記組成物がさらに、少なくとも１つの生理活性物質を含む、請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物が使用前に水和される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記組成物が人工角膜としての使用に適した形状に形成される、請求項３に記載の組成物。
7. 前記組成物が５５０ｎｍで９０％を超える光学的透明度を有する、請求項３に記載の組成物。
8. 哺乳類の組織の修復のためのマトリクスとしての請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
9. 前記組成物が水和され、その後外科的に目に移植される、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
10. 第一構成成分と第二構成成分とを有するガラス化マトリクスゲルの製造方法であって、
    前記第一構成成分がコラーゲンを含み、前記第二構成成分がシクロデキストリンを含み、
    ａ）コラーゲン水溶液を得るステップ、
    ｂ）シクロデキストリン水溶液を得るステップ、
    ｃ）前記ａ）の溶液及び前記ｂ）の溶液を混合するステップ、および
    ｄ）前記ｃ）の混合溶液をガラス化するのに十分な時間で脱水するステップ、を含む製造方法。
11. コラーゲン溶液のシクロデキストリン溶液に対する混合比が体積で約１：１である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記コラーゲンが１型コラーゲンである、請求項１０に記載の方法。
13. 前記シクロデキストリンがα―シクロデキストリン、β―シクロデキストリン、及びγ―シクロデキストリンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記シクロデキストリンが１つ又は複数の異なるシクロデキストリンの混合物である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記脱水が、前記ｃ）の溶液を、約５〜４０℃の温度で、約２０〜８０％の相対湿度で、約３日から約２８日の期間乾燥させることを含む、請求項１０に記載の方法。
16. ステップｄ）が、前記ガラス化マトリクスゲルを再水和するステップをさらに含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。

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