JP2017513021A - 子癇前症の早期検出 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2014年3月21日に出願された米国仮出願第61/968,728号および2014年3月24日に出願された米国仮出願第61/969,520号(これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
ANXA2欠乏を通して媒介される子宮内膜脱落膜化抵抗性が、子癇前症の母体における原因を示す
材料および方法
組織収集、hESC単離、および培養
IRB承認がCEIC Ethics Committee of Hospital La Fe、Valencia Spain(コード 2011/0383)によって2011年8月8日に得られ、書面でのインフォームドコンセントは、組織収集の前に各患者からサインされた。重篤な子癇前症(sPE)子宮内膜生検材料(n=13)を、1〜5年間の間に生じた最近の妊娠中にsPEを患ったことがある女性から得た。非子癇前症(非PE)子宮内膜生検材料を、18〜32歳の正常な妊娠をもつ女性から収集した(n=13)。全ての患者は、規則的な月経周期を有し、潜在する子宮内膜病理はなく、生検材料収集前の3ヶ月間の間、ホルモン処置を受けなかった。平均年齢および平均BMIは、2つの群において類似していた。
コンフルエントなhESC単層を、2%FBS、0.1%抗生物質、ならびに2つの異なる脱落膜化プロトコール:i)3日ごとに培地を新しくしながら、9日間、プロゲステロン(P4)(1μM)およびβ−エストラジオール(E2)(30nM);ii)3日間、8−ブロモ−cAMP(cAMP、Sigma)(0.5mM)および酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA、Sigma)(1μM)を含有するDMEM/F12で脱落膜化させた。対照hESCを、脱落膜反応の誘導物質を含まずに、並行して培養した。
hESC細胞を、溶解バッファー(50mM Tris−HCl pH8.0、150mM NaCl、1% IGEPAL CA 360、0.5% Na−DOC、0.1% SDS、および0.5M EDTA)中に溶解した。タンパク質抽出物(25μg/レーン)を、電気泳動により10%SDS−PAGEゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜(Hybond−P(疎水性ポリビニリデンジフルオリド膜)(Amersham Biosciences、NJ、USA)に転写し、5%ミルクおよび0.1% Tweenを含むPBS緩衝食塩水中でブロッキングした。膜を、1/2500ウサギポリクローナル抗ヒトアネキシンII(Abcam、Cambridge、UK)および1/2000マウスモノクローナル抗ヒトβ−アクチン(Santa Cruz、CA、USA)と4℃で終夜、インキュベートし、Santa Cruz(CA、USA)製の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次ヤギ抗ウサギ抗体およびヤギ抗マウスIgG−HRP抗体で調べた。抗体−抗原複合体を、増強ケミルミネッセンスECL Plus試薬(Amersham Biosciences、CT、USA)を使用して検出した。
ホルマリン固定されかつパラフィン包埋された子宮内膜生検材料を、切片にし、Vectabond(Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA)でコーティングされたスライドガラス上にマウントした。脱パラフィンおよび再湿潤化(rehydration)後、切片を、PBSで5分間、3回、すすいだ。免疫組織化学を、LSABペルオキシダーゼキット(Dako、Carpinteria、CA、USA)を使用して、子宮内膜切片上で実施した。非特異的結合を、PBS中5%BSAでブロッキングした。3%BSAを含むPBS中に希釈した1:100ウサギポリクローナル抗ヒトアネキシンII(Abcam、Cambridge、UK)と、室温で1時間、切片をインキュベートした。抗体の非存在下で、陰性対照を、3%BSAを含むPBSとともにインキュベートした。ウサギ起源一次抗体に対して適用される二次抗体は、LSABペルオキシダーゼキット(Dako)に含まれていた。3,30−ジアミノベンジジン(DAB)色素原で、30秒間から1分間の間の時間、染色を達成させた。ヘマトキシリンでの10秒間の対比染色および蒸留水での洗浄後、スライドをentellan(Merck、Darmstadt、Germany)でマウントした。
ANXA2をサイレンスさせるために、ANXA2に対する特異性を有するsiRNAオリゴヌクレオチド(CGGCCUGAGCGUCCAGAAATT、配列番号1)および陰性対照RNA二重鎖を、どちらも3’−AlexaFluor488(Qiagen CA、USA)で修飾して、使用した。hESCにANXA2 siRNA(100nM)またはsiRNA陰性対照(100nM)をトランスフェクションした。全てのトランスフェクション実験を、Lipofectamine 2000(Invitrogen)およびDMEM/F12培地を使用して実施した。その処理と共に、細胞を37℃で6時間、インキュベートし、その後、培地は、新しく、siRNAを含まない新鮮な培地に交換した。
ANXA2阻害、続いて脱落膜誘導物質(AMPcおよびMPA)に供したESC細胞中の遊離単量体アクチン(G−アクチン) 対 線維状アクチン(F−アクチン)の含有量を、G−アクチン/F−アクチンin vivoアッセイキット(Cytoskeleton、CO、USA)を使用して決定した。非脱落膜対照、対照野生型、ANXA2 siRNA、および脱落膜のESC細胞を、F−アクチン安定化バッファー中、37℃でホモジナイズした。その後、細胞溶解産物を、低速度遠心分離(2000rpm)で非破壊細胞を除去した。除去後の溶解産物を、その後、100000×gで遠心分離して、可溶性G−アクチンを不溶性F−アクチンから分離した。その後、諸画分を、ポリアクリルアミドゲル上に比例させてロードし、電気泳動SDS−PAGEにより分離し、1/500抗アクチン抗体(Cytoskeleton、CO、USA)でプローブするためにニトロセルロース膜に転写した。ウェスタンブロットの濃度測定定量化により、総アクチンで正規化された、サイトゾル中に見出されるG−アクチン 対 細胞骨格に組み入れられたF−アクチンの比が決定された。
hESC細胞をカバーガラス上に播種し、コンフルエンスまで増殖させ、脱落膜化させ、続いて、ANXA2 siRNA処理(6時間)を行った。96時間後、各カバーガラスを滅菌ピペットチップで引っ掻き、PBSで洗浄し、新鮮な培地に置いた。創傷幅を、位相差顕微鏡により、すぐに、および24時間後に、測定した。創傷閉鎖を、最初の創傷幅のうちの閉鎖区域のパーセンテージとして計算した。示されたデータは、3つの独立した実験から取られた10個の測定値の平均値±SEMを表している。
使用されるプロトコールは、Animal Care and Use Committee of the Valencia University School of Medicineにより、実験動物の保護および使用についてのU.S. National Institutes of Healthガイドラインに従って、承認された。B6C3F1マウス系統を、Charles River Laboratories(Barcelona、Spain)から購入した。週齢6〜8週間の雌マウスを過排卵させ、繁殖用雄とペアで終夜、収容した。妊娠2日目に、卵管から胚を回収し、CCM−30培地(Vitrolife、Lubeck、Germany)中で3日間、培養した。正常な形態を有する発達した胚盤胞だけを、研究に含めた(n=425マウス胚)。
トロホブラスト由来細胞株JEG−3を使用して、トロホブラストの脱落膜hESCを通って浸潤する能力を評価した(参考文献 Hannan 2010年)。浸潤アッセイを、コラーゲンTranswell浸潤キット(Chemicon Int. Billerica、MA)を使用して実施した。対照、対照siRNA、またはANXA2 siRNAとしての5×105個の脱落膜化hESCを、8mmポアサイズのtranswellインサートに入れて、24時間、コンフルエンスまで増殖させた。インサートの上面において、106個のJEG−3細胞をhESC培地中に再懸濁し、JEG−3細胞を48時間、浸潤させた。浸潤を、標準マイクロプレートリーダーを使用してODにより測定した(図4C)。
プラスミノーゲンレベルを、馴化培地において、ELISAキット(Cell Biolabs、CA、USA)により、製造業者の使用説明書に従って評価した。2連のウェルにおける平均吸光度(Δ450nm)を、hESCを含まない培地を有するウェル由来のバックグラウンドを引き算することにより計算した。
MMP2およびMMP9のプロタンパク質型および活性タンパク質型を、市販のELISA分析(RayBiotech、GA、USA)により評価した。これらのアッセイは、96ウェルプレート上にコーティングされたヒトMMP−2およびMMP−9に特異的な抗体を利用している。標準および試料を、ピペットによりウェルへ2連にし、試料中に存在するMMP−2およびMMP−9を、固定化抗体によりウェルに結合させる。ビオチン化抗ヒトMMP−2およびMMP−9ならびにHRP結合体化ストレプトアビジンを加えた。TMB基質溶液を加え、450nmでの吸光度を、標準曲線に外挿した。
全RNAを、Trizol LS試薬(Invitrogen、Barcelona、Spain)を使用して、製造業者の使用説明書に従い、hESC培養物から抽出した。最初に、1μgの全RNAを、Advantage RT−for−PCRキット(Clontech CA、USA)を使用して、製造業者の使用説明書に従い、cDNAへ逆転写した。定量的リアルタイムPCRを、Light Cycler 480システム(Roche)においてSYBR Green(Roche)を使用して実施した。転写産物を、内部対照としてGAPDHを使用して、対応する標準曲線から定量化した。各実験を、3連で試料ごとに3回、実施した。以下のプライマーを使用した:ANXA2(Fw:TGTGCAAGCTCAGCTTGGA、配列番号2、Rv:AGGTGTCTTCAATAGGCCCAA、配列番号3)およびGAPDH(Fw:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC、配列番号4、Rv:GAAGATGGTGATGGGATTTC、配列番号5)。
hESCを、用量反応実験を策定するために、50μg/mLおよび100μg/mLのヘパリン(Sigma、Madrid)の存在下、15分間、30分間、および60分間、単層上で培養した。hESC細胞からの馴化培地を収集して、プラスミノーゲンレベル、プラスミン活性、およびメタロプロテアーゼ産生を分析した。
各実験あたり、少なくとも3つの異なる子宮内膜生検材料を使用し、3連で測定値を取った。平均値±SEMが提示され、nは実験の数を示す。データは、SPSSソフトウェアを用い、t検定を使用して、分析された群間の大域的差について分析した。P≦0.05のp値は、有意とみなされた。(*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001)。
以前の妊娠においてsPEを患った患者におけるin vitro脱落膜化抵抗性
正常な妊娠の過去をもつ対照患者(非PE)(n=13)と比較した、以前の妊娠において重篤なPE(sPE)を患ったことがある女性(n=13)由来のhESCのin vitro脱落膜化を評価した。sPE群において、混合型HELLP症候群、子癇、または子癇に終わったHELLP症候群を発症した2つの連続した以前のsPEを含む異なる型を患った女性からhESCを単離した。sPEおよび非PEの患者は、同等のBMIおよび年齢をもつが、sPEの患者は、より高い収縮期/拡張期血圧、蛋白尿、GOT、GPT、ならびにより低い血小板数およびフィブリノーゲンレベルを有した。脱落膜刺激物質としてのcAMP(0.5μM)+MPA(1μM)で5日間か、またはホルモン誘導物質P4(1μM)+E2(30nM)で9日間のいずれかで脱落膜化したhESCは、類似した結果を示した。したがって、cAMP+MPAプロトコールをこの研究に使用した。興味深いことには、PRLおよびIGFBP−1分泌は、非PE対応物と比較して、sPEから得られたhESCにおいてin vitro脱落膜化が損なわれていたことを実証している(それぞれ、図1Aおよび1B)。hESCにおけるF−アクチン再編成を、in vitro脱落膜化中に調べ、非PEにおいて線維芽細胞表現型から膨大した円形細胞形態への移行を示したが、脱落膜表現型への移行は、sPE患者由来の脱落膜化hESCにおいて存在しなかった(図1C)。
以前の妊娠においてsPEを患った女性 対 非PE患者に由来した全子宮内膜試料におけるANXA2タンパク質存在量を分析した(図2A)。濃度測定分析により、非PE患者(n=6)と比較して、sPE(n=6)由来の子宮内膜におけるANXA2存在量の有意な低下が示された(図2A)。子宮内膜ANXA2局在化を調べた。非PEに対してsPEにおける間質コンパートメントでのより低い染色が観察された(図2B)。次に、sPE患者 対 非PE患者に由来したhESCを単離し、脱落膜化させ、ANXA2タンパク質をウェスタンブロットによって評価した(図2C)。濃度測定分析により、sPE女性において、非PE患者と比較して、ANXA2が、基礎条件下で有意に低下し、脱落膜化したhESCにおいて制御解除されることが実証された(図2C)。この分子をさらに定量化するために、両方の条件において脱落膜化中の細胞内型および分泌型のANXA2を、ELISAを使用して分析した。この分析により、脱落膜化刺激物質の存在下でsPE女性由来のhESCが、対照と比較して、細胞内および細胞外の両方のANXA2において有意な低下および制御解除を受けることが裏付けられる(図2D)。さらに、分泌型は細胞内ANXA2を反映し、これにより、PE患者において脱落膜化抵抗性を予測するために使用することができるバイオマーカーとしてのANXA2の使用が確認される。
以前の研究は、ANXA2が、胚着床の受容能獲得および初期段階の間、ヒト子宮内膜において月経周期を通して制御されることを示している。次に、in vitroでのhESC脱落膜化中のANXA2の制御を調べた。ウェスタンブロット(図3A)および濃度測定分析により評価された細胞内ANXA2は、どちらのプロトコールを使用しても、非脱落膜化hESCに対する脱落膜化hESCにおける細胞内ANXA2の上方制御が裏付けられる(図3A)。その細胞内動力学と並行して、分泌型ANXA2を、hESCの上清においてELISAにより測定した(図3B)。これらの結果は、細胞内および細胞外ANXA2が、in vitro脱落膜化中にhESCにおいて上方制御されることを実証している。
ANXA2阻害により誘導される脱落膜化抵抗性のトロホブラスト拡散および浸潤へのパラクリン作用をさらに理解するために、ANXA2のhESC運動性への関与を分析するために、創傷閉鎖アッセイを実施した。hESCの脱落膜化に続いて、ANXA2 siRNAを、6時間、トランスフェクションし、その後、細胞の単層を引っ掻きによって破壊し、遊走に関してのANXA2阻害の効果を、ビデオ顕微鏡観察により24時間中、追跡した(図4A)。ANXA2 siRNA阻害細胞における創傷閉鎖のパーセンテージは、対照細胞および対照siRNA細胞と比較して、有意に低下した(図4A)。
線維素溶解系は、フィブリン沈着を通してPEの病因および子宮内膜機能不全の素因に結びつけられている。PE女性由来のhESCと比較した、hESC ANXA2阻害の線維素溶解活性への機能的効果を調べた。この目的のために、脱落膜化対照、ANXA2 siRNA、およびPE由来のhESCからの、馴化培地におけるプラスミノーゲンレベルおよびプラスミン活性を分析した。プラスミノーゲンレベルおよびプラスミン活性は、対照siRNA hESCおよび対照脱落膜化hESCと比較して、ANXA2 siRNAおよびsPE由来のhESCにおいて有意に低下した(プラスミノーゲンレベル:それぞれ、229.1±23.1および191.5±36.7pg/mL 対 305.1±23.2および397.1±45.1pg/mL;プラスミン活性:それぞれ、12.7±3.6mMおよび4.2±0.75mM 対 27.5±10.2mMおよび23.1±4.1mM)(図5Aおよび5B)。したがって、線維素溶解系は、脱落膜化hESCにおいてANXA2が阻害されている場合に欠乏し、sPE患者由来のhESCにおいてより高い程度で欠乏している。
ヘパリンは、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)を通して線維素溶解経路に作用し、ヘパリンのANXA2との結合の直接的効果としても記載されている。ヘパリンの線維素溶解への効果を、対照siRNA、ANXA2 siRNA阻害、非PE、およびPEの脱落膜化hESCにおいてプラスミノーゲン存在量およびプラスミン活性を測定する用量反応および時間依存性実験で分析した。100μg/mLでのヘパリンは、ANXA2阻害およびsPEの脱落膜化hESCを含む、調べられた全ての条件において馴化培地へのプラスミノーゲンおよびプラスミンの分泌を有意に増加させた(図5E)。また、ヘパリンのプラスミンへの効果もまた評価し、同じ用量において、ANXA2 siRNAおよびsPE由来のhESCにおけるプラスミン活性の有意な増加を生じた(図5F)。対照、ANXA2 siRNA、およびsPE患者由来のhESCの馴化培地における分泌された細胞外ANXA2レベルをELISAによって測定した。結果により、ヘパリン処理が、培養培地へ分泌されたANXA2タンパク質の有意な増加を誘導することが裏付けられた(図5G)。
PEの考え得る原因として欠損CTB分化は熱心に研究されているが、本研究は、この産科合併症の起源に関与する子宮内膜の母体のパラクリン因子に着目した。疫学研究によって、母系家族における過去のPEが、近親者の女性においてPEを患うリスクの24%〜163%増加と関連することが明らかになっている。しかしながら、父系家族におけるPEエピソードは、所定の患者におけるPEリスクに影響しない。したがって、PEについての遺伝子感受性は、母系と明らかに関連している。
Claims (27)
- 子癇前症を処置するための方法であって、
被験体から得られた試験試料においてアネキシンA2(ANXA2)のレベルを測定することにより、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、
前記試験試料における前記ANXA2のレベルをANXA2の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および
子癇前症を発症するリスクが高いと決定された前記被験体に、有効量のグリコサミノグリカンを投与するステップ
を含む、方法。 - 前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ANXA2の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ANXA2のレベルが、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が妊娠していることがわかっている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が妊娠しようと試みている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 子癇前症を診断するか、または子癇前症の診断を補助するための方法であって、
被験体から得られた試験試料においてアネキシンA2(ANXA2)のレベルを測定するステップ、および
前記試験試料における前記ANXA2のレベルをANXA2の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ
を含む、方法。 - 前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項9に記載の方法。
- 前記試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、および子宮内膜液の試料からなる群より選択される、請求項9〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 対照試料が、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から得られる、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ANXA2のレベルが、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が妊娠していることがわかっている、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が妊娠しようと試みている、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 子癇前症を処置するための方法であって、
現在、子癇前症を有していない被験体の子宮内膜液試料を得るステップであって、前記被験体が妊娠しているか、または前記被験体が妊娠する計画を有する、ステップ、
前記子宮内膜液試料においてANXA2のレベルを決定するアッセイを実施するステップ、
前記子宮内膜液試料中の前記ANXA2のレベルをANXA2の対照レベルと比較して、前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いかどうかを決定するステップ、および
前記被験体が子癇前症を発症するリスクが高いと決定された場合には、有効量のグリコサミノグリカンを前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 前記被験体が子癇前症の病歴をもたない、請求項16に記載の方法。
- 前記ANXA2の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項16〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ANXA2のレベルが、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 子癇前症を処置するための方法であって、
ANXA2の対照レベルと比較して低レベルのANXA2を有し、妊娠する計画を有し、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体を同定するステップ、および
グリコサミノグリカンを、前記被験体において前記ANXA2のレベルを上昇させるのに十分な量で前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 前記ANXA2の対照レベルが、妊娠に成功したことがあり、かつ子癇前症の病歴をもたない被験体から導かれる、請求項21に記載の方法。
- 前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項21〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ANXA2のレベルが、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 子癇前症についてのグリコサミノグリカン治療の効力を評価するための方法であって、
子癇前症を有するか、または子癇前症を発症するリスクが高い被験体を有効量のグリコサミノグリカンで処置するステップ、
グリコサミノグリカンでの前記処置前および前記処置後、前記被験体から得られた試験試料においてアネキシンA2(ANXA2)のレベルを測定するステップであって、処置前の前記レベルに対する処置後の前記ANXA2のレベルの増加が、前記グリコサミノグリカン治療が有効であることを示す、ステップ
を含む、方法。 - 前記グリコサミノグリカンが、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、化学修飾されたヘパリンまたはヘパラン硫酸、低分子量デルマタン硫酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記ANXA2のレベルが、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色からなる群より選択される免疫アッセイを使用して決定される、請求項25〜26のいずれか一項に記載の方法。
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