BR112016021630A2 - Composição para tratar pré-eclampsia, método de uso do nível de anexina a2 (anxa2) como indicador de pré-eclampsia e método para avaliar a eficácia da terapia de glicosaminoglicano para pré-eclampsia - Google Patents

Abstract

detecção inicial de pré-eclampsia. a presente invenção proporciona ensaios não invasivos pa-ra identificar com segurança mulheres que tenham ou estejam predis-postas a desenvolver pré-eclampsia (pe). o método compreende me-dir um nível de anexina a2 (anxa2) em uma amostra de teste obtida de uma paciente; e identificar a paciente como tendo pré-eclampsia ou correndo um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia, quando o nível de anxa2 na amostra de teste estiver diminuído em relação a uma amostra de controle. proporcionam-se também métodos para tra-tar a paciente identificada como tendo pe ou correndo um risco au-mentado de desenvolver pré-eclampsia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO PARA TRATAR PRÉ-ECLAMPSIA, MÉTODO DE USO DO NÍVEL DE ANEXINA A2 (ANXA2) COMO INDICADOR DE PRÉ-ECLAMPSIA E MÉTODO PARA AVALIAR A EFICÁCIA DA TERAPIA DE GLICOSAMINOGLICANO PARA PRÉ-ECLAMPSIA.

PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório U.S. N°de série 61/968.728, depositado em 21 de março de 2014, e do pedido provisório U.S. N°de série 61/969.520, depositado em 24 de março de 2014, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência, na sua totalidade.

CAMPO DE INVENÇÃO [002] A presente invenção em geral se refere aos biomarcadores para a pré-eclampsia, bem como aos métodos para tratar esta doença. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] A pré-eclampsia (PE) é uma causa importante de morbidade e mortalidade materna e fetal, afetando 4%-8% das gravidezes, levando a mais de 8 milhões de casos em todo o mundo por ano. Clinicamente, a pré-eclampsia é definida pela existência de pressão arterial elevada, proteinúria, edema, e, em alguns pacientes, síndrome de HELLP e eclampsia. Esforços extensos têm sido feitos para desenvolver marcadores que possam predizer acuradamente a pré-eclampsia. Os marcadores bioquímicos e as medições com ultrassom Doppler do fluxo sanguíneo nas artérias uterinas maternas foram testados extensivamente, mas nenhum destes, até o momento, alcançou, desse modo, um uso clínico generalizado (Conde-Agudelo e col., Obstet Gerneral 2004; 104:1367-91). Permanece uma necessidade de desenvolver marcadores confiáveis e clinicamente úteis para predizer a préeclampsia. Ser capaz de identificar mulheres grávidas correndo o risco de desenvolver a pré-eclampsia podería permitir o uso de agentes

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Petição 870180021648, de 19/03/2018, pág. 8/15

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Petição 870180021648, de 19/03/2018, pág. 9/15

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] A presente invenção proporciona ensaios não invasivos para identificar com segurança as mulheres que estão predispostas a desenvolver a PE. Isto permite a intervenção inicial com a terapia adequada para prevenir ou atenuar a PE. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que os níveis de anexina A2 (ANXA2) endometrial estão diminuídos em mulheres que tiveram préeclampsia (PE) nas suas gravidezes anteriores, em comparação com os níveis em mulheres que tiveram gravidezes normais (saudáveis) [005] De acordo com algum aspecto da invenção, um método para tratar a pré-eclampsia é proporcionado. O método compreende determinar se uma paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia pela medição de um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida da paciente, comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver préeclampsia; e administrar à paciente determinada correr um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano.

[006] Em algumas modalidades, a paciente não tem nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste em uma amostra de tecido do endométrio, células estromais endometriais e fluido endometrial. Em algumas modalidades, o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tiveram uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 é

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3/44 determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imunohistoquímica. Em algumas modalidades, sabe-se que a paciente está grávida. Em algumas modalidades, a paciente está tentando engravidar.

[007] Alguns aspectos da invenção proporcionam um método para diagnosticar a pré-eclampsia ou auxiliar na diagnose de préeclampsia. O método compreende medir um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida de uma paciente; e comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia.

[008] Em algumas modalidades, a paciente não tem nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, a amostra é selecionada a partir o grupo que consiste em uma amostra de tecido do endométrio, células estromais endometriais e fluido endometrial. Em algumas modalidades, a amostra de controle é obtida de pacientes que tiveram uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de préeclampsia. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica. Em algumas modalidades, sabe-se que a paciente está grávida. Em algumas modalidades, sabe-se que a paciente está grávida.

[009] Alguns aspectos da invenção proporcionam um método para tratar a pré-eclampsia. O método compreende obter uma amostra de fluido endometrial de uma paciente que atualmente não têm préeclampsia, em que a paciente está grávida ou em que a paciente tem planos de tornar-se grávida; efetuar um ensaio para determinar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial; comparar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial com um nível de controle de

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ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia; e administrar à paciente uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano, se a paciente for determinada correr um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia.

[0010] Em algumas modalidades, a paciente não tem nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tiveram uma gravidez bemsucedida e nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.

[0011] Alguns aspectos da invenção proporcionam um método para tratar a pré-eclampsia. O método compreende identificar uma paciente que tenha baixos níveis de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, tenha planos de engravidar e não tenha história de pré-eclampsia; e administrar à paciente um glicosaminoglicano em quantidade suficiente para aumentar o nível de ANXA2 na paciente.

[0012] Em algumas modalidades, o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tiveram uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia. Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado

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5/44 a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.

[0013] Alguns aspectos da invenção proporcionam um método para avaliar a eficácia da terapia de glicosaminoglicano para préeclampsia. O método compreende tratar uma paciente que tenha ou corra um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia com uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano; medir os níveis de anexina A2 (ANXA2) em amostras de teste obtidas da paciente, antes e após o tratamento com glicosaminoglicano, em que um aumento no nível de ANXA2 após o tratamento em relação ao nível antes do tratamento indica que a terapia de glicosaminoglicano é efetiva.

[0014] Em algumas modalidades, o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.

[0015] Cada uma das limitações da invenção pode abranger várias modalidades da invenção. Antecipa-se, portanto, que cada uma das limitações da invenção que envolve qualquer um elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção. Esta invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes apresentados na descrição que segue ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou de ser realizada em vários modos. Também, a fraseologia e a terminologia usadas neste documento são para o propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitantes. Pretende-se que o uso de incluindo, compreendendo ou tendo, contendo, envolvendo, e suas variações, neste documento,

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6/44 abranja os itens listados em seguida e os seus equivalentes, assim como os itens adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0016] A Figura 1 mostra a decidualização de hESC in vitro em pacientes que sofreram sPE em gravidezes anteriores. As Figuras. 1A e 1B mostram as secreções de Prolactina e IGFBP-1, medidas por ELISA, sobre a hESC decidual vs. não decidual de mulheres que sofreram pré-eclampsia grave (sPE) em suas gravidezes anteriores (n = 13) e pacientes de controle (sem PE) (n = 13). As secreções de Prolactina e IGFBP-1 foram apresentadas como ng/ml (média ± dp) em não decidual (barra preta) e decidualizada (barra cinza) e os valores do meio foram esquematizados no gráfico. A Figura 1B mostra as secreções de IGFBP-1 medidas por ELISA. A Figura 1C mostra a remodelação de F-actina quando a decidualização in vitro foi induzida sobre a hESC de sPE e sem PE, comparada com as hESCs não deciduais. *, P <0,05; **, P <0,005 [0017] A Figura 2 mostra as análises por imuno-histoquímica e western blot da ANXA2 em sPE. A Figura 2A mostra as proteínas celulares totais extraídas a partir de biopsias de endométrios com préeclampsia grave (sPE), que foram submetidas à SDS-PAGE e imunomanchadas com o anticorpo para ANXA2 e a proteína de manutenção (housekeeping), β-actina. As análises densitométricas de ANXA2 foram realizadas a partir de 3 experimentos diferentes e normalizadas com GAPDH. A Figura 2B mostra o perfil de coloração do teor de ANXA2 observado no tecido do endométrio sem PE e de sPE. A Figura 2C mostra o western blot de ANXA2 e a análise densitométrica do extrato de proteína celular total obtido a partir de endométrio decidualizado e não decidualizado de hESC de pacientes com sPE e sem PE. A Figura 2D mostra a análise de ANXA2 intracelular e extracelular de extrato de proteína e hESCs de meios condicionados, respectivamen

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7/44 te. A proteína ANXA2 foi medida por ELISA e expressa como ng/ml (média ± dp) a partir de três experimentos diferentes. *, P <0,05; **, P <0,005 [0018] A Figura 3 mostra o efeito da inibição de ANXA2 sobre a decidualização in vitro. A Figura 3A mostra o western blot de ANXA2 e a análise densitométrica de hESC decidual por dois sistemas: P4+E2 e cAMP+MPA em comparação com hESC não tratada. A Figura 3B mostra o nível de ANXA2 extracelular sobre meios condicionados de hESC decidualizada e não tratada, medido por ELISA, em três experimentos diferentes. Os níveis de mRNA (Figura 3C) e de proteína ANXA2 (Figura 3D) de células de controle (não transfectadas), células transfectadas com uma sequência de embaralhamento (scramble) (siRNA de controle), ou células transfectadas com um siRNA específico para ANXA2 (siRNA para ANXA2) foram avaliados por RT-PCR e análise de western blot. As Figuras 3E e 3F mostram os níveis de PRL e IGFBP-1 medidos por ELISA sobre meios condicionados de controles e hESC de siRNA para ANXA2 inibido. A Figura 3G mostra a arquitetura de F-actina no controle, siRNA de controle e hESCs de ANXA2 inibida, visualizada por um corante de rodamina faloidina. A Figura 3H mostra as frações de G-actina (solúvel), F-actina (filamentosa), e actina total analisadas por um ensaio in vivo, e os resultados foram observados por análise de western blot nas hESCs de ANXA2 inibida e de controle. A análise densitométrica foi realizada a partir de 3 experimentos diferentes, expressa como a razão de actinas G/F, e normalizada com actina total.

[0019] A Figura 4 mostra a análise de motilidade, espalhamento e invasão de trofoblastos de hESCs de ANXA2 inibida. A Figura 4A mostra um ensaio da cicatrização sobre os controles e as hESCs de ANXA2 inibida. A largura da ferida foi medida em 0 e 24 h após o ferimento. A porcentagem de fechamento da ferida foi determinada por

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8/44 uma análise da imagem. Os valores são as médias de 10 medições a partir de 3 experimentos diferentes. A Figura 4B mostra as hESCs transfectadas com siRNA para ANXA2 e depois cocultivadas com blastocisto de camundongo até que a fixação do embrião ocorresse. Após 48 h, as hESCs foram imunotingidas com vimentina e as células de trofoblasto de camundongo com a E-caderina. O espalhamento dos blastocistos de camundongo sobre as hESCs foi circundado com uma linha branca e a área foi medida em pixels. A Figura 4C mostra uma representação esquemática do ensaio de invasão transwell de colágeno, usado para medir o efeito da invasão de células de trofoblasto humanas JEG-3 sobre as hESCs de ANXA2 inibida. Os histogramas mostram a porcentagem das células invasoras JEG-3, com a invasão das células de controle designadas como 100%. Os dados representam a média de três experimentos independentes. *, P <0,05; **, P <0,005 [0020] A Figura 5 mostra a atividade fibrinolítica sobre as hESCs de ANXA2 inibida e as hESCs de sPE. A Figura 5A mostra o nível de plasminogênio sobre os meios condicionados de hESC de ANXA2 inibida e hESC de pacientes com sPE, avaliado por ELISA, em três experimentos diferentes, e expresso como valores médios pg/mL. A Figura 5B mostra a atividade da plasmina presente com os meios condicionados de hESC, avaliada por ensaio funcional fluorométrico e expressa como concentração em mM de plasmina ativa. Os níveis das proteínas MMP2 (Figura 5C) e MMP9 (Figura 5D) foram avaliados sobre os meios condicionados de hESCs de ANXA2 inibida e hESCs de sPE, por ELISA, em três experimentos diferentes. A Figura 5E mostra o controle, o siRNA de controle, o siRNA para ANXA2 e as hESCs de sPE tratados com 50 ou 100 μg/mL de heparina e analisados quanto ao nível de plasminogênio durante os intervalos de 0, 15, 30 e 60 minutos e também sem tratamento. A Figura 5E mostra a atividade da

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9/44 plasmina medida sobre os meios condicionados de hESCs de ANXA2 inibida e hESCs de sPE, tratadas com ou sem 100 mg/mL de heparina. A Figura 5F mostra a proteína ANXA2 secretada sobre os meios condicionados de hESC tratada com dose de heparina. Os níveis de MMP2 (Figura 5H) e MMP9 (Figura 5G) foram avaliados por ELISA sobre os meios condicionados de hESCs tratadas com heparina.

[0021] A Figura 6 mostra um modelo que integra a resistência à decidualização de hESC presente na sPE, mediada, pelo menos em parte, pela deficiência de ANXA2, com invasão trofoblástica superficial e alterações fibrinolíticas como uma causa materna de PE.

[0022] A Figura 7 mostra um estudo dos níveis ANXA2 no fluido endometrial.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0023] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta que os níveis de anexina A2 (ANXA2) endometrial estão diminuídos em mulheres que tiveram pré-eclampsia (PE) nas suas gravidezes anteriores, em comparação com os níveis em mulheres que tiveram gravidezes normais. Os métodos da invenção proporcionam ensaios não invasivos para identificar com segurança mulheres que estejam predispostas a desenvolver PE. Assim, a presente invenção permite a detecção inicial de uma predisposição a desenvolver a PE, antes dos sintomas desenvolverem-se, com isso permitindo que uma terapia adequada seja iniciada em tempo hábil. Outra vantagem da presente invenção é que as mulheres que tenham sido determinadas correrem um risco aumentado por pré-eclampsia podem ser tratadas com agentes que aumentam os níveis de ANXA2, de modo a prevenir ou atenuar a pré-eclampsia.

[0024] A pré-eclampsia (PE) é uma condição caracterizada por pressão sanguínea alta (pressão sanguínea sistólica > 140 mm de Hg e/ou pressão sanguínea diastólica > 90 mm de Hg) que ocorre após 20

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10/44 semanas de gravidez em mulheres com pressão sanguínea previamente normal. Além disso, há um nível aumentado de proteínas na urina em comparação com o normal. A proteinúria aumentada é definida como > 300 mg em uma coleta de urina de 24 horas (The National High Blood Pressure Education Program Working Group Report on High Blood Pressure in Pregnancy. Am J Obstet General 2000; 183:S1 -S22). Juntamente com a pressão sanguínea elevada, podem estar associados sinais e sintomas, tais como a dor de cabeça, a dor abdominal, os problemas de sangramento, a convulsão e as complicações, tais como o crescimento fetal insatisfatório, o parto prematuro e até a morte do feto ou da mãe. A frequência é 5-8% de todas as gravidezes, mas pode ser muito maior em certos grupos, por exemplo, mulheres carregando gêmeos.

[0025] De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método para tratar a pré-eclampsia. O método compreende determinar se uma paciente tem ou corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia pela medição de um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida da paciente, comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente tem ou corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia; e administrar à paciente determinada correr um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia uma quantidade efetiva de um agente que se sabe aumenta os níveis de ANXA2.

[0026] Em algumas modalidades, o método compreende determinar se uma paciente corre um risco aumentado de desenvolver préeclampsia pela medição de um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida da paciente, comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver préeclampsia; e administrar à paciente determinada correr um risco au

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11/44 mentado de desenvolver pré-eclampsia uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano.

[0027] De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método para diagnosticar a pré-eclampsia ou auxiliar na diagnose de pré-eclampsia. O método compreende medir um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida de uma paciente; comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia.

[0028] De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método para tratar a pré-eclampsia. O método compreende obter uma amostra de fluido endometrial de uma paciente que presentemente não tenha pré-eclampsia, onde a paciente está grávida ou onde a paciente tem planos de tornar-se grávida; efetuar um ensaio para determinar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial; comparar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia; e administrar à paciente uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano, se a paciente for determinada correr um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia.

[0029] De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método para tratar a pré-eclampsia. O método compreende identificar uma paciente que tenha baixos níveis de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, planeje engravidar e não tenha nenhuma história de pré-eclampsia; e administrar à paciente um glicosaminoglicano em uma quantidade suficiente para aumentar o nível de ANXA2 na paciente.

[0030] De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método para avaliar a eficácia da terapia de glicosaminoglicano para a pré-eclampsia. O método compreende tratar uma paciente que

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12/44 tenha ou corra um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia com uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano; medir os níveis de anexina A2 (ANXA2) em amostras de teste obtidas da paciente antes e após o tratamento com glicosaminoglicano, em que um aumento no nível de ANXA2 após o tratamento em relação ao nível antes do tratamento indica que a terapia de glicosaminoglicano é efetiva.

[0031] Como usado neste documento, uma paciente inclui todos os mamíferos, incluindo, mas não limitado às, cadelas, gatas, éguas, ovelhas, cabras, vacas, porcas, seres humanos e primatas não humanos. Em algumas modalidades, a paciente é uma mulher. Como usado neste documento, uma paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia inclui uma paciente que tenha uma maior probabilidade de desenvolver pré-eclampsia, quando comparada com uma representante média da população. Em algumas modalidades, sabese que a paciente está grávida. Em algumas modalidades, a paciente está tentando engravidar. A paciente pode não ter tido nenhuma gravidez anterior, ter tido uma ou mais gravidezes anteriores normais ou ter sofrido PE em uma gravidez anterior. Em algumas modalidades, a paciente tem um ou mais fatores de risco para a pré-eclampsia. Por exemplo, a paciente pode ter um ou qualquer combinação dos que seguem: a paciente está grávida de mais de um bebê, tem uma história de pressão sanguínea alta crônica, diabetes, doença renal ou transplante de órgão, está grávida pela primeira vez, é obesa, particularmente com índice de Massa Corporal (IMG) de 30 ou maior, está acima da idade de 40 anos ou abaixo da idade de 18 anos, tem uma história familiar de pré-eclampsia (isto é, uma mãe, irmã, avó ou tia teve o distúrbio), tem síndrome do ovário policístico, tem Lúpus ou outros distúrbios autoimunes, incluindo artrite reumatoide, sarcoidose e esclerose múltipla, teve fertilização in vitro ou tem a doença das células falciformes.

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13/44 [0032] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem identificar uma paciente que tenha níveis baixos de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, planeje engravidar e não tenha nenhuma história de préeclampsia. Conforme usado neste documento, identificar uma paciente que tenha baixos níveis de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, planeje engravidar e não tenha nenhuma história de pré-eclampsia significa selecionar uma paciente que tenha baixos níveis de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, tenha planos de engravidar e não tenha nenhuma história de pré-eclampsia. A paciente assim identificada ou selecionada é tratada para a PE por administração à paciente de um glicosaminoglicano em uma quantidade suficiente para aumentar o nível de ANXA2 na paciente.

[0033] O termo amostra de teste refere-se a uma amostra derivada de uma paciente sendo avaliada usando um método da invenção, por exemplo, uma paciente que esteja grávida ou tentando engravidar. Os exemplos não limitativos da amostra incluem o tecido do endométrio, as células estromais endometriais e o fluido endometrial. Obter uma amostra de uma paciente significa tomar posse de uma amostra da paciente. Obter uma amostra de uma paciente significa remover uma amostra da paciente. Portanto, a pessoa que obtém uma amostra de uma paciente e mede um nível de ANXA2 na amostra não necessariamente obtém a amostra da paciente. Em algumas modalidades, a amostra pode ser removida da paciente por um profissional de medicina (por exemplo, um médico, enfermeira ou um profissional de laboratório clínico) e em seguida fornecida para a pessoa que mede um nível de ANXA2. A amostra pode ser fornecida para a pessoa que mede um nível de ANXA2 pela paciente ou por um profissional de medicina (por exemplo, um médico, enfermeira ou um profissional de laboratório clí

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14/44 nico). Em algumas modalidades, a pessoa que mede um nível de ANXA2 obtém uma amostra da paciente pela remoção da amostra da paciente.

[0034] A Anexina A2 (ANXA2) é uma proteína de ligação ao fosfolipídio regulada pelo cálcio que é significativamente suprarregulada durante as fases secretórias médias e posteriores do endométrio humano. Esta proteína é chave para a aquisição do fenótipo receptivo pelo epitélio endometrial pela modulação da rede de F-actina. A ANXA2 é um receptor pró-fibrinolítico, presente e funcional sobre as células estromais endometriais humanas (hESCs). Ela atua como um correceptor da superfície celular para o plasminogênio e o seu ativador tPA, significativamente aumentando a geração de plasmina na superfície da célula. Conforme usado neste documento, o termo Anexina A2 refere-se a qualquer isoforma de Anexina A2 conhecida. Sem estar assim limitado, ela inclui as sequências de ácidos nucleicos NM_001002858.2, NM_001136015.2, NM_004039.2, e

NM_001002857.1 e as sequências de proteínas NP_001002858.1, NP-001129487.1, NP_004030.1 e NP_001002857.1. Outro ácido nucleico de Anexina A2 e polipeptídeos codificados conhecidos estão descritos no WO 2009/143633 (incorporado por referência neste documento).

[0035] Os métodos divulgados neste documento tipicamente compreendem medir um nível de ANXA2 em uma amostra ou efetuar um ensaio para determinar o nível de ANXA2. Os níveis de ANXA2 podem, em geral, ser detectados por detecção do mRNA a partir das células e/ou por detecção dos produtos de expressão, tais como os polipeptídios e as proteínas. A expressão dos transcritos e/ou das proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos pode ser medida por quaisquer de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos para medir o nível das proteínas ANXA2 incluem, mas não

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15/44 estão limitados ao, ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), Western blot, análise imuno-histoquímica, radioimunoensaio (RIA), espectrometria de massa, microarranjo, e microscopia. Os métodos para detectar as sequências de ácidos nucleicos da ANXA2 incluem, mas não estão limitados à, reação em cadeia por polimerase (PCR), transcriptase reversa-PCR (RT-PCR), PCR in situ, PCR quantitativa (q-PCR), hibridização in situ, Southern blot, Northern blot, análise da sequência, análise do microarranjo, detecção de um gene relator, ou outras plataformas de hibridização de DNA/RNA.

[0036] Os métodos divulgados neste documento tipicamente compreendem comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2, para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia. Em algumas modalidades, o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tiveram uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de préeclampsia. Em tais casos, quando o nível de controle de ANXA2 for derivado de pacientes que tiveram uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia, um nível de ANXA2 na amostra de teste menor do que o nível de controle é indicativo que a paciente tem ou corre um risco aumentado de desenvolver a pré-eclampsia. Em algumas modalidades, sabe-se que o nível de controle é preditivo do desenvolvimento de PE e, em tais casos, um nível de ANXA2 na amostra de teste que corresponda ao nível de controle indica que a paciente tem ou corre um risco aumentado de desenvolver préeclampsia. Assim, em vez de determinar se um nível de teste é estatisticamente menor do que um nível de controle, poder-se-ia determinar se o nível de teste está dentro de uma faixa que se sabe ser preditiva de desenvolver a PE. O nível de controle pode ser um número fixo, por exemplo, em unidades de ANXA2 por ml de fluido endometrial. O nível de controle pode ser uma faixa. O nível de controle pode ser um nível

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16/44 comparativo medido em uma amostra de controle, o nível sendo medido simultaneamente com o ensaio do nível de teste. O nível de controle pode ser expresso como uma média com um desvio padrão. Não se pretende que a invenção esteja limitada pela metodologia particular pela qual uma amostra de teste é determinada ser estatisticamente menor do que, ou corresponde a, um controle.

[0037] Em algumas modalidades, os níveis de ANXA2 são medidos em qualquer fase por todo o ciclo menstruai. Em algumas modalidades, os níveis de ANXA2 são medidos durante a fase lútea do ciclo menstruai. Em algumas modalidades, os níveis de ANXA2 são medidos durante a fase lútea média (dias 18-24) do ciclo menstruai. Em algumas modalidades, o nível de fluido endometrial de controle de ANXA2 médio, medido em pacientes normais (isto é, pacientes que tenham tido uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de préeclampsia) na fase lútea média (dias 18-24) do ciclo menstruai, é 32 pg/ml (média ± 4), enquanto o nível de ANXA2 na fase lútea média em pacientes predispostas à PE é significativamente reduzido em comparação com este nível de controle. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 em pacientes predispostas à PE é 2, 3, 4, ou 5 desvios padrões menores do que este nível de ANXA2 de controle médio. Em algumas modalidades, o nível de ANXA2 na fase lútea média em pacientes predispostas à PE é menos do que 5, menos do que 10, menos do que 15, menos do que 20, ou menos do que 25 pg/ml.

[0038] Em algumas modalidades, uma diminuição no nível de ANXA2 na amostra de teste em relação a uma amostra de controle é indicativa que a paciente tem ou corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia. Por expressão reduzida, pretende-se que a expressão de ANXA2 na amostra de teste tenha uma diminuição estatisticamente significativa daquela na amostra de controle. Por exemplo, uma diminuição significativa pode ser detectada quando o nível de ex

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17/44 pressão de ANXA2 na amostra de teste for de pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 250%, pelo menos 500%, ou pelo menos 1000% menor, do que aquele na amostra de controle. De forma similar, uma diminuição significativa pode ser detectada quando o nível de expressão de ANXA2 na amostra de teste for pelo menos duas vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, ou mais, menor do que aquele de uma amostra de controle. Diferenças significativas podem ser identificadas usando um teste estatístico apropriado. Os testes para a significância estatística são bem conhecidos na técnica e são exemplificados em Applied Statistics for Engineers and Scientists por Petruccelli, Chen e Nandram 1999 Reprint Ed.

[0039] Em algumas modalidades, um relatório resumindo os resultados da análise, isto é, se a paciente tem ou está predisposta a ter PE e qualquer outra informação que diga respeito à análise, podería ser opcionalmente gerado como parte da análise (que pode ser referido de modo permutável neste documento como proporcionando um relatório, produzindo um relatório, ou gerando um relatório). Por exemplo, as medições da pressão sanguínea, e/ou do teor de proteína na urina podem ser determinadas, e estas podem ser incluídas no relatório. Os exemplos de relatórios podem incluir, mas não estão limitados aos, relatórios em papel (tais como as impressões de resultados de teste geradas por computador) ou formatos equivalentes e relatórios armazenados em meio legível por computador (tal como um CD, disco rígido do computador, ou um servidor de rede de computadores , etc.). Os relatórios, particularmente aqueles armazenados no meio legível

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18/44 por computador, podem ser parte de um banco de dados (tal como um banco de dados de registros de pacientes, que pode ser um banco de dados seguro que tem características de segurança que limitam o acesso ao relatório, tal como para permitir que somente a paciente e os profissionais de medicina da paciente vejam o relatório, por exemplo). Além de, ou como uma alternativa para, gerar um relatório tangível, os relatórios também podem ser exibidos sobre uma tela do computador (ou a exibição em outro dispositivo ou instrumento eletrônico).

[0040] Um relatório pode adicionalmente ser transmitido, comunicado ou divulgado (estes termos podem ser usados neste documento, de modo intercambiável), tal como para a pessoa que foi testada, um profissional da medicina (por exemplo, um médico, enfermeira, um profissional de laboratório clínico, conselheiro genético, etc.), uma organização de saúde, um laboratório clínico, e/ou qualquer outro interessado que pretenda visualizar ou possuir o relatório. O ato de transmitir ou comunicar um relatório pode ser por qualquer meio conhecido na técnica, com base na forma do relatório, e inclui a transmissão tanto oral quanto não oral. Além disso, a transmissão ou a comunicação de um relatório pode incluir a entrega de um relatório (envio) e/ou a recuperação (obtenção) de um relatório. Por exemplo, os relatórios não orais podem ser transmitidos/comunicados por meios tais como sendo transferidos fisicamente entre os interessados (tal como para os relatórios em formato de papel), tal como sendo fisicamente entregues de um interessado para outro, ou sendo transmitidos eletronicamente ou na forma de sinal (por exemplo, por meio de correio eletrônico, ou através da internet, por fac-símile, e/ou por quaisquer métodos de comunicação com ou sem fios conhecidos na técnica), tal como sendo obtidos a partir de um banco de dados armazenado em um servidor de rede de computador, etc.

[0041] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do

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19/44 cumento compreendem tratar as pacientes que são identificados como tendo ou estando predispostas a desenvolver pré-eclampsia com uma quantidade efetiva de um agente que se sabe aumenta os níveis de ANXA2 de modo a impedir ou atenuar a pré-eclampsia. Os agentes que se sabe aumentam os níveis ANXA2 incluem, mas não estão limitados a, um glicosaminoglicano. Os exemplos de um glicosaminoglicano incluem, mas não estão limitados à, heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas. Os exemplos adicionais de glicosaminoglicanos para o tratamento para a pré-eclampsia estão descritos na EP 1016410, incorporada neste documento por referência.

[0042] Como usado neste documento, o termo tratar significa reduzir ou atenuar o risco de uma paciente desenvolver PE. Uma redução no risco de uma paciente desenvolver PE pode ser evidente como um aumento nos níveis de ANXA2 em comparação com os níveis ANXA2 obtidos antes do tratamento ou em comparação com os níveis de ANXA2 normais de controle (isto é, níveis de ANXA2 da paciente que teve gravidezes anteriores normais e nenhuma história de PE). Em algumas modalidades, o termo tratar significa reduzir ou atenuar a PE por uma quantidade ou grau detectável. O termo tratar, como usado neste documento, refere-se ao tratamento tanto completo quanto parcial. Por exemplo, o tratamento da PE pode ser evidente como uma redução nos níveis de proteína na urina e/ou uma diminuição nos níveis de pressão sanguínea em comparação com os níveis de pressão sanguínea obtidos antes do tratamento ou em comparação com os níveis de pressão sanguínea normais de controle.

[0043] Uma quantidade efetiva de um glicosaminoglicano referese a uma quantidade suficiente para provocar a resposta biológica desejada, isto é, tratar a pré-eclampsia. Como será apreciado por aque

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20/44 les de habilidade comum na técnica, a quantidade efetiva de glicosaminoglicano pode variar dependendo de tais fatores como o ponto final biológico desejado, a farmacocinética do composto, a condição que está sendo tratada, o modo de administração, e a idade e a saúde da paciente. Uma quantidade efetiva inclui, mas não está limitada àquela quantidade necessária para retardar, reduzir, inibir, atenuar ou reverter um ou mais sintomas associados com a PE. No tratamento de PE, tal quantidade pode referir-se a uma quantidade suficiente para diminuir os níveis de pressão sanguínea em comparação com os níveis de pressão sanguínea obtidos antes do tratamento, ou em comparação com os níveis de pressão sanguínea normais de controle. Em algumas modalidades, uma quantidade efetiva pode referir-se a uma quantidade suficiente para causar uma redução nos níveis de proteína na urina. Em algumas modalidades, uma quantidade efetiva pode referir-se a uma quantidade suficiente para reduzir o risco de uma paciente desenvolver PE. Tal quantidade pode referir-se a uma quantidade suficiente para aumentar/elevar os níveis de ANXA2 em comparação com os níveis de ANXA2 obtidos antes do tratamento, ou em comparação com os níveis de ANXA2 normais de controle (isto é, os níveis de ANXA2 de pacientes que tenham tido uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia). Em algumas modalidades, a quantidade é suficiente para restabelecer os níveis de ANXA2 normais de controle na paciente tratada.

[0044] Uma quantidade efetiva de um composto pode variar de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1000 mg/kg em uma ou mais administrações de doses, por um ou vários dias (dependendo do modo de administração). Em certas modalidades, a quantidade efetiva varia de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1000 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 750 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 250 mg/kg, e de cerca de 10,0

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21/44 mg/kg a cerca de 150 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade efetiva é 1000, 2000, 3000, 40000, 5000, 6000, ou 7000 IU de glicosaminoglicano. Em algumas modalidades, a quantidade efetiva é 5000 IU de glicosaminoglicano (por exemplo, heparina de baixo peso molecular). O glicosaminoglicano pode ser administrado através de qualquer rota de administração adequada. Por exemplo, o glicosaminoglicano pode ser administrado por meio de rotas subcutâneas, intravenosas, intraperitoneais, ou intramusculares.

[0045] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem medir os níveis de anexina A2 (ANXA2) em amostras de teste obtidas da paciente antes e após o tratamento com glicosaminoglicano. Espera-se que uma terapia efetiva aumente o nível de ANXA2 após o tratamento em relação ao nível antes do tratamento. Assim, uma terapia efetiva é indicada por um aumento no nível de ANXA2 após o tratamento.

[0046] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos Exemplos a seguir, os quais, de modo algum, devem ser interpretados como limitação adicional. Os conteúdos completos de todas as referências (incluindo as referências de literatura, as patentes expedidas, os pedidos de patente publicados, e os pedidos de patente copendentes) citadas por todo este pedido são, pelo presente, expressamente incorporados por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: A resistência à decidualização endometrial mediada através de deficiência de ANXA2 revela uma causa materna de pré-eclampsia

Materiais e Métodos

Coleta de tecido, isolamento da hESC, e cultura [0047] A aprovação pelo IRB foi obtida em 08/08/2011 pelo CEIO Ethics Committee of Hospital La Fe, Valencia, Espanha (código

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2011/0383) e o consentimento por escrito informado foi assinado a partir de cada paciente, antes da coleta de tecido. As biopsias endometriais de Pré-eclampsia grave (sPE) (n=13) foram obtidas de mulheres que sofreram sPE durante a sua última gravidez, que ocorreu entre a 5 anos. As biopsias endometriais Sem Pré-eclampsia (Sem PE) foram coletadas de mulheres com gravidezes normais, com idade de 18-32 anos (n=13). Todas as pacientes tinham ciclos menstruais regulares, sem nenhuma patologia endometrial básica, e não receberam tratamento hormonal nos 3 meses que precederam a coleta da biopsia. A idade média e o IMG médio eram semelhantes nos dois grupos.

[0048] A biopsia endometrial foi obtida usando pipelle (Genetics, Bélgica), sob condições estéreis. As amostras foram processadas e o compartimento estremai isolado por digestão branda com colagenase, conforme anteriormente descrito (41). As culturas de células estremais endometriais humanas (hESCs) foram desenvolvidas usando um meio composto de meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM)/F12 (Sigma, Madri, Espanha) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) removido com carvão vegetal e 0,1% de antibióticos. As hESCs para os diferentes ensaios foram cultivadas em placas até confluência, por ou 4 dias.

Protocolos de decidualizacão in vitro [0049] As monocamadas de hESCs confluentes foram decidualizadas com DMEM/F12 contendo 2% de FBS, 0,1% de antibióticos e dois diferentes protocolos de decidualização: i) progesterone (P4) (1 μΜ) e β-estradiol (E2) (30 nM) durante 9 dias, renovando o meio a cada 3 dias; ii) 8-bromo-cAMP (cAMP, Sigma) (0,5 mM) e Acetate de Medróxi-Progesterona (MPA, Sigma) (1 μΜ) durante 3 dias. As hESCs de controle foram cultivadas em paralelo, sem indutores da reação decidual.

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23/44 [0050] O fenótipo decidual característico foi confirmado bioquimicamente pela análise dos níveis das proteínas PRL (Abnova) e IGFBP1 (Raybiotech) no meio de cultura condicionado por ELISA, e morfologicamente por coloração com F-actina. As hESCs foram cultivadas em placas plásticas até 30-40% de confluência. Para minimizar os efeitos do mascaramento do epítopo, as células foram fixadas com baixas concentrações de fixador (2-3% de paraformaldeído) e bloqueadas com 5% de BSA. As células foram incubadas com 0,1 pg/mL de Conjugado de faloidina-isotiocianato de tetrametilrodamina B de Amanita Phalloides (Sigma Aldrich, EUA) à F-actina, por 30 min, na temperatura ambiente, no escuro. As imagens confocais de fluorescência foram obtidas com um microscópio Nikon, equipado com uma objetiva de abertura numérica 100x 1,45 e uma unidade confocal de disco rotativo Yokogawa (Perkinelmer). Para cada marcação de imunofluorescência, pelo menos três preparações de tecido diferentes foram usadas.

Ensaio da proteína ANXA2 intra- e extracelular [0051] As células hESC foram lisadas em tampão de lise (50 mM de Tris-HCI pH 8,0, 150 mM de NaCI, 1% de IGEPAL CA 360, 0,5% de Na-DOC, 0,1% de SDS e 0,5 M de EDTA). Os extratos proteicos (25 pg/pista) foram separados sobre um gel de SDS-PAGE a 10%, transferidos para uma membrana de poli(difluoreto de vinilideno) (Hybond-P (membrana de poli(difluoreto de vinilideno) hidrofóbica) (Amersham Biosciences, NJ, EUA) por eletroforese e bloqueados em solução salina tamponada com PBS com 5% de leite e 0,1% de Tween. As membranas foram incubadas durante a noite, a 40, com antiAnexina humana II policlonal de coelho a 1/2500 (Abeam, Cambridge, UK) e antiβ-actina humana monoclonal de camundongo a 1/2000 (Santa Cruz, CA, EUA) e reveladas com os anticorpos IgG-HRP anticoelho de cabra e anticamundongo de cabra secundários conjugados à peroxidase da raiz-forte de Santa Cruz (CA, EUA). Os complexos de anticorpos

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24/44 antígenos foram detectados usando o reagente ECL Plus de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, CT, EUA).

[0052] Os extratos proteicos (2 pg/poço) e os meios condicionados foram analisados por ELISA (R&D Systems, MN, EUA). O anticorpo de captura imobilizado especificamente liga a Anexina A2. Após lavagem do material não ligado, um anticorpo de detecção biotinilado, específico para a Anexina A2, é usado para detectar a anexina A2 ligada, usando o formato padrão de Estreptavidina-HRP. Três réplicas foram efetuadas para cada condição e os valores da absorbância foram extrapolados para uma curva padrão, para estabelecer a concentração de anexina A2 humana (pg/mL).

Imuno-histoauímica da ANXA2 [0053] As biopsias endometriais fixadas com formalina e incrustadas em parafina foram secionadas e montadas sobre lâminas de vidro revestidas com Vectabond (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Após desparafinização e reidratação, as seções foram enxaguadas 3 vezes com PBS, por 5 min. A imuno-histoquímica foi efetuada sobre as seções endometriais usando o kit de peroxidase LSAB (Dako, Carpinteria, CA, EUA). A ligação não específica foi bloqueada com 5% de BSA em PBS. As seções foram incubadas por uma hora, na temperatura ambiente, com antianexina II humana policlonal de coelho a 1:100 (Abeam, Cambridge, UK), diluída em PBS com 3% de BSA. Na ausência de anticorpos, os controles negativos foram incubados com PBS incluindo 3% de BSA. Os anticorpos secundários foram incluídos no kit de peroxidase LSAB (Dako), válido para anticorpos primários de origem de coelho. A coloração foi obtida com o cromógeno de 3,30-diaminobenzidina (DAB) por um tempo de entre 30 s e 1 min. Após a contracoloração com hematoxilina por 10 s e a lavagem com água destilada, as lâminas foram montadas com entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).

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ANXA2 siRNA [0054] Para silenciar a ANXA2, um oligonucleotideo de siRNA com especificidade por ANXA2 (CGGCCUGAGCGUCCAGAAATT, SEQ ID N^Q: 1) e duplexes de RNA de controle negativos foram usados, ambos com a modificação 3'-AlexaFluor488 (Qiagen CA, EUA). As hESCs foram transfectadas com o siRNA para ANXA2 (100 nM) ou o controle negativo de siRNA (100 nM). Todos os experimentos de transfecção foram efetuados usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) e meio DMEM/F12. As células foram incubadas por 6 h a 37Ό com o tratamento, e então os meios foram renovados por meio novo sem siRNA. Ensaio in vivo de F-actina/G-actina [0055] O teor de actina monomérica livre (G-actina) versus actina filamentosa (F-actina) nas células ESC sujeitas à inibição da ANXA2 seguida por indutores deciduais (AMPc e MPA) foi determinado usando o kit de ensaio in vivo de G-actina/F-actina (Cytoskeleton, CO, EUA). As células de controle não deciduais, do tipo selvagem de controle, de siRNA para ANXA2 e ESC deciduais foram homogeneizadas no tampão de estabilização de F-actina, a 370. Os lisados celulares foram então limpos de células inteiras com uma centrífuga de baixa velocidade (2000 rpm). Os lisados limpos foram então centrifugados a 100 000 x g para separar a G-actina solúvel da F-actina insolúvel. As frações foram então proporcionalmente carregadas sobre um gel de poliacrilamida, separadas por eletroforese SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose para examinar com o anticorpo antiactina a 1/500 (Cytoskeleton, CO, EUA). A quantificação densitométrica do western blot determinou a razão de G-actina encontrada no citossol versus a F-actina incorporada no citoesqueleto normalizado com actina total.

Ensaio de fechamento da ferida [0056] As células hESCs foram semeadas sobre lamínulas, de

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26/44 senvolvidas até a confluência e decidualizadas, seguido por tratamento com siRNA para ANXA2 (6 h). Após 96 h, cada lamínula foi riscada com uma ponta de pipeta estéril, lavada com PBS e colocada em meio novo. A largura da ferida foi medida por microscopia de contraste de fases imediatamente e após 24 h. O fechamento da ferida foi calculado como uma porcentagem de área fechada da largura da ferida inicial. Os dados mostrados representam a média ± SEM de dez medições obtidas de três experimentos independentes.

Ensaio de esoalhamento do trofoblasto [0057] O protocolo usado foi aprovado pelo Animal Care and Use Committee of the Valencia University School of Medicine e em conformidade com as U.S. National Institutes of Health guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. A raça de camundongos B6C3F1 foi adquirida do Charles River Laboratories (Barcelona, Espanha). Os camundongos fêmeos com idade de 6-8 semanas foram superovulados e alojados durante a noite, em pares, com urn macho garanhão. No dia 2 de gestação, os embriões foram recuperados do oviduto e cultivados por 3 dias em meio CCM-30 (Vitrolife, Lubeck, Alemanha). Somente os blastocistos expandidos com morfologia normal foram incluídos no estudo (n=425 embriões de camundongos).

[0058] Os embriões incubados foram cocultivados sobre a monocamada de hESCs decidualizadas confluentes atuando como controles, siRNA de controle ou siRNA para ANXA2. Após 48 horas, a área de espalhamento de trofoblasto do blastocisto unido foi avaliada. As coculturas foram fixadas com baixas concentrações de fixador (2-3% paraformaldeído) e bloqueadas com 5% de BSA, incubadas com anticorpos primários que incluem o anti Vimentina de camundongo a 1/50 (Sigma Aldrich, EUA) e o anti E-caderina de coelho a 1/100 (Abeam, Cambridge, UK), diluídos em 3% de BSA por duas horas, na temperatura ambiente. As células foram incubadas com anticorpo secundário

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27/44 anticamundongo TRICT a 1/1000 (Invitrogen, Barcelona, Espanha) para vimentina e anticoelho Alexa Fluor 488 a 1/1000 (Invitrogen, Barcelona, Espanha) para E-caderina, por uma hora, na temperatura ambiente, no escuro. 10-15 blastocistos de camundongos por condição foram avaliados em cada experimento. A área que se desenvolve (expressa em pixels) foi expressa como valores médios ± SEM de grupos em triplicate de medições obtidas de três experimentos independentes. Ensaio de invasão [0059] A linhagem celular derivada de trofoblasto JEG-3 foi usada para avaliar a capacidade do trofoblasto de invadir através da hESC decidual (Ref. Hannan 2010). Os ensaios de invasão foram efetuados com os kits Collagen Transwell Invasion (Chemicon Int. Billerica, MA). 5 x 10⁵ hESCs decidualizadas como controles, siRNA de controle ou siRNA para ANXA2 foram desenvolvidas até a confluência em insertos transwell de tamanho de poro de 8 mm, durante 24 h. Sobre o topo do inserto, 10⁶ células JEG-3 foram suspensas novamente no meio de hESCs e as células JEG-3 foram deixadas invadir por 48 h. A invasão foi medida por DO usando uma leitora de microplacas padrão (Figura 4C).

Estudo de fibrinólise [0060] O nível de plasminogênio foi avaliado em meio condicionado pelo kit de ELISA (Cell Biolabs, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A absorbância média (Δ450 nm) nos poços em duplicada foi calculada subtraindo-se o fundo dos poços com meio sem hESC.

[0061] A atividade da plasmina foi medida no meio condicionado pelo kit de ensaio fluorimétrico (Anaspec, CA, EUA). Ele é baseado em uma divagem por protease no substrato de plasmina, que gera um fluoróforo de rodamina 110 que tem uma fluorescência verde brilhante detectada a 496 nm/520 nm (excitação/emissão). Cinquenta microlitros

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28/44 de meio condicionado foram pré-incubados 10 min, na temperatura ambiente, e 50 uL de solução de substrato de plasmina foram adicionados a cada poço. O sinal de fluorescência foi obtido para a leitura cinética para imediatamente começar a medição e registrar os dados a cada 5 min por 60 min, com um total de 13 leituras. Cada condição foi avaliada em duplicata. A fluorescência foi inserida nos valores da concentração usando um padrão de referência de fluorescência de Rh110. Níveis de MMP2 e MMP9 [0062] As formas de pró-proteínas e proteínas ativas MMP2 E MMP9 foram avaliadas através de análise por ELISA comercial (RayBiotech, GA, USA). Estes ensaios empregam um anticorpo específico para MMP-2 e MMP-9 humanas revestido sobre uma placa de 96 poços. Os padrões e as amostras são pipetados em duplicata para os poços e a MMP-2 e a MMP-9 presentes em uma amostra são ligadas aos poços pelo anticorpo imobilizado. Os anti-MMP-2 e MMP-9 humanos biotinilados e a estreptavidina conjugada à HRP foram adicionados. As soluções de substrato de TMB foram adicionadas e a absorbância a 450 nm foi extrapolada para a curva padrão.

PCR quantitativa [0063] O RNA total foi extraído das culturas de hESC usando o reagente Trizol LS (Invitrogen, Barcelona, Espanha) de acordo com as instruções do fabricante. Primeiramente, 1 pg de RNA total foi transcrito invertido no cDNA usando o kit Advantage RT-for-PCR (Clontech CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A PCR quantitativa em tempo real foi efetuada usando SYBR Green (Roche) em um sistema Light Cycler 480 (Roche). Os transcritos foram quantificados a partir da curva padrão correspondente, usando GAPDH como um controle interno. Cada experimento foi efetuado três vezes com cada amostra em triplicata. Os seguintes primers foram usados: ANXA2 (Fw: TGTGCAAGCTCAGCTTGGA, SEQ ID N^Q: 2, Rv

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AGGTGTCTTCAATAGGCCCAA, SEQ ID N^Q: 3), e GAPDH (Fw GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, SEQ ID N^Q: 4, Rv GAAGATGGTGATGGGATTTC, SEQ ID N^Q: 5).

Resposta à Dose de Heparina [0064] As hESCs foram cultivadas sobre a monocamada, na presença de 50 pg/mL e 100 pg/mL de heparina (Sigma, Madri), durante 15, 30 e 60 min, para elaborar um experimento de resposta à dose. Os meios condicionados de células hESC foram coletados para analisar os níveis de plasminogênio, a atividade da plasmina e a produção de metaloproteases.

Análise Estatística [0065] Pelo menos três biopsias endometriais diferentes foram usadas por cada experimento e as medições foram obtidas em triplicata. Os valores médios ± SEM são apresentados com n significando o número de experimentos. Os dados foram analisados com o software SPSS, usando o teste t para as diferenças globais analisadas entre os grupos. Um valor de p de P < 0,05 foi considerado significativo. (*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001).

Resultados

Resistência à decidualização in vitro nas pacientes que sofreram sPE em suas gravidezes anteriores [0066] Avaliou-se a decidualização in vitro das hESCs de mulheres que sofreram PE grave (sPE) em suas gravidezes anteriores (n = 13) em comparação com as pacientes de controle com história de gravidezes normais (sem PE) (n = 13). No grupo de sPE, as hESCs foram isoladas de mulheres que sofreram diferentes formas, incluindo a síndrome de HELLP sobreposta, a eclampsia, ou duas sPE anteriores consecutivas desenvolvendo a síndrome de HELLP que terminou em eclampsia. As pacientes com sPE e sem PE tinham IMCs e idades comparáveis, porém as mulheres com sPE tinham maiores pressões

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30/44 sanguíneas sistólicas/diastólicas, proteinúria, GOT, GPT e menores contagens de plaquetas e níveis de fibrinogênio. As hESCs decidualizadas com cAMP (0,5 μΜ) + MPA (1 μΜ) por cinco dias como estímulo decidual ou com os indutores hormonais P4 (1 μΜ) + E2 (30 nM) por 9 dias mostraram resultados similares. Portanto, o protocolo de cAMP+MPA foi usado para este estudo. De modo interessante, a secreção de PRL e IGFBP-1 demonstra que a decidualização in vitro foi diminuída na hESC obtida de sPE em comparação com o correspondente sem PE (Figuras 1A e 1B, respectivamente). A reorganização da F-actina nas hESCs foi investigada durante a decidualização in vitro e mostrou uma transição do fenótipo fibroblástico para morfologia de células arredondadas aumentadas na sem PE, enquanto que a transição para fenótipo decidual estava ausente na hESC decidualizada de pacientes com sPE (Figura 1C).

Expressão de hESC infrarregulada e desregulada de ANXA2 na sPE [0067] Analisou-se a abundância da proteína ANXA2 nas amostras endometriais totais de mulheres que sofreram sPE em sua gravidez anterior vs. pacientes sem PE (Figura 2A). A análise densitométrica mostrou uma redução significativa na abundância de ANXA2 no endométrio das pacientes com sPE (n=6), em comparação com as sem PE (n=6) (Figura 2A). A localização da ANXA2 endometrial foi examinada. Observou-se uma menor coloração no compartimento estromal na sPE versus sem PE (Figura 2B). A seguir, as hESCs das pacientes com sPE versus sem PE foram isoladas, decidualizadas e a proteína ANXA2 foi avaliada por western blot (Figura 2C). A análise densitométrica demonstrou que nas mulheres com sPE, a ANXA2 foi significativamente reduzida nas condições basais e estava desregulada na hESC decidualizada, em comparação com as pacientes sem PE (Figura 2C). Para quantificar adicionalmente esta molécula, as formas de

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ANXA2 intracelulares e secretadas durante a decidualização em ambas as condições foram analisadas usando ELISA. Esta análise confirma que as hESCs das mulheres com sPE, na presença de estímulo de decidualização, sofrem uma redução e uma desregulação significativas na ANXA2 tanto intracelular quanto extracelular, em comparação com os controles (Figura 2D). Além disso, a forma secretada espelha a ANXA2 intracelular, o que confirma o uso de ANXA2 como um biomarcador que pode ser usado para predizer a resistência à decidualização em pacientes com PE.

Regulação e funcionalidade da ANXA2 nas hESCs durante a decidualização in vitro [0068] Os estudos anteriores mostram que a ANXA2 é regulada por todo o ciclo menstrual, no endométrio humano, durante a aquisição de receptividade e as etapas iniciais da implantação do embrião. A regulação da ANXA2 durante a decidualização das hESCs in vitro foi investigada a seguir. A ANXA2 intracelular avaliada por western blot (Figura 3A) e análise densitométrica confirmou a suprarregulação da ANXA2 intracelular nas hESCs decidualizadas vs. não decidualizadas, usando ambos os protocolos (Figura 3A). A ANXA2 secretada foi medida no sobrenadante das hESCs por ELISA, comparando a sua dinâmica intracelular (Figura 3B). Estes resultados demonstram que as ANXA2s intra- e extracelulares são suprarreguladas na hESC durante a decidualização in vitro.

[0069] A seguir, a funcionalidade da ANXA2 nas hESCs foi avaliada durante a decidualização in vitro, por inibição da molécula de ANXA2 usando uma abordagem de siRNA. Vinte e quatro horas após a transfecção da hESC, uma redução significativa no mRNA da ANXA2 (Figura 3C) e na proteína (Figura 4D) foi observada no grupo de siRNA, em comparação com os grupos de controle e de siRNA de controle em ambas as condições não deciduais e deciduais. Para con

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32/44 firmar a sua relevância funcional, o impacto da inibição da ANXA2 foi avaliado na secreção dos biomarcadores deciduais, tais como PRL e IGFBP-1, bem como as mudanças fenotípicas morfológicas em 72 h após o início do estímulo decidual. Ao contrário dos controles, PRL e IGFBP-1 estavam ausentes nas hESCs decidualizadas com siRNA (Figuras 3E e 3F). Também, a coloração com rodamina-faloidina confirmou que a interferência da ANXA2 anulava as modificações fenotípicas características da arquitetura da F-actina durante o processo de decidualização, deixando inalterada a orientação longitudinal dos filamentos de F-actina (Figura 3G). A reorganização do citoesqueleto da actina durante a decidualização, após a inibição da ANXA2, foi também investigada usando a razão da G-actina monomérica livre encontrada no citossol em comparação com a F-actina incorporada no citoesqueleto (Figura 3H). A razão média de G/F-actina foi aproximadamente 1:1 nas células hESC de controle e com siRNA de controle no fenótipo tanto decidual quanto não decidual, enquanto as células hESC de ANXA2 inibida revelaram um aumento significativo no teor de G-actina monomérica em comparação com F-actina (uma razão de 3:1 nas células não deciduais e de 4:1 nas tratadas com siRNA para ANXA2) (Figura 3H). Estes dados demonstram que a inibição da ANXA2 induz uma resistência à decidualização através da despolimerização dos filamentos de actina e um aumento significativo na fração monomérica de G-actina, demonstrando um papel funcional da ANXA2 na reorganização das fibras de F-actina durante o processo de decidualização.

A inibição da ANXA2 reduz a motilidade da hESC, o espalhamento e a invasão de trofoblastos [0070] Para entender mais as ações parácrinas da resistência à decidualização induzida pela inibição da ANXA2 sobre o espalhamento e a invasão de trofoblastos, um ensaio de fechamento da ferida foi efetuado para analisar a implicação da ANXA2 na motilidade das hESCs.

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A decidualização das hESCs foi seguida pela transfecção com siRNA para ANXA2, por 6 horas, então a monocamada de células foi rompida com uma raspagem, e os efeitos da inibição da ANXA2 em termos de migração foram acompanhados durante 24 horas, por microscopia de vídeo (Figura 4A). A porcentagem de fechamento da ferida nas células de siRNA para ANXA2 inibido foi significativamente reduzida em comparação com as de controle e de siRNA de controle (Figura 4A).

[0071] Estudou-se a seguir o efeito da inibição da ANXA2 sobre o espalhamento do trofoblasto, usando um modelo de cocultura in vitro heterólogo, onde os embriões de camundongos foram colocados sobre a monocamada de hESC decidualizada confluente, seguido por inibição do siRNA para ANXA2. A imunocoloração para a E-caderina e a vimentina identifica o trofoblasto de camundongo e as hESCs, respectivamente. A área total do espalhamento de trofoblastos foi avaliada como um número de pixels e foi observada uma diminuição significativa no siRNA para ANXA2 em comparação com as células hESC de controle e de siRNA de controle (Figura 4B).

[0072] A capacidade de invasão da linhagem celular de trofoblasto humano JEG-3 nas células hESC de ANXA2 inibida foi também analisada usando um ensaio de câmara de invasão de colágeno. As hESCs decidualizadas foram inibidas no siRNA da ANXA2 e cultivadas em insertos sobre uma camada de colágeno. Então, uma suspensão de células JEG-3 foi colocada sobre o topo dos insertos. A capacidade de invadir através da monocamada de hESCs tratadas e da barreira de colágeno foi examinada. As porcentagens de células JEG-3 invasoras nas células de ANXA2 inibida foram significativamente reduzidas, em comparação com a hESC de controle (Figura 4C).

A atividade fibrinolítica deficiente devida à inibição da ANXA2 está também presente na hESC de sPE [0073] O sistema fibrinolítico está implicado na patogênese da PE

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34/44 através do depósito de fibrina e de uma predisposição à disfunção endotelial. Investigou-se o efeito funcional da inibição da ANXA2 de hESC sobre a atividade fibrinolítica, em comparação com a hESC de mulheres com PE. Para este propósito, foram analisados os níveis de plasminogênio, e a atividade da plasmina nos meios condicionados a partir de controles decidualizados, siRNA para ANXA2 e hESCs de PE. Os níveis de plasminogênio e a atividade da plasmina foram significativamente reduzidos no siRNA para ANXA2 e nas hESCs de sPE, em comparação com as hESCs com siRNA de controle e as hESCs decidualizadas de controle (níveis do plasminogênio: 229,1 ±23,1 e 191,5±36,7 pg/mL versus 305,1 ±23,2 e 397,1 ±45,1 pg/mL, respectivamente; atividade da plasmina: 12,7±3,6 mM e 4,2±0,75 mM versus 27,5±10,2 mM e 23,1 ±4,1, respectivamente) (Figuras 5A e 5B). Portanto, o sistema de fibrinólise é deficiente quando a ANXA2 for inibida na hESC decidualizada e, até uma proporção maior, na hESC de pacientes com SPE [0074] De modo interessante, o sistema de plasminogênio/plasmina regula a invasão de trofoblastos pela produção das proteínas MMP2 e MMP9, que degradam os componentes de ECM, tais como a fibrina e o colágeno. A secreção das proteínas MMP2 e MMP9 foi analisada nos meios condicionados de hESCs de ANXA2 inibida e decidualizadas de sPE por ELISA. Os níveis de secreção de MMP2 e MMP9 foram significativamente reduzidos quando a ANXA2 foi inibida e nas pacientes com sPE (FIGs. 5C e 5D).

O tratamento com heparina favorece a ativação do sistema de fibrinólise defeituoso na hESC de ANXA2 reduzida [0075] A heparina atua sobre a via da fibrinólise através do ativador de plasminogênio do tecido (tPA), e também foi descrita como um efeito direto da ligação da heparina à ANXA2. O efeito da heparina sobre a fibrinólise foi analisado em experimentos de resposta à dose e

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35/44 dependentes do tempo, medindo a abundância de plasminogênio e a atividade da plasmina sobre hESCs com siRNA de controle, de siRNA para ANXA2 inibido, decidualizadas sem PE e de PE. A heparina a 100 ug/mL significativamente aumentou a secreção de plasminogênio e plasmina nos meios condicionados em todas as condições investigadas, incluindo na hESC de ANXA2 inibida e decidualizada de sPE (Figura 5E). Também, o efeito da heparina sobre a plasmina foi também avaliado, resultando em um aumento significativo da atividade da plasmina sobre o siRNA para ANXA2 e as hESCs de sPE na mesma dose (Figura 5F). Os níveis de ANXA2 extracelular secretada nos meios condicionados de controle, siRNA para ANXA2 e hESC de pacientes com sPE foram medidos por ELISA. Os resultados confirmam que o tratamento com heparina induz um aumento significativo na proteína ANXA2 secretada nos meios de cultura (Figura 5G).

[0076] Finalmente, o efeito funcional da heparina sobre a produção das metaloproteases MMP2 e MMP9, em todas as condições, foi testado in vitro (Figura 5H). O tratamento com heparina induziu um aumento significativo das metaloproteases, elementos-chave para facilitar a invasão de trofoblastos através das células estremais endometriais. Portanto, os efeitos diretos e/ou indiretos da heparina sobre a hESC decidualizada deficiente de ANXA, induzidos por siRNA ou que ocorrem naturalmente nas pacientes com sPE, corrigem, pelo menos em parte, o defeito fibrinolítico associado.

[0077] Com base nestes dados, um modelo é proposto que integra a resistência à decidualização da hESC presente na sPE, mediada pelo menos em parte pela deficiência de ANXA2, com invasão de trofoblastos superficial e alterações fibrinolíticas como uma causa materna de PE (Figura 7). Verificou-se que a hESC deficiente de ANXA2 na sPE ou induzida através de siRNA não decidualiza adequadamente devido à despolimerização dos filamentos de actina e a um aumento

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36/44 significativo na fração monomérica de G-actina, impedindo a sua transformação morfológica típica. Uma consequência principal à jusante incluiu o efeito direto sobre a pró-enzima plasminogênio, levando à geração de plasmina reduzida, criando um efeito parácrino prótrombótico devido a uma deficiência no sistema de fibrinólise. Similarmente, a deficiência na ativação da ANXA2 leva à invasão de trofoblastos superficial através da inibição de MMP2 e MMP9 que degradam os componentes de ECM, tais como a fibrina e o colágeno. A adição de heparina atuando através da ANXA2 é capaz de superar os efeitos à jusante indicados.

Discussão [0078] Embora a diferenciação defeituosa de CTB, como uma causa possível da PE, esteja sob uma investigação intensa, este trabalho concentrou-se nos fatores parácrinos maternais endometriais envolvidos na origem desta complicação obstétrica. Os estudos epidemiológicos revelam que a PE anterior na família materna está associada com um risco aumentado de 24%-163% de sofrer PE nos parentes da mulher. Entretanto, os episódios de PE na família paterna não afetam o risco de PE em uma dada paciente. Desse modo, a suscetibilidade genética por PE está claramente associada com as linhagens maternas.

[0079] As hESCs foram alvejadas através da transformação por decidualização a partir da decídua que regula a invasão do CTB na parede uterina. A identificação da resistência à decidualização nas hESCs obtidas de sPE em comparação com as equivalentes sem PE originou o estudo.

[0080] A Anexina A2 (ANXA2) é uma proteína de ligação ao fosfolipídio regulada pelo cálcio que é significativamente suprarregulada durante as fases secretórias médias e posteriores do endométrio humano. Esta proteína é chave para a aquisição do fenótipo receptivo

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37/44 pelo epitélio endometrial pela modulação da rede de F-actina. A ANXA2 é um receptor pró-fibrinolítico, presente e funcional sobre a hESC. Ela atua como um correceptor da superfície celular para o plasminogênio e o seu ativador tPA, significativamente aumentando a geração de plasmina na superfície da célula. Devido à alteração da via fibrinolítica na PE, as análises mecanicistas foram concentradas sobre a ANXA2 porque altos títulos desta molécula têm estado associados com os eventos trombóticos na síndrome antifosfolipídio (APS), uma condição que se sabe predispõe o desenvolvimento de PE. Além disso, os autoanticorpos para ANXA2 nas placentas com PE têm sido sugeridos como uma causa possível de formação de trombina placentária.

[0081] Inicialmente, a ANXA2 no compartimento estromal endometrial foi reduzida nas pacientes que sofreram sPE em suas gravidezes anteriores vs. sem PE. A seguir, a análise confirmou que a hESC de mulheres com sPE na presença de estímulo de decidualização sofrem uma redução e uma desregulação significativas na ANXA2 tanto intracelular quanto extracelular, em comparação com os controles. Outra descoberta surpreendente foi que as ANXA2s intra- e extracelulares eram suprarreguladas na hESC durante a decidualização in vitro e a sua inibição funcional induziu a resistência à decidualização através da despolimerização dos filamentos de actina e aumento da fração monomérica de G-actina. A investigação adicional das ações autócrinas e parácrinas da resistência à decidualização induzida pela inibição da ANXA2 revelou um efeito direto sobre a motilidade da hESC, e uma redução do espalhamento e da invasão dos trofoblastos, que são particularidades desta condição patológica.

[0082] A fibrinólise é um processo bem organizado, através do qual o plasminogênio é convertido em plasmina, através da ação do ativador de plasminogênio do tecido (tPA) e do ativador de plasmino

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38/44 gênio de urocinase (uPA), que remodelam e degradam os trombos de fibrina. Uma descoberta histopatológica comum nas placentas de PE é o surgimento de diversos graus de trombose juntamente com os depósitos de fibrina. Os defeitos da função fibrinolítica são fatores de risco conhecidos para a trombose aumentada. As alterações da fibrinólise estão presentes na PE, sugerindo uma anormalidade fibrinolítica no desenvolvimento da doença, como causa ou consequência. A ANXA2 tem um efeito direto sobre a pró-enzima plasminogênio e para a mesma via de fibrinólise extrínseca, portanto, o sistema de fibrinólise era deficiente na hESC decidualizada quando a ANXA2 foi inibida e, até um maior grau, na hESC de pacientes com sPE com resistência à decidualização. A alteração do sistema de plasminogênio/plasmina prejudicou a invasão dos trofoblastos através da inibição de MMP2 e MMP9, que degradam os componentes de ECM, tais como a fibrina e o colágeno. Também foi demonstrado que a heparina, em uma dose de 100 ug/mL in vitro, aumentou a produção de proteína ANXA2 secretada, plasminogênio, plasmina, MMP2 e MMP9 em todas as condições investigadas. Portanto, esta investigação estabelece os fundamentos para entender o efeito benéfico descrito do tratamento com heparina na PE.

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44/44 [0083] Diversas modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas neste documento, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e incidirão no escopo das reivindicações anexas. As vantagens e os objetivos da invenção não são necessariamente abrangidos por cada modalidade da invenção.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição para tratar pré-eclampsia, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz de glicosaminoglicano e pelo fato de a composição ser administrada ao paciente determinado a ter risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia por:

   (1) medição de um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida do paciente, e (2) comparação do nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2.

   2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a paciente não tem nenhuma história de préeclampsia.

   3. Composição, de acordo com qualquer reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste em uma amostra de tecido do endométrio, células estromais endometriais e fluido endometrial.

   4. Composição , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tenham tido uma gravidez bemsucedida e nenhuma história de pré-eclampsia.

   5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas.

   6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.

   Petição 870180021648, de 19/03/2018, pág. 10/15

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   7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a paciente está grávida.

   8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a paciente está tentando engravidar.

   9. Método de uso do nível de anexina A2 (ANXA2) como indicador de pré-eclampsia, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

   medir um nível de anexina A2 (ANXA2) em uma amostra de teste obtida de uma paciente; e comparar o nível de ANXA2 na amostra de teste com um nível de controle de ANXA2 para determinar se a paciente corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia.

   10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a paciente não tem nenhuma história de préeclampsia.

   11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste em uma amostra de tecido do endométrio, células estromais endometriais e fluido endometrial.

   12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é obtida de pacientes que tenham tido uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia.

   13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.

   14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que a paciente está grávida.

   Petição 870180021648, de 19/03/2018, pág. 11/15

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   15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que a paciente está tentando engravidar.

   16. Composição para tratar a pré-eclampsia, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz de glicosaminoglicano e pelo fato de que a composição é administrada ao paciente determinado a ter um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia através de:

   (1) efetuar um ensaio para determinar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial obtida de um paciente que não tenha presentemente pré-eclampsia, onde a paciente está grávida ou onde a paciente tem planos de tornar-se grávida ;
2. (2) comparar o nível de ANXA2 na amostra de fluido endometrial com um nível de controle de ANXA2.

   17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o paciente não tem nenhuma história de préeclampsia.

   18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 17, caracterizada pelo fato de que o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tenham tido uma gravidez bemsucedida e nenhuma história de pré-eclampsia.

   19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas.

   20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo

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   4/5 que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imunohistoquímica.

   21. Composição para tratar a pré-eclampsia, caracterizada pelo fato de que compreender glicosaminoglicano em quantidade suficiente para aumentar o nível de ANXA2 no paciente:

   o paciente tendo baixos níveis de ANXA2 em comparação com um nível de controle de ANXA2, tendo planos de engravidar e não tendo nenhuma história de pré-eclâmpsia.

   22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o nível de controle de ANXA2 é derivado de pacientes que tenham tido uma gravidez bem-sucedida e nenhuma história de pré-eclampsia.

   23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22, caracterizada pelo fato de que o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas.

   24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imunohistoquímica.

   25. Método para avaliar a eficácia da terapia de glicosaminoglicano para pré-eclampsia, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

   medir os níveis de anexina A2 (ANXA2) nas amostras de teste obtidas da paciente que tenha ou corre um risco aumentado de desenvolver pré-eclampsia antes e após o tratamento com uma quantidade efetiva de glicosaminoglicano, onde um aumento no nível de

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   ANXA2 após o tratamento em relação ao nível antes do tratamento indica que a terapia de glicosaminoglicano é efetiva.

   26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o glicosaminoglicano é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina de baixo peso molecular, sulfato de heparana, heparina ou sulfato de heparana quimicamente modificados, sulfatos de dermatana de baixo peso molecular e suas misturas.

   27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pelo fato de que o nível de ANXA2 é determinado usando um ensaio imune selecionado a partir do grupo que consiste em ELISA, Western Blot, e coloração imuno-histoquímica.