JP2017510283A - 配合培地粉末製剤および細胞培養用液体培地の調製方法 - Google Patents

配合培地粉末製剤および細胞培養用液体培地の調製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、基礎培地粉末および細胞培養培地補充物を含む配合細胞培養培地粉末製剤であって、細胞培養培地補充物が１または複数の塩；１または複数の増殖因子；１または複数の無機イオン；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を含む、前記配合細胞培養培地粉末製剤を提供する。本発明はさらに、配合細胞培養培地粉末製剤を作製する方法、哺乳動物細胞を増殖させるための該細胞培養培地を作製する方法、該細胞培養培地中で細胞を培養することにより目的タンパク質を生産し、目的タンパク質を単離する方法を提供する。【選択図】図１

Description

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、２０１４年４月１０日に作成された「ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた１つの（６６，９８９バイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ））ファイルとして特定されるコンピューター読み取り可能な配列表は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
技術分野
本発明は、細胞生物学および細胞培養の分野に関する。
培養中に真核生物細胞を増殖させるための様々な培地が、文献中に記載され、市販されている。細胞培養培地は、細胞の生存、増殖およびタンパク質発現に必須の好適なｐＨおよび浸透圧および栄養分を細胞に提供するように機能する。
いくつかの通例の基礎培養培地の例は、ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（最小必須培地、ＭＥＭ）培地（付着哺乳動物細胞の増殖のための「最小の」培地）、ＣＯ２非存在下での増殖のためのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（リーボビッツ）培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ（ハムＦ１２培地）である。様々な培地は、正確なアミノ酸、ビタミン、有機塩、微量元素、ならびに培養細胞の増殖（および培養細胞によるタンパク質発現）を促進する他の有機化合物という点で異なる成分を含有することで、互いに区別される。
最適な細胞培養培地の開発は著しく重要であるが、その理由は、様々な成分の変化が予想できない細胞増殖の改善、増殖速度の向上、高細胞密度までの増殖、細胞分化のステージおよび量の制御の改善、タンパク質分泌の増加、表現型安定性および遺伝的安定性の向上ならびに多くの細胞種についての老化の排除を導くことがあるためであり、これらの全ては商業的規模で組換えタンパク質を生産するときに必然の性質である。
細胞培養培地の調製は、とりわけ商業的環境において複雑であり、通常、多数のストック溶液および粉末の貯蔵、輸送、調製および保存ならびに順次のバッチ化を必要とする。培地調製における数多くのプロセスステップおよび成分は、効率を下げてコストを上昇させており；それらはまたばらつきを持ち込むこともあり、結果として細胞の増殖およびタンパク質生産に影響を与えることがある。水和もまた克服への著しい障害であるが、その理由は、より多くの成分が培地製剤に加えられると、組成物の豊かさおよび複雑性ならびに様々な成分間での相互作用が原因で、均一な混合物および最適な浸透圧を達成するために成分を完全に水和して溶解することがより難しく予測できないものになるためである。この理由のため、いくつかの成分は、複雑な培地製剤においてしばしば別々に水和される。しかしながら、これは生産時のコストおよび複雑性の増加をもたらす。
したがって、完全に水和した液体培地中での正しい組成ならびに同様の細胞培養性能および組換えタンパク質生産を維持しながら複雑性を減らしてコストを下げるため、改良された／さらに配合された乾燥培地粉末（ＤＭＰ）製剤およびそれを作製する方法へのニーズが当該技術分野においてなお存在する。
１の態様において、本発明は、基礎培地粉末および細胞培養培地補充物を含む配合細胞培養培地粉末製剤であって、細胞培養培地補充物が１または複数の塩；１または複数の増殖因子；１または複数の無機イオン；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を含む、前記配合細胞培養培地粉末製剤を提供する。
いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ１２（ハム培地Ｆ１２）、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（イーグル最小必須培地）、ＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ（ハムＦ１２培地）（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；１：１の比）およびそれらの組み合わせまたは改変物を含む。
いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、以下の成分のうちの１もしくは複数またはそれらの組み合わせを含む：ビオチン、塩化カルシウム、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、Ｄ＋マンノース、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ブドウ糖（無水）、ＤＬ−アルファ−リポ酸、硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ、葉酸、グリシン、ヒポキサンチン、Ｉ−イノシトール、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸（無水）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタチオン、Ｌ−ヒスチジンＦＢ、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、塩化マグネシウム、無水硫酸マグネシウム、ナイアシンアミド、Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン、塩化カリウム、プトレッシン２ＨＣｌ、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、無水二塩基性リン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、チアミンＨＣｌ、チミジン、硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、硫酸銅、二酸化セレン、リノール酸、ベータ−メルカプトエタノールおよびエタノールアミン遊離塩基ＦＢ。
いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、基礎培地粉末の濃度は８〜３０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、基礎培地粉末の濃度は１２〜１４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、基礎培地粉末の濃度は約１３ｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤は、ｐＨ指示薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ指示薬はＰｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）であり、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）は約０．００１から約０．０２ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）は約０．００６９ｇ／Ｌの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、基礎培地粉末成分は以下の終濃度を提供する：
ｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ ビオチン；
ｉｉ） ０．０３５〜０．３３ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
ｉｉｉ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ 塩化コリン；
ｉｖ） ０．０００２〜０．００２ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
ｖ） １〜１０ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
ｖｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
ｖｉｉ） ０．３〜３．０ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
ｖｉｉｉ） ０．００００３〜０．０００３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
ｉｘ） ０．００００２〜０．０００１５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
ｘ） ０．０００１〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
ｘｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ 葉酸；
ｘｉｉ） ０．００７〜０．２０ｇ／Ｌ グリシン；
ｘｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
ｘｉｖ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
ｘｖ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
ｘｖｉ） ０．０８〜１．４ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
ｘｖｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
ｘｖｉｉｉ） ０．００５〜０．１０ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
ｘｉｘ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
ｘｘ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
ｘｘｉ） ０．００５〜０．１５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
ｘｘｉｉ） ０．０２〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
ｘｘｉｉｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
ｘｘｉｖ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
ｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
ｘｘｖｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
ｘｘｖｉｉ） ０．０５〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
ｘｘｖｉｉｉ） ０．０１〜０．３ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
ｘｘｉｘ） ０．０２〜０．６ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
ｘｘｘ） ０．００８〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
ｘｘｘｉ） ０．００９〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
ｘｘｘｉｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
ｘｘｘｉｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
ｘｘｘｉｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
ｘｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
ｘｘｘｖｉ） ０．０１〜０．１８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉ） ０．０２〜０．１２ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
ｘｘｘｉｘ） ０．０００５〜０．００５ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
ｘｌ） ０．１〜１．０ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
ｘｌｉ） ０．００００２〜０．０００２ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
ｘｌｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
ｘｌｉｉｉ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
ｘｌｉｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ リボフラビン、
ｘｌｖ） ２．０〜１５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
ｘｌｖｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
ｘｌｖｉｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
ｘｌｖｉｉｉ） ０．０１５〜０．１５ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、
ｘｌｉｘ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
ｌ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ チミジン、
ｌｉ） ０．０００１５〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉ） ０．００００００６〜０．０００００６ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉｉ） ０．００００００５〜０．０００００８ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
ｌｉｖ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ リノール酸、
ｌｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
ｌｖｉ） ０．０００３〜０．００５ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、基礎培地粉末成分は以下の終濃度を提供する：
ｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ ビオチン；
ｉｉ） 約０．１１６６５ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
ｉｉｉ） 約０．００９９８ｇ／Ｌ 塩化コリン；
ｉｖ） 約０．０００６８ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
ｖ） 約３ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
ｖｉ） 約０．００３１２ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
ｖｉｉ） 約１ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
ｖｉｉｉ） 約０．０００１０３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
ｉｘ） 約０．００００５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
ｘ） 約０．０００４１７ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
ｘｉ） 約０．００３６６ｇ／Ｌ 葉酸；
ｘｉｉ） 約０．０２６２６ｇ／Ｌ グリシン；
ｘｉｉｉ） 約０．００２７ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
ｘｉｖ） 約０．０１４５１ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
ｘｖ） 約０．０１３３６ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
ｘｖｉ） 約０．２７４３５ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
ｘｖｉｉ） 約０．０２２５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
ｘｖｉｉｉ） 約０．０１９９５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
ｘｉｘ） 約０．０１７５６ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
ｘｘ） 約０．０６２５６ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
ｘｘｉ） 約０．０２２０６ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
ｘｘｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
ｘｘｉｉｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
ｘｘｉｖ） 約０．０７３４８ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
ｘｘｖ） 約０．１０５７ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
ｘｘｖｉ） 約０．１１０９６ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
ｘｘｖｉｉ） 約０．１６３８５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
ｘｘｖｉｉｉ） 約０．０３２２４ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
ｘｘｉｘ） 約０．０６７４８ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
ｘｘｘ） 約０．０２８７５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
ｘｘｘｉ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
ｘｘｘｉｉ） 約０．１０１５６ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
ｘｘｘｉｉｉ） 約０．０１９０２ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
ｘｘｘｉｖ） 約０．１０７７１ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
ｘｘｘｖ） 約０．０９８６６ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
ｘｘｘｖｉ） 約０．０２８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉ） 約０．０４８８４ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉｉ） 約０．００３０２ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
ｘｘｘｉｘ） 約０．００１４ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
ｘｌ） 約０．３１１８２ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
ｘｌｉ） 約０．００００８１ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
ｘｌｉｉ） 約０．００３ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
ｘｌｉｉｉ） 約０．００００３１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
ｘｌｉｖ） 約０．０００３１９ｇ／Ｌ リボフラビン、
ｘｌｖ） 約６．１２３４ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
ｘｌｖｉ） 約０．０６２５ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
ｘｌｖｉｉ） 約０．０７０９９ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
ｘｌｖｉｉｉ） 約０．０５５ ピルビン酸ナトリウム、
ｘｌｉｘ） 約０．００３１７ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
ｌ） 約０．０００３６４ｇ／Ｌ チミジン、
ｌｉ） 約０．０００４３２ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉ） 約０．０００００１２５ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉｉ） 約０．０００００２２２ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
ｌｉｖ） 約０．００００４２ｇ／Ｌ リノール酸、
ｌｖ） 約０．０００３９０６５ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
ｌｖｉ） 約０．００１２ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、細胞培養培地補充物のうちの１または複数の塩は塩化マグネシウムを０．５〜５ｇ／Ｌの濃度で含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の塩化マグネシウムの濃度は約１．４２８ｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物は、組換えインスリンを増殖因子として含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度は０．５〜１５ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度は約３ｍｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちの１または複数の無機イオンは、モリブデン酸アンモニウム、硫酸カリウムクロム、硫酸銅、塩化リチウム、硫酸マンガン、メタけい酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせから選択される微量金属を含む。いくつかの実施形態において、モリブデン酸アンモニウムはモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏであり；硫酸カリウムクロムは硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏであり、硫酸銅は硫酸銅５Ｈ２Ｏであり、塩化リチウムは塩化リチウム（無水）であり、硫酸マンガンは硫酸マンガンＨ２Ｏであり、メタけい酸ナトリウムはメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏである。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、微量金属は以下の終濃度を提供する：
ｉ） ０．０００５〜０．０１ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
ｉｉ） ０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
ｉｉｉ） ０．００１〜０．１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
ｉｖ） ０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
ｖ） ０．００００４〜０．００４ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
ｖｉ） ０．０４〜４．２ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物は、モリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ、硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ、硫酸銅５Ｈ２Ｏ、塩化リチウム（無水）、硫酸マンガンＨ２Ｏおよびメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、微量金属は以下の終濃度を提供する：
ｉ） 約０．００３７ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
ｉｉ） 約０．００１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
ｉｉｉ） 約０．０１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
ｉｖ） 約０．０１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
ｖ） 約０．０００４５２ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
ｖｉ） 約０．４２６３ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちのアミノ酸補充物は、アスパラギンＨ２Ｏ、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度は以下である：
ｉ） ０．００７〜０．０７ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
ｉｉ） ０．２５〜２．５ｇ／Ｌ グルタミン；
ｉｉｉ） ０．５〜５．０ｇ／Ｌ ヒスチジン、遊離塩基；および
ｉｖ） ０．０１〜０．１ｇ／Ｌ セリン。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度は以下である：
ｉ） 約 ０．０２２５ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
ｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ グルタミン；
ｉｉｉ） 約１．５５２ｇ／Ｌ ヒスチジン；および
ｉｖ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ セリン。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちの１または複数のバッファーは、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）遊離酸、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）Ｎａ、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および炭酸水素ナトリウムよりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、製剤は、ＭＯＰＳ遊離酸およびＭＯＰＳ Ｎａの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、バッファーは以下の終濃度を提供する：
ｉ） ０．３〜３ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ遊離酸；および
ｉｉ） １．０〜１０ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ Ｎａ。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちの消泡剤は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをベースとしたポリオールコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、消泡剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の濃度は０．１〜１０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の濃度は約１ｇ／Ｌである。
別の態様において、本発明は、基礎培地粉末；１または複数の塩；１または複数の増殖因子；１または複数の無機イオン；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を合わせることを含む、本発明の配合細胞培養培地粉末製剤を作製する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、配合細胞培養培地粉末製剤を水と接触させ、それによって哺乳動物細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製することを含む、哺乳動物細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、成分は、水に実質的に溶解する。いくつかの実施形態において、方法は、ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびキレート剤を含む溶液を合わせることをさらに含む。いくつかの実施形態において、キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は、以下である：０．００４〜０．０４ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および０．００６〜０．０６ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は、以下である：約０．０１３８ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および約０．０１８６２５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。
別の実施形態において、方法は、本発明の細胞培養培地を細胞と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。
別の実施形態において、本発明は、細胞を本発明の細胞培養培地と接触させること、および細胞を培地中で一定の時間培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、目的タンパク質を発現する細胞を細胞培養培地と接触させること；細胞を培地中で一定の時間培養すること；および目的タンパク質を細胞培養培地から単離することを含む、目的タンパク質を生産する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（チャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ）細胞、ＤＰ１２ ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ヒト胎児腎、ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、目的タンパク質を組換えで発現する。いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）、そのバリアントおよび断片よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩは、野生型ＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメインを欠損したＦＶＩＩＩおよび生体適合性ポリマーとコンジュゲートしたＦＶＩＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着している。
本教示のこれらの態様および他の特徴は、本明細書中に記述されている。
当業者は、下に記載されている図面は説明の目的のみのためのものであることを理解する。図面は、本教示の範囲を何ら限定することが意図されるものではない。
非配合の培地調合物の説明。大半の（例として５７の）培地成分はＢａｓｅ Ｍｅｄｉａ（基礎培地）粉末中に含有されており、これらは予め混ぜ合わせることができる。追加の培地成分はそれら各々の標的終濃度まで別々に加えられ、製剤が完成する。ＦｅＳＯ４／ＥＤＴＡ、Ｔｒａｃｅ Ｍｅｔａｌｓ Ｐａｎｅｌ（微量金属パネル）およびｒＨインスリンはストック溶液として調製され、液体として培地バッチに加えられるが、塩化マグネシウムおよび補充物は粉末として加えられる。完全培地は、基礎的な細胞栄養分、塩、炭水化物、抗剪断因子、アミノ酸、ビタミン、微量金属、インスリン、ならびに細胞増殖および組換えタンパク質生産を助け、細胞から分泌された組換えタンパク質生産物を安定化させる様々な他の化学物質を含有する。 （ほぼ完全に配合された）本明細書中で「配合」製剤と呼ばれる製剤を用いた細胞培養培地調合物の説明。硫酸第一鉄／ＥＤＴＡは配合することができないが、これは明らかにＥＤＴＡによる他の二価微量金属（培地中に存在するもの）の意図せぬキレートが原因であり、それゆえに別々に加えられる。 現行のおよび配合された調製方法を用いた細胞培養ランは、同様の増殖性、代謝および生産物タイター（Ｐｏｔｅｎｃｙ（力価）として測定される）を実証した。基礎培地粉末（ｖ．１）および順次の補充物添加を用いた（図１）、および配合培地粉末（ｖ３．３）を硫酸第一鉄／ＥＤＴＡ添加のみを伴って用いた（図２）標準的方法で培地を調製し、ｒＦＶＩＩＩ発現細胞を１Ｌ灌流バイオリアクターランで培養するのに用いた。非配合培地から配合培地に変えた後、細胞培養性能およびｒＦＶＩＩＩタイター（力価）に明らかな変化はなかった。
本発明者は、細胞培養培地を作製するため、および組換えタンパク質生産のために有用な配合細胞培養培地粉末製剤を開発した。本明細書中に記載されているのは、コストを減らし、ワークフローを簡略化し、および培地調製の複雑性を減らすことができる配合哺乳動物細胞培養培地粉末の製剤、これを作製する方法および水和方法であって、これらの利点の全ては本明細書中に記載されている他の利点のなかでも商業的環境において特に重要である。
本明細書を解釈する目的のため、以下の定義が当てはまり、適切なときは常に、単数形で用いられる用語はその複数形をも包含し、逆もまた同様である。下に記述されるいずれかの定義が参照により本明細書中に組み込まれるいずれかの資料を包含するいずれかの他の資料におけるその言葉の使用と矛盾する場合、下に記述される定義は、（例えばその用語が元々用いられた資料において）逆の意味が明確に意図されないかぎり、常に、本明細書およびその関連したクレームを解釈する目的のために支配するものとなる。「または」の使用は、特に述べられないかぎり「および／または」を意味する。本明細書中での「ａ」の使用は、特に述べられないかぎり、または「１または複数の」の使用が明確に不適切な場合でないかぎり、「１または複数」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、交換可能であり、限定することを意図するものではない。さらには、１または複数の実施形態の記載が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いる場合、当業者は、いくつかの特定の例において、１または複数の実施形態を言語「から本質的になる」および／または「からなる」を用いて代替的に記載することができることを理解する。
特に定義されないかぎり、本明細書中で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明に関係する当業者が通例的に理解するものと同じ意味を持つ。以下の参考文献は、本発明中で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ． Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ． Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ ｅｄ．， ２０００）。実務者はまた、当該技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ Ｇｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ，ｅｄｓ．（１９９７）にも向けられる。本発明に具体的に当てはまるこれらの用語のうちのいくつかのさらなる説明は、本明細書中で提供される。
組成物に関する用語「約」は、プラスマイナス最大２０％までの範囲を意味する。
本明細書中で用いられるように、用語「細胞（ｃｅｌｌ）」、「細胞（ｃｅｌｌｓ）」、「細胞株」、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」および「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ）」は、交換可能に用いられ、植物細胞および動物細胞を包含し、無脊椎動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞および哺乳動物細胞を含む。全てのかかる名称は、細胞集団および後代を包含する。したがって、用語「トランスフォーマント」および「トランスフェクタント」は、初代の対象細胞およびそれに由来する細胞株を移植の回数にかかわらず包含する。例示的な非哺乳動物脊椎動物細胞としては、例えば、鳥類細胞、爬虫類細胞および両生類細胞が挙げられる。例示的な無脊椎動物細胞としては、限定されるものではないが、昆虫細胞、例えばイモムシ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞、蚊（エデス・エジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ））細胞、ショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞（シュナイダー細胞）およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞などが挙げられる。例として、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８８）を参照されたい。細胞は、分化していても、部分的に分化していても、または未分化、例として胚性幹細胞および多能性幹細胞といった幹細胞であってもよい。加えて、器官および器官系に由来する組織試料が本発明に従って用いられ得る。
用語「細胞培養」または「組織培養」とは、容器、例えばローラーボトル、組織培養フラスコ、ディッシュ、マルチウェルプレートなどの中で、懸濁液中で増殖させたまたは種々の表面または基材に付着させて増殖させた細胞をいう。付着細胞を撹拌発酵槽中でマイクロキャリアに付着させて増殖させることといった大規模アプローチ、例えばバイオリアクターなどもまた、用語「細胞培養」に包含される。そのうえ、特許請求の範囲に記載された発明の方法においては、接触依存的な細胞を培養するだけでなく、懸濁培養技術を用いることも可能である。例示的なマイクロキャリアとしては、例えばデキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロース、ならびにＢｕｔｌｅｒ，Ｓｐｉｅｒ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２８３−３０３（１９８８）中に記載されている他のものが挙げられる。多孔質担体、例えばＣｙｔｏｌｉｎｅ（商標）またはＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）など、同様にデキストランを基材とする担体、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ １（商標）第四級アミンでコーティングされたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標））などまたはゼラチンを基材とする担体、例えばゼラチンでコーティングされたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（商標））などもまた用いられ得る。タンパク質の大規模生産および小規模生産のいずれについての細胞培養手法も、本発明に包含される。限定されるものではないが流動層バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養または撹拌タンクバイオリアクターシステムといった手法が、マイクロキャリアを伴ってまたは伴わずに用いられ、回分モード、流加モードまたは灌流モードのいずれかで操作され得る。
用語「哺乳動物宿主細胞」、「哺乳動物細胞」、「哺乳動物組換え宿主細胞」などは、適切な栄養分および増殖因子を含有する培地中での単層培養または懸濁培養に置かれたときに増殖および生存の能力を持つ哺乳類に由来する細胞株をいう。例示的な哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、ならびにマウス、ハムスター、ラットおよびモルモットといった齧歯類に由来する細胞ならびにそれらの任意の派生物および後代が挙げられる。典型的に、細胞は、特定の目的タンパク質（典型的に組換えタンパク質）を発現して培養培地中に大量に分泌する能力があり、この目的のために培養される。しかしながら、細胞は、種々の他の目的のためにも培養され得るものであり、本発明の範囲は組換えタンパク質の生産のためだけに細胞を培養することに限定されない。本発明の培地中で増殖能を持つ好適な哺乳動物細胞株の例としては、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶＩ細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎細胞株２９３Ｓ（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶＩ−７６、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ ＳＩ）；ラット肝がん細胞（ＨＴＣ、ＭＩ．５４、Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８５：１（１９８０））；ならびにＴＲ−１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４（１９８２））およびハイブリドーマ細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｕｒｌａｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））を培地中で増殖させることができる。本発明の方法における使用に適したＣＨＯ細胞は、以下の資料中にも記載されている：１９８９年８月２９日に公開されたＥＰ１１７，１５９；米国特許第４，７６６，０７５号；第４，８５３，３３０号；第５，１８５，２５９号；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｓｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８９）中のＬｕｂｉｎｉｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．４４２〜４５１。本明細書中での使用に適した公知のＣＨＯ派生物としては、例えば、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，：４２１６（１９８０））、ＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２４９５−２４９９（１９８３）；上のＵｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ）およびｄｐ １２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ３０７，２４７）が挙げられる。１の実施形態において、培地中での増殖のために有用な細胞は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（チャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ）細胞、ＤＰ１２ ＣＨＯ 細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ヒト胎児腎、ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、タンパク質または目的タンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、タンパク質を組換えで発現するように設計されている。
１の実施形態において、本発明は、基礎培地粉末および細胞培養培地補充物を含む配合細胞培養培地粉末製剤であって、細胞培養培地補充物が１または複数の塩；１または複数の増殖因子；１または複数の無機イオン；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を含む、前記配合細胞培養培地粉末製剤を提供する。
配合細胞培養培地粉末製剤は、概して「無血清」である細胞培養培地としての使用のためのものであり、ここでこの培地は何らかの哺乳動物供給源からの血清（例としてウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を本質的に含まない。「本質的に含まない」とは、細胞培養培地が約０〜５％の間の血清、好ましくは約０〜１％の間の血清、最も好ましくは約０〜０．１％の間の血清を含むことを意味する。好都合には、無血清「限定」培地を用いることができ、ここでこの培地中の各々の成分の正体および濃度は公知である（すなわち未決定の成分、例えばウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）などはこの培養培地中に存在しない）。
それにもかかわらず、本発明中に記載されている配合細胞培養乾燥粉末培地は、様々な供給源および／もしくは動物からの血清ならびに／またはそれらの組み合わせもしくは派生物（例として、ＦＢＳまたはヒト血漿タンパク質分画溶液ＨＰＰＳなど）を加えることで細胞を培養するための最終製剤が生成する製剤中で用いることもできる。
用語「基礎培地粉末」または「基礎培地」とは、例えば以下の成分のいずれかまたは全てを含有し得る細胞培養培地をいう：タンパク質、脂質、炭水化物、アミノ酸、有機および／または無機の塩、バッファー（例として重炭酸塩）、ビタミン、ホルモン、抗生物質およびｐＨ指示薬（例としてフェノールレッド）。本発明に従って用いることができる細胞培養培地基材の例は、限定されず、以下を挙げることができる：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ（ハムＦ１２培地）、ＭＣＤＢ Ｍｅｄｉａ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（最小必須培地イーグル）、ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ、Ａｍｅｓ’ Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ−１０６６ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｃｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（グラスゴー最小必須培地、ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（イスコフ改変ダルベッコ培地、ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌ−１５培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ（リーボビッツ））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（マッコイ５Ａ改変培地）、ＮＣＴＣ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｗｉｍ’ｓ Ｓ−７７ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ウェイマウス培地）およびＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ウィリアム培地Ｅ）。いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、上に列挙された細胞培養培地基材の組み合わせまたは改変物である。いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ（ハムＦ１２培地）（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；１：１の比）である。
いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、以下の成分のうちの１もしくは複数またはそれらの組み合わせを含む：ビオチン、塩化カルシウム、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、Ｄ＋マンノース、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ブドウ糖（無水）、ＤＬ−アルファ−リポ酸、硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ、葉酸、グリシン、ヒポキサンチン、Ｉ−イノシトール、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸（無水）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタチオン、Ｌ−ヒスチジンＦＢ、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、塩化マグネシウム、無水硫酸マグネシウム、ナイアシンアミド、Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン、塩化カリウム、プトレッシン２ＨＣｌ、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、無水二塩基性リン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、チアミンＨＣｌ、チミジン、硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、硫酸銅、二酸化セレン、リノール酸、ベータ−メルカプトエタノールおよびエタノールアミン遊離塩基ＦＢ。
細胞培養培地成分は、概して以下の供給者から入手可能である：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｇｕｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、（Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ） Ｂａｙｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｉｎｃ．、Ｆｅｒｒｏ／Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ ＡｍｉｎｏＳｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ、ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｉｎｃ．およびＴｉｌｌｅｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．。
いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤は、ｐＨ指示薬を含む。ｐＨ指示薬は、細胞培養に適しているかぎり限定されない。いくつかの実施形態において、ｐＨ指示薬はＰｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）である。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）は約０．００１から約０．０２ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ（フェノールレッドＮａ）は約０．００６９ｇ／Ｌの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、水和させて細胞培養培地を形成させた際に以下の終濃度を提供する以下の成分を含む：
ｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ ビオチン；
ｉｉ） ０．０３５〜０．３３ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
ｉｉｉ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ 塩化コリン；
ｉｖ） ０．０００２〜０．００２ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
ｖ） １〜１０ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
ｖｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
ｖｉｉ） ０．３〜３．０ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
ｖｉｉｉ） ０．００００３〜０．０００３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
ｉｘ） ０．００００２〜０．０００１５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
ｘ） ０．０００１〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
ｘｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ 葉酸；
ｘｉｉ） ０．００７〜０．２０ｇ／Ｌ グリシン；
ｘｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
ｘｉｖ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
ｘｖ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
ｘｖｉ） ０．０８〜１．４ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
ｘｖｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
ｘｖｉｉｉ） ０．００５〜０．１０ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
ｘｉｘ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
ｘｘ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
ｘｘｉ） ０．００５〜０．１５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
ｘｘｉｉ） ０．０２〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
ｘｘｉｉｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
ｘｘｉｖ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
ｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
ｘｘｖｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
ｘｘｖｉｉ） ０．０５〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
ｘｘｖｉｉｉ） ０．０１〜０．３ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
ｘｘｉｘ） ０．０２〜０．６ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
ｘｘｘ） ０．００８〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
ｘｘｘｉ） ０．００９〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
ｘｘｘｉｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
ｘｘｘｉｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
ｘｘｘｉｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
ｘｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
ｘｘｘｖｉ） ０．０１〜０．１８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉ） ０．０２〜０．１２ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
ｘｘｘｉｘ） ０．０００５〜０．００５ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
ｘｌ） ０．１〜１．０ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
ｘｌｉ） ０．００００２〜０．０００２ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
ｘｌｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
ｘｌｉｉｉ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
ｘｌｉｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ リボフラビン、
ｘｌｖ） ２．０〜１５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
ｘｌｖｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
ｘｌｖｉｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
ｘｌｖｉｉｉ） ０．０１５〜０．１５ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、
ｘｌｉｘ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
ｌ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ チミジン、
ｌｉ） ０．０００１５〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉ） ０．００００００６〜０．０００００６ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉｉ） ０．００００００５〜０．０００００８ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
ｌｉｖ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ リノール酸、
ｌｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
ｌｖｉ） ０．０００３〜０．００５ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ。
いくつかの実施形態において、基礎培地粉末は、水和させて細胞培養培地を形成させた際に以下の終濃度を提供する以下の成分を含む：
ｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ ビオチン；
ｉｉ） 約０．１１６６５ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
ｉｉｉ） 約０．００９９８ｇ／Ｌ 塩化コリン；
ｉｖ） 約０．０００６８ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
ｖ） 約３ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
ｖｉ） 約０．００３１２ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
ｖｉｉ） 約１ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
ｖｉｉｉ） 約０．０００１０３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
ｉｘ） 約０．００００５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
ｘ） 約０．０００４１７ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
ｘｉ） 約０．００３６６ｇ／Ｌ 葉酸；
ｘｉｉ） 約０．０２６２６ｇ／Ｌ グリシン；
ｘｉｉｉ） 約０．００２７ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
ｘｉｖ） 約０．０１４５１ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
ｘｖ） 約０．０１３３６ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
ｘｖｉ） 約０．２７４３５ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
ｘｖｉｉ） 約０．０２２５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
ｘｖｉｉｉ） 約０．０１９９５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
ｘｉｘ） 約０．０１７５６ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
ｘｘ） 約０．０６２５６ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
ｘｘｉ） 約０．０２２０６ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
ｘｘｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
ｘｘｉｉｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
ｘｘｉｖ） 約０．０７３４８ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
ｘｘｖ） 約０．１０５７ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
ｘｘｖｉ） 約０．１１０９６ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
ｘｘｖｉｉ） 約０．１６３８５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
ｘｘｖｉｉｉ） 約０．０３２２４ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
ｘｘｉｘ） 約０．０６７４８ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
ｘｘｘ） 約０．０２８７５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
ｘｘｘｉ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
ｘｘｘｉｉ） 約０．１０１５６ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
ｘｘｘｉｉｉ） 約０．０１９０２ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
ｘｘｘｉｖ） 約０．１０７７１ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
ｘｘｘｖ） 約０．０９８６６ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
ｘｘｘｖｉ） 約０．０２８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉ） 約０．０４８８４ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉｉ） 約０．００３０２ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
ｘｘｘｉｘ） 約０．００１４ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
ｘｌ） 約０．３１１８２ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
ｘｌｉ） 約０．００００８１ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
ｘｌｉｉ） 約０．００３ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
ｘｌｉｉｉ） 約０．００００３１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
ｘｌｉｖ） 約０．０００３１９ｇ／Ｌ リボフラビン、
ｘｌｖ） 約６．１２３４ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
ｘｌｖｉ） 約０．０６２５ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
ｘｌｖｉｉ） 約０．０７０９９ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
ｘｌｖｉｉｉ） 約０．０５５ ピルビン酸ナトリウム、
ｘｌｉｘ） 約０．００３１７ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
ｌ） 約０．０００３６４ｇ／Ｌ チミジン、
ｌｉ） 約０．０００４３２ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉ） 約０．０００００１２５ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉｉ） 約０．０００００２２２ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
ｌｉｖ） 約０．００００４２ｇ／Ｌ リノール酸、
ｌｖ） 約０．０００３９０６５ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
ｌｖｉ） 約０．００１２ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ。
本明細書中で論じられている配合培地製剤中で用いることができる成分は、無水または水和の形態であることができ、多くのかかる無水または水和の形態の成分は当業者に公知である。例えば、上で指し示されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、水和形態の硫酸銅、硫酸亜鉛、一塩基性リン酸ナトリウム、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、硝酸第二鉄および硫酸第一鉄を含む。これらの成分の各々は、無水形態と置き換えることができ、その濃度範囲は水和形態と無水形態の間の分子量の差に基づいて再計算することができる。同じく、本明細書中で言及されている任意の無水形態は、水和形態と置き換えることができ、その濃度範囲はそれに応じて再計算される。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末の濃度は８〜３０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末の濃度は１２〜１４ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末の濃度は約１３ｇ／Ｌである。
細胞培養培地補充物のうちの１または複数の塩は、限定されず、細胞培養における使用に適した任意の塩、およびその水和状態のものを包含する。いくつかの実施形態において、１または複数の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２ならびにそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の補充物中の塩の量の濃度は０．５〜５ｇ／Ｌである。１の実施形態において、細胞培養培地補充物のうちの塩は、塩化マグネシウムである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の補充物のうちの塩化マグネシウムの濃度は約１．４２８ｇ／Ｌである。
細胞培養培地補充物のうちの１または複数の増殖因子は、限定されない。いくつかの実施形態において、増殖因子は、Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ（アンフィレギュリン）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ（アンジオポエチン）、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ（ベータセルリン）、（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−１３、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−１４、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−２、Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−３、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−４、Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−５、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−６、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）−７、Ｈｕｍａｎ ＣＤ１３５ Ｌｉｇａｎｄ／Ｆｌｔ−３ Ｌｉｇａｎｄ（ヒトＣＤ１３５リガンド／Ｆｌｔ−３リガンド）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｈｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ヒトマクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ）、Ｈｕｍａｎ Ｃｒｉｐｔｏ−１、Ｈｕｍａｎ ＣＴＧＦ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（結合組織増殖因子））、Ｈｕｍａｎ ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（上皮増殖因子））、Ｈｕｍａｎ ＥＧ−ＶＥＧＦ（Ｅｎｄｃｒｉｎｅ−Ｇｌａｎｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（内分泌腺由来血管内皮増殖因子））、Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ヒトエリスロポエチン、ＥＰＯ）、Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（線維芽細胞増殖因子）１−２３）、Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ−１１、Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ−１５、Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ−８、Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ヒト成長ホルモン放出因子、ＧＨＲＦ、ＧＲＦ、ＧＨＲＨ、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ（成長ホルモン放出ホルモン）、Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ヒトヘパリン結合性上皮増殖因子、ＨＢ−ＥＧＦ）、Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ヒト肝細胞増殖因子、ＨＧＦ）、Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ ｂｅｔａ １（ヒトヘレグリンベータ１）、Ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ（ヒトインスリン）、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１（インスリン様増殖因子−１））、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦ−２（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−２（インスリン様増殖因子−２））、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦＢＰ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（インスリン様増殖因子結合タンパク質１））、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦＢＰ−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３（インスリン様増殖因子結合タンパク質３））、腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）、Ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ヒトケラチノサイト増殖因子）１＆２、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ヒト白血病阻止因子、ＬＩＦ）、Ｈｕｍａｎ ＭＳＰ、Ｈｕｍａｎ Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ヒトミオスタチン）、Ｈｕｍａｎ Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ｐｒｏ（ヒトミオスタチン、プロペプチド）、Ｈｕｍａｎ ＮＲＧ１、Ｈｕｍａｎ ＮＧＦ、Ｈｕｍａｎ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ（ヒトオンコスタチンＭ）、Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｃｔｏｒ １（ヒト造骨細胞特異的因子１、ＯＳＦ−１、Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ（プレイオトロフィン））、Ｈｕｍａｎ ＰＤ−ＥＣＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、血小板由来内皮細胞増殖因子）、Ｈｕｍａｎ ＰＤＧＦ、Ｈｕｍａｎ ＰＩＧＦ、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １（胎盤増殖因子１、ＰＬＧＦ１）、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（胎盤増殖因子２、ＰＬＧＦ２）、Ｈｕｍａｎ ＳＣＧＦ−ａ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（幹細胞増殖因子アルファ））、Ｈｕｍａｎ ＳＣＧＦ−ｂ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ（幹細胞増殖因子ベータ））、Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）／ＣＤ１１７ Ｌｉｇａｎｄ（ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）／ＣＤ１１７リガンド）、Ｈｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ヒトトロンボポエチン、ＴＰＯ、ＴＨＰＯ）、Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ヒトトランスフォーミング増殖因子）、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−ａｌｐｈａ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（トランスフォーミング増殖因子アルファ）、ＴＧＦａ）、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ １（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子ベータ１）、ＴＧＦｂ）、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ １．２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子ベータ１）、ＴＧＦｂ）、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ２（トランスフォーミング増殖因子ベータ２）、ＴＧＦｂ）、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ３（トランスフォーミング増殖因子ベータ３）、ＴＧＦｂ）、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（血管内皮増殖因子））、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ−１２１、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ−１６５およびＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ−Ａである。上のリストは、天然起源および合成の両方の前述の因子のアミノ酸置換体および／または伸長体および／または欠失体といった、配列バリアント、アナログおよびアゴニストを包含する（例えばＩＧＦ−ＩはＬＲ３−ＩＧＦ−Ｉ、米国特許第５，３３０，９７１号を包含する）。
いくつかの実施形態において、増殖因子はインスリンを含む。インスリンは組換えで生産することも、天然の供給源から単離することも、または合成であることもできる。いくつかの実施形態において、インスリンはヒト組換えインスリン（ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）である。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度は０．５〜１５ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度は約３ｍｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちの１または複数の無機イオンは、モリブデン酸アンモニウム、硫酸カリウムクロム、硫酸銅、塩化リチウム、硫酸マンガン、メタけい酸ナトリウム、パラモリブデン酸アンモニウム、酸化アンモニウムバナジウム、硫酸第一鉄、塩化ニッケル、亜セレン酸、塩化第１スズ、硫酸亜鉛およびそれらの組み合わせから選択される微量金属を含む。いくつかの実施形態において、モリブデン酸アンモニウムはモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏであり；硫酸カリウムクロムは硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏであり、硫酸銅は硫酸銅５Ｈ２Ｏであり、塩化リチウムは塩化リチウム（無水）であり、硫酸マンガンは硫酸マンガンＨ２Ｏであり、メタけい酸ナトリウムはメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏである。化学物質は、一般にＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈおよびＶＷＲから入手可能である。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際の細胞培養培地補充物のうちの１または複数の無機イオンの終濃度は以下である：
ｉ） ０．０００５〜０．０１ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
ｉｉ） ０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
ｉｉｉ） ０．００１〜０．１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
ｉｖ） ０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
ｖ） ０．００００４〜０．００４ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
ｖｉ） ０．０４〜４．２ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物の１または複数の無機イオンは、モリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ、硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ、硫酸銅５Ｈ２Ｏ、塩化リチウム（無水）、硫酸マンガンＨ２Ｏおよびメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際に、微量金属は以下の終濃度を提供する：
ｉ） 約０．００３７ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
ｉｉ） 約０．００１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
ｉｉｉ） 約０．０１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
ｉｖ） 約０．０１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
ｖ） 約０．０００４５２ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
ｖｉ） 約０．４２６３ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
細胞培養培地補充物のうちのアミノ酸補充物は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、システイン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンといった任意のアミノ酸を包含することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物のうちのアミノ酸補充物は、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンの組み合わせを含む。細胞培養に適したアミノ酸は、一般にＫｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．およびＡｊｉｎｏｍｏｔｏ ＡｍｉｎｏＳｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣから入手可能である。いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度は以下である：
ｉ） ０．００７〜０．０７ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
ｉｉ） ０．２５〜２．５ｇ／Ｌ グルタミン；
ｉｉｉ） ０．５〜５．０ｇ／Ｌ ヒスチジン、遊離塩基；および
ｉｖ） ０．０１〜０．１ｇ／Ｌ セリン。
いくつかの実施形態において、水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度は以下である：
ｉ） 約 ０．０２２５ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
ｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ グルタミン；
ｉｉｉ） 約１．５５２ｇ／Ｌ ヒスチジン；および
ｉｖ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ セリン。
細胞培養培地補充物のうちのバッファーは限定されない。「バッファー」は、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨ変化に抵抗する溶液である。例えばバッファーの所望ｐＨに応じて（ならびに細胞増殖および代謝性質、用いた細胞培養培養系、ｐＨ調整および培地に応じて）使用することができる様々なバッファーは、Ｂｕｆｆｅｒｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，ｅｄ． Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）中に記載されている。１の実施形態において、バッファーのｐＨは約２から約９、あるいは約３から約８、あるいは約４から約７あるいは約５から約７の範囲内である。この範囲内でｐＨを調整するバッファーの限定されない例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アンモニウムバッファー、同様にこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、バッファーは、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）遊離酸、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）Ｎａ、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および炭酸水素ナトリウムよりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、製剤は、ＭＯＰＳ遊離酸およびＭＯＰＳ Ｎａの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、細胞培養培地補充物のうちのバッファーは以下の終濃度を提供する：
ｉ） ０．３〜３ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ遊離酸；および
ｉｉ） １．０〜１０ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ Ｎａ。
本発明の消泡剤は限定されない。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤のうちの消泡剤は、イオン性または非イオン性の界面活性剤を含む。消泡（「ｄｅｆｏａｍｉｎｇ」とも呼ばれる）剤としては、オイル、水、シリコーン、ポリエチレングリコール／コポリマーおよびアルキルポリアクリレートをベースとするものを挙げることができる。一般的な例としては、以下が挙げられる：Ｓｃｈｉｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｉｎｇｅｒ’ｓ Ｓｔｒｕｋｔｏｌ ＳＢ２１２１（ポリアルキレングリコール）、Ｓｃｈｉｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｉｎｇｅｒ’ｓ Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３Ａ（植物ベースのアルコキシル化脂肪酸エステル）、Ｆｌｕｋａ Ｐ２０００（ポリプロピレングリコール）、Ｓｉｇｍａ Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ（シリコーンポリマーの３０％エマルション）およびＳｉｇｍａ Ａｎｔｉｆｏａｍ Ｃ（シリコーンポリマーの３０％エマルション）（参考文献：Ｓａｒａｈ Ｊ Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（２０１２）；Ｂｅｙｏｎｄ ｄｅ−ｆｏａｍｉｎｇ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｆｏａｍｓ ｏｎ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ．３（４）およびその中の参考文献）。いくつかの実施形態において、消泡剤は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをベースとしたポリオールコポリマーである。
いくつかの実施形態において、消泡剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８は、平均分子量８４００の非イオン性ブロックコポリマーであり、中央のポリ（オキシプロピレン）のブロック（２０重量％）および両端のポリ（オキシエチレン）のブロックからなる。いくつかの実施形態において、他のポリオールもまた用いることができ、これらとしては約１０００から約１６，０００の範囲の分子量を持つポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、消泡剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８であり、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたときの濃度は０．１〜１０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせて細胞培養培地を形成させたとき、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の濃度は約１ｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態において、配合細胞培養培地粉末製剤は、水和させて細胞培養培地を形成させた際に以下の終濃度を提供する以下の成分を含む：
ｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ ビオチン；
ｉｉ） ０．０３５〜０．３３ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
ｉｉｉ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ 塩化コリン；
ｉｖ） ０．０００２〜０．００２ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
ｖ） １〜１０ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
ｖｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
ｖｉｉ） ０．３〜３．０ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
ｖｉｉｉ） ０．００００３〜０．０００３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
ｉｘ） ０．００００２〜０．０００１５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
ｘ） ０．０００１〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
ｘｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ 葉酸；
ｘｉｉ） ０．００７〜０．２０ｇ／Ｌ グリシン；
ｘｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
ｘｉｖ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
ｘｖ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
ｘｖｉ） ０．０８〜１．４ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
ｘｖｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
ｘｖｉｉｉ） ０．００５〜０．１０ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
ｘｉｘ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
ｘｘ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
ｘｘｉ） ０．００５〜０．１５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
ｘｘｉｉ） ０．０２〜０．６ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
ｘｘｉｉｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
ｘｘｉｖ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
ｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
ｘｘｖｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
ｘｘｖｉｉ） ０．０５〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
ｘｘｖｉｉｉ） ０．０１〜０．３ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
ｘｘｉｘ） ０．０２〜０．６ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
ｘｘｘ） ０．００８〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
ｘｘｘｉ） ０．００９〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
ｘｘｘｉｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
ｘｘｘｉｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
ｘｘｘｉｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
ｘｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
ｘｘｘｖｉ） ０．０１〜０．１８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム
ｘｘｘｖｉｉ） ０．０２〜０．１２ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
ｘｘｘｖｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
ｘｘｘｉｘ） ０．０００５〜０．００５ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
ｘｌ） ０．１〜１．０ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
ｘｌｉ） ０．００００２〜０．０００２ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
ｘｌｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
ｘｌｉｉｉ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
ｘｌｉｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ リボフラビン、
ｘｌｖ） ２．０〜１５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
ｘｌｖｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
ｘｌｖｉｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
ｘｌｖｉｉｉ） ０．０１５〜０．１５ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、
ｘｌｉｘ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
ｌ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ チミジン、
ｌｉ） ０．０００１５〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉ） ０．００００００６〜０．０００００６ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
ｌｉｉｉ） ０．００００００５〜０．０００００８ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
ｌｉｖ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ リノール酸、
ｌｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；
ｌｖｉ） ０．０００３〜０．００５ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ；
ｌｖｉｉ） ０．５〜５ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２；
ｌｖｉｉｉ） ０．５〜１５ ｍｇ／Ｌ インスリン；
ｌｉｘ） ０．０００５〜０．０１ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
ｌｘ） ０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
ｌｘｉ） ０．００１〜０．１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
ｌｘｉｉ） ０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
ｌｘｉｉｉ） ０．００００４〜０．００４ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；
ｌｘｉｖ） ０．０４〜４．２ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ；
ｌｘｖ） ０．００７〜０．０７ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
ｌｘｖｉ） ０．２５〜２．５ｇ／Ｌ グルタミン；
ｌｘｖｉｉ） ０．５〜５．０ｇ／Ｌ ヒスチジン、遊離塩基；
ｌｘｖｉｉｉ） ０．０１〜０．１ｇ／Ｌ セリン；
ｌｘｉｘ） ０．３〜３ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ遊離酸；
ｌｘｘ） １．０〜１０ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ Ｎａ；および
ｌｘｘｉ） ０．１〜１０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８。
別の実施形態において、本発明は、基礎培地粉末の成分；１または複数の塩；１または複数の増殖因子；１または複数の無機イオン；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を合わせることを含む、本発明の配合細胞培養培地粉末製剤を作製する方法を提供する。配合細胞培養培地粉末製剤の成分の添加順序は限定されない。１の実施形態において、組成物の各成分が個々に加えられることで、配合細胞培養培地粉末製剤が作製される。いくつかの実施形態において、基礎培地は、最初はバッチとして作製され、次いで培養培地補充物を構成する他の成分と合わされる。いくつかの実施形態において、細胞培養培地補充物をバッチとして作製し、その後にバッチ化された基礎培地粉末と合わせるか、または順次添加により基礎培地粉末の成分と合わせることで、配合細胞培養培地粉末製剤を作製することができる。
細胞培養培地は、水和ステップを実施することにより、本発明の配合細胞培養培地粉末製剤を用いて調製することができる。別の態様において、本発明は、配合細胞培養培地粉末製剤を水と接触させ、それによって細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製することを含む、細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製する方法を提供する。１の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、成分は、水に実質的に溶解する。いくつかの実施形態において、タンクを水で満たし、配合細胞培養培地粉末製剤をタンクに加える。ユーザーは、成分の全てが狙った量で存在することを確実にするため、混合ならびに浸透圧、導電率およびｐＨの試験により粉末が溶解したことを確かめる品質管理プロセスステップを実施してもよい。
１の実施形態において、本発明は、配合細胞培養培地粉末製剤を水で実質的に溶解させることを含み、ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびキレート剤を含む溶液を合わせることをさらに含んでもよい、細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、水とＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびキレート剤を含む溶液とを最初に混合し、その後に配合細胞培養培地粉末製剤を加える。いくつかの実施形態において、キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は、以下である：０．００４〜０．０４ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および０．００６〜０．０６ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。いくつかの実施形態において、細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は、以下である：約０．０１３８ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および約０．０１８６２５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。
別の実施形態において、本発明は、細胞を本発明の細胞培養培地と接触させること、および細胞を培地中で一定の時間培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、回分培養または半回分培養でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、細胞は、灌流培養でインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、目的タンパク質を発現させるためのものである。別の実施形態において、本発明は、目的タンパク質を発現する細胞を細胞培養培地と接触させること；細胞を培地中で一定の時間培養すること；および目的タンパク質を細胞培養培地から単離することを含む、目的タンパク質を生産する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）ならびにその機能的バリアントおよび断片よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、それらがヒトＦＶＩＩＩの機能的セグメントおよび必須の特徴的なヒトＦＶＩＩＩの機能的活性を含有するかぎり、ＦＶＩＩＩの派生物をもたらす対立遺伝子変異、グリコシル化バージョン、修飾体および断片を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明の配合培地を用いた発現のために有用なＦＶＩＩＩ分子は、完全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたは断片、ならびにそれらのバリアントおよび抗原性断片を包含する。ＦＶＩＩＩへの言及は、かかるタンパク質の全ての可能な形態を包含することを意味する。
組換えＦＶＩＩＩの例としては、いずれもＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造販売されているＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（商標）およびＡｄｖａｔｅ（登録商標）；Ｗｙｅｔｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造販売されている、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメイン欠損形態であるＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）；ならびにＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造販売されているＫＯＧＥＮＡＴＥが挙げられる。いくつかの実施形態において、発現させるＦＶＩＩＩポリペプチドは、完全長ヒトＦＶＩＩＩを含む。いくつかの実施形態において、完全長ＦＶＩＩＩは、配列番号１、配列番号２およびそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含むが、対立遺伝子バリアントが可能である。分泌タンパク質として、ＦＶＩＩＩは、翻訳プロセス中にタンパク質分解で切断されるシグナル配列を含有する。１９アミノ酸のシグナル配列が除かれた後、分泌されたＦＶＩＩＩ産物の最初のアミノ酸はアラニンである。
いくつかの実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩは、Ｂ−ドメインを欠損したＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）である。本明細書中で用いられるように、ＢＤＤは、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの１４アミノ酸以外の全ての欠損を含有するアミノ酸配列を持つことを特徴とする。Ｂ−ドメインの最初の４アミノ酸（配列番号３）は、Ｂ−ドメインの最後の１０残基（ＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号４）につながっている。いくつかの実施形態において、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、配列番号５および配列番号６ならびにそれらの組み合わせよりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩは、生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧなどで修飾することができる。第ＶＩＩＩ因子のＰＥＧ化形態は、ＷＯ２００６／０５３２９９および米国特許出願公開Ｎｏ．２００６０１１５８７６中に開示されており、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
以下のＦＶＩＩＩの例において、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質は、当該技術分野で慣用的な方法で名付けられる。本明細書中で用いられるように、「変異タンパク質」は、実験室で導入されたタンパク質またはポリペプチドへの突然変異の結果として生じる遺伝子改変タンパク質である。変異体の命名については、配列番号２中で提供される成熟した、完全長の第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列に基づくのが慣例的である。
慣用的であって本明細書中で用いられるように、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ内の変異アミノ酸を呼ぶとき、変異アミノ酸は、完全長ＦＶＩＩＩ配列中のその位置により命名される。例えば、ある特定の変異タンパク質はＫ１８０８Ｃと命名されるが、それは、完全長配列中の１８０８と似た位置におけるリジン（Ｋ）がシステイン（Ｃ）に変わったためである。いくつかの実施形態において、下で論じられる変異体について、システインが完全長ＦＶＩＩＩまたはＢ−ドメイン欠損ＦＶＩＩＩの指定された位置における天然のアミノ酸を置き換え、生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧなどが、システイン残基に付着している。
生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧなどの定義済みの共有結合のための部位は、ＦＶＩＩＩ活性に関与しないまたはＦＶＩＩＩをインビボで安定化させる他のメカニズム、例えばｖＷＦへの結合などに関与する、ポリペプチドの表面上に露出した部位から最良に選択される。かかる部位はまた、ＦＶＩＩＩを不活性化または循環から取り除くメカニズムに関与することが知られている部位から最良に選択される。これらの部位の選択は、下に詳細に論じられている。好ましい部位としては、（ａ）低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質、（ｂ）ヘパリン硫酸プロテオグリカン、（ｃ）低密度リポタンパク質受容体および／または（ｄ）第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の結合部位の中または近傍にあるアミノ酸残基が挙げられる。「結合部位の中または近傍にある」とは、その部位への生体適合性ポリマーの共有結合的付着が結合部位の立体障害をもたらすほどに結合部位に十分に近い残基を意味する。かかる部位は、例えば結合部位の２０オングストローム以内にあると予想される。
１の実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに、（ａ）第ＶＩＩＩ因子クリアランス受容体、（ｂ）第ＶＩＩＩ因子の分解能を持つプロテアーゼの結合部位および／または（ｃ）第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の結合部位の中または近傍にあるアミノ酸残基において共有結合的に付着する。プロテアーゼは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）であり得る。別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の定義済みの部位において、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質のこのポリペプチドへの結合がコンジュゲートしていないときのポリペプチドへの結合より弱く、好ましくは２倍超弱いように共有結合的に付着する。１の実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の定義済みの部位において、ヘパリン硫酸プロテオグリカンのこのポリペプチドへの結合がコンジュゲートしていないときのポリペプチドへの結合より弱く、好ましくは２倍超弱いように共有結合的に付着する。さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の定義済みの部位において、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体のこのポリペプチドへの結合がコンジュゲートしていないときのポリペプチドへの結合より弱く、好ましくはコンジュゲートしていないときのポリペプチドへの結合より２倍超弱いように共有結合的に付着する。別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の定義済みの部位において、低密度リポタンパク質受容体のこのポリペプチドへの結合がコンジュゲートしていないときのポリペプチドへの結合より弱く、好ましくは２倍超弱いように共有結合的に付着する。別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の定義済みの部位において、ポリペプチドがコンジュゲートしていないときよりも血漿プロテアーゼがこのポリペプチドを分解しないように共有結合的に付着する。さらなる実施形態において、血漿プロテアーゼによるこのポリペプチドの分解は、同じ時間にわたって同じ条件下で測定されるコンジュゲートしていないときのポリペプチドの分解より２倍超少ない。
ＦＶＩＩＩに対するＬＲＰ、ＬＤＬ受容体またはＨＳＰＧの結合アフィニティーは、表面プラスモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて決定することができる。例えば、ＦＶＩＩＩを直接的に、またはＦＶＩＩＩ抗体を介して間接的にＢｉａｃｏｒｅチップにコーティングし、様々な濃度のＬＲＰをチップ上で通過させることで、相互作用があるときの速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）とないときの速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の両方を測定することができる（Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ Ｎ． ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１１），ｐｐ．９３７０−７）。２つの速度の比は、アフィニティーの測定値を与える。ＰＥＧ化時のアフィニティーが２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、なおより好ましくは３０倍減少するのが望ましい。
プロテアーゼＡＰＣによるＦＶＩＩＩの分解は、当業者に公知の方法のいずれかにより測定することができる。
１の実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着する。別の実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着し、（１）このコンジュゲートの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への結合は、コンジュゲートしていないポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への結合より弱い；（２）このコンジュゲートの低密度リポタンパク質受容体への結合は、コンジュゲートしていないポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体への結合より弱い；または（３）このコンジュゲートの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度リポタンパク質受容体の両方への結合は、コンジュゲートしていないポリペプチドの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度リポタンパク質受容体への結合より弱い。１の実施形態において、Ｂ−ドメイン欠損ＦＶＩＩＩ中の残基１８０４をシステインに変異させ、ＰＥＧとコンジュゲートさせる。
さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着し、このコンジュゲートのヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合は、コンジュゲートしていないポリペプチドのヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合より弱い。さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着し、このコンジュゲートは、コンジュゲートしていないポリペプチドより弱く第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に結合する。さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ（配列番号２）のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数において、好ましくは位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着し、このコンジュゲートはコンジュゲートしていないポリペプチドよりも第ＶＩＩＩ因子分解能を持つ血漿プロテアーゼによる分解が少ない。より好ましくは、血漿プロテアーゼは活性化プロテインＣである。
さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、Ｂ−ドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子に、アミノ酸位置１２９、４９１、１８０４および／または１８０８において、より好ましくは４９１または１８０８において共有結合的に付着する。さらなる実施形態において、生体適合性ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸位置１８０４においてこのポリペプチドに付着し、ポリエチレングリコールを含む。好ましくは、１または複数の定義済みの生体適合性ポリマー付着部位は、部位特異的システイン変異により制御される。
機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド上の１または複数の、好ましくは１または２の部位は、定義済みのポリマー付着部位であり得る。特定の実施形態において、このポリペプチドはモノＰＥＧ化またはジＰＥＧ化される。
本発明はまた、機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を変異させることで、定義済みの部位においてコーディング配列をシステイン残基に置き換えること；変異ヌクレオチド配列を発現させることで、システイン強化変異タンパク質を生産すること；変異タンパク質を精製すること；変異タンパク質を、実質的に還元されたシステイン残基のみにおいてポリペプチドと反応するように活性化された生体適合性ポリマーと反応させることで、コンジュゲートを形成させること；およびコンジュゲートを精製することを含む、コンジュゲートの調製方法に関する。別の実施形態において、本発明は、（ａ）部位特異的な第ＶＩＩＩ因子変異タンパク質であって、第ＶＩＩＩ因子変異タンパク質の露出した表面上のアミノ酸残基がシステイン置換されており、そのシステインがキャップされている前記変異タンパク質を発現させること；（ｂ）システイン変異タンパク質を穏やかに還元するための条件下で、システイン変異タンパク質を還元剤と接触させることで、キャップを外すこと；（ｃ）キャップおよび還元剤をシステイン変異タンパク質から除去すること；ならびに（ｄ）還元剤の除去から少なくとも約５分間、好ましくは少なくとも１５分間、なおより好ましくは少なくとも３０分間、ＰＥＧ化された第ＶＩＩＩ因子変異タンパク質を生産するような条件下で、スルフヒドリルカップリング部分を含むＰＥＧでシステイン変異タンパク質を処理することを含む、第ＶＩＩＩ因子変異タンパク質の部位特異的ＰＥＧ化の方法を提供する。ＰＥＧのスルフヒドリルカップリング部分は、チオール部分、トリフレート部分、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）部分、アジリジン部分、オキシラン部分、Ｓ−ピリジル部分およびマレイミド部分よりなる群から選択され、好ましくはマレイミドである。
１の実施形態において、１または複数の表面ＢＤＤアミノ酸をシステインで置き換え、哺乳動物発現系においてシステイン変異タンパク質を生産し、発現の際に増殖培地からのシステインによりキャップされたシステインを還元し、還元剤を除去することでＢＤＤジスルフィドを再形成させ、システイン特異的生体適合性ポリマー試薬、例えばＰＥＧ−マレイミドなどと反応させる。かかる試薬の例は、例えばサンカルロス、カリフォルニアのＮｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからそれぞれＮｅｋｔａｒカタログ番号２Ｄ２Ｍ０Ｈ０１ ｍＰＥＧ−ＭＡＬ ＭＷ ５，０００Ｄａ、２Ｄ２Ｍ０Ｐ０１ ｍＰＥＧ−ＭＡＬ ＭＷ ２０ｋＤ、２Ｄ３Ｘ０Ｐ０１ ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ ＭＷ ４０ｋＤの下で入手可能な５、２２もしくは４３ｋＤ、またはＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京、日本からそれぞれＮＯＦカタログ番号Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−１２０ＭＡおよびＳｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−３００ＭＡの下で入手可能な１２もしくは３３ｋＤなどのＰＥＧサイズを有するＰＥＧ−マレイミドである。ＰＥＧ化された生産物は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することで未反応のＰＥＧが除去され、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することで未反応のＢＤＤが除去される。この方法は、ＦＶＩＩＩとの何らかの不都合な相互作用、例えば受容体を介したクリアランス、阻害抗体の結合およびタンパク質分解酵素による分解などを特定して選択的に保護するために用いることができる。なお、ＮｅｋｔａｒまたはＮＯＦにより５ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は本発明者らの実験室において６ｋＤとして試験され、同様に直鎖の２０ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は本発明者らの実験室において２２ｋＤとして試験され、４０ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は本発明者らの実験室において４３ｋＤとして試験され、６０ｋＤとして供給されたＰＥＧ試薬は本発明者らの実験室において６４ｋＤとして試験されたことを述べておく。混同を避けるため、本明細書中のディスカッションの中では、製造者が同定した通りに５ｋＤと報告している５ｋＤ ＰＥＧ以外は、本発明者らの実験室において試験された分子量を用いる。
ＢＤＤの位置４９１および１８０８におけるシステイン変異（上に開示されているもの）に加えて、位置４８７、４９６、５０４、４６８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３および１８０４をシステインへと変異させることで、ＰＥＧ化時にＬＲＰ結合を遮断することが潜在的に可能になった。また、位置３７７、３７８および５５６をシステインへと変異させることで、ＰＥＧ化時にＬＲＰおよびＨＳＰＧの両方の結合を遮断することが可能になった。位置８１、１２９、４２２、５２３、５７０、１８６４、１９１１、２０９１および２２８４は、これらの位置における高分子のＰＥＧ（＞４０ｋＤ）での部位特異的ＰＥＧ化が天然のグリコシル化部位（４１、２３９および２１１８）およびＬＲＰ結合部位におけるＰＥＧ化を伴って、ＢＤＤの表面を完全に覆い、新規のＢＤＤクリアランスメカニズムを同定できるよう、ＢＤＤ上で等しく離れるように選択された。
１の実施形態において、細胞培養培地は、ジスルフィド結合を形成することにより変異タンパク質上のシステイン残基を「キャップ」するシステインを含有する。コンジュゲートの調製において、組換え系において生産されるシステイン変異タンパク質は、培地からのシステインでキャップされ、このキャップは、キャップを外す穏やかな還元により除去され、その後にシステイン特異的ポリマー試薬が加えられる。当業者に明らかであるように、ＦＶＩＩＩの部位特異的変異のための当該技術分野で公知の他の方法もまた用いられ得る。
いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩは、野生型ＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠損ＦＶＩＩＩおよび生体適合性ポリマーとコンジュゲートしたＦＶＩＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着する。
本発明は本明細書中である特定の例および実施形態を参照して記載されているが、当業者は、全ての関連する特許法に従う目的のために、様々な例および実施形態を組み合わせることができることを理解する（例として、具体的な例の中に記載されている方法は、それへの参照が明示的に述べられていなくとも、本発明の特定の態様およびその操作を記載するために用いることができる）。
実施例１
第ＶＩＩＩ因子を生産するための現行の培地調製方法は、それらの細胞培養培地を構築するために数種のアドバック（ａｄｄ−ｂａｃｋ）溶液および乾燥粉末成分／混合物の添加を伴う。増殖および性能特性が許容されるより複雑な（すなわちアドバックのより少ない）粉末製剤を特定するため、アドバック（ＤＰＭへと粉砕されたもの）のうちのいくつかまたは全てを包含する数種の関係する粉末バリエーションを評価した。ゴールは、培地製剤プロセスを合理化し、（表１中に見られるような）サプライチェーンの複雑性を減らすことである。
ＰＥＧ化された第ＶＩＩＩ因子を生産するのに適した粉末化培地製剤を生産するため、最適化されたＦＶＩＩＩ粉末製剤をアミノ酸粉末ブレンド（３×ＡＡ混合物）と混ぜて１つの製剤にし、その特性を評価した。
材料／方法
材料
天秤はＭＳＡ１２４Ｓであり；浸透圧計はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｄｅｌ ３３００であり；ｐＨの示度はＴｈｅｒｍｏＯｒｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ ７２０Ａで取得し；濁度の示度はＨａｃｈ ２１００Ｎ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ上で測定し；インスリンのＵＰＬＣ分析はＡｃｑｕｉｔｙ Ｈ−Ｃｌａｓｓ、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラムによって行い；インスリンのＥＬＩＳＡ定量はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＬＩＳＡキットを用いて行い；アミノ酸の定量はＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＡＡＡカラムによって行い；ＩＣＰ分析はＡｇｉｌｅｎｔ ７２０−ＥＳ ＩＣＰ−ＯＥＳ上で行った。
方法
ＤＰＭのバージョンならびに全ての関連したアドバック溶液および粉末はＳＡＦＣ’ｓ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ａｄｖａｎｔａｇｅ部門により製造された。アドバック粉末および溶液は表１中にまとめられている。バージョン、粉末の明細、およびＳＡＦＣ製品番号は表２中にまとめられている。
表１：現行の培地製剤材料
Figure 2017510283
Figure 2017510283
＊下の実施例２の製剤を参照されたい。
表２：評価された様々な第ＶＩＩＩ因子（非ＰＥＧ化）製剤
Figure 2017510283
Figure 2017510283
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ製剤は、２２．２９ｇ／Ｌ 非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３を２．５９４ｇ／Ｌ ３×ＡＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｉｘと混合した組み合わせであった。
結果
以下の特性についてこれらのバージョンを試験した：
１）水和された粉末のｐＨおよび浸透圧
２）アミノ酸濃度の分析
３）Ｆｅ濃度の分析
４）インスリン濃度の分析
表３Ａおよび表３Ｂは、試験された非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩバージョンについてのデータをまとめている。
表３Ａ：非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ １〜６についての完成品の結果
Figure 2017510283
表３Ｂ：非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ １〜６についての完成品の結果
Figure 2017510283
インスリン定量用のＨＰＬＣの使用は、インスリン用のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＬＩＳＡキットを用いるよりも精密で正確である。ＨＰＬＣ法はインスリン定量用のＵＳＰ ＨＰＬＣ法と非常に類似しており、したがって頑強で頑丈であり、その精密性および正確性は確立されている。対照的に、ＥＬＩＳＡ法は単純なインスリン製剤のために設計されており、おそらく細胞培養において見出されるかかる複雑な製剤における使用のために最適化されていない。おそらく、ＥＬＩＳＡ試験で見られた一致しない結果はインスリン結合との成分の干渉（または競合的阻害）が原因であり、それゆえにＥＬＩＳＡ試験をかかる複雑な細胞培養培地中のインスリンの精密な定量のために最適以下のものとしている。
表４は、１ＬのＶｅｒｓｉｏｎ １、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１およびＶｅｒｓｉｏｎ ３．３をろ過するために用いた０．２２μｍのろ紙上に残った鉄の残留を概説している。この鉄試験の結果は、使用のための製剤としてＶｅｒｓｉｏｎ ３．３を選択することの根拠であった。
表４：様々なバージョンの非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを個々にろ過するために用いられた０．２２μｍろ紙をすすいだものからの鉄の量
Figure 2017510283
表５は、試験されたＫＧ−Ｎバージョンについての結果をまとめている。
表５：ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩバージョンについての完成品の結果
Figure 2017510283
結論
非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの最終バージョンは、Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３であった。これは、製剤中の大部分（９７．１％）の鉄および全ＥＤＴＡを抜いた完全培地である。この鉄／ＥＤＴＡを含まない乾燥粉末製剤（鉄／ＥＤＴＡの液体アドバックを利用する）は、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１（ＤＰＭへと粉砕された鉄およびＥＤＴＡを含有する）は水和すると鉄を適切にキレート（すなわち可溶化）しなかったという発見に起因して製剤として選択されたものであり、したがって鉄はろ過により溶液から取り除かれていた（表４）。
インスリン濃度、アミノ酸濃度およびｐＨ（水和時）を測定したＶｅｒｓｉｏｎ ３．３の分析的評価は、完全に製剤化されたＶｅｒｓｉｏｎ １（対照）に対して有意に異ならないものであった。
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ製剤は、追加のアミノ酸を添加して増強した非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ製剤である。
実施例２
この例は、本発明の配合培地製剤にさらに配合することにより強化することができる例示的な基礎培地を示す。この例において、指示薬、例えばフェノールレッドなどが包含されているが、指示薬は省くことができる。
Figure 2017510283
Figure 2017510283
Figure 2017510283
実施例３
この例は、配合培地粉末製剤の例示的実施形態を記載している。
Figure 2017510283
Figure 2017510283
Figure 2017510283
Figure 2017510283
配合細胞培養培地粉末製剤は、水和タンク内で、１Ｌの２回脱イオン化した滅菌Ｈ２Ｏ中で水和した。粉末を水に加え、その後に混合することで適切な分散および溶解を確実にした。次に、ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液をタンクに加えた。細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は以下である：約０．０１３８ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および約０．０１８６２５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。細胞培養培地を次いでその後の使用のために４℃で保存した。
実施例４
この例は、配合培地粉末製剤の例示的実施形態を記載している。
Figure 2017510283
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Figure 2017510283
Figure 2017510283
Figure 2017510283
配合細胞培養培地粉末製剤は、水和タンク内で、１Ｌの２回脱イオン化した滅菌Ｈ２Ｏ中で水和した。粉末を水に加え、その後に混合することで適切な溶解を確実にした。次に、ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液をタンクに加えた。細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度は以下である：約０．０１３８ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および約０．０１８６２５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。細胞培養培地を次いでその後の使用のために４℃で保存した。
（さらなる）配合培地を用いることの可能性は、２つのレベル：（ｉ）水和後の濃度決定および（ｉｉ）細胞培養性能調査に沿って実証される。水和調査は、（さらなる配合培地中の）重要な培地成分の濃度が理論値（期待値）と一致しており、同様に標準的方法で調製された液体培地中のそれと一致していることを示す（実施例１を参照されたい）。１Ｌの灌流細胞培養調査は、いずれかの培地調製方法を用いたときの同等の細胞培養性能（増殖および代謝）ならびに組換えタンパク質生産（力価／タイター）をさらに実証する（図３）。
本発明の好ましい実施形態であると現在考えられるものが示され、記載されているが、当業者は、本出願中で記載されている本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の実施形態およびさらなる実施形態を行うことができることを認識するものであり、本出願は、本明細書中に記載の意図された特許請求の範囲の中にある全てのかかる改変を包含する。本明細書中で言及および／または引用されている全ての特許および刊行物は、各々の個別の刊行物が参照によりその全体が組み入れられるとして具体的におよび個々に指示されているかのように、参照により同程度に組み入れられる。

Claims (44)

  1. 基礎培地粉末および細胞培養培地補充物を含む配合細胞培養培地粉末製剤であって、細胞培養培地補充物が
    ｉ） １または複数の塩；
    ｉｉ） １または複数の増殖因子；
    ｉｉｉ） １または複数の無機イオン；
    ｉｖ） アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；
    ｖ） １または複数のバッファー；ならびに
    ｖｉ） １または複数の消泡剤
    を含む、前記配合細胞培養培地粉末製剤。
  2. 基礎培地粉末が、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハム培地Ｆ１２（Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ１２）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ １６４０ 培地（ＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ）およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）／ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；１：１の比）を含む、請求項１の配合細胞培養培地粉末製剤。
  3. 基礎培地粉末が、以下の成分のうちの１もしくは複数またはそれらの組み合わせを含む、請求項１の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ビオチン、塩化カルシウム、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、Ｄ＋マンノース、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ブドウ糖（無水）、ＤＬ−アルファ−リポ酸、硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ、硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ、葉酸、グリシン、ヒポキサンチン、Ｉ−イノシトール、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸（無水）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタチオン、Ｌ−ヒスチジンＦＢ、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、塩化マグネシウム、無水硫酸マグネシウム、ナイアシンアミド、Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン、塩化カリウム、プトレッシン２ＨＣｌ、ピリドキサールＨＣｌ、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、無水二塩基性リン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、チアミンＨＣｌ、チミジン、硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、硫酸銅、二酸化セレン、リノール酸、ベータ−メルカプトエタノールおよびエタノールアミン遊離塩基ＦＢ。
  4. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末の濃度が８〜３０ｇ／Ｌである、請求項３の配合細胞培養培地粉末製剤。
  5. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末の濃度が約１３ｇ／Ｌである、請求項４の配合細胞培養培地粉末製剤。
  6. ｐＨ指示薬をさらに含む、請求項１〜５の配合細胞培養培地粉末製剤。
  7. ｐＨ指示薬がフェノールレッドＮａ（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｎａ）であり、水和させて細胞培養培地を形成させた際にフェノールレッドＮａが約０．００１から約０．０２ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項６の配合細胞培養培地粉末製剤。
  8. 水和させて細胞培養培地を形成させた際にフェノールレッドＮａが約０．００６９ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項７の配合細胞培養培地粉末製剤。
  9. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末成分の終濃度が以下である、請求項３の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ ビオチン；
    ｉｉ） ０．０３５〜０．３３ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
    ｉｉｉ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ 塩化コリン；
    ｉｖ） ０．０００２〜０．００２ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
    ｖ） １〜１０ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
    ｖｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
    ｖｉｉ） ０．３〜３．０ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
    ｖｉｉｉ） ０．００００３〜０．０００３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
    ｉｘ） ０．００００１〜０．０００１５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄；
    ｘ） ０．００００５〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄；
    ｘｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ 葉酸；
    ｘｉｉ） ０．００７〜０．２０ｇ／Ｌ グリシン；
    ｘｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
    ｘｉｖ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
    ｘｖ） ０．００３〜０．０３ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
    ｘｖｉ） ０．０８〜１．４ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
    ｘｖｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
    ｘｖｉｉｉ） ０．００５〜０．１０ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
    ｘｉｘ） ０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ；
    ｘｘ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
    ｘｘｉ） ０．００５〜０．１５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
    ｘｘｉｉ） ０．０２〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
    ｘｘｉｉｉ） ０．０００３〜０．００３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
    ｘｘｉｖ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
    ｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
    ｘｘｖｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
    ｘｘｖｉｉ） ０．０５〜１．５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
    ｘｘｖｉｉｉ） ０．０１〜０．３ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
    ｘｘｉｘ） ０．０２〜０．６ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
    ｘｘｘ） ０．００８〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
    ｘｘｘｉ） ０．００９〜０．２５ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
    ｘｘｘｉｉ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
    ｘｘｘｉｉｉ） ０．００６〜０．１６ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
    ｘｘｘｉｖ） ０．０２〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ；
    ｘｘｘｖ） ０．０３〜０．９ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
    ｘｘｘｖｉ） ０．０１〜０．１８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
    ｘｘｘｖｉｉ） ０．０２〜０．１２ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
    ｘｘｘｖｉｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
    ｘｘｘｉｘ） ０．０００５〜０．００５ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
    ｘｌ） ０．１〜１．０ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
    ｘｌｉ） ０．００００２〜０．０００２ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
    ｘｌｉｉ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
    ｘｌｉｉｉ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
    ｘｌｉｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ リボフラビン、
    ｘｌｖ） ２．０〜１５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
    ｘｌｖｉ） ０．０１〜０．２ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウム、
    ｘｌｖｉｉ） ０．０２〜０．２ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
    ｘｌｖｉｉｉ） ０．０１５〜０．１５ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、
    ｘｌｉｘ） ０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
    ｌ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ チミジン、
    ｌｉ） ０．００００６〜０．００１５ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛、
    ｌｉｉ） ０．００００００３〜０．０００００６ｇ／Ｌ 硫酸銅、
    ｌｉｉｉ） ０．００００００５〜０．０００００８ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
    ｌｉｖ） ０．００００１〜０．０００１ｇ／Ｌ リノール酸、
    ｌｖ） ０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
    ｌｖｉ） ０．０００３〜０．００５ｇ／Ｌ エタノールアミン。
  10. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の基礎培地粉末成分の終濃度が以下である、請求項９の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ ビオチン；
    ｉｉ） 約０．１１６６５ｇ／Ｌ 塩化カルシウム；
    ｉｉｉ） 約０．００９９８ｇ／Ｌ 塩化コリン；
    ｉｖ） 約０．０００６８ｇ／Ｌ シアノコバラミン（Ｂ１２）；
    ｖ） 約３ｇ／Ｌ Ｄ＋マンノース；
    ｖｉ） 約０．００３１２ｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム；
    ｖｉｉ） 約１ｇ／Ｌ ブドウ糖（無水）；
    ｖｉｉｉ） 約０．０００１０３ｇ／Ｌ ＤＬ−アルファ−リポ酸；
    ｉｘ） 約０．００００５ｇ／Ｌ 硝酸第二鉄９Ｈ２Ｏ；
    ｘ） 約０．０００４１７ｇ／Ｌ 硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ；
    ｘｉ） 約０．００３６６ｇ／Ｌ 葉酸；
    ｘｉｉ） 約０．０２６２６ｇ／Ｌ グリシン；
    ｘｉｉｉ） 約０．００２７ｇ／Ｌ ヒポキサンチン２Ｎａ；
    ｘｉｖ） 約０．０１４５１ｇ／Ｌ Ｉ−イノシトール；
    ｘｖ） 約０．０１３３６ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン；
    ｘｖｉ） 約０．２７４３５ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン；
    ｘｖｉｉ） 約０．０２２５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン；
    ｘｖｉｉｉ） 約０．０１９９５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン酸；
    ｘｉｘ） 約０．０１７５６ｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；
    ｘｘ） 約０．０６２５６ｇ／Ｌ Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；
    ｘｘｉ） 約０．０２２０６ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン酸（無水）；
    ｘｘｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン；
    ｘｘｉｉｉ） 約０．００１ｇ／Ｌ Ｌ−グルタチオン；
    ｘｘｉｖ） 約０．０７３４８ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ；
    ｘｘｖ） 約０．１０５７ｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン；
    ｘｘｖｉ） 約０．１１０９６ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン；
    ｘｘｖｉｉ） 約０．１６３８５ｇ／Ｌ Ｌ−リジン；
    ｘｘｖｉｉｉ） 約０．０３２２４ｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン；
    ｘｘｉｘ） 約０．０６７４８ｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアリン（ｐｈｅｎｙｌａｌｉｎｅ）；
    ｘｘｘ） 約０．０２８７５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；
    ｘｘｘｉ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ Ｌ−セリン；
    ｘｘｘｉｉ） 約０．１０１５６ｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン；
    ｘｘｘｉｉｉ） 約０．０１９０２ｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン；
    ｘｘｘｉｖ） 約０．１０７７１ｇ／Ｌ Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ２Ｏ；
    ｘｘｘｖ） 約０．０９８６６ｇ／Ｌ Ｌ−バリン；
    ｘｘｘｖｉ） 約０．０２８ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム；
    ｘｘｘｖｉｉ） 約０．０４８８４ｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム；
    ｘｘｘｖｉｉｉ） 約０．００３０２ｇ／Ｌ ナイアシンアミド；
    ｘｘｘｉｘ） 約０．００１４ｇ／Ｌ Ｏ−ホスホリル（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌ）−エタノールアミン；
    ｘｌ） 約０．３１１８２ｇ／Ｌ 塩化カリウム；
    ｘｌｉ） 約０．００００８１ｇ／Ｌ プトレッシン２ＨＣｌ；
    ｘｌｉｉ） 約０．００３ｇ／Ｌ ピリドキサールＨＣｌ；
    ｘｌｉｉｉ） 約０．００００３１ｇ／Ｌ ピリドキシンＨＣｌ、
    ｘｌｉｖ） 約０．０００３１９ｇ／Ｌ リボフラビン、
    ｘｌｖ） 約６．１２３４ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、
    ｘｌｖｉ） 約０．０６２５ｇ／Ｌ 一塩基性リン酸ナトリウムＨ２Ｏ、
    ｘｌｖｉｉ） 約０．０７０９９ｇ／Ｌ 無水二塩基性リン酸ナトリウム、
    ｘｌｖｉｉｉ） 約０．０５５ ピルビン酸ナトリウム、
    ｘｌｉｘ） 約０．００３１７ｇ／Ｌ チアミンＨＣｌ、
    ｌ） 約０．０００３６４ｇ／Ｌ チミジン、
    ｌｉ） 約０．０００４３２ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏ、
    ｌｉｉ） 約０．０００００１２５ｇ／Ｌ 硫酸銅５Ｈ２Ｏ、
    ｌｉｉｉ） 約０．０００００２２２ｇ／Ｌ 二酸化セレン、
    ｌｉｖ） 約０．００００４２ｇ／Ｌ リノール酸、
    ｌｖ） 約０．０００３９０６５ｇ／Ｌ ベータ−メルカプトエタノール；および
    ｌｖｉ） 約０．００１２ｇ／Ｌ エタノールアミンＦＢ。
  11. 水和させて細胞培養培地を形成させた際に、請求項１のパートｉ）の１または複数の塩が塩化マグネシウムを０．５〜５ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１〜１０の配合細胞培養培地粉末製剤。
  12. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の塩化マグネシウムの濃度が約１．４２８ｇ／Ｌである、請求項１１の配合細胞培養培地粉末製剤。
  13. 増殖因子が組換えインスリンを含む、請求項１〜１２の配合細胞培養培地粉末製剤。
  14. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度が０．５〜１５ｍｇ／Ｌである、請求項１３の配合細胞培養培地粉末製剤。
  15. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のインスリンの濃度が約３ｍｇ／Ｌである、請求項１４の配合細胞培養培地粉末製剤。
  16. １または複数の無機イオンが、モリブデン酸アンモニウム、硫酸カリウムクロム、硫酸銅、塩化リチウム、硫酸マンガン、メタけい酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせから選択される微量金属を含む、請求項１〜１５の配合細胞培養培地粉末製剤。
  17. モリブデン酸アンモニウムがモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏであり；硫酸カリウムクロムが硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏであり、硫酸銅が硫酸銅５Ｈ２Ｏであり、塩化リチウムが塩化リチウム（無水）であり、硫酸マンガンが硫酸マンガンＨ２Ｏであり、メタけい酸ナトリウムがメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏである、請求項１６の配合細胞培養培地粉末製剤。
  18. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の微量金属の終濃度が以下である、請求項１７の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） ０．０００５〜０．０１ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
    ｉｉ） ０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
    ｉｉｉ） ０．００１〜０．１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
    ｉｖ） ０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
    ｖ） ０．００００４〜０．００４ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
    ｖｉ） ０．０４〜４．２ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
  19. 配合細胞培養培地粉末製剤が、モリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ、硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ、硫酸銅５Ｈ２Ｏ、塩化リチウム（無水）、硫酸マンガンＨ２Ｏおよびメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏの組み合わせを含む、請求項１〜１８の配合細胞培養培地粉末製剤。
  20. 水和させて細胞培養培地を形成させた際の微量金属の終濃度が以下である、請求項１９の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） 約０．００３７ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４Ｈ２Ｏ；
    ｉｉ） 約０．００１ｍｇ／Ｌの硫酸カリウムクロム１２Ｈ２Ｏ；
    ｉｉｉ） 約０．０１２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅５Ｈ２Ｏ；
    ｉｖ） 約０．０１ｍｇ／Ｌの塩化リチウム（無水）；
    ｖ） 約０．０００４５２ｍｇ／Ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏ；および
    ｖｉ） 約０．４２６３ｍｇ／Ｌのメタけい酸ナトリウム９Ｈ２Ｏ。
  21. アミノ酸補充物が、アスパラギンＨ２Ｏ、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンの組み合わせを含む、請求項１〜２０の配合細胞培養培地粉末製剤。
  22. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度が以下である、請求項１〜２１の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） ０．００７〜０．０７ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
    ｉｉ） ０．２５〜２．５ｇ／Ｌ グルタミン；
    ｉｉｉ） ０．５〜５．０ｇ／Ｌ ヒスチジン、遊離塩基；および
    ｉｖ） ０．０１〜０．１ｇ／Ｌ セリン。
  23. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のアミノ酸補充物の終濃度が以下である、請求項１〜２２の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） 約 ０．０２２５ｇ／Ｌ アスパラギンＨ２Ｏ；
    ｉｉ） 約０．７３ｇ／Ｌ グルタミン；
    ｉｉｉ） 約１．５５２ｇ／Ｌ ヒスチジン；および
    ｉｖ） 約０．０３６７６ｇ／Ｌ セリン。
  24. １または複数のバッファーが、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）遊離酸、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）Ｎａ、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）および炭酸水素ナトリウムよりなる群から選択される、請求項１〜２３の配合細胞培養培地粉末製剤。
  25. 製剤が、ＭＯＰＳ遊離酸およびＭＯＰＳ Ｎａの組み合わせを含む、請求項１〜２４の配合細胞培養培地粉末製剤。
  26. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のバッファーの終濃度が以下である、請求項１〜２５の配合細胞培養培地粉末製剤：
    ｉ） ０．３〜３ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ遊離酸；および
    ｉｉ） １．０〜１０ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ Ｎａ。
  27. 消泡剤が、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをベースとしたポリオールコポリマーを含む、請求項１〜２６の配合細胞培養培地粉末製剤。
  28. 消泡剤がＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である、請求項１〜２７の配合細胞培養培地粉末製剤。
  29. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の濃度が０．１〜１０ｇ／Ｌである、請求項１〜２８の配合細胞培養培地粉末製剤。
  30. 水和させて細胞培養培地を形成させた際のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の濃度が約１ｇ／Ｌである、請求項２９の配合細胞培養培地粉末製剤。
  31. 基礎培地粉末；塩化マグネシウム；インスリン；１または複数の微量金属；アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびセリンのうちの１または複数を含むアミノ酸補充物；１または複数のバッファー；ならびに１または複数の消泡剤を合わせることを含む、請求項１〜３０の配合細胞培養培地粉末製剤を作製する方法。
  32. 請求項１〜３０の配合細胞培養培地粉末製剤を水と合わせ、それによって哺乳動物細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製することを含む、哺乳動物細胞を増殖させるための細胞培養培地を作製する方法。
  33. ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏおよびキレート剤を含む溶液を合わせることをさらに含む、請求項３２の方法。
  34. キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項３３の方法。
  35. 細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度が以下である、請求項３４の方法：
    ｉ） ０．００４〜０．０４ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および
    ｉｉ） ０．００６〜０．０６ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。
  36. 細胞培養培地中のＦｅＳＯ４ ７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡの終濃度が以下である、請求項３５の方法：
    ｉ） 約０．０１３８ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ；および
    ｉｉ） 約０．０１８６２５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ。
  37. 細胞培養培地を哺乳動物細胞と接触させることをさらに含む、請求項３２〜３６の方法。
  38. 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞、ＤＰ１２ ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ヒト胎児腎（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ、ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞よりなる群から選択される、請求項３７の方法。
  39. 哺乳動物細胞が目的タンパク質を組換えにより発現する、請求項３８の方法。
  40. 目的タンパク質が、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）、そのバリアントおよび断片よりなる群から選択される、請求項３９の方法。
  41. ＦＶＩＩＩが、野生型ＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメインを欠損したＦＶＩＩＩおよび生体適合性ポリマーとコンジュゲートしたＦＶＩＩＩから選択される、請求項４０の方法。
  42. 生体適合性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４１の方法。
  43. ＰＥＧが、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうちの１または複数においてこのポリペプチドに共有結合的に付着している、請求項４２の方法。
  44. 哺乳動物細胞がＢＨＫ細胞である、請求項３８〜４３の方法。
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