JP2017506073A - Dna−蛋白質複合体の組成及びその密度の定量評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
用語「エピトープ」は、親和性試薬の結合を引き起こす生体分子上のいずれかの部位を意味する。親和性試薬は、生体分子又は生体分子フラグメントの線状配列、生体分子又は生体分子フラグメントの形状、生体分子又は生体分子フラグメントの化学的−物理的特性、或いは、これらの組み合わせを認識し得る。
現在実施されるプルダウンアッセイは、プルダウン実験の比較が不正確となる測定の単位の恣意性に悩まされており、医療診断及び調査におけるプルダウンアッセイの使用が妨げられている。データ解釈の正確性は、アッセイによる試験結果値に連結せず、実際の生体現象に連結された絶対的単位の標準化スケールにより改善される。本発明の一態様は、疾病標識同定アッセイのような医療診断においてプルダウンアッセイの使用を可能とする材料及び方法を提供する。これらの方法においては、ChIPのようなプルダウンアッセイから得られたデータは、アッセイを特定する恣意的な値だけではなく疾病標識自身を特定する絶対的な値により特徴付けられる。これは、現在市販の方法及び技術ではしばしば不可能な、異なる試料のプルダウン由来の結果、同じ試料の異なるプルダウン、異なるエピトープのプルダウン、異なる実験室で行われたプルダウンが容易にかつ直接的に互いに比較され得ることを意味する。
一実施形態においては、ICe−ChIPを実施するために、ChIP読み取りが比較される一組の前記内部標準は、天然DNA−蛋白質複合体のコレクション内にドープされる。以下に、これらの標準分子がどのように標準IP効率の算出に用いられるか、同様に、研究されたエピトープが変異蛋白質フラグメント、蛋白質インフォマー又は蛋白質翻訳後修飾かどうかに依存して、蛋白質又はエピトープ密度(PD)、蛋白質変異体密度(PVD)又は蛋白質修飾密度(PMD)が何と呼ばれるか算出するために用いられることを我々は記載する。天然様親和性、特異性及び結合活性を有するヌクレオソームを含む半合成又は変異体に基づく標準分子は、ヒストン修飾密度(HMD)又はヒストン変異体密度(HVD)の絶対的定量を行うことにより、クロマチン免疫沈降法を改良する。
プルダウン実験の分析に要求される他の問題は、プルダウンアッセイに用いられる親和性試薬のオフターゲットの特異性由来の予測の正確性の低さである。用語「偽陽性」及び「オフターゲット」は、同意語であり、無差別又は非特異的な親和性試薬に接触し、不正確な結果を生じるエピトープを意味する。用語「真陽性」及び「オンターゲット」は、同意語であり、関連の又は正確な結果を生じるエピトープを意味する。
従来のChIPアッセイが診療所で採用されない主な理由は、実験間の幅広いIP変異における%濃縮を作成し、問題点の多く、信頼できないバイアスのかけられていない比較用とする微細な取扱相異及び可変の抗体特異性に起因してこのアッセイがしばしば再現不可能なことである。変化に敏感なChIPのステップを行う内部標準を有することにより、ICe−ChIPは図6A、6B及び7Aに示された結果の複製及び信頼性に関してはさらに健全であり、HMDが普遍的で、良好に定義された内部標準に対する原位置での直接的な比較により作成された生物学的に相対的なスケールであるため、数が容易に比較される。
本発明の他の態様は、ここに記載された方法の1つを実施する試薬を含む試薬及びキットを提供する。試薬は適切なパッケージ又は容器に含まれる。キットは、例えばプルダウンアッセイ又はクロマチン免疫沈降アッセイにおいて、真陽性及び偽陽性エピトープの絶対的定量のためのここに記載された標準分子を含む1つ以上の試薬を含む。キットは、ここに記載された少なくとも1つの親和性試薬、例えば抗体も含む。標準分子は、真陽性エピトープに対して天然様親和性、特異性及び結合活性を有する。キットは、偽陽性エピトープに対するエピトープの天然様親和性、特異性及び結合活性を有する少なくとも1つの標準分子を含む。
マウスESC E14株細胞のH3K4me3 ICe−ChIP−seq
生物学的に有意義なスケールにクロマチン免疫沈降を標準化するために、定義された内部標準による校正の分析化学の概念を採用した。従来の天然ChIPにおける小球菌ヌクレアーゼフラグメント化により単離された天然モノヌクレオソームの対応物に正確に類似の翻訳後修飾を有する再構成ヌクレオソームを添加した(例えば、非特許文献28参照。)。図4は、マウスESC E14株細胞のHOXA遺伝子クラスターにおけるH3K4me3 ICe−ChIP−seqのデータを示す。ヒストン修飾密度値は、期待範囲(0〜100%)内で存在する。前記したように、H2K4me3は、転写開始部位及びエンハンサーで主として濃縮される。
半合成(例えば、非特許文献27及び31参照。)により、重要な点−ライゲーション結合は傷がなく、脱硫化ステップに続く(例えば、非特許文献32参照。)−で区別される、ヒトヒストンH3.2(C110A)K4me3を作成した。得られたヒストンは、組換えヒストンにおける取扱いが頻繁に容易になるC110A突然変異を除いては天然修飾ヒストンに一致した。S−トリル−β−メルカプトプロニオニル−p−メチル−ベンズハイドリルアミン樹脂(Nova Biochem社製)上のBoc chemistry社製のSPPS(例えば、非特許文献33参照。)によって、K4me3修飾を有するヒストン3の1〜20残基に対応する配列を、ペプチドチオエステルとして合成した。この樹脂を、DMFで1時間膨張し、その後、95%TFA、2.5%トリイソプロピルシラン及び2.5%H2Oで3分間に3回洗浄して脱保護した。4モル等価Boc保護アミノ酸、3.9モル等価HBTU及び6モル等価DIPEAで全てのアミノ酸を結合し、窒素攪拌しながら10分間樹脂で保温した。結合に続いて、DMF(代わりにDCMを用いたグルタミンを除く)で樹脂を3回洗浄し、1回目がフロー洗浄のTFAの3回洗浄でBocを脱保護した。最後のアミノ酸脱保護の後、DMF、DCM及びメタノールで樹脂を連続的に洗浄した。冷たいジエチルエーテルで沈殿させ、凍結乾燥された樹脂の全てのペプチドを、HF/DMS/アニソール(10:1:1)で分裂した。
ICeChIPプロトコールは、天然ChIPプロトコールに類似のプルダウンプロトコールである(例えば、非特許文献28参照。)。プレート付着細胞(〜107細胞/IP)を10mLのPBSで2回洗浄し、37℃で5分間5mLのアキュターゼ(Millipore社製)で外し、2mLの完全培地で急冷し、遠心分離(500×g、4℃で5分間)により回収した。氷冷バッファとともに氷上で全てのその後のステップを行った。細胞を、10mLPBSで2回、5mLのバッファN(15mMトリス pH7.5、15mM NaCl、60mM KCl、8.5%(w/v)ショ糖、5mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM DTT、200μM PMSF、1X RLプロテアーゼ阻害混合物)で2回洗浄した。2PCV(詰め込まれた細胞体積)のバッファN内に細胞を再懸濁し、2PCVの2倍溶解バッファ(0.6%NP−40置換物(Sigma社製)を追加したバッファN)を4℃で10分間かけて添加することにより溶解した。遠心分離(500×g、4℃で5分間)により細胞核を回収し、6PCVのバッファN中に再懸濁した。細胞デブリを除去するために、遠心分離1300×g、バケットローターが揺り動くSorvall Legend XTR、4℃で12分間)された50mL遠心管中の7.5mLのショ糖クッション(10mM HEPES pH7.9、30%(w/v)ショ糖、1.5mM MgCl2)の表面上に再懸濁細胞核を載置した。殆どの細胞デブリは上層に留まったが、細胞核はショ糖クッションを通過して沈降し、遠心管の底に沈殿した。上澄みを処分し、2PCVのバッファN中に細胞核を再懸濁した。クロマチンの見かけ上の濃度を測定するために、2μLの再懸濁細胞核を98μLの2M NaCl中に3通り希釈し、Nanodrop(Thermo Scientific社製)及び使用されたクロマチンの1A260=50ng/μLを想定する従来の因子により総核酸の260nmの吸光度を測定した。これらの測定に基づいて、クロマチンの見かけ上の濃度をバッファNにより1μg/μLに調整した。血球計数器を用いて細胞核の量及び品質も評価した。
ライブラリ調製に関しては、IP又はインプットから単離された10ngのDNAを用いた。DNA総量が10ng未満の場合、全ての入手可能なDNAをライブラリ調製に用いた。End-it(登録商標)End-Repairキット(Epicentre社製)(7μLの10倍End-itバッファ、7μLの2.5mM dNTP混合物、7μLの10mM ATP、1.4μLのENd-Repair酵素混合物及び47.6μLのDNA溶解TEバッファ)を用い、室温で45分間保温することにより、DNAの末端を平滑末端化した。126μL(1.8体積)のAmpure XPビーズ(Beckman Coulter社製)でDNAを精製した。10回上下にピペッティングしてENd-Repair混合物とビーズを混合し、室温で5分間保温した。磁石によりチューブの側面上でマグネティックビーズを回収し、磁石上において250μLの80%EtOHで2回の30秒間洗浄を行った。マグネティックラックからチューブを除去し、34μLのTEバッファをビーズに添加し、10回上下にピペッティングした。マグネティックビーズは、Aテーリングの間に溶離液から除去することなく、チューブ内に留めた。DNAの3’末端への単一のアデノシンの付加は、末端修復DNAに5μLのNEBバッファ2、10μLの1mM dATP、1μLのクレノーフラグメント(3’→5’exo−、NEB)を添加し、37℃で30分間保温することにより達成した。DNA精製に関しては、110μL(2.2体積)のSPRIバッファ(20%PEG6000、2.5M NaCl)を反応物に添加し、10回上下にピペッティングし、室温で5分間保温した。磁石によりチューブの側面上でマグネティックビーズを回収し、磁石上において200μLの80%EtOHで2回の30秒間洗浄を行った。マグネティックラックからチューブを取り外し、13μLのTEバッファをビーズに添加し、ピペットで混合した。マグネティックビーズは、アダプターライゲーションの間に溶離液から除去することなく、チューブ内に留めた。2倍のQuickDNAライゲースバッファ、2μLの2μMアダプター二本鎖、1μLのQuickDNAライゲース(NEB)を調製し、13μLのAテーリングされたDNAに添加し、アダプターへのライゲーションを行った。反応液を室温で15分間保温した。DNAを精製するために、21μL(0.7体積)のSPRIバッファを反応物に添加し、10回上下にピペッティングし、室温で5分間保温した。磁石によりマグネティックビーズを回収し、200μLの80%EtOHで2回の30秒間洗浄を行い、46μLのTEバッファで溶離した。新しいシリコンチューブに上澄みを移した。
シカゴ大学ゲノム機能解析コア施設によるIllumina HiSeq 2500用の標準Illuminaプロトコールを用いてクラスター作成及びシークエンシングを行った。Galaxyによりデータ分析を行った(例えば、非特許文献37〜39参照。)。FastQフォーマットの未加工読み取りは、まずFastQ Groomerを施した。読み取りは、起源の有機体に依存して、Bowtie2(例えば、非特許文献40参照。)(高感度プリセットオプション、エンドツーエンドアライメント)により、末端で鎖状に連結されたバーコードの配列を有する(各バーコードがそれ自身のエントリーを有する)マウス(MM10)の参照ゲノムに対応づけられた。SAMツール(例えば、非特許文献41参照。)を用いて得られたSAMファイルをフィルター処理した。このデータ分析経路によって、対応付けされない、対になっていない(距離>1000塩基対)及び間違って対にされた読み取りを除去した。繰り返し可能なゲノム配列を隠すとともに低品質読み取り及び混入物由来のノイズを除去するために、対応付け品質が20未満の読み取りを除去した。信号の乱れを避け、ポアソンサンプリング統計を曲解しないために、対にされた読み取りを1つのエントリーに組合わせた(重複フラグメントを平板化し、隙間を埋めた)。オリゴヌクレオソーム結合活性バイアスを避けるため、別な方法で明らかに述べられた場合を除いて、220塩基対より長い読み取りを削除した。ゲノム区間ベッドグラフを作成するために、BEDツール(例えば、非特許文献42参照。)を用いた。
ICeChIP−seqの確認:再現性及び頑健性
複製によりICeChIPの濃度を試験するために、mESCにおけるH3K4me3 ICeChIP−seqを繰り返し、HMDの痕跡の強固な結合を観測した。相応して、ピークでの各生物学的複製の平均HMD値は高い相関があり(R2=0.95)、分布は評価誤差内である(図6)。
複数ラダーICeChIPが原位置のIP特異性を測定する
見かけ上のChIP信号は、関連するエピトープ(例えば他のリジンメチル標識)のオンターゲット捕捉、オフターゲット捕捉、及び、抗体樹脂に対するヌクレオソームの非特異的接着の混合物である。いくつかの異なるタイプの内部標準により実施されたICeChIPは、これらのChIP信号の可能な3つの源を全て測定し、最初にChIPの適正な信号及びエラーを批判的に処理できる。3タイプの内部標準、H3K4me3、H3K36me3及びICeChIP−qPCRにより区別可能なDNA種(各タイプの2つのヌクレオソーム)上に再構成された未修飾ヌクレオソームでドープされたmESCヌクレオソームを我々は不審に思った。H3K36me3は異なる配列内に埋め込まれたトリメチルリジンを有するように選択され、H3K36me3に対するこの抗体の質素なオフターゲット親和性はペプチドアレイ上で予め観測されている(例えば、非特許文献7参照。)。これらの内部標準の精査によって、未修飾ヌクレオソームバックグラウンド(1.9±0.2)を超えてH3K36me3のかろうじて検出可能な濃縮(2.8±0.4)が観測された。頑健なオンターゲット信号(81±10)と比較すると、この実験では30倍の見かけ上の特異性がある。このように、H3K36me3結合ヌクレオソームに対する抗体のオフターゲット結合は見かけ上のH3K4me3密度に対して軽微な誘因である。
診断ツールとしてのICe−ChIP
ここに記載されたICe−ChIP材料及び方法は、哺乳類試料における特定遺伝子座でのヒストンPTMのレベルを検出することを目的とするアッセイへの使用を想定されている。本発明の材料及び方法は、癌を含むヒストン翻訳後修飾における変化に関するいずれかの疾病に対する診断、予後、分類、疾病リスクの予測、再発の検出、治療の選択、及び、治療効率の評価に用いられる。
Claims (22)
- 細胞のクロマチン内のゲノム遺伝子座でコアヒストンの第1エピトープの密度を測定する方法であって、
前記クロマチンから天然のヌクレオソームのライブラリを準備する工程と、
ドープライブラリを作成するために前記ライブラリに標準分子を追加する工程と、
前記第1エピトープを含む天然のヌクレオソーム及び標準分子の量を捕捉するために前記ドープライブラリに第1親和性試薬を追加する工程と、
前記第1エピトープを含む捕捉された天然のヌクレオソームに関する所望のヌクレオチド配列の量と、前記ドープライブラリからのインプット量における天然のヌクレオソームに関する所望のヌクレオチド配列の量とを比較することによって前記第1エピトープに対する相対的ゲノム数を測定する工程と、
捕捉された標準分子に関するバーコード配列の量と、前記ドープライブラリからのインプット量における前記標準分子に関する所望のヌクレオチド配列の量とを比較することによって前記第1エピトープに対する標準分子捕捉効率を測定する工程と、
前記標準分子捕捉効率に対する前記相対的ゲノム数を比較することによって前記ゲノム遺伝子座で前記コアヒストンの前記第1エピトープの密度を測定する工程とを備え、
前記ライブラリは、前記第1エピトープを有する前記コアヒストン及び前記ゲノム遺伝子座を示すヌクレオソームヌクレオチド配列を含むヌクレオソームを有し、
前記標準分子は、(i)前記第1エピトープを有する標準ヒストン又は標準ヒストンフラグメント及び(ii)バーコード分子にリンクする標準ヌクレオチド配列を有する標準分子を含む再構成ヌクレオソームを含み、
前記標準ヒストン又は標準ヒストンフラグメント及び前記標準ヌクレオチド配列は、安定的な蛋白質−DNA結合を形成することを特徴とする方法。 - 前記標準分子捕捉効率の測定は、前記再構成ヌクレオソームのインプット量に対する前記バーコード分子の捕捉量の比率の比較を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記相対的ゲノム数の測定は、天然のヌクレオソームのヌクレオチド配列のインプット量に対する天然のヌクレオソームのヌクレオチド配列の捕捉量の比率の比較を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記第1親和性試薬は前記第1エピトープに対する抗体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 複数の標準分子は前記ライブラリに追加され、
前記標準分子のそれぞれは、(i)前記第1エピトープを有する前記標準ヒストンと、(ii)前記バーコード分子にリンクする前記標準ヌクレオチド配列を有する前記標準分子とを備える再構成ヌクレオソームを含み、
前記バーコード分子は、前記ライブラリに追加された前記標準分子の濃度を示す濃度パラメータをコード化し、
少なくとも2つの異なる濃度を有する標準分子が前記ライブラリに追加されることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記複数の標準分子は、(i)1つ以上のオフターゲットのエピトープと、(ii)オフターゲットのエピトープの同一性及び前記オフターゲットのエピトープを示す濃度パラメータをコード化する標準分子バーコードとを含む再構成ヌクレオソームを有する標準分子をさらに含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- オフターゲットのエピトープに対する1つ以上の捕捉効率に基づいて、前記第1親和性試薬に対するオフターゲット捕捉の特異性を測定する工程と、
前記オフターゲット捕捉の特異性に基づいて、前記ゲノム遺伝子座の前記コアヒストンの前記第1エピトープの密度を修正する工程とをさらに備えることを特徴とする請求項5に記載の方法。 - 前記第1エピトープは翻訳後修飾又は蛋白質のアイソフォームであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バーコード配列は前記細胞のゲノム内に存在しない配列であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオソームヌクレオチド配列及び前記標準ヌクレオチド配列の少なくとも1つの数は、PCR、qPCR、ddPCR、次世代シークエンシング、ハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィ、蛍光ラベリング、光学密度及び、及び、インターカレーター性蛍光プローブの使用からなる一群から選択された方法により測定されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記コアヒストンの前記第1エピトープは、セリン及びアラニンのN−アセチル化;セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化;リジンのN−クロトニル化、N−アセチル化;リジンのN6−メチル化、N6,N6−ジメチル化、N6,N6,N6−トリメチル化;アルギニンのオメガ−N−メチル化、対称性ジメチル化、非対称性ジメチル化;アルギニンのシトルリン化;リジンのユビキチン化;リジンのSUMO化;セリン及びスレオニンのO−メチル化;並びに、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のADP−リボース化からなる一群から選択された少なくとも1つの翻訳後アミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記標準分子は、二本鎖ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖ポリヌクレオチドは、配列ID No.1−115からなる一群から選択されたヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記バーコード分子は、ヌクレオチドバーコード配列分子、ロックド核酸配列及びDNA配列からなる一群から選択された分子を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞は患者由来の細胞であり、
所望の遺伝子座の前記第1エピトープの量は、腎細胞癌、神経膠腫、神経膠肉腫、悪性星状細胞腫、骨芽細胞腫、肺癌、小細胞性肺癌、子宮頸癌、大腸癌、直腸癌、脊索腫、咽頭癌、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、睾丸腫瘍、ウィルムス腫瘍、ユーイング癌、膀胱癌、血管肉腫、内皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺肉腫、乳頭肉腫、乳頭腺肉腫、嚢胞腺肉腫、気管支原性肺癌、髄様癌、マスト細胞腫、中皮腫、滑膜腫、黒色腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起神経膠腫、聴神経腫瘍、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、脳室上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胚性癌腫細胞、扁平上皮癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、神経膠腫、脂肪肉腫;ヘリコバクターピロリ、リステリア・モノサイトゲネス、シゲラ・フレックスネリ、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、クラミドフィラ、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペス、HIV、ビルハルツ住血吸虫に起因する感染症;肥満、糖尿病、心臓病;自閉症、脆弱X染色体症候群、ATR−X症候群、アンジェルマン症候群、プラダ−ウィリ症候群、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、レット症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群、コフィン−ローリー症候群、免疫不全−セントロメア不安定性−顔貌異常症候群、α−サラセミア、白血病、ハンチントン病、精神分裂病、双極性障害、老化、痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、コルネリア・デ・ランゲ症候群、歌舞伎メーキャップ症候群、シェーグレン症候群、尋常性白斑、進行性全身性硬化症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、クローン病及び潰瘍性大腸炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、及び、心肥大からなる一群から選択された病気又は状態を示すことを特徴とする請求項1の方法。 - 細胞のクロマチン内のゲノム遺伝子座でコアヒストンの第1エピトープの密度を測定する方法であって、
前記クロマチンから天然のヌクレオソームのライブラリを準備する工程と、
ドープライブラリを作成するために前記ライブラリに標準分子を追加する工程と、
前記ドープライブラリ内の前記ゲノム遺伝子座で前記コアヒストンの量を測定する工程と、
前記ドープライブラリ内の標準分子の量を測定する工程と、
前記エピトープを含む天然のヌクレオソーム及び再構成ヌクレオソームの量を捕捉するために前記ドープライブラリに親和性試薬を追加する工程と、
前記エピトープを含む前記捕捉標準分子の量及び前記ドープライブラリ内の前記ゲノム遺伝子座での前記コアヒストンの量に基づいて、ゲノム遺伝子座で前記第1エピトープに対する相対的ゲノム数を測定する工程と、
捕捉再構成ヌクレオソームの量及び前記ドープライブラリ内の標準分子の量に基づいて、前記エピトープに対する標準分子捕捉効率を測定する工程と、
前記コアヒストンに対する前記第1エピトープ数及び前記標準分子捕捉効率に基づいて、前記ゲノム遺伝子座で前記コアヒストンの前記第1エピトープの前記相対的ゲノム数を測定する工程とを備え、
前記ライブラリは、前記コアヒストン及び基点のゲノム遺伝子座を示すヌクレオソームヌクレオチド配列をそれぞれ含むヌクレオソームを有し、
前記標準分子は、(i)前記第1エピトープを有する標準ヒストン又は標準ヒストンフラグメント及び(ii)バーコードを有する標準分子を含む再構成ヌクレオソームを含み、
前記標準ヒストン又は標準ヒストンフラグメント及び前記標準分子は、安定的な蛋白質−DNA結合を形成することを特徴とする方法。 - 前記ドープライブラリ中のゲノム遺伝子座で前記コアヒストンの量を計測する工程は、
前記ドープライブラリに第2親和性試薬を添加し、第2エピトープを含むヌクレオソームの量を取り出す工程と、
前記第2エピトープを含む取り出されたヌクレオソームの量におけるヌクレオソームのヌクレオチド配列の量を測定する工程とを備え、
前記第2エピトープは、前記コアヒストン上に存在する不変のエピトープであることを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 前記ドープライブラリ中の標準分子の量の測定は、
再構成されたヌクレオソームの量を取り出す工程と、
前記第2エピトープを含む前記取り出された再構成ヌクレオソームの量における前記標準分子の量を測定する工程とを備え、
前記再構成されたヌクレオソームは前記第2エピトープを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 前記第1親和性試薬は前記第1エピトープに対する抗体であり、前記第2親和性試薬は前記第2エピトープに対する抗体であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 配列ID No.1−115を含む配列からなる一群から選択されたヌクレオチド配列を有するヌクレオソームを含むことを特徴とする組成物。
- 複数のエピトープを含む1つ以上の標準分子及びバーコードを含む標準分子を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法を実施するキット。
- 前記キットは、複数のエピトープのうちの少なくとも1つを認識する少なくとも1つの親和性試薬を含むことを特徴とする請求項21に記載のキット。
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