JP2017501110A - 診断的および治療的使用を有するタンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）に結合し、これにより結合ＣＦＨによる未結合ＣＦＨと比較して向上したＣ３ｄおよびＣ３ｂの結合を誘導することができる、組換えタンパク質に関する。これを利用する方法および医療機器についても記載する。

Description

本発明は、補体因子Ｈと相互作用し、その活性を調節することができるタンパク質に関する。本発明はまた、治療、診断および他の用途におけるこうしたタンパク質の使用方法に関する。
補体系は、感染に対する防御の最前線となる血液中の４０〜５０個のタンパク質のセットである。不適切に調節された補体系は、細菌細胞だけでなく、宿主または自己細胞を損傷し得る。これはよって多数の疾患の症状を引き起こし、または悪化させ得る。したがって補体系のタンパク質をモニターまたは調節する試薬の開発には大きな関心がある。
ヒト補体因子（Ｈ）（ＣＦＨ）は、補体系媒介損傷から保護するため、自己表面に対して選択的に作用するタンパク質である。しかし多くの病原体がそれらの独自の目的のため宿主ＣＦＨを利用し得る。ＣＦＨ（２０個の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール、別称ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）またはスシドメインからなる）がどのように関連微生物タンパク質と相互作用するかの研究は、どのようにＣＦＨを捕捉し、実験室で生成されたポリペプチドによりその活性を調節することができるかの手がかりを提供した。
ＰｓｐＣは、その遺伝子がすべてのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株の約７５％中に存在する肺炎球菌表面タンパク質の４つ名称のうちの１つである。ＳｐｓＡの名称では、タンパク質は分泌型免疫グロブリンＡに結合することが示された（Ｓ．Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｒ．Ｔａｌａｙ，Ｐ．Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｃｈｈａｔｗａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１１１３−１１２４，１９９７）。ＣｂｐＡの名称では、タンパク質はヒト上皮および内皮細胞と相互作用することが示された（Ｃ．Ｒｏｓｅｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：８１９−８２９，１９９７）。その遺伝子はＳ・ニューモニエ中のＰｓｐＡ遺伝子とパラロガスであり、よってＰｓｐＣと称された（Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｔａｒｔ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｉｌｅｓ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ９７ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７）。ＨＩＣの名称では、タンパク質はヒト因子Ｈと相互作用することが示された（Ｊａｎｕｌｃｚｙｋ Ｒ．，Ｉａｎｎｅｌｌｉ Ｆ．，Ｓｊｏｈｏｌｍ Ａ．Ｇ．，Ｐｏｚｚｉ Ｇ．，Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７２５７−３７２６３，２０００）。ＰｓｐＣの詳細な説明は、Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｐｓｐＣ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ， ＰｓｐＣ， Ｗｈｉｃｈ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＰｓｐＡ ａｎｄ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ”Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；６７（１２）：６５３３-６５４２．ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ９７０６４において提供される。この論文において、５つの発表済みおよび７つの新規対立遺伝子の配列比較は、この遺伝子がモザイク構造を有し、モジュラードメインが進化中の遺伝子多様性の一因であったことを明らかにする。２つの主要なクレードが存在する：クレードＡ対立遺伝子はより大きく、多くのＰｓｐＡ対立遺伝子と共有される追加のモジュールを含有し；クレードＢ対立遺伝子はより小さく、このＰｓｐＡ様ドメインを欠く。すべての対立遺伝子は、ＰｓｐＡタンパク質中の同様のドメインからの０％の相違度を示す、プロリンリッチドメインおよびコリン結合リピートドメインを有する。
本発明者らは、主にＣＣＰ８〜１０との相互作用によってＣＦＨに（生物学的タイムスケールで）不可逆的に結合する、ストレプトコッカス・ニューモニエＰｓｐＣ切断物（ＰｓｐＣＮ）を生成した。ＰｓｐＣＮに捕捉されたＣＦＨは、化学架橋剤がそのＣＣＰ５およびＣＣＰ１８、ならびにそのＣＣＰ７およびＣＣＰ２０を結合させることができる構造をとり；ＣＣＰ７および２０が自己表面認識を媒介し、多数の他のＣＦＨ相互作用細菌の二重結合部位であることが興味深い。
表面プラズモン共鳴を用いて行われた実験において、ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体は、固定化Ｃ３ｂ、補体成分Ｃ３の活性化バージョンに、ＣＦＨより少なくとも３倍良好に結合することが見出された。ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体は、タンパク質分解Ｃ３ｂ断片、Ｃ３ｄに、ＣＦＨより数倍良好に結合した。ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体は、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂ．Ｂｂ（Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに開裂する酵素）をＣＦＨより最大１０倍効率的に解離した。これらの観察結果は、複合体形成の際の、ＣＦＨのＣＣＰ１９〜２０内の塞がれた表面相互作用およびＣ３ｄ／Ｃ３ｂ結合部位の露出に起因すると推測された。
この概念を支持して、Ｃ３ｄ／Ｃ３ｂ：ＣＣＰ１９界面内の必須残基を欠き、腎臓疾患、非典型溶血性尿毒症症候群に関連するＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）は、ＣＦＨ（野生型）と同程度に効果的に、表面プラズモン共鳴チップ上に固定されたＣ３ｂに結合し、同様に固定されたＣ３ｂ．Ｂｂを崩壊させることが見出され；しかしこの変異体はシアル酸を有する赤血球の補体媒介溶血を防止せず、ＣＣＰ１９〜２０が、表面プラズモン共鳴チップ上でのＣ３ｂ結合には関わらなくても、自己表面上でのＣＦＨの調節作用に用いられることを示した。
重要なことには、ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）はＣ３ｄにＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ（野生型）より数倍弱く結合し、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）単独に対して、Ｃ３ｂ．Ｂｂ崩壊促進の向上をほとんど示さなかった。よって、本発明者らは、ＣＦＨは細菌による利用を回避するため調節部位を「隠す」が、ＰｓｐＣはそれらを露出すると仮定した。同様のＦＨ構造変化が自己表面上で起こり得る。
補体成分、とくにＣＦＨを固体支持体に選択的に結合し、補体活性を調節するための方法および組成物の必要性は満たされていない。補体活性を調節する能力は、とくに、異常な補体活性に関連する疾患を治療する機会を広げる。
本発明の第１態様によると、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）に結合し、これにより結合ＣＦＨによる未結合ＣＦＨと比較して向上したＣ３ｄおよびＣ３ｂの結合を誘導することができる、組換えタンパク質が提供される。
組換えタンパク質は、ＣＦＨに結合し、これにより結合ＣＦＨによる未結合ＣＦＨと比較して向上したＣ３ｄおよびＣ３ｂに対する親和性を誘導することができ得る。
本発明のタンパク質はよって、ＣＦＨとのそれらの相互作用を通して、代替補体経路におけるＣ３ｂ増幅の阻害剤として作用することができる。
好適には前記タンパク質は、野生型ＣＦＨに結合し、１×１０−１０Ｍ以下、より好適には１×１０−１１Ｍ以下、さらにより好適には１×１０−１２Ｍ以下、もっとも好適には１×１０−１３Ｍ以下の解離定数ＫＤを有する複合体を形成することができる。
いずれかのタンパク質のこの要件を達成する能力を評価するのに適したアッセイについては後述する。
適切にはタンパク質は細菌タンパク質に由来する。例えば、タンパク質は細菌タンパク質の断片とすることができる。
因子Ｈをリクルートすることが示された病原体としては：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；Ｂ・ダットニイ（Ｂ．ｄｕｔｔｏｎｉｉ）；Ｂ・レカレンチス（Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）；フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；およびストレプトコッカス・ニューモニエが挙げられる。
したがって、前記病原体からのタンパク質は本発明によるタンパク質を開発するのに用いることができる。
本発明の好適な実施形態において、タンパク質は細菌病原性因子に由来し、例えばこれは病原性因子の断片または変異体に対応する。
本発明の好適な実施形態において、本発明のタンパク質は肺炎球菌表面タンパク質、とくにストレプトコッカス・ニューモニエからの肺炎球菌表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ）に由来する。
ＰｓｐＣの各種形態、例えばＳ・ニューモニエの異なる株に由来する変異体が知られる。これらの変異体のいずれも本発明に用いることができる。Ｄ３９およびＴＩＧＲ４株由来のＰｓｐＣはとくによく研究されている変異体であり、後述する具体的な実験の中心である。
したがって、本発明の好適な実施形態において、本発明のタンパク質は、Ｓ・ニューモニエのＤ３９（ＮＣＴＣ ｎｏ７４６６）株のＰｓｐＣ由来とすることができる。本発明の別の好適な実施形態において、本発明のタンパク質はＴＩＧＲ４（ＮＣＴＣ ｎｏ７４６５）株のＣｂｐＡ由来とすることができる。しかしながら、ＣＦＨに結合し、その補体調節活性を向上させることができる限り、その他の株からのＰｓｐＣタンパク質を用いることができる。
各種異なる株からのＰｓｐＣのヌクレオチド配列についてのＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号は次のとおりである：Ｄ３９、ＡＦ０６８６４６；ＥＦ６７９６、Ｕ７２６５５；ＤＢＬ６Ａ、ＡＦ０６８６４５；Ｅ１３４、ＡＦ０６８６４７；ＢＧ８０９０、ＡＦ０６８６４８；Ｌ８１９０５、ＡＦ０６８６４９；およびＢＧ９１６３、ＡＦ０６８６５０。
適切には本発明のタンパク質はＰｓｐＣの断片を含み、前記断片はＰｓｐＣのＮ末端領域の部分を含む。
本発明の１つの実施形態において、本発明のタンパク質は、Ｎ末端から数えてＰｓｐＣの最初の２５０個のアミノ酸の部分を含むＰｓｐＣの断片、またはその機能的変異体を含む。好適には本発明のタンパク質はＰｓｐＣからの追加の配列を含まない。すなわち、タンパク質はＰｓｐＣの最初の２５０個のアミノ酸の部分を含み、これに加えて他の配列を含有し得るが、これらの配列は好適にはＰｓｐＣ由来の配列ではない。
適切にはタンパク質は、７０〜１５０個のアミノ酸残基長、適切には８０〜１３０個のアミノ酸残基長、一般的には９０〜１２０個のアミノ酸長である、ＰｓｐＣの断片、またはその変異体を含む。
適切には本発明によるタンパク質全体は、７０〜１５０個のアミノ酸残基長、適切には８０〜１３０個のアミノ酸残基、任意で９０〜１２０個のアミノ酸残基であるが、多くの場合、例えば融合タンパク質では、より長くなり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は、生理的環境において、例えば血清において可溶性である。他の場合において、不溶性または表面に結合もしくは吸着し得る。
好適な実施形態において、本発明のタンパク質は配列：
ＡＴＥＮＥＧＳＴＱＡＡＴＳＳＮＭＡＫＴＥＨＲＫＡＡＫＱＶＶＤＥＹＩＥＫＭＬＲＥＩＱＬＤＲＲＫＨＴＱＮＶＡＬＮＩＫＬＳＡＩＫＴＫＹＬＲＥＬＮＶＬＥＥＫＳＫＤＥＬＰＳＥＩＫＡＫＬＤＡＡＦＥＫＦＫＫＤＴＬＫＰＧＥＫ（配列番号１）
またはその機能的変異体もしくは断片を含む。
この特定の配列はＰｓｐＣのアミノ酸残基３７〜１４０を含み、以降ＰｓｐＣＮと称する。アミノ酸番号はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６８６４６において示されるＰｓｐＣの全長配列に基づく。
ＰｓｐＣＮは、ＣＦＨに極めて強く結合し、これを活性化する能力を有する、Ｎ末端領域に由来する、ＰｓｐＣの断片を表す。実際、これはどこから見ても不可逆的と思われるほど強くＣＦＨに結合する。
別の好適な実施形態において、本発明のタンパク質は配列：
ＫＱＶＶＤＥＹＩＥＫＭＬＲＥＩＱＬＤＲＲＫＨＴＱＮＶＡＬＮＩＫＬＳＡＩＫＴＫＹＬＲＥＬＮＶＬＥＥＫＳＫＤＥＬＰＳＥＩＫＡＫＬＤＡＡＦＥＫＦＫＫＤＴＬＫＰＧＥＫ（配列番号２）
またはその機能的変異体もしくは断片を含む。
この特定の配列は、ＰｓｐＣＮと比較して、ＰｓｐＣのさらなる切断形態を表し、ＰｓｐＣのアミノ酸６２〜１４０を含み、ＰｓｐＣＮ（６２〜１４０）と称する。ＰｓｐＣＮ（６２〜１４０）は、高い親和性でＣＦＨに結合することができるＰｓｐＣの最小限の、またはほぼ最小限の断片を表すと考えられる。
別の好適な実施形態において、本発明によるタンパク質は配列：
ＡＴＥＮＥＧＡＴＱＶＰＴＳＳＮＲＡＮＥＳＱＡＥＱＧＥＱＰＫＫＬＤＳＥＲＤＫＡＲＫＥＶＥＥＹＶＫＫＩＶＧＥＳＹＡＫＳＴＫＫＲＨＴＩＴＶＡＬＶＮＥＬＮＮＩＫＮＥＹＬＮＫＩＶＥＳＴＳＥＳＱＬＱＩＬＭＭＥＳＲＳＫＶＤＥＡＶＳＫＦＥＫＤＳＳＳＳＳＳＳＤＳＳＴＫＰＥＡＳＤＴＡＫＰＮＫＰＴＥＰＧＥＫ（配列番号９）
またはその機能的変異体もしくは断片を含む。
ＰｓｐＣのやや小さな断片も高い親和性でＣＦＨに結合することができ得ると考えられるが、ＰｓｐＣＮ（６２〜１４０）のＮまたはＣ末端をアミノ酸１０個分短縮することはＣＦＨ結合親和性にひどく悪影響を及ぼすことが示された。
よって、本発明の好適な実施形態において、タンパク質はＰｓｐＣの、その機能的変異体の、少なくともアミノ酸残基６８〜１３６、より好適には６５〜１３８、さらにより好適には６２〜１４０を含む。
当然ながら、ＰｓｐＣＮ（６２〜１４０）内の部分は、タンパク質の機能性に悪影響を及ぼすことなく、除去または置換することができると考えられ、どの領域を除去または置換することができるかの決定は当業者の通常の技術の範囲内である。アミノ酸６２〜１４０内の部分が除去または置換されたが、機能的なままであるタンパク質は、以下で詳述するように、本発明の範囲内である。
本発明のタンパク質のとくに興味深い特性は、それらがＣＦＨについて高度に選択的であると考えられることである。例えば、本発明によるタンパク質は、関連タンパク質、ＣＦＨ様タンパク質１または他のＣＦＨ関連タンパク質より優先してＣＦＨに選択的に結合することができると考えられる。これはタンパク質の治療的、診断的および他の使用に関して影響を有する。
本発明のタンパク質は好適には、主にＣＦＨのＣＣＰ８および１５の間内の位置で、好適にはＣＣＰ８〜１０内の位置でＣＦＨに結合する。
さらに、上述した断片はより大きなタンパク質の一部であり、（例えば融合タンパク質またはＰｓｐＣのより大きな断片の一部として）その結合特性を保持し得る。
よって、本発明が配列番号１または２の正確な配列に限定されず、ＰｓｐＣＮの生物学的活性を保持する、すなわちＣＦＨ結合および活性化に関して機能的なままである、その変異体または断片も本発明の範囲内に含まれることは、当業者には明らかとなるだろう。
とくに、野生型ＣＦＨと複合体化した場合、１０ｎＭ以下、より好適には１ｎＭ以下、より好適には１００ｐＭ以下、より好適には１０ｐＭ以下、もっとも好適には１ｐＭ以下のＫＤを有する変異体または断片は、本発明の好適な実施形態である。驚くべきことには、ＰｓｐＣＮおよびＰｓｐＣＮ（６２〜１４０）のようなタンパク質は５×１０−１４Ｍほどの低いＫＤを有すると測定され、よって、本発明のとくに好適なタンパク質は１×１０−１３Ｍ以下のＫＤにより表される親和性を有する。より高い親和性がより低いＫＤに対応することは言うまでもない。
本明細書において用いられる場合、「タンパク質」の語は「ペプチド」または「ポリペプチド」と互換的に用いることができ、ぺプチジル結合により結合した少なくとも２つの共有結合αアミノ酸残基を意味する。タンパク質の語は、精製天然生成物、または組換えもしくは合成技術を用いて部分的もしくは全体的に生成され得る、化学生成物を含む。タンパク質の語は、二量体もしくは他の多量体、融合タンパク質、タンパク質変異体、またはその誘導体のような、２つ以上のポリペプチドの複合体を指し得る。その用語は修飾タンパク質、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化、等により修飾したタンパク質も含む。タンパク質は核酸コドンによりコードされないアミノ酸を含み得る。
配列中に少しの修飾を有するタンパク質は、機能的である限り、等しく有用であることが明らかとなり、本発明はよって、配列番号１において示されるアミノ酸配列との少なくとも５０％の類似性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質またはその機能的断片も提供する。本発明は好適には、配列番号１における配列に対して少なくとも６０％、または好適には少なくとも７０％、より好適には８０％、より好適には９０％、より好適には少なくとも９９％、もっとも好適には１００％の類似性を有するポリペプチド配列を含むタンパク質、またはその機能的断片を提供する。
「類似性」の語は、アミノ酸の違いからタンパク質間の類似性の程度を指すが、ほぼ等しいサイズ、親油性、酸性、等からどの異なるアミノ酸が機能的に類似しているかが考慮される。類似性パーセントは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ．ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｊ．Ｇ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ １９９２，８９：１０９１５−１０９１９に記載されるＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスのような類似性スコアリングマトリックスを用いて配列の最適アラインメントにより計算することができる。Ｂｌｏｓｕｍ６２類似性マトリックスおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）のアルゴリズムを用いる２つの配列の類似性パーセントおよび最適アラインメントの計算は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、米国ウィスコンシン州マディソン）のＧＡＰプログラムを用い、プログラムのデフォルトパラメータを用いて行うことができる。
本発明におけるアミノ酸比較のための例となるパラメータは、ＧＡＰプログラムの次の設定と併せてＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、上記）を用いる：
−ギャップペナルティ：８
−ギャップ長ペナルティ：２
−末端ギャップペナルティなし
ＰｓｐＣの多形形態は本発明に含まれる。同様に本発明の一部を形成するタンパク質の変異体は、配列における１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、反転もしくは付加による、またはタンパク質に化学的に結合した部分の変化により、アミノ酸残基配列中に変異を含有し得る天然または合成変異体である。例えば、タンパク質変異体はタンパク質に結合した変化炭化水素またはＰＥＧ構造であり得る。本発明のタンパク質は少なくとも１つのこうしたタンパク質修飾を含み得る。
タンパク質の置換性変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なるアミノ酸残基が挿入されたものである。本発明のタンパク質は保存的または非保存的置換を含有することができる。
「保存的置換」の語は、１つ以上のアミノ酸残基の同様の生化学的特性を有するアミノ酸残基での置換に関する。一般的には、保存的置換は得られるタンパク質の活性に対してほとんどまたはまったく影響を及ぼさない。例えば、本発明のタンパク質における保存的置換は、ＣＦＨに結合し、これを活性化するタンパク質の能力に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸残基置換であり得る。本発明のタンパク質の変異体のスクリーニングは、どのアミノ酸残基がアミノ酸残基置換を許容することができるかを同定するのに用いることができる。１つの例において、修飾タンパク質の関連生物学的活性は、１つ以上の保存的アミノ酸残基置換が行われる場合、ＰｓｐＣＮと比較して、２５％超、好適には２０％以下、とくに１０％以下で減少していない。
１つ以上の保存的置換を本発明のタンパク質に含めることができる。１つの例では、１０以下の保存的置換がタンパク質に含まれる。本発明のタンパク質はしたがって１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の保存的置換を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発、遺伝子合成、またはＰＣＲのような標準的な手順を用い、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより、１つ以上の保存的置換を含有するように生成することができる。あるいは、ポリペプチドは、例えば当技術分野において知られるような、ペプチド合成方法を用いることにより、１つ以上の保存的置換を含有するように生成することができる。
タンパク質中のもとのアミノ酸残基を置換し得、保存的置換とみなされるアミノ酸残基の例としては：ＡｌａについてのＳｅｒ；ＡｒｇについてのＬｙｓ；ＡｓｎについてのＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐについてのＧｌｕ；ＧｌｎについてのＡｓｎ；ＧｌｕについてのＡｓｐ；ＧｌｙについてのＰｒｏ；ＨｉｓについてのＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅについてのＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕについてのＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓについてのＡｒｇまたはＧｌｎ；ＭｅtについてのＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅについてのＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒについてのＴｈｒ；ＴｈｒについてのＳｅｒ；ＴｒｐについてのＴｙｒ；ＴｙｒについてのＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌについてのＩｌｅまたはＬｅｕが挙げられる。１つの実施形態において、置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；ＬｙｓおよびＡｒｇ間；ならびに／またはＰｈｅおよびＴｙｒ間である。保存的置換についてのさらなる情報は、とりわけ、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ‘Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１−５，１９８８）、国際公開第ＷＯ００／６７７９６号（Ｃｕｒｄ ｅｔ ａｌ．）ならびに遺伝学および分子生物学の標準的なテキストを参照することができる。
他の変異体は、例えば、塩、アミド、エステル、とくにＣ末端エステル、およびＮ−アシル誘導体のような機能的変異体とすることができる。例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化により、インビボまたはインビトロで修飾されるペプチドも含まれる。
本発明によるタンパク質は、さまざまな化学技術により修飾し、非修飾ペプチドと本質的に同じ活性を有し、任意で他の所望の特性を有する誘導体を生成することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端でも側鎖でも、医薬的に許容可能なカチオンの塩の形態でもたらされ、または例えばＣ１〜Ｃ６アルキルエステルを形成するようにエステル化され、または例えばＲ１およびＲ２がそれぞれ独立してＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルである式ＣＯＮＲ１Ｒ２の、アミドに変換され、または５員もしくは６員環のような、複素環を形成するように組み合わされ得る。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端でも側鎖でも、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸および他の有機塩のような、医薬的に許容可能な酸付加塩の形態であり得、またはＣ１〜Ｃ６アルキルもしくはジアルキルアミノに修飾またはアミドにさらに変換され得る。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、周知の技術を用い、アルコキシまたはエステル基、例えばＣ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルエステルに変換され得る。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩのような、１つ以上のハロゲン原子で、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはこうしたカルボン酸のアミドで置換され得る。ペプチド側鎖のメチレン基は相同なＣ２〜Ｃ４アルキレンまで拡大することができる。チオールは、アセトアミド基のような、多数の周知の保護基のいずれか１つで保護することができる。当業者であれば、向上した安定性をもたらす構造に対する構造的制約を選択および提供するため、本開示のペプチド中に環状構造を導入する方法も認識するだろう。
ＰｓｐＣＮの機能的断片のみを含むタンパク質またはその変異体も本発明の一部を形成する。機能的断片は、タンパク質がＣＦＨに結合し、これを活性化する働きをするのに必須である、タンパク質の１又は複数の部分を少なくとも表す断片であり、例えば、単独またはマルチサブユニット形態で用いられる場合、この機能を果たすことができる。よって、こうした機能的断片はそれ自体が機能的であるポリペプチドであり得、または断片は、例えばキメラタンパク質を得るため、他のポリペプチドに結合させた場合、機能的であり得る。こうした機能的断片は本発明の範囲内に含まれると理解される。断片が機能的であるかどうかは、本明細書に記載される各種バイオアッセイを用いて決定することができる。
断片は、とくに、ＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼおよびポリペプチドにプロテアーゼを用いる、前駆体分子の酵素開裂により生成することができる。他の方法としては、断片の化学合成またはＤＮＡによりコードされるペプチド断片の生成が挙げられる。
本発明のタンパク質は融合タンパク質とすることができる。２つ以上のサブユニットを結合して融合タンパク質を形成する多数の手段が当業者には周知である。こうした融合タンパク質はリンカーを含むことができ、またはリンカーを有さなくてもよい。適切なリンカーは当技術分野において周知であり、関連情報は、とくに、Ｇｅｏｒｇｅ ＲＡ ａｎｄ Ｈｅｒｉｎｇａ Ｊ．‘Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：ｔｈｅｉｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ’．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，２００２ Ｎｏｖ；１５（１１）８７１−９を参照することができる。
本発明によるタンパク質の生物活性は、適切なバイオアッセイを用いてインビトロで測定することができる。適切なバイオアッセイは以下で詳述し、ＣＦＨへのタンパク質の結合を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の使用、および他の関連補体成分と相互作用する（例えばＣ３ｂもしくはＣ３ｄに結合する、またはＣ３ｂ．Ｂｂの崩壊を誘発する）タンパク質結合ＣＦＨの能力の測定を含む。
一般的には本発明のタンパク質は組換えタンパク質である。例えば、タンパク質は酵母菌または大腸菌のような適切な細胞株における発現によって製造することができる。
さらなる態様において、本発明は、ＣＦＨに結合した本発明のタンパク質を含む複合体であって、ＣＦＨがＣＦＨ単独で用いられる構造より活性な構造で保持される複合体を提供する。こうした複合体は、対象におけるＣＦＨ活性のレベルを増加させる治療剤として有用であり得る。
本発明のさらなる態様において、本発明のタンパク質をコードする核酸が提供される。
別の態様において、本発明はしたがって、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。適切なベクターとしては、細菌または酵母菌プラスミド、コスミド、ファゲミド、フォスミド、広宿主域プラスミドならびにプラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。複製起点および／または優性選択マーカーは適切にはベクター中に存在することができる。
本発明によるベクターは宿主細胞を形質転換するのに適している。適切なクローニングベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、各種ｐＵＣ、ｐＥＭＢＬおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのようなプラスミドベクター、またはウイルスベクターがある。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現に用いられる場合、本発明によるベクターは一般的には、関連ポリヌクレオチドの発現を制御するため、タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に結合した発現制御配列を含む。こうした発現制御配列は一般的には、プロモーター配列ならびに転写および翻訳を調節および／または発現レベルを向上する追加の配列を含む。適切な発現制御配列は当技術分野において周知であり、真核生物、原核生物もしくはウイルスのプロモーターまたはポリＡシグナルを含む。発現制御および他の配列は、もちろん、選択される宿主細胞に応じて変動し、構成的であり得、または誘導的となり得る。有用なプロモーターの例としては、ＳＶ−４０プロモーター（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３，２２２：５２４−５２７）、メタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ １９８２，２９６：３９−４２）、ヒートショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ １９８５，８２：４９４９−４９５３）、ＰＲＶ ｇＸプロモーター（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９０，３０：５５−６６）、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ １９８２，７９：６７７７−６７８１）、またはヒト伸長因子１αもしくはユビキチンプロモーターがある。多くの他の適切な制御配列は当技術分野において知られ、用いられる発現系に適した配列を選択することは当業者には通常の作業であるだろう。
ポリヌクレオチドが適切なベクターにクローニングされた後、構成物は、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２トランスフェクションまたはリポフェクションのような、適切な方法により細胞（例えば動物細胞、細菌、または酵母菌）に導入され得る。バキュロウイルス発現系が用いられる場合、ポリヌクレオチドを含有するトランスファーベクターは全バキュロゲノムとともにトランスフェクトされ得る。
これらの技術は当技術分野において周知であり、分子生物学的材料の製造業者（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、および／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は適切な試薬およびそれらの使用説明書を提供する。さらに、これについてのさらなる情報を提供する多数の標準的な参照テキスト、例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｄ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄ．，“Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ”，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．，１９９５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａ；およびＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ． １−４，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９５，ｅｄｓ．：Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓがある。
さらなる態様において、本発明は、発現する組換えタンパク質をコードする本発明によるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えタンパク質を発現することができる細胞も提供する。適切には細胞は上述したようにポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換された宿主細胞である。本発明によるポリヌクレオチドもしくはベクターは、細胞のゲノム材料中に安定に組み込むことができ、または自律複製ベクターの一部とすることができる。この文脈における「組換え」とは、自然状態の細胞では発現されないタンパク質を指す。
したがって、細胞は組換えタンパク質を産生することができ得る。
宿主細胞は、例えば転写の適切な選択、増幅または誘導およびよって組換えタンパク質の発現のため、修飾することができる従来の栄養培地において培養することができる。
宿主細胞は原核または真核とすることができる。適切な原核細胞としては、例えば、大腸菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。適切な真核細胞としては、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＣＨＯ、またはＣＯＳ−７細胞が挙げられる。
各種適切な細胞タイプに適した培養条件は当業者には周知である。
さらなる態様において、本発明は本発明による細胞を含む細胞培養物を提供する。
本発明のさらなる態様において、疾患の治療または予防に有用な本発明によるタンパク質が提供される。
本発明のさらなる態様において、対象または補体活性の低減が有益である場合における異常な補体調節活性に関連する疾患（症状）または他の内科的合併症の治療または予防に有用な本発明によるタンパク質が提供される。
本発明のタンパク質は、補体が不適切に活性である、例えば過活性である疾患の治療にとくに有用である。
本発明のタンパク質は、代替補体経路が不適切に活性である疾患の治療にとくに有用である。
本発明のタンパク質は、例えば血漿中のＣＦＨまたは変異またはＣＦＨ産生もしくは調節活性を低減するＣＦＨをコードする遺伝子（もしくはその調節領域）内のＳＮＰのレベルの低下のため、または例えば加齢もしくは病状に伴って起こり得るような自己表面マーカーにおける変化のため、またはＣＦＨ関連タンパク質からのＣＦＨによる表面結合との競合のため、ＣＦＨが補体活性化を適切に調節することができない疾患の治療にとくに有用である。また、本発明のタンパク質は、補体の調節機構がその他の理由でオーバーランされた場合、例えば他の補体調節剤がいくつかの点でまたは異物および宿主細胞損傷もしくは死の産物の両方を含む補体活性化のトリガーが豊富である場合に不足している場合、有用であり得る。こうした疾患は当技術分野に精通した者には周知である。当技術分野において知られるように、ＣＦＨは、因子Ｉ媒介Ｃ３ｂ開裂の補因子活性、および代替経路Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂ．Ｂｂに対する崩壊促進活性の両方を有することにより、流体相における、ならびに自己細胞および表面上での補体活性化を調節する。
適切には疾患は：
−発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
−非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；
−密沈積症（ＤＤＤ）；
−加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）；
−全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；
−敗血症；および
−アルツハイマー病
の１つ以上である。
この疾患群からとくに関心があるのは、本発明のタンパク質がとくに有用であると考えられる、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、ＤＤＤおよびＡＭＤである。
適切には上記疾患はＣＦＨにおける変異に関連し、またはこれに影響を及ぼす。しかしながら、上記疾患のいくつか（例えばＰＮＨ）にはＣＦＨにおける変異もＳＮＰも関与せず、ＣＦＨにおける変異もＳＮＰも関与しない疾患について、上記疾患の発症のすべてがこうしたＣＦＨにおける変異またはＳＮＰにより（全体的にも部分的にも）引き起こされるわけではない。本発明のタンパク質はＣＦＨが直接関与する例に明らかによく適合している。しかしながら、ＣＦＨにおける変異またはＳＮＰが存在しない例においても、本発明のタンパク質は依然として症状の治療に有用であり得る。
本発明のタンパク質はＣＦＨの活性を向上させ、このようなものとして、ＣＦＨの不適切な活性が症状の病理の一因となる条件で、ＣＦＨの活性を増強するのに用いることができる。
疾患がプロファイルされ、プロファイルに基づき適切な療法が選択される層別化／個別化医療の到来を鑑みると、本発明のタンパク質は、疾患、例えば上記疾患の１つに異常なＣＦＨレベルもしくは活性が関与する場合、または代替補体経路が過活性である場合、投与することができる。これは本発明のタンパク質での治療を好ましい効果をもたらしやすい条件に集中させることを可能にする。
本発明のさらなる態様によると、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質をコードする核酸を含む医薬製剤が提供される。
医薬組成物は適切には医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容可能な担体」は、生理的に相溶性である、いずれかまたはすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、等を含む。１つの実施形態において、担体は非経口投与に適している。担体は、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内投与に適し得る。別の実施形態において、担体は経口投与に適している。医薬的に許容可能な担体としては、無菌水溶液または分散液および無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。医薬的に活性な物質のこうした媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が本発明の融合タンパク質と非相溶性でない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が考慮される。組成物は、所望に応じて、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。補助活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
通常、こうした医薬組成物の調製は、活性剤の緩衝剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定剤および／または賦形剤との組み合わせを伴う。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合した生理食塩水は、タンパク質治療剤の例となる適切な希釈剤である。
１つの好適な実施形態において、組成物は、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用い、凍結乾燥物として製剤される。
組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、タブレット、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとることができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、等のような標準的な担体を含むことができる。
各種参考文献は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤の選択を容易にするのに利用可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）；Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｗａｎｇ，Ｅ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８５：１２９−１８８（１９９９）ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｗ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３：１−６０（２０００），ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。
こうした組成物は、患者に適切な投与の形態を提供するため、治療効果的な量の本発明のタンパク質を、好適には精製形態で、適切な量の担体とともに含有するだろう。製剤は投与様式に適するべきである。
いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質はＣＦＨとの複合体として提供される。こうした複合体は、治療される対象が機能的ＣＦＨを産生する能力が低減し、よって対象中にタンパク質が結合および活性化するのに不適切なＣＦＨが存在し得る場合、とくに価値がある。
好適な実施形態において、組成物は、通常の手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤される。一般的には、静脈内投与用の組成物は無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるリドカインのような局所麻酔剤も含み得る。一般的には、成分は別々に、または単位剤形に混合して、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットのような密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が点滴により投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴ボトルで調合することができる。組成物が注射により投与される場合、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルは成分が投与前に混合され得るように用意することができる。
本発明の組成物は、中性または塩形態として製剤することができる。医薬的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、等から誘導されるもののような遊離カルボキシル基で形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等から誘導されるもののような遊離アミン基で形成されるもの、ならびに水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および第二鉄、等から誘導されるものが挙げられる。
各種送達システム、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、およびマイクロカプセル中へのカプセル化；本発明のタンパク質を発現することができる組換え細胞の使用；受容体媒介エンドサイトーシス（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）の使用；レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療的核酸の構成、等が知られ、本発明のタンパク質を投与するのに用いることができる。
別の実施形態において、本発明の医薬組成物はベシクル、とくにリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７；一般的には同書を参照されたい）。
また別の実施形態において、本発明の医薬組成物は制御放出システムによって送達することができる。
本発明の医薬組成物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施形態において、核酸は、そのコードタンパク質の発現を促進するため、適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、細胞内となるように投与することにより、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号明細書）の使用により、または直接注射により、またはマイクロ粒子衝突（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質、細胞表面受容体またはトランスフェクション剤でのコーティングにより、または核に入ることが知られるホメオボックス様ペプチドとの結合中での投与（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−８６８）、等により、インビボで投与することができる。あるいは、核酸は発現のため細胞内に導入し、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
特定の障害または症状の治療に効果的であるだろう本発明の医薬組成物の量は障害または症状の性質によって異なり、標準的な臨床技術により決定することができる。適切な用量は治験で決定することができる。適切な産業標準に従って、ベンジルアルコールのような、防腐剤も添加され得る。投与量および回数は、もちろん、治療下の適応症の性質および重症度、所望の反応、患者の状態、等のような要素によって異なるだろう。加えて、最適な用量範囲の同定を補助するため、任意でインビトロアッセイを用いてもよい。製剤中に用いられる正確な用量も、投与経路、および疾患または障害の重篤度によって異なり、医療従事者の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与の適切な用量範囲は、一般的には体重１キログラム当たり活性化合物約１〜５００マイクログラムである。効果的な用量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから誘導される用量反応曲線から推定され得る。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
こうした容器と任意で関連づけられるものとして、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の注意書きを挙げることができ、この注意書きはヒト投与用の製造、使用または販売の機関による承認を反映する。
本発明は、効果的な量の本発明の医薬組成物の対象への投与による、対象における疾患の治療または予防方法を提供する。とくに、本発明は、対象における異常な補体活性に関連する疾患の治療または予防を提供する。
対象は好適には動物、好適には哺乳類、もっとも好適にはヒトである。
適切には疾患は：
−発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
−非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；
−密沈積症（ＤＤＤ）；
−加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）；
−全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；
−敗血症；および
−アルツハイマー病
の１つ以上である。
この疾患群からとくに関心があるのは、本発明のタンパク質がとくに有用であると考えられる、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、ＤＤＤおよびＡＭＤである。
本発明は、本発明のタンパク質および医薬的に許容な希釈剤または担体を含む医薬組成物の形態の本発明のタンパク質の、それを必要とする対象（例えば、哺乳類とくにヒト）への投与を考慮する。本発明はこうした組成物でのヒト疾患の治療方法も提供する。
導入方法は、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む。化合物はいずれかの便利な経路により、例えば点滴により、ボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔、直腸および腸粘膜、等）を介する吸収により投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。
投与は全身または局所とすることができる。経肺投与は、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、用いることができる。
一般的には、本発明の方法は、医薬的に効果的な量の本発明のタンパク質を含む医薬組成物、または医薬的に効果的な量の本発明のタンパク質を発現することができる核酸を含む組成物のインビボ投与を含むだろう。用いられる医薬的に効果的な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重のような要素に応じて変動し得る。
本発明のタンパク質の医薬的に効果的な量は、タンパク質約１μｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１０μｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１００μｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約２５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約２５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約２５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約２５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約２５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１００μｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約２．５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約７．５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇであり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質の医薬的に効果的な量は、タンパク質０．５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質１ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質２ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質３ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質４ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質５ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質６ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質７ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質８ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、タンパク質９ｍｇ／対象の体重１ｋｇ、またはタンパク質約１０ｍｇ／対象の体重１ｋｇであり得る。
単位剤形とは治療される哺乳類の対象用の単一用量として適した物理的に不連続な単位を指し；各単位は必要な医薬担体に関連した所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の本発明のタンパク質を含有する。本発明のタンパク質の単位剤形は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約２５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約４００ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。本発明のタンパク質の単位用量は、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、または７００ｍｇであり得る。
本発明の組成物は、本発明のタンパク質を、組成物の総重量の約０．１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１８ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１６ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１４ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１２ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約８ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約６ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約４ｗｔ％、約０．１％〜約２ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．９ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．８ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．７ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．６ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．４ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約０．３ｗｔ％、または約０．１ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％のレベルで含み得る。
本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明のタンパク質を、組成物の総重量の約１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約１８ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約１６ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約１４ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約１２ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約８ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約７ｗｔ％、約１％〜約６ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約４ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約３ｗｔ％、または約１ｗｔ％〜約２ｗｔ％のレベルで含み得る。本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明のタンパク質を、組成物の総重量に対して約０．１ｗｔ％、約０．２ｗｔ％、約０．３ｗｔ％、約０．４ｗｔ％、約０．５ｗｔ％、約０．６ｗｔ％、約０．７ｗｔ％、約０．８ｗｔ％、約０．９ｗｔ％、約１ｗｔ％、約２ｗｔ％、約３ｗｔ％、約４ｗｔ％、約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、または約９ｗｔ％のレベルで含み得る。
用法は最適な治療反応をもたらすように調節され得る。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、時間をかけていくつかの分割した用量を投与してもよく、または用量を治療状況の危急性により示されるように比例的に低減もしくは増加させてもよい。非経口組成物を投与しやすさおよび用量均一性のための単位剤形に製剤することはとくに有利である。本発明の組成物は製剤し、静脈内、筋肉内、または皮下注射により投与してもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は皮下または筋肉内投与してもよい。
いくつかの実施形態において、用法は、用量の反復投与、例えば、用量の週１回投与を伴ってもよい。治療計画は、ある期間（例えば、４週間）の週１回投与、その後のより頻度の少ない（例えば、１か月に１回または２か月に１回の）「維持」用法を伴ってもよい。用法は所望の治療結果を達成するように調節され得る。
適切には本方法は、本発明のタンパク質の対象における特定の部位または組織への標的化を含む。標的化方法は当技術分野において周知であり、標的化部分またはそうでなければ結合標的化部分を含む融合タンパク質の用意を含むことが多い。一般的な標的化部分は抗体または受容体のリガンドである。例えば、ＰｓｐＣＮのＩＶ型コラーゲンに対する抗体断片との融合は、ＰｓｐＣＮを糸球体に標的化し、これはａＨＵＳの治療に有用であるだろう。
本発明の別の態様において、表面上に固定された本発明によるタンパク質が提供される。表面はいずれかの適切な表面とすることができ、例えば、ビーズ、容器、医療機器、マイクロカプセル、または生物学的組織の表面を含む。
本発明のタンパク質を表面に結合させることにより、表面がＣＦＨに結合することを可能にする。これは多数の異なる用途において有用であり得る。例えば、結合ＣＦＨは表面をＣ３ｂ増幅の影響から保護するのに用いることができる。あるいは、表面は、診断目的でＣＦＨに選択的に結合、混合物からＣＦＨを抽出もしくは精製、または捕捉されたＣＦＨと相互作用およびよって結合する分子を同定するためＣＦＨに結合するのに用いることができる。
適切には本発明によるタンパク質は表面に共有結合させることができる。当業者が共有結合を達成するのに利用可能な適切な技術は多数ある。例えば、そのＮまたはＣ末端側のいずれかへのＣｙｓ残基の付加は、血液または血清と接触する表面への便利な結合方法を提供するだろう。ＣＦＨ結合および活性化特性を保持する、本発明の各種Ｃｙｓ修飾タンパク質については後述する。
あるいは、タンパク質は、非共有結合的手段、例えば受動吸着、タンパク質間相互作用、イオン性相互作用、等によって結合させることができる。例えば、表面はビオチン／アビジンでコーティングすることができ、本発明のタンパク質は表面への結合を可能にする対応するビオチン／アビジン分子との融合体とすることができる。
タンパク質コーティングを促進するため医療機器の表面を修飾する既知の方法としては、物理的修飾、化学的修飾、光化学的修飾、およびプラズマ処理が挙げられ；例えば、Ｖａｓｉｔａ，Ｒａｊｅｓｈ；Ｓｈａｎｍｕｇａｍｉ，Ｋ；Ｋａｔｔ，ＤＳ（２００８）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（４）：３４１−３５３、およびＭｏｒｒａ，Ｍ．；Ｃａｓｓｉｎｅｌｌｉ，Ｃ．（２００６）．“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”．Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ ２９（９）：８２４−８３３を参照されたい。
本発明のさらなる態様において、その表面が本発明によるタンパク質で少なくとも部分的にコーティングされた、医療機器が提供される。
適切には機器（すなわち体組織および／または体液と接触するもの）の外面の実質的にすべてがタンパク質でコーティングされる。
医療機器は、対象の体の組織に露出した、本質的にすべての医療機器、例えば幹細胞送達用マイクロカプセル、ステント、ステントグラフト、整形外科用インプラント、カテーテル、ガイドワイヤー、心臓弁修復装置および体外循環装置であり得る。
本発明は、埋め込み型医療機器、例えばマイクロカプセル、ステント、血管グラフト、整形外科用インプラント、ペースメーカー等、ならびに血液透析、血漿交換、体外膜型酸素供給および関連手順に用いられる装置のような体外循環装置にとくに適している。
血液に露出した埋め込み型医療機器の表面へのタンパク質の吸着および結果として起こる補体活性化はよくある問題であり、炎症反応を引き起こす。
こうした医療機器の表面の少なくとも一部を本発明によるタンパク質でコーティングすることにより、こうした表面に関連する補体活性／活性化は低減すると期待されるだろう。本発明による固定化タンパク質は、血液／血清から因子Ｈをリクルートし、表面上での、またはこれに関連する補体活性化を減少させるだろう。
別の実施形態において、機器はＣＦＨに結合した本発明のタンパク質の複合体でコーティングすることができる。
本発明の関連態様において、
−医療機器を用意するステップ；
−本発明によるタンパク質を用意するステップ；および
−前記タンパク質を医療機器の表面の少なくとも一部に結合させるステップ
を含む医療機器の処理方法が提供される。
本発明によるタンパク質の医療機器への結合は、もちろん、上述したものを含む、いずれかの適切な方法により行うことができる。
本発明のさらなる態様において、
−試料を用意するステップ；
−本発明によるタンパク質を用意するステップ；
−試料を本発明のタンパク質と接触させるステップ；および
−試料中に存在するＣＦＨへのタンパク質の結合を検出するステップ
を含む、試料中のＣＦＨの存在または量の検出方法が提供される。
適切には本発明によるタンパク質は、従来の「ＥＬＩＳＡ」に類似した方法で、表面上に固定し、ＣＦＨを吸着するように用いることができる。ＰｓｐＣＮは、高い親和性および選択性により、ＣＦＨのレベルの定量化に用いられる魅力的な薬剤である。正常ヒト血清中のＣＦＨレベルを定量化するのに用いられる本発明によるタンパク質の例は以下に記載する。
標識／検出（おそらくシステイン残基の導入もしくは他の手段による蛍光タグの結合による、または遺伝子発現およびタンパク質産生のレベルでの酵素との融合による）を促進するため、ＰｓｐＣＮの修飾、例えば共有結合修飾と組み合わせる場合、これにより標識ＰｓｐＣＮはＣＦＨレベルの定量化の理想的な選択肢となる。
本方法は適切には診断方法であり得、よって対象からの生物学的試料、例えば血液の試料または血漿のような血液分画中のＣＦＨの存在の検出を含むことができる。例えば、ＣＦＨおよびＰｓｐＣＮ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ融合タンパク質は複合体を形成することが可能であり、これはその後抗体により捕捉され、定量化される。あるいは、ＣＦＨとの複合体の形成が熱泳動または別の適切な手段によりモニターされるアッセイにおいて、蛍光標識ＰｓｐＣＮを用いることができる。
本発明のさらなる態様において、
−試料を用意するステップ；
−ＣＦＨを用意するステップ；
−試料をＣＦＨと接触させるステップ；および
−試料中に存在するＣＦＨへのＰｓｐＣＮの結合を検出するステップ
を含む、試料中のＰｓｐＣＮの存在または量の検出方法が提供される。
本方法は表面上のＰｓｐＣＮの存在の検出方法であり得る。表面は細菌膜であり得る。したがって、本方法は、細菌、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスまたはストレプトコッカス・ニューモニエの存在の検出方法であり得る。
本発明のさらなる態様において、
−表面上に固定された本発明によるタンパク質を用意するステップ；
−試料を用意するステップ；
−試料を表面上に通すステップ；および
−表面に結合したＣＦＨを回収するステップ；ならびに／または
−ＣＦＨを失った試料を回収するステップ
を含む、試料からのＣＦＨの精製または分離方法が提供される。
表面は、例えば、容器、導管、マトリックス（例えば多孔質または繊維質マトリックス）、ビーズ、ゲル、またはクロマトグラフィーに用いられるいずれかの充填材料の表面とすることができる。
本発明のさらなる態様において、
−表面上に固定されたＣＦＨ、またはＣＦＨの切断構成物を用意するステップ；
−試料を用意するステップ；
−試料を表面上に通すステップ；および
−表面に結合したＰｓｐＣ、ＰｓｐＣＮもしくはＰｓｐＣＮを含有する融合タンパク質を回収するステップ；ならびに／または
−ＰｓｐＣを失った試料を回収するステップ
を含む、試料からのＰｓｐＣ、ＰｓｐＣＮまたはＰｓｐＣＮを含有する融合タンパク質の精製または分離方法が提供される。
表面は、例えば、容器、導管、マトリックス（例えば多孔質または繊維質マトリックス）、ビーズ、ゲル、またはクロマトグラフィーに用いられるいずれかの充填材料の表面とすることができる。
本発明のさらなる態様において、
−適切なマイクロカプセルを用意するステップ；および
−本発明によるタンパク質を前記マイクロカプセル上に固定するステップ
を含む、埋め込み型マイクロカプセルの本発明によるタンパク質でのコーティング方法が提供される。
したがって、こうしてコーティングされたマイクロカプセルは、補体活性化およびその後の拒絶反応の可能性が低い。こうしたマイクロカプセルの例としては、これらに限定されないが、１型糖尿病の患者へその後埋め込むための膵島細胞のような細胞のカプセル化用に設計された各種アルギン酸マイクロカプセルが挙げられる。
本方法は、マイクロカプセルをコーティングするタンパク質に結合させるＣＦＨまたはその機能的変異体を用意するステップをさらに含んでもよい。
下記の定義は本発明の適切な範囲を理解するのに役立つ。
「アミノ酸配列」とは、本明細書において用いられる場合、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、およびその断片または部分を指し、自然発生または合成分子を指す。「アミノ酸配列」および本明細書に記載される「ポリペプチド」または「タンパク質」のような類似語は、アミノ酸配列を記載されるタンパク質分子に関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意図しない。
「細胞培養物」とは、本明細書において用いられる場合、未分化または分化状態のいずれかであり得る、増殖する細胞集団を指す。
「融合タンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、２つの異なるタンパク質のそれぞれからのアミノ酸配列を含有するタンパク質を指し；これは２つのコード配列をそれらのリーディングフレームが一致するように結合した組換え遺伝子の発現により形成される。このタイプのハイブリッド遺伝子は、特定の遺伝子の産物をより容易にアッセイすることができるタンパク質で標識するため、インビトロで構成され得る（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性を有する融合タンパク質を得るため大腸菌中のｌａｃＺと融合した遺伝子）。あるいは、タンパク質は、細胞によるその分泌を可能にするシグナルペプチドに結合し得る。あるいは、タンパク質は、精製を促進するペプチドに結合し得る（例えばポリヒスチジンタグ）。あるいは、タンパク質は、宿主細胞における発現を向上させるペプチドに結合し得る（例えばＳＵＭＯタンパク質との融合体）。
「分離」の語は、それが天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離または精製された生物学的成分（例えば核酸分子またはタンパク質）を意味する。「分離」された核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質を含む。この語は、宿主細胞における組換え発現により調製される核酸およびタンパク質、ならびに化学合成核酸、タンパク質およびペプチドも含む。
「核酸」または「核酸配列」とは、本明細書において用いられる場合、１つのヌクレオチド糖の３’位が次の５’位にホスホジエステル架橋により結合したヌクレオチドのポリマーを指す。線状核酸鎖において、一端は一般的には遊離５’ホスフェート基、他端は遊離３’ヒドロキシル基を有する。核酸配列は、本明細書において、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびこれらの断片もしくは部分、ならびに一本もしくは二本鎖であり、センスもしくはアンチセンス鎖を表し得るゲノムもしくは合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを指すのに用いられ得る。
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて記載される機構、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、これらと非適合性でない限り、本明細書において記載されるいずれかの他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（いずれかの添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）において開示される機構のすべて、ならびに／またはこうして開示されるいずれかの方法もしくはプロセスのステップのすべては、こうした機構および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、いずれの組み合わせで組み合わせてもよい。本発明はいずれの前記実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（いずれかの添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）において開示される機構のいずれかの新規の１つ、もしくはいずれかの新規の組み合わせ、またはこうして開示されるいずれかの方法もしくはプロセスのステップの、いずれかの新規の１つ、もしくはいずれかの新規の組み合わせまで拡大する。
読者の注意を本出願において記載され、公衆の閲覧に供されるすべての論文および文献に向け、すべてのこうした論文および文献の内容を本明細書に参照により組み入れる。
本発明の実施形態について、非限定的な例により、添付の図面を参照しながら、ここで説明する。
この研究において調査されるタンパク質および複合体。（上）：Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂ．Ｂｂ（Ｃ３ｂ：ＣＦＢプロコンバターゼ複合体のＣＦＤ触媒タンパク質分解により形成）は、Ｃ３をＣ３ｂおよびＣ３ａに開裂し；Ｃ３ｂはそのチオエステルドメイン（ＴＥＤ）を介して表面に結合する。これはＣＦＨまたは他の（膜結合）補因子を要する反応において補体因子Ｉ（ＣＦＩ）によりｉＣ３ｂおよびＣ３ｆに、次にＣ３ｃおよび３Ｃｄ（ｇ）に分解され得る。Ｃ３ｄ（ｇ）はＣ３ｄに分解され、これはＣ３ｂのＴＥＤに対応する。（中央）：ヒトＣＦＨ（楕円として示される２０個のＣＣＰ）は血漿から精製されたが、組換え（ｒ）ＣＦＨ（およびｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ））は、示される各種ｒＣＦＨ断片と同様に、ピキア・パストリスから生成された。すべてのＰ・パストリス由来の糖タンパク質は最終精製前にＥｎｄｏ Ｈｆで処理された。いくつかのリガンドのＣＦＨ上の結合部位が示される（点線は本文で記載されるようにそれらが塞がれていることを示す）。（下）：組換え（大腸菌由来）ｓＰｓｐＣＮおよびｓＰｓｐＣＮＲ１は、それぞれＰｓｐＣの残基３７〜１４０および３７〜２９２に対応するポリペプチドのＮ末端にｈｅｘａＨｉｓのタグをつけたＳＵＭＯ融合体であり；開裂バージョンはＰｓｐＣＮと称される（Ｒ１およびＲ２はリピート１および２であり；ＣＢＤはコリン結合ドメインである）。 ＰｓｐＣＮはＣＦＨとの安定な複合体を形成する。（Ａ）血漿精製ＣＦＨ、（Ｂ）組換えＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）、および（Ｃ）組換えＣＦＨ（ｗｔ）は示される濃度で、すべて固定化ｓＰｓｐＣＮ（ＮＴＡ／Ｎｉ２＋センサーチップ上で１４４ＲＵ）に結合し、明らかに２５分間は解離しない安定な複合体を形成する。センサーチップは個別の測定間で除去および再装填された。計算ＫＤ値は表１に示される。 ＰｓｐＣＮは主にＣＣＰ８および９に結合する。ｓＰｓｐＣＮを有するセンサーチップは図２と同様に用意された。（Ａ）５０ｎＭの血漿精製ＣＦＨ、ＣＦＨ８〜９、ＣＦＨ８〜１５、ＣＦＨ１０〜１５（ベースライン近く）およびＣＦＨ１９〜２０（ベースライン近く）について得られた結合曲線の比較。（Ｂ）ＣＦＨ１９〜２０、およびＣＦＨ１０〜１５について得られた非常に低い反応を明らかにする（Ａ）におけるセンサーグラムの拡大部分。（Ｃ）一連の濃度のＣＦＨ８〜９が固定化ＰｓｐＣＮ上に通され、（平衡法による）ＫＤ値の推定を可能にした（表１参照）。 ＣＦＨ８〜９のＰｓｐＣＮとの複合体における大きな接触表面は、１Ｈ、５Ｎ ＨＳＱＣ（ＮＭＲ）スペクトルの比較により示される。（Ａ）遊離ＰｓｐＣＮは化学シフトの分散が小さい折り畳まれていないタンパク質を示すスペクトルを示す。（Ｂ）ＡにおけるＣＦＨ８〜９のＰｓｐＣＮ試料への付加は、ＣＦＨ８〜９に結合した場合、ＰｓｐＣＮのスペクトルにおける大きな変化を引き起こす。この複合体のスペクトルはコンパクトな折り畳まれたタンパク質を示す十分に分散した鋭いピークを示す。多数の化学シフトの摂動は遊離ＣＦＨ８〜９（Ｃ）およびＰｓｐＣＮ結合ＣＦＨ８〜９（Ｄ）のスペクトルの間で明らかである。両方のＣＦＨ８〜９スペクトルはコンパクトな折り畳まれたタンパク質を示す十分に分散した鋭いピークを示すが、スペクトル間の大きな変化は多数のＣＦＨ８〜９アミノ酸残基がＰｓｐＣＮとの相互作用に関与することを示す。 ＰｓｐＣＮはＣＦＨの新たな構造を安定させる。（Ａ）質量分析を行うバンド（ｓ１〜ｓ５）を示す、ＣＦＨおよび架橋剤、ＢＳ３を含むＣＦＨ：ＰｓｐＣＮについて行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。ＭＷＭ＝示される分子量マーカー（ｋＤ）；レーン１および２：０．５：１のＢＳ３：ＣＦＨは、架橋単量体ＣＦＨおよび架橋ＣＦＨ二量体／多量体のラダーに対応する２つのバンドを生成し；レーン３および４：４：１のＢＳ３：ＣＦＨは単量体ＣＦＨの欠如を示し、推定されるＣＦＨ二量体（ｓ３）および多量体の表示の増加を示す。レーン５および６：４：１比のＢＳ３：（ＣＦＨ＋ＰｓｐＣＮ）はＰｓｐＣとの複合体における単量体ＣＦＨの単一バンド（ｓ４）、および未定数のＰｓｐＣＮ分子と複合体化したＣＦＨの二量体（ｓ５）、三量体等に対応するより高いバンドをもたらす。（Ｂ）ｓ１〜ｓ５におけるクラスター化した架橋のマップ。ＣＦＨ内の架橋を表す弧は、（ｉ）より希薄に、またはＰｓｐＣＮ結合の際に検出可能でなくなったＣＦＨにおける架橋；（ｉｉ）より一般的に、または二量体化および／もしくはＰｓｐＣＮ結合の際に新たに検出可能になる架橋；（ｉｉｉ）ｓ１〜ｓ５において変化を示さなかった架橋；（ｉｖ）二量体に特有の架橋；（ｖ）ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体に特有の架橋を示すように、（キーに従って）カラーコードされる。 ＣＦＨ単独およびＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体によるＣ３ｂおよびＣ３ｄ結合の比較。（Ａ）血漿精製ＣＦＨは固定化Ｃ３ｂについて血漿精製ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体より低い親和性を有するというＳＰＲによる例示。（Ｂ）血漿精製ＣＦＨはＣ３ｄ（Ｃ３ｂのＴＥＤに等しい）について非常に低い親和性を有するが、ＰｓｐＣＮとの複合体である場合、Ｃ３ｄによく結合する。計算された親和定数は表２にまとめる。 ＰｓｐＣＮはＣＦＨの崩壊促進活性を増強する。２．５ｎＭのＣＦＨ：ＰｓｐＣＮは、少量のＣ３ｂが充填されたＣＭ５チップ上にＣ３、ＣＦＢおよびＣＦＤを通すことにより形成される、Ｃ３ｂ．Ｂｂの、１０ｎＭのＣＦＨより良好な崩壊促進剤である（本文参照）。 ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の特性。（Ａ）還元および非還元条件下でＰｓｐＣＮ、ｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）、ならびに血漿精製ＣＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｒＣＦＨの純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）ｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）はＣ３ｂ．Ｂｂの崩壊を促進するのにＣＦＨと等しく有用であり；ＰｓｐＣＮはＣＦＨの崩壊促進活性をｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）のそれより実質的に増強する。（Ｃ）ＣＦＨもｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）も（または２つの混合物も）（シアル酸を含有しない）ウサギ赤血球を保護せず；ＰｓｐＣＮはＣＦＨおよび１：１のＣＦＨ：ｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）混合物のいくらかの保護能力を誘発する。（Ｄ）ｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）は、ＣＦＨと比較して、（シアル化され、したがってヒト赤血球の代替となる）ヒツジ赤血球の、希釈ヒト血漿（ｘ座標）による（ｙ座標上の放出されたヘモグロビンに比例する吸光度測定値により示される）溶血からの保護が不十分である。ＰｓｐＣＮの付加はＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の保護力を向上させる。１μＭ：１μＭのＣＦＨおよびｒＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の混合物は、ＰｓｐＣＮが付加されない限り、十分な保護をもたらさない。 本発明のタンパク質を用いる発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の治療を示すグラフを示す。赤血球はＡＥＴで処理され、「ＰＮＨ様」細胞が生成された。ＰＮＨ様細胞はＰＮＨ赤血球と同様に酸性化血清溶解の影響を受けやすい。グラフＡ：増加する濃度の因子Ｈの付加はＰＮＨ様赤血球の溶解を阻害する。グラフＢ：増加する濃度のＰｓｐＣＮの付加はＰＮＨ様赤血球の溶解を２８ｎＭのＩＣ５０で阻害する。ＰｓｐＣＮは血清中にすでに存在するＣＦＨを活性化し、溶解を効果的に防止する。 断片ＰｓｐＣ（５２〜１４０）（Ａ）、ＰｓｐＣ（６２〜１４０）（Ｂ）、ＰｓｐＣ（７２〜１４０）（Ｃ）、ＰｓｐＣ（３７〜１３０）（Ｄ）、ＰｓｐＣ（３７〜１２０）（Ｅ）、およびＰｓｐＣ（３７〜１１０）（Ｆ）の結合親和性を示すセンサーグラムを示す。 野生型ＰｓｐＣＮの場合と同様に、Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮ（Ａ）およびＰｓｐＣＮ−Ｃｙｓ（Ｂ）の両方がＣＦＨにほぼ不可逆的に結合する能力を有することを示し、検出可能なオフレートを示さないセンサーグラムを示す。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下での移動度のシフトによってわかるように、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドが穏やかな条件下でＣｙｓ−ＰｓｐＣＮに効率的に結合することを示すゲルを示す。 標準曲線を作成するのに用いられるようなＰＢＳ中の精製ＣＦＨを定量化するため（Ａ）、および正常ヒト血清の希釈液中に存在するＣＦＨを定量化するため（Ｂ）の、ＰｓｐＣＮベースのサンドイッチＥＬＩＳＡの使用を示す。 本発明によるＳＵＭＯ融合タンパク質を発現するのに用いられた、プラスミドｐＥ−ＳＵＭＯ Ｋａｎ（http://www.lifesensors.com）の概略を示す。 システインタグをつけたＰｓｐＣＮが、それらのチオールを通して結合される場合、それらのＣＦＨ結合能力を保持することを示す。 システインタグをつけたＰｓｐＣＮがシステインタグなしのＰｓｐＣＮと同様のＣＦＨの崩壊促進活性を示すことを示す。 固定されたシステインタグをつけたＰｓｐＣＮを一段階方法で用いることにより、高度精製ＣＦＨを生成することができることを示す。 マレイミド活性化ポリスチレン上に固定されたシステインタグをつけたＰｓｐＣＮが、正常ヒト血清への露出の際の結合密度に応じて、表面を補体からある程度保護することを示す。 ＥＬＩＳＡタイプアッセイにおいてＦＨをポリスチレンプレートに結合するのにＰｓｐＣＮを用いる抗ＦＨ自己抗体の検出を示す。精製ＩｇＧは、正常ヒト血清からの精製ＩｇＧとともに抗ＦＨ自己抗体について陽性であることが以前示された患者から用いられた。グラフは、陽性試料中、アッセイにおいて用いられる精製ＩｇＧの濃度に依存するレベルで、対照中より顕著に多いシグナルが検出されることを明確に示す。 ＦＨに結合するＴＩＧＲ４株からの固定化ＰｓｐＣＮを示すＳＰＲセンサーグラムを示す。Ａ：固定化ＴＩＧＲ４残基３７〜１７９のセンサーグラム。Ｂ：固定化ＴＩＧＲ４残基６８〜１４８のセンサーグラム。各例において、センサーグラムはＤ３９株と同様の不可逆性を示し、１×１０−１６Ｍおよび８×１０−１６ＭのＫＤは、それぞれＴＩＧＲ４残基３７〜１７９および６８〜１４８について計算され、同様の結合メカニズムを示す。 ＴＩＧＲ４残基３７〜１７９または残基６８〜１４８からのＰｓｐＣＮとの複合体におけるＦＨの崩壊促進活性の増加を示す。ＴＩＧＲ４は、Ｄ３９のように、内因性の崩壊促進活性を含まないことも明らかである。 Ｓ・ニューモニエからのＰｓｐＣＮ（ＣｂｐＡ）が、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄについてのＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体の親和性を増加させることにより、ＣＦＨを活性化する能力を有することを示すセンサーグラム。Ａ：結合Ｃ３ｂに結合するＦＨおよびＦＨ：ＴＩＧＲ４（残基３７〜１７９）を示すセンサーグラム；Ｂ：結合Ｃ３ｄに結合するＦＨおよびＦＨ：ＴＩＧＲ４（残基３７〜１７９）を示すセンサーグラム；Ｃ：結合Ｃ３ｂに結合するＦＨおよびＦＨ：ＴＩＧＲ４（残基６８〜１４８）を示すセンサーグラム；ならびにＤ：結合Ｃ３ｄに結合するＦＨおよびＦＨ：ＴＩＧＲ４（残基６８〜１４８）を示すセンサーグラム。Ｓ・ニューモニエＤ３９株からのＰｓｐＣＮの例と同様に、Ｃ３ｄへの非複合体化ＦＨの結合は無視できるほどであるが、ＰｓｐＣＮと複合体化したＦＨはＣ３ｂ親和性の顕著な増加およびＣ３ｄ親和性の大幅な増加をもたらすことが明らかである。これらの相互作用のＫＤは表３に挙げる。
本発明者らは、本発明のタンパク質が、補体活性化の代替経路の重要な調節剤、ヒト補体因子Ｈ（ＣＦＨ）に、生物学的なタイムスケール（時間〜日）で事実上不可逆的に結合する能力を有することを発見した。さらにＰｓｐＣＮ結合ＣＦＨは、その天然リガンドＣ３ｂについて少なくとも３倍高い親和性を有し、Ｃ３ｄ（Ｃ３ｂの重要な分解生成物）について非常により大きな親和性を有する。
ＣＦＨおよびＰｓｐＣＮの間の親和性は、ＰｓｐＣＮを因子Ｈに事実上永久的に結合するほど強い。おそらくこれは補体媒介破壊に対してそれ自体を保護するためのＳ・ニューモニエによるＰｓｐＣの使用を説明する（以下参照）。ＣＦＨを活性化するＰｓｐＣの能力により、これは自己保護のさらにより効果的な手段となる。
よってＰｓｐＣＮおよび本発明による他のタンパク質は、ＣＦＨを高度に生物活性な形態で捕捉する洗練された方法を表す。ＰｓｐＣＮが固定された場合、血清のような複合混合物からＣＦＨを分離するのに用いることができる。
ＣＦＨに結合し、またそのリガンドについてのその親和性、およびよってその調節活性を向上させる、このＰｓｐＣＮの両方の能力は、主な病因がＣＦＨの活性低下である症状の治療剤としてのその潜在的使用も示す。こうした症状としては非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、密沈積症（ＤＤＤ）および加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が挙げられる。
標識／検出タグの結合の促進または共有表面結合のため、この配列を修飾することができる。
（実施例１：ヒト因子Ｈの「活性」構造はストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質ＰｓｐＣによるこの不可逆的捕捉の際に安定化される）
はじめに
補体系とは、異種細胞ならびにアポトーシスおよび酸化損傷の産物のような潜在的に危険な物質を認識し、タグづけし、除去するため、それ自体で、および他の免疫成分と協働する脊椎動物中の４０〜５０個の血液タンパク質のセットに与えられた名称である（１）。補体系を回避するのに細菌が用いる戦略は、新規抗生物質およびワクチンの潜在的標的であり、補体系の治療的調節は広範囲の臨床状況において積極的に研究されている（２）。
補体系を活性化するすべての経路の中核をなすのは、オプソニンおよび炎症誘発性タンパク質分子、Ｃ３ｂが、Ｃ３の分子を酵素開裂し、アナフィラトキシンＣ３ａおよび追加のＣ３ｂを形成するＣ３ｂ．Ｂｂ複合体の形成を通して増幅される、ポジティブフィードバックループの珍しい例である（図１）（３）。新生Ｃ３ｂは、チオエステル含有ドメイン（ＴＥＤ）を介して、いずれかの局所表面に共有結合する一時的な能力を有する（４）。よって宿主（または「自己」）および異種（または「非自己」）表面の両方には、Ｃ３ｂ分子でコーティングされる潜在的なリスクがある。
２０個のＣＣＰ（９、１０）からなる補体因子Ｈ（５〜８）は、Ｃ３ｂへの結合について補体因子Ｂ（ＣＦＢ、Ｂｂの前駆体）と競合し、Ｃ３ｂ．Ｂｂ複合体の不可逆的な解離（崩壊としても知られる）を促進し、ＣＦＢに結合することはできないが（さらなる連続表面結合タンパク質分解生成物、Ｃ３ｄｇおよびＣ３ｄのように）オプソニンとして機能し続けるのに関わるｉＣ３ｂを形成するＣ３ｂの補体因子Ｉ（ＣＦＩ）触媒開裂の補因子であるので、この重要事象の重要な可溶性調節剤である。最終開裂生成物、Ｃ３ｄは、Ｃ３ｂのＴＥＤ（図１）に等しく、長期間表面に化学的に結合したままである。Ｂ細胞上での補体受容体タイプ２のライゲーションによって、ｉＣ３ｂまたはＣ３ｄ（ｇ）の存在は抗体産生の閾値を低下させる（１１）。よってＣＦＨは、流体相中および自己表面上両方でのＣ３ｂ増幅を防止し、ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｄ（ｇ）産生を促進するが、オプソニン化、アナフィラトキシンの放出、および細胞溶解を他の場所で進行させるので、補体系による自己と非自己との区別には重要である。
Ｃ３ｂ増幅の調節のためのＣＦＨの重要性は、ＣＦＨ遺伝子における対立遺伝子変異および不適切に調節された補体系と関連するさまざまな疾患のリスクの関連性により強調される（１２）。ＣＦＨのよくある（対立遺伝子の３つに１つの）「ハプロタイプ２」は加齢性黄斑変性症のリスクの推定５０％の原因であり（１３）；ＣＦＨによる自己表面に特異的な分子マーカー（例えばＧＡＧ鎖およびシアル酸クラスター）の認識に関与するＣＣＰ７における位置４０２でのヒスチジンのチロシンでの置換を含む（１４−１７）。死に至る可能性の高い腎臓疾患、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）に関連する変異はＣＦＨ全体で発生するが、同様に表面認識に関与し、Ｃ３ｂおよびその分解生成物の結合部位も含む（１５）ＣＣＰ１９および２０においてクラスター化される（１８）。ＣＦＨのＮ末端の４つのＣＣＰはＣ３ｂ（ｉＣ３ｂでもＣ３ｄでもない）に結合し、補因子および崩壊促進活性の両方に必要であり（１９）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、ａＨＵＳおよびＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎に関連する変異およびＳＮＰを抱える（２０）。ＣＣＰ１〜４（２１）、またはＣＣＰ１〜４およびＣＣＰ１９〜２０（２２、２３）の両方を組み込むように設計された、可能性のある治療的タンパク質は、開発のさまざまな段階にある。
補体系の主要な可溶性調節剤として、ＣＦＨは微生物ハイジャックに不可避的に影響されやすい。多数の細菌表面タンパク質が血漿ＣＦＨに結合することは驚くにあたらない（２４、２５）。例えば、鼻咽頭の常在菌、ストレプトコッカス・ニューモニエ（別称ＳｐｓＡ、ＣｂｐＡ、およびＨｉｃ）からの莢膜下タンパク質ＰｓｐＣは、カプシド表面上で宿主由来ＣＦＨを捕捉する（２６〜２８）。Ｓ・ニューモニエによる下気道または血液の侵襲は、肺炎、髄膜炎および敗血症を引き起こし得る。ワクチン耐性株が鼻咽頭管に定着し、その莢膜血清型がワクチン中に存在する株に取って代わり得るという心配な認識が広まっている［Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＤＭ，Ｍａｌｌｅｙ Ｒ，Ｌｉｐｓｉｔｃｈ Ｍ．Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ａｆｔｅｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ３；３７８（９８０７）：１９６２−７３．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１０）６２２２５−８］。よって血清型侵襲性が主にＣＦＨへの結合能力により決定されると考えられることは非常に興味深い。ＰｓｐＣの産生レベル、または対立遺伝子変異の違いが、ＣＦＨ捕捉におけるこれらの多様性の原因であると考えられる（２９）。
ＣＦＨの魅力的な態様は、その調節特性がＣ３ｂの状況に従って調節されることである。流体相において、ＣＦＨはＣ３ｂ産生を（いずれかの局所表面に共有結合する新生Ｃ３ｂの一時的な能力による）免疫監視に必要なレベルまで制限するが、重要なことには、血漿Ｃ３および因子Ｂを欠乏させる暴走活性化を防止する（３、３０）。健康な宿主組織の表面上で、ＣＦＨは膜結合制御剤（３１）と協働し、Ｃ３ｂ増幅をほぼ完全に停止する。他方で、適度なレベルのＣ３ｂ沈着およびｉＣ３ｂ形成は、老化または損傷細胞および細胞破片の場合ＣＦＨにより促進され、非炎症性クリアランスをもたらす（３２〜３４）。最後に、ＣＦＨは、（ＣＦＨ結合タンパク質または他の対補体手段を欠く）細菌細胞上でのＣ３ｂ増幅を抑制せず、これにより非常に急速なオプソニン化、炎症誘発性Ｃ３ａおよびＣ５ａの放出、ならびに細胞溶解を含む、侵入する微生物に対する補体系による本格的な猛攻撃を可能にする。
なぜＣＦＨ活性はＣ３ｂ（およびＣ３ｂ．Ｂｂ）の状況に従って変動するのだろうか。こうしたメカニズムはＣＦＨを微生物による利用に対して非常に脆弱にするので、これは単に保護を必要とするそれらの表面でのＣＦＨ濃度の選択的増加の問題であるとは考えにくい。本発明者らは、宿主および病原体の間の進化的軍拡競争がＣＦＨの構造およびＣ３ｂ増幅の自己表面に特異的な調節剤としてのその機能の間のあまり理解されていない関係を解明することができるかどうか実験を試みた。１つの仮説によると、そのＮおよびＣ末端側の両方に位置する、ＣＦＨ分子中の合計２０個のＣＣＰのうち６または７個のみがリガンドと直接関与するという事実（１５）は、残りの１３または１４個のＣＣＰのほとんどまたはすべてがＣＦＨを細菌タンパク質により成功裏にハイジャックされにくくするように作用するのであれば、容易に説明される。よって、この概念によると、細菌表面（または宿主表面）での単なる濃度の増加は、効果的な細菌（または宿主細胞）保護には不十分であるだろう。それよりも、ＣＦＨの完全な潜在的調節能力は、特定の自己表面分子署名、または細菌表面上のそれらの模倣体との相互作用によってもたらされる構造的再配置後にのみ明らかになり得る。この仮説を試すため、本発明者らはＣＦＨおよびＰｓｐＣの間の相互作用を調査した。これはＰｓｐＣがＣＦＨに極めて密接に結合し、そのＣ末端の近くに位置する以前塞がれたＣ３ｂ／Ｃ３ｄ結合部位を露出するＣＣＰの再配置物を安定させることを明らかにした。本発明者らは、他の細菌タンパク質、実際には宿主表面分子マーカーも、ＣＦＨのこの「活性化」形態を安定させるように作用し得ることを示す。
材料および方法
タンパク質の用意
プール血漿から精製された、ヒト補体タンパク質は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（テキサス州タイラー）から入手し、供給業者の指示に従って保存し、希釈する前に新しく解凍し、さらなる精製なく使用した。組換えＣＦＨモジュール切断変異体（「断片」、図１参照）のライブラリーはピキア・パストリスから調製され、以前記載された（３５）ように特徴分析され、−８０℃で保存された。
野生型配列（ＣＦＨ（ｗｔ））を有する、全長組換えヒトＣＦＨは、発酵槽において増殖させた組換えＰ・パストリス中で産生し、以前記載された（３５）ように酵素的脱グリコシル化形態で精製した。ＣＦＨのＤ１１１９Ｇ変異体（ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ））をコードする発現最適化ＤＮＡは、Ｇｅｎｅａｒｔ−ＬｉｆｅＴｅｃｈにより合成され、Ｐ・パストリス発現ベクター、ｐＰＩＣＺαＢにサブクローニングされた。ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の産生および精製はその後ＣＦＨ（ｗｔ）について以前記載されたように行った。
ＰｓｐＣ（Ｄ３９）の残基３７〜１４０を表す遺伝子は、大腸菌中での発現について最適化され（以下の配列番号４参照）、ＧｅｎｅＡｒｔ−ＬｉｆｅＴｅｃｈから購入された。得られた構成物は次にｐＥ−ＳｕｍｏＰｒｏＫａｎ大腸菌発現ベクター（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ、ペンシルベニア州マルバーン、図１４参照）にクローニングされ、溶原性ブロス（ＬＢ）において大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中で発現させた。タンパク質産生は、一晩２５℃で、０．２５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘発した。得られたｈｅｘａＨｉｓ−ＳＵＭＯタグをつけたタンパク質は「ｓＰｓｐＣＮ」と称され、ＨｉｓＴｒａｐ固定化Ｎｉ２＋親和性カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で捕捉し、０〜０．５Ｍのイミダゾールの直線勾配で溶出した。ｓＰｓｐＣＮの試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。同様の手順を用い、ｓＰｓｐＣＮＲ１と称される、隣接するＲ１ドメイン（図１参照）（残基３７〜２９２）を含む、より長い構成物を調製した。
ほとんどの実験について、ＳＵＭＯ特異的プロテアーゼ、ＵＬＰ１からの触媒ドメインを用い、ｈｅｘａＨｉｓ−ＳＵＭＯタグを（ベクター由来残基を含まない）ｓＰｓｐＣＮ（またはｓＰｓｐＣＮＲ１）から除去し、次にタグを第２Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーステップにより除去した。開裂した物質、ＰｓｐＣＮ（またはＰｓｐＣＮＲ１）は、次に上記のようなＰＢＳ中のＨｉＰｒｅｐ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム上でさらに精製した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同種であると判断され、タンパク質の完全性および同一性は質量分析により確認された（図示せず）。
ｓＰｓｐＣＮへのＣＦＨ結合のＳＰＲ誘導測定
すべての表面プラズモン共鳴実験は、２５℃、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、５０μＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を補充した、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−Ｐ＋）を用いて行った。Ｎｉ２＋（５１ＲＵ）およびその後（そのＮ末端ｈｅｘａＨｉｓ−ＳＵＭＯタグを介して）ｓＰｓｐＣＮ（１４４）をＢｉａｃｏｒｅＮＴＡセンサーチップ上に固定した。（血漿または組換えＰ・パストリスからの）全長ＣＦＨ、またはＣＦＨ断片の溶液のアリコートは示される濃度で１８０秒間、１００μｌ／分でチップ上を通し、次に１５００秒の解離フェーズを行った。ＣＦＨによる不可逆的結合のため、センサーチップは、１ＭのＮａＣｌ中の３５０ｍＭのＥＤＴＡの３０秒注入２回、その後の５０ｍＭのＮａＯＨ、次に０．５（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の３０秒注入により、測定の間で再生した。データはＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて分析し、曲線をあてはめ、１：１結合モデルに基づき動的パラメータを推定した。
ｓＰｓｐＣＮについてのＣＦＨの親和性を測定するためのＮＴＡセンサーチップの使用は、その関連するタンパク質の異種沈着の可能性およびリガンド認識部位をマスキングする危険性を伴う、アミン結合の必要性を回避した。また、測定間でのＳＰＲセンサーチップ表面の比較的簡単な再生を可能にした。この方法の不利点は、ｈｅｘａＨｉｓタグをつけた分析物のチップ表面からの漸進的な浸出、ならびにＣＦＨおよびその断片がＮｉ２＋に直接結合する可能性であった（Ｎａｎ Ｒ，Ｇｏｒ Ｊ，Ｌｅｎｇｙｅｌ Ｉ，Ｐｅｒｋｉｎｓ ＳＪ．Ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｚｉｎｃ− ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｄｅｃ ３１；３８４（５）：１３４１−５２）。実際には我々は、Ｎｉ２＋充填ＮＴＡセンサーチップ表面（ＰｓｐＣＮが存在しない）へのＣＦＨの弱い結合、およびこの表面へのＣＦＨ６〜８の密接な結合を観察した（データ記載せず）。これらの問題点は大部分を背景差分により回避した。
Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄ結合親和性のＳＰＲ測定
実験は、Ｃ３ｂ（２７２ＲＵ）；Ｃ３ｃ（１６６ＲＵ）；およびＣ３ｄ（６９ＲＵ）を、標準的なアミン結合を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｃ１センサーチップの３つの異なるフローセル上に固定した（第４のフローセルは背景差分に用いた）以外、上記のとおり行った。（２倍モル過剰のＰｓｐＣＮ有りまたは無しでプレインキュベートした）因子Ｈを指示濃度でチップ上に注入（９０秒、３０μｌ／分）した後、４００秒の解離フェーズを行った。センサーチップは１ＭのＮａＣｌの２回×３０秒注入により再生した。データはＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて分析し、平衡親和性パラメータは１：１結合親和性モデルを用いて計算した。
崩壊促進アッセイ
ＣＦＨまたはＣＦＨ：ＰｓｐＣＮの崩壊促進活性は、以前記載された（参考文献）ＳＰＲに基づくアッセイにおいて測定した。簡潔には、Ｃ３ｂの５３５ＲＵを標準的なアミン結合によってＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ上に固定した。その後、Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂ．Ｂｂ）を、ＣＦＢおよびＣＦＤ（それぞれ５００ｎＭ＋５０ｎＭ）の１２０秒、１０μｌ／分での注入により、チップ上で組み立てた。Ｃ３ｂ．Ｂｂ（〜１４５ＲＵ）の形成、その後の初期解離フェーズ（２００秒）を（ＳＰＲにより）観察し、内因性Ｃ３コンバターゼ崩壊（Ｂｂの離脱）の速度のモニタリングを可能にした。この後、ＣＦＨまたはＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体を指示濃度で注入（１２０秒、１０μｌ／分）し、次にさらなる解離フェーズを行った。チップはサイクル間で、０．２μＭのＣＦＨの３０秒注入、その後の１ＭのＮａＣｌの２回の３０秒注入により再生した。
溶血アッセイ
ヒツジおよびウサギ全血はＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（英国、バッキンガム）から購入し、ＣＦＨ欠乏血清はＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。溶血アッセイは９６ウェルプレートにおいて、より従来的なベローナル緩衝液（３７）の代わりにＨＥＰＥＳを用いた以外、Ｐａｎｇｂｕｒｎ（３６）により記載された方法に基づいて行った。５ｍｌの全血からの赤血球を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１４５ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン（ブタ皮膚、Ｆｌｕｋａ）、ｐＨ７．３（緩衝液Ｈ１）で３回、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１４５ｍＭのＮａＣｌ；１００μＭのＥＤＴＡ；０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、ｐＨ７．３（緩衝液Ｈ２）でさらに３回洗浄した。ＣＦＨ欠乏血清はＣＦＨ構成物で２μＭまで再構成し、最終指示濃度で使用した。赤血球は、水で完全に溶解される場合、１（ウサギ）または１．２（ヒツジ）の最終Ａ４１２をもたらす濃度で用いた。ＣＦＨで再構成された血清は次に氷上で、最終指示濃度まで、赤血球および緩衝液Ｈ２と組み合わせ、４５μｌの最終体積を得た。溶解は５０ｍＭのＭｇ２＋、５０ｍＭのエチレングリコール四酢酸、ｐＨ７．３の溶液５μｌの添加により開始した。反応物は３７℃で３０分間インキュベートし、すぐに２００μｌの緩衝液Ｈ１の添加によりクエンチした。未溶解細胞をその後１５００ｇ、１０分間、４℃での遠心分離によりペレット化し、次に１００μｌの浮遊物を除去し、Ａ４１２を記録した。
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
タンパク質試料（〜０．５μＭ）を、２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５中の１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎクロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、１ＭのＮａＣｌの直線勾配で２０のカラム体積にわたり溶出した。
核磁気共鳴分光分析
ＮＭＲスペクトルは５ｍｍのＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（Ｂｒｕｋｅｒ）を備えるＡｖａｎｃｅ ＩＩ ８００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ）上で得た。ＮＭＲデータはＴｏｐＳｐｉｎ３．１（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて処理し、ＣＣＰＮＭＲ分析ソフトウェアスイートを用いて分析した［Ｖｒａｎｋｅｎ ＷＦ，Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｗ，Ｓｔｅｖｅｎｓ ＴＪ，Ｆｏｇｈ ＲＨ，Ｐａｊｏｎ Ａ，Ｌｌｉｎａｓ Ｍ，Ｕｌｒｉｃｈ ＥＬ，Ｍａｒｋｌｅｙ ＪＬ，Ｉｏｎｉｄｅｓ Ｊ，Ｌａｕｅ ＥＤ．Ｔｈｅ ＣＣＰＮ ｄａｔａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００５ Ｊｕｎ １；５９（４）：６８７−９６］。１５Ｎ標識ＦＨ８〜９および１５Ｎ標識ＰｓｐＣＮの試料を用い、ＮａＣｌ濃度を０〜１５０ｍＭ、ｐＨを４〜６．５、および温度を１５℃〜７０℃と変動させることにより条件を最適化した。その後、２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．２中の４０μＭの１５Ｎ標識ＦＨ８〜９の試料を用い、１Ｈ、１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを３１０Ｋで記録し、次にＰｓｐＣＮを１００μＭの最終濃度に付加し、スペクトルを記録した。別の実験において、２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０中の３０μＭの１５Ｎ標識ＰｓｐＣＮの試料を用い、１Ｈ、１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを２９８Ｋで記録し、次にＦＨ８〜９を４０μＭの最終濃度に付加し、スペクトルを再度記録した。
架橋および質量分析（ＭＳ）
血漿精製ＣＦＨ（２０μｇ）または血漿精製ＣＦＨおよびＰｓｐＣＮ（２０μｇのＣＦＨ、対ＰｓｐＣＮ１：１．１５のモル比）のいずれかの新しく解凍した試料を、ビス（スルホスクシニミジル）スベラート（ＢＳ３）で、タンパク質対ＢＳ３の１：４の質量比、および反応混合物中の最終［ＣＦＨ］＝０．５６μｇ／μｌを用いて架橋した。架橋生成物にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［（ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を行った。ゲルバンドをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、５つの異なる架橋生成物に対応するバンド（図５Ａ参照）を選択し、ポリアクリルアミドゲルから切断した。これらに記載されたようなゲル内トリプシン消化を行った［Ｃｈｅｎ ＺＡ，Ｊａｗｈａｒｉ Ａ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｌ，Ｂｕｃｈｅｎ Ｃ，Ｔａｈｉｒ Ｓ，Ｋａｍｅｎｓｋｉ Ｔ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｍ，Ｌａｒｉｖｉｅｒｅ Ｌ，Ｂｕｋｏｗｓｋｉ−Ｗｉｌｌｓ ＪＣ，Ｎｉｌｇｅｓ Ｍ，Ｃｒａｍｅｒ Ｐ，Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ Ｊ．Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ−ＴＦＩＩＦ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＥＭＢＯ Ｊ．２０１０ Ｆｅｂ １７；２９（４）：７１７−２６］。各試料について、架橋ペプチドはＳＣＸ−ＳｔａｇｅＴｉｐを用いて画分し［Ｉｓｈｉｈａｍａ Ｙ，Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ Ｊ，Ｍａｎｎ Ｍ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｓｔｏｐ ａｎｄ ｇｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｐｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｃｋｅｄ ｄｉｓｋｓ ｆｏｒ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００６ Ａｐｒ；５（４）：９８８−９４］；非架橋ペプチドは主に低塩（６０ｍＭの酢酸アンモニウム）で溶出すべきであるが、架橋ペプチドは高塩画分（５００ｍＭの酢酸アンモニウム）で濃度増加すべきである。高塩画分は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。ペプチドはＣ１８材料（ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１８−ＡＱ ３μｍ；Ｄｒ Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ、ドイツ）を充填した分析カラム上でＰｉｃｏＴｉｐエミッタ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、マサチューセッツ州ウーバン）に分離した。直線勾配を１．６％（ｖ／ｖ）の水性アセトニトリルから３２％（ｖ／ｖ）の水性アセトニトリルまで１０９分かけて適用した後、７６％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルまで急速に増加させた。質量分析データ取得はデータ依存設定で行った：各ＭＳ１スキャン後、１０個のもっとも強いイオンを高エネルギーＣトラップ解離により分離および断片化した。ＭＳ１およびＭＳ２スペクトルの両方をオービトラップ分析計において、ＭＳ１スキャンは７００００、ＭＳ２スキャンは３５０００の解像度で記録した。「動的排除」を６０秒に設定し、「繰り返し回数」を１とした。
架橋ペプチドはインハウスで書かれたソフトウェアを用いて同定した。これらの５つの試料から合計５０個の結合を同定した。次の結合レベルでラベルフリー定量を行った。それぞれの特異的な結合について、すべての対応する架橋ペプチドの質量分析クロマトグラフィー信号強度はＰｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収し、合計した。試料にわたる公正な比較を確実に達成するため、個別の結合対の信号強度は、５つの試料すべてにおいて観察された２３個の架橋および２９個の非架橋ＣＦＨペプチドの合計信号強度を用いて正規化した。５つの試料にわたる架橋の強度変動はこれにより、各試料内のその相対強度において反映され、これは５つの試料におけるこの架橋の観察された強度を平均強度で割った商の底５の対数として計算された。さらに、Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０を用い［ｄｅ Ｈｏｏｎ ＭＪ，Ｉｍｏｔｏ Ｓ，Ｎｏｌａｎ Ｊ，Ｍｉｙａｎｏ Ｓ．Ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４ Ｊｕｎ １２；２０（９）：１４５３−４］、５０個の観察された架橋は、それらの強度変動および位置の間の相関を明確にするため、５つの試料におけるそれらの相対強度に基づきクラスター化した。これらの架橋はＣＦＨの配列に沿って均一には分布されず、それらの位置におけるバイアスは全長ＣＦＨの構造およびＰｓｐＣＮとの相互作用後のその構造変化に価値のある洞察を与えた。
結果
ＰｓｐＣＮのＮ末端領域はＣＦＨに不可逆的に結合する
Ｓ・ニューモニエ（Ｄ３９株）からのＰｓｐＣのＮ末端領域（図１）は以前示され（Ｄａｖｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．２００４ Ｍａｙ；１１９ Ｓｕｐｐｌ：６６−７３、およびＨａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｖｉａ ｔｗｏ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰｓｐＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｈｏｓｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｍａｙ １；１７８（９）：５８４８−５８）、ＣＦＨ結合部位を含有するが、その正確な境界は十分に定義されないままであった。我々は大腸菌において、ＰｓｐＣ残基３７〜１４０（ｓＰｓｐＣＮ）および３７〜２９２（ｓＰｓｐＣＮＲ１）（すなわちＲ１ドメイン、図１を含む）に対応する２つのＮ末端ｈｅｘａＨｉｓ−ＳＵＭＯタグをつけたタンパク質を産生した。ＳＰＲを用い、我々はＳＵＭＯ融合パートナー（データ記載せず）もＲ１ドメインの存在（データ記載せず）もＣＦＨまたはＣＦＨ断片への結合には顕著に影響を及ぼさなかったことを見出した。ＳＵＭＯ自体はＣＦＨに結合しなかった（データ記載せず）。我々は一連の濃度を用意し、ＳＰＲを用い、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で予め固定し、Ｎｉ２＋を充填したカルボキシメチル化デキストランでコーティングしたチップ上に固定したｓＰｓｐＣＮについての、血漿精製ＣＦＨおよび（Ｐ・パストリスからの）組換えＣＦＨ（３５）の親和性を測定した（図２、表１）。両方の例において、結合は測定するには遅すぎるオフレートおよびサブｐＭ ＫＤで事実上不可逆的であった。結合ＣＦＨは高塩洗浄により除去することができず；ＮＴＡチップをＥＤＴＡ、ＮａＯＨおよびＳＤＳ溶液の連続処理で除去することによってのみ、ｓＰｓｐＣＮコーティング表面は測定間で再生することができた。それにもかかわらず、再生ｓＰｓｐＣＮコーティング表面は、２つの反応単位内で再生可能であった。
ＰｓｐＣＮはＣＦＨにおいて中央部位に結合する
ＰｓｐＣは、ＣＣＰ８〜１１、１３〜１５および１９〜２０を含むＣＦＨのさまざまな部位に結合すると以前報告された（Ｄａｖｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．２００４ Ｍａｙａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．．２００７；Ｄｕｔｈｙ ＴＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００２ Ｏｃｔ；７０（１０）：５６０４−１１）。我々は、我々のライブラリー（１５）からの関連組換えＣＦＨ断片を有するＰｓｐＣＮ（図１）を用い、この問題について再考した。ＣＦＨ６〜８（すなわち、ＣＦＨ ＣＣＰ６〜８に対応する組換え構成物）は、ＮＴＡチップ上のＮｉ２＋に、全長ＣＦＨまたはその他の試験断片より強く結合したことがわかった（図示せず）が、これはそれ以上調査されなかった。
我々は、ｓＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体ほど安定ではないが、ＣＦＨ８〜１５がｓＰｓｐＣＮに非常に密接に（ＫＤ＝１−２ｎＭ）結合し、ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ８〜１５複合体が非常にゆっくり解離することを見出した（図３、表１）。他方で、ＣＦＨ１０〜１１（データ記載せず）およびＣＦＨ１０〜１５はｓＰｓｐＣＮについて無視できる親和性を有し、ＣＣＰ８および９が結合にとって重要であることを示した。実際に二重モジュールＣＦＨ８〜９も比較的遅いオフレートで密接に（ＫＤ＝〜２６ｎＭ）結合した。ＣＦＨ６〜８によるｓＰｓｐＣＮ結合の証拠はなかったが（Ｎｉ２＋充填ＮＴＡセンサーチップ表面についてのその親和性を考慮後、データ記載せず）、ＣＦＨ１９〜２０は一時的かつＣＦＨ８〜９またはＣＦＨ８〜１５よりかなり弱く結合した（図３）。
そのＰｓｐＣＮはＣＣＰ８〜９と密接に相互作用し、複合体形成の際の実質的な分子間界面の埋没を示した。さらに調査するため、我々は、未標識ＰｓｐＣＮを含む、および含まない、１５Ｎ ＣＦＨ８〜９の１Ｈ、１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを記録した。これは予想された非常に多数の１Ｈおよび１５Ｎ化学シフトの摂動（図４Ａ）を明らかにした。興味深いことに、同位体標識ＰｓｐＣＮの１Ｈ、１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、ＣＦＨ８〜９付加前の折り畳まれたタンパク質と一致しなかった。ＰｓｐＣＮのモルテン・グロビュールのような特徴は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸結合（データ記載せず）についてのその傾向により確認された。ＦＨ８〜９との複合体形成の際、結合ＰｓｐＣＮは、十分に分散および分解した比較的鋭いクロスピークにより特徴づけられる１Ｈ、１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルをもたらした。ＰｓｐＣＮは、ＣＦＨ８〜９との複合体である場合、折り畳まれたタンパク質として存在すると考えられる（図４Ｂ）。
ＰｓｐＣＮおよび全長ＣＦＨにより形成された複合体の構造を調査するため、我々は化学架橋および質量分析（ＭＳ）の組み合わせを用いた。ＰｓｐＣＮと混合した血漿精製ＣＦＨの試料に、我々は、ホモ二官能性であり、１１．４Åまで離れた第一級アミン間の架橋を形成する、ＢＳ３を添加した。我々は次に架橋生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、バンドを切断し、これらにトリプシン消化を行った。次に我々はＭＳ／ＭＳを適用し、架橋ペプチド対を同定した。１：１のＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体に対応する分子量（ＭＷ）を有するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動した架橋生成物（バンドｓ４、図５Ａ）内では、５つの分子間架橋はＰｓｐＣＮ中のペプチドおよびＣＦＨ中のペプチドの間で同定され；これらはすべてＣＣＰ９または１０に位置した（図５Ｂ）。この結果はＣＦＨ断片を用いる我々の研究（上記）と完全に一致する。
これらの実験は他のＣＣＰの直接関与を除外しないが、まとめて考慮すると、それらはＣＣＰ８、９および１０がＣＦＨおよびＰｓｐＣＮの間の相互作用の主な原因であることを示す。ＰｓｐＣＮは、その小さなサイズ（１２ｋＤａ）に見合って、（それぞれ〜７ｋＤａを有する）ほんのいくつかの中央ＣＣＰに直接結合し得るが、そのＣＦＨとの顕著に密接な複合体は、新たな分子内モジュール間相互作用により安定された、他のＣＣＰの協働空間的再配置により好まれ得る。この仮説を試すため、我々はＰｓｐＣＮ付加前後のＣＦＨ内の化学架橋データを比較した。
架橋および質量分析によるＣＦＨ構成の分析
架橋剤の非存在下、血漿精製ＣＦＨ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、予想どおり単一のバンドを検出した。同じＣＦＨ試料（０．５６μｇ／μＬ）を３．９ｍＭＢＳ３と６０分のインキュベーション後、ともに単量体ＣＦＨの候補である２つのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが現れた（図５Ａ）。よりゆっくり移動するバンドはより多くのヘッド−テイル（例えばＣＣＰ２０−ＣＣＰ４およびＣＣＰ１９−ＣＣＰ２０）架橋（図５Ｂ）を含有し、ＣＦＨの折り畳み構造の捕捉を反映した。もとの試料におけるこうした構造の相対存在量は、比較的希少である場合でも時間とともに蓄積するので、不明である。
０．５６μｇ／μＬのＣＦＨへの１．１５：１のモル比でのＰｓｐＣＮの付加、次の３．９ｍＭのＢＳ３とのインキュベーション後、これらの２つのバンドは１つにまとまった（図５Ｂ）。このバンドは、上述したように、ＰｓｐＣＮおよびＣＦＨの両方を含有した。分析により、架橋はＰｓｐＣＮの非存在下で捕捉されたものと比較してＣＦＨの異なるコンパクトな構造を捕捉したことが明らかとなった。重要なことには、ＰｓｐＣＮの付加後、ＣＣＰ２０−ＣＣＰ７およびＣＣＰ１８−ＣＣＰ５架橋が得られたが、ＣＣＰ２０−ＣＣＰ４およびＣＣＰ１９−ＣＣＰ５架橋はそれ以上検出されなかった（図５Ｂ）。加えて、ＣＦＨのＰｓｐＣＮおよび架橋剤とのインキュベーション後、突出した新規バンドが出現し、これは二量体ＣＦＨのＭＷと一貫して移動した。この推定されるＰｓｐＣＮ誘発性ＣＦＨ二量体に特異的な架橋は、ＣＣＰ５−ＣＣＰ７およびＣＣＰ１８−ＣＣＰ２０を含んだ。
我々は、これらの研究から、中央ＣＦＨへのＰｓｐＣＮの結合がＣＦＨの新規安定構造の採用を促進し、二分子複合体の無視できる解離速度の説明に役立つと推量した。ＣＦＨのＰｓｐＣＮ安定化構造は、架橋剤による二量体捕捉の増加を説明する新生露出自己結合部位を有し得る。しかしサイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）による分析（架橋剤の非存在下）は、主に１：１の血漿精製ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮの複合体を示し、ＰｓｐＣＮ付加前（７１０μｇ／ｍｌで充填）または後（５２０μｇ／ｍｌで充填）にいずれのＣＦＨ二量体も検出しなかった。意外なことに、ＣＦＨとの混合前にＳＥＣ−ＭＡＬＳのために提出された試料において少量の二量体ＰｓｐＣＮが形成され、対応するＦＨ：ＰｓｐＣＮ２複合体の出現があった。しかしこれらの種は少量で存在し、ほぼ確実にアーティファクトである。より重要なことには、我々はＣＦＨのＰｓｐＣＮ安定化構造には新たに露出したリガンド結合部位があると仮定し、我々は機能アッセイを通してこの仮説を試験することにした。
ＣＦＨへのＰｓｐＣＮ結合により露出したＴＥＤ／Ｃ３ｄの新規結合部位
市販の血漿精製ヒトＣ３ｂ、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄは、標準的なアミン結合を用い、同じＣ１ ＳＰＲチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の異なるチャネルに固定した。その後、ＰｓｐＣＮがＣ３ｂ、Ｃ３ｃまたはＣ３ｄに結合しないことを示した（データ記載せず）ので、Ｃ３ｂおよびその各種分解生成物について、ＣＦＨ、またはＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体の親和性を同じ実験で測定した（図６）。固定化Ｃ３ｂについて顕著に一致した親和性は、０．５〜０．６ｍＭの文献ＫＤ値とよく一致する、組換えおよび血漿精製ＣＦＨについて得られた（表１）。興味深いことには、ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体はＣ３ｂに、ＫＤ＝０．１５〜０．２ｍＭで、一貫して３倍良好に結合した。実質的に同じ結果をＰｓｐＣＮＲ１について得た（データ記載せず）。
我々は、ＣＦＨ（単独）がＳＰＲチップ上でＣ３ｃまたはＣ３ｄに十分に結合しなかったことを見出した（図６）。これは他の最近のレポート（２２、２３、３８）とよく一致する。他方で、組換え断片ＣＦＨ１９〜２０がＣ３ｄおよびＣ３ｂの両方に等しく良好に（および同じアミノ酸残基を用いて）〜２μＭのＫＤで結合することは確立されてきた（１５、３９）。明らかに、ＣＣＰ１９〜２０に位置するＣ３ｂ／Ｃ３ｄ結合部位は、このＳＰＲベースアッセイにおいて無傷ＣＦＨ内に完全にはアクセス可能でない。したがって、ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮがＣ３ｄにＣＦＨ単独より数百倍良好に結合したことは驚きである（図６、表２）。この相互作用についてのＫＤ（２μＭ）はＣ３ｄまたはＣ３ｂへのＣＦＨ１９〜２０結合のそれと同等であった。この結果は、ＰｓｐＣＮ結合が新たなリガンド結合部位を露出するＣＦＨの構造的再配置をもたらすという我々の仮説と一致する。
ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮの機能アッセイ
ＰｓｐＣＮがＣＦＨに非常に密接に結合し、その構造を修飾する能力を発達させたとして、ＰｓｐＣＮ結合はＣ３ｂ増幅の阻害剤としてＣＦＨの機能的特性に対して何の効果を有するのかという疑問が出てくる。我々は、ＳＰＲチップ上でコンバターゼを組み立て、これがＣＦＨ（またはＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ）付加前後でその成分に解離するのを観察することにより、崩壊促進活性に対するその効果を試験した（図７）。１０ｎＭのＣＦＨは（予想どおり）崩壊に対して明らかな促進効果を有することがわかるが、これは２．５ｎＭのＣＦＨおよび２．５ｎＭのＰｓｐＣＮの混合物により約２倍超となる。
ＰｓｐＣＮはＣＦＨにおける疾患関連変異の隠れた影響を明らかにする
我々はＰ・パストリスにおいて変異体ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）を産生した（図８Ａ）。ＣＣＰ１９内のこのａＨＵＳ関連変異は、精製全長ＣＦＨの状況では、以前は完全には特徴分析されていなかった。他方でＣ末端の断片、ＣＦＨ１９〜２０の状況では、Ｄ１１１９ＧはＣ３ｄおよびＣ３ｂ結合のほぼ全損失を引き起こすことが報告された（３９）。また、ＣＦＨ１９〜２０：Ｃ３ｄ複合体内で、Ｄ１１１９は分子間界面における主要な位置を占める（３９）。興味深いことには、我々は、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｄ）がＳＰＲチップ表面上でＣ３ｂに、ＣＦＨ（ｗｔ）とほとんど同じ親和性で結合することを見出した（表２）。予想どおり、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）はｉＣ３ｂまたはＣ３ｄについて顕著な親和性を有さなかった。
我々はＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）複合体を生成し、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄへのその結合を試験した。複合体は、Ｃ３ｂ結合においてＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）単独と比較していくらかの向上を示した（表２）が、ＣＦＨ（ｗｔ）：ＰｓｐＣＮ複合体とは異なり、Ｃ３ｄ結合の向上を示さなかった。よってＰｓｐＣＮ結合は、ＳＰＲチップ上でＰｓｐＣＮの非存在下で行ったＣ３ｂ／Ｃ３ｄ結合実験からは明らかではなかった、ＣＦＨ（ｗｔ）およびＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の間の目立つ相違を明らかにした。これはＰｓｐＣＮがＣＦＨの部分的または完全に埋没したＣ末端Ｃ３ｄ／Ｃ３ｂ結合部位を掘り出すことができるという我々の仮説を再確認する。
我々は次に、ＰｓｐＣＮにより脱マスキングすることができる、Ｃ３ｂのＴＥＤドメインに結合するＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の能力の隠れた欠如が、この変異体の能力がＣ３ｂ．Ｂｂの崩壊を促進する結果を有するかどうかを問うた。我々は、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）がそれ自体により、ＣＦＨ（ｗｔ）とほぼ程度に良好に、Ｃ３ｂ．Ｂｂの解離を促進することを見出した（図８Ｂ）。この結果は、変異ＣＦＨにおける、（ＳＰＲチップ上での）ほぼ野生型Ｃ３ｂ結合親和性の保持と一致する。ＣＦＨ変異体は、しかしながら、ＰｓｐＣＮとの複合体である場合、ＣＦＨ（ｗｔ）とは目立って異なって挙動し；ＰｓｐＣＮ結合時の野生型ＣＦＨの例において観察された約１０倍の向上とは反対に、崩壊促進速度においてわずかな向上のみが記録された。
次に我々は、代替宿主細胞表面に対する作用から、Ｄ１１１９Ｇ変異がＣＦＨを混乱させる程度を調べた。血漿精製ヒトＣＦＨは、ＣＦＨ欠乏ヒト血清に付加した場合、補体媒介溶血からヒツジ赤血球（ヒト赤血球のように、シアル酸に富む表面を有する）を保護する（図８Ｃ）が、ウサギ赤血球（シアル酸に乏しい表面を有する）を保護せず（図７Ｄ）；これは以前示されたもの（４０）と一致する。他方で、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）（単独）は、非典型溶血性尿毒症症候群における因果的な役割と一致して、ウサギまたはヒツジ赤血球のいずれも保護することができない。これは、ＳＰＲセンサーチップ表面上でのＣ３ｂへのＣＦＨ（ｗｔ）のようなＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）結合にかかわらず、この疾患関連変異体は、自己表面上でのＣＦＨ（ｗｔ）と同程度に良好に機能しないことを示す。ＰｓｐＣＮの付加は、ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）のＣ３ｂ結合におけるＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）と比較した上記のわずかな向上と一致して、ヒツジ赤血球を保護するＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の能力をわずかに向上させた（図８Ｃ）。ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体は、血漿精製ＣＦＨ単独と比較した場合、（シアル酸に乏しい）ウサギ赤血球の保護のわずかな向上のみを示す（図８Ｄ）。よって、ＣＦＨにおけるＣ末端Ｃ３ｄ／ＴＥＤ結合部位のＰｓｐＣＮ誘導可用性にかかわらず、ウサギ赤血球上でのＣ３ｂ増幅の制御は不適切なままである。明らかに、ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体におけるＣＦＨによる活性化構造の採用は十分ではなく、無傷ＰｓｐＣのコレステロール結合ドメインを介する細胞表面への結合、または、宿主表面上での、シアル酸へのＣＦＨの結合（例えば）も要件である。
最後に、我々は、１μＭのＣＦＨ（ｗｔ）および１μＭのＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の混合物を用いて同じ溶血アッセイを行うことにより、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）変異を有するヘテロ接合型個体のシナリオを部分的に再生することを試みた（図８ＣおよびＤ）。この１：１の例では、同様の高レベルの溶血が、驚くことなく、２μＭのＣＦＨ（ｗｔ）についての観察と同様にウサギ赤血球について得られ；ＰｓｐＣＮの存在下、ウサギ赤血球溶血の同様のわずかな減少が、１：１混合物およびＣＦＨ（ｗｔ）の両方について得られた。興味深いことには、しかしながら、１：１「ヘテロ接合型」混合物は、反応にＰｓｐＣＮも含まれるまで、ヒツジ赤血球を補体媒介溶血から完全に保護することができなかった。ＰｓｐＣＮは、したがって、溶解を阻害するのに十分に（ヘテロ接合型個体に等しい）１：１混合物中のＣＦＨを活性化することができた。
議論
ＣＦＨは補体系の作動における中心的な事象であるＣ３ｂ増幅の制御に重要である。ＣＦＨは宿主細胞上および異種細胞上のＣ３ｂ間で区別することが不可欠である。保護を必要とする表面でのＣＦＨの選択的な濃度増加のみの問題である可能性は低く；これは微生物によるＣＦＨの非常に容易なハイジャックを可能にし、補体系を感染に対する防御の最前線として実質的に無用にする。よってＣＦＨはその補体調節部位のいくつかを「隠し」、それらを特定の分子マーカーの存在下でのみ明らかにするように進化し得た。我々は、こうした仮説戦略が、なぜＣＦＨがリガンドに直接結合するとは考えられないこれほど多数のＣＣＰモジュールを有するのかを説明することができると推量した。それらはＣＦＨに異なる構造をとらせ、表面特異的な分子署名に応えて、異なるリガンド結合部位を露出することができた。ここで示される我々の結果は、ＰｓｐＣＮおよびＣＦＨの間で形成された複合体の研究に基づき、こうしたモデルを強く支持する。
我々は、ＳＰＲを用い、Ｓ・ニューモニエ（Ｄ３９）のＮ末端の１０４アミノ酸残基（予備処理したタンパク質の残基３７〜１４０）が、血液から精製したヒトＣＦＨと同様に組換えヒトＣＦＨに、生物学的タイムスケールで、不可逆的に結合するのに十分であることを示した。この観察は、等温滴定熱量測定を用いて溶液中で評価され、測定するには密接すぎる（＜１ｎＭ）ことがわかった、ＰｓｐＣＮの同様の長さのＮ末端の構成物への、血漿精製ＣＦＨの以前報告された結合（Ｌｕ Ｌ，Ｍａ Ｙ，Ｚｈａｎｇ ＪＲ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ＣｂｐＡ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６ Ｊｕｎ ２；２８１（２２）：１５４６４−７４）と一致する。我々のＰｓｐＣＮ：ＣＦＨの複合体は、わずかに拡大したＰｓｐＣ構成物（残基３９〜１５２）を用いて以前行われたＳＰＲベースの実験において観察された複合体（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，Ａｇａｒｗａｌ Ｖ，Ｋｕｎｅｒｔ Ａ，Ｈａｅｌｂｉｃｈ Ｓ，Ｓｋｅｒｋａ Ｃ，Ｚｉｐｆｅｌ ＰＦ．Ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｖｉａ ｔｗｏ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰｓｐＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｈｏｓｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｍａｙ １；１７８（９）：５８４８−５８）より顕著に安定である。他方で、我々は顕著に長い構成物（残基３９〜２５９）についての親和性のいずれの増減も観察せず、ＰｓｐＣＮは全長ＰｓｐＣ内のＣＦＨ結合部位の全体を含むと考えられる。
血漿由来ＣＦＨは、二シアル酸化二分岐グリカンが占める、主に中央ＣＣＰにおいて、９つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位のうち８つを有する（Ｆｅｎａｉｌｌｅ Ｆ，Ｌｅ Ｍｉｇｎｏｎ Ｍ，Ｇｒｏｓｅｉｌ Ｃ，Ｒａｍｏｎ Ｃ，Ｒｉａｎｄe Ｓ，Ｓｉｒｅｔ Ｌ，Ｂｉｈｏｒｅａｕ Ｎ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎ−ｇｌｙｃａｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００７ Ｓｅｐ；１７（９）：９３２−４４）。この実験に用いられた組換えＣＦＨ（野生型およびＤ１１１９Ｇ両方）は酵素的に脱グリコシル化した。ＣＦＨのすべてのこれらのバージョンがＰｓｐＣＮについて同等の親和性を有することは、血漿ＣＦＨのＮ−グリカンがＰｓｐＣＮ結合において顕著な役割を果たさないことを示す。それらはまた、Ｃ３ｂへの結合またはインビトロで行われるさまざまなアッセイへの関与には不可欠でないと考えられた（Ｊｏｕｖｉｎ ＭＨ，Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ ＭＤ，Ｃａｈｏｕｒ Ａ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｎ．Ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃ３ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８４ Ｄｅｃ；１３３（６）：３２５０−４）。
細菌表面上のＰｓｐＣＮがＣＦＨについてＰｓｐＣＮと同様の親和性を有すると仮定すると、細菌は、おそらく血流中に滞留するその時間中に、その表面を表示するＰｓｐＣＮ分子のそれぞれに結合したＣＦＨ分子を取得および保持するだろう。Ｓ・ニューモニエは、Ｃ３ｂ増幅の回避のためだけでなく、侵襲の準備の、ＣＦＨのリガンドを有する宿主細胞の表面での局所化のためにも、この分子を利用することが示された（Ａｇａｒｗａｌ Ｖ，Ａｓｍａｔ ＴＭ，Ｌｕｏ Ｓ，Ｊｅｎｓｃｈ Ｉ，Ｚｉｐｆｅｌ ＰＦ，Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ｊｕｌ ２３；２８５（３０）：２３４８６−９５；Ｑｕｉｎ ＬＲ，Ｏｎｗｕｂｉｋｏ Ｃ，Ｍｏｏｒｅ ＱＣ，Ｍｉｌｌｓ ＭＦ，ＭｃＤａｎｉｅｌ ＬＳ，Ｃａｒｍｉｃｌｅ Ｓ．Ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＰｓｐＣ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００７ Ａｕｇ；７５（８）：４０８２−７）。したがってこの顕著に密接な複合体の構造的および機能的特性についてより多くを知ることは興味深かった。
３つの直交するアプローチ、切断変異体の結合親和性、ＮＭＲ化学シフト摂動および化学架橋に基づき、我々は、ＰｓｐＣＮがＣＦＨの中央領域にＣＣＰ８〜１０内の部位で非常に密接に結合することを見出した。我々は他のＣＣＰの顕著な直接関与の証拠を得なかった。それにもかかわらず全長ＣＦＨはＰｓｐＣＮに、ＦＨ８〜１５よりかなり密接に結合するので、他のＣＣＰが、さらに後述するように、複合体形成において、間接的でなものはあるが、役割を果たすことは明らかである。我々の結果は、ＣＣＰ６〜１０のいくつかまたはすべてが、ＰｓｐＣＮのＮ末端の２２５個のアミノ酸による、１４個の異なる株の肺炎球菌分離株への、ＣＦＨの結合にとって重要であることを示した、フローサイトメトリー研究（Ｄａｖｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．２００４）と一致する。我々の結果はまた、ＳＨ２と称されたＡＴＣＣ３３４００株（セロタイプ１）からのＰｓｐＣの２５０残基セグメントを用いた、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．２００７）と大部分一致する。彼らは、ドットブロットにより、およびＳＰＲ（ＫＤ値は報告されなかったが）により、ＣＣＰ８〜１１はＳＨ２に結合するが、ＦＨ１〜７、ＦＨ１１〜１５およびＦＨ１６〜２０はＳＨ２への結合をまったくまたはほとんど示さなかったことを示した。これらの著者は、（ＣＦＨのＣＣＰ７および２０と相互作用するが、我々の観察によるとＰｓｐＣＮにも結合する）ヘパリンはＳＨ２−ＣＦＨ相互作用を阻害するが、ＣＣＰ１９〜２０に対するモノクローナル抗体はＳＨ２のＦＨ８〜２０への結合を阻害することを示した。これは著者らに、第２の直接ＰｓｐＣＮ結合部位がＣ末端モジュール上に位置するはずであることを示した。我々の研究は（非常に弱いＦＨ１９〜２０：ＰｓｐＣＮ相互作用を示すが）、これらの阻害剤が、さらに後述するように、二元複合体の分子内成分を阻害することにより、間接的に作用する可能性が高いことを示す。別の研究（Ｄｕｔｈｙ ＴＧ，ｅｔ ａｌ．２００２）も、我々のデータと一致して、ＰｓｐＣへの、ＦＨ１〜７、ＦＨ１０〜１２またはＦＨ１６〜２０ではなく、ＦＨ８〜１３はもちろんＦＨ８〜１５の結合を（ＥＬＩＳＡにより）報告した。彼らは、しかしながら、ＦＨ８〜１４への弱い結合のみでＦＨ８〜１２について結合を検出することができず、彼らはよって結合部位をＦＨ１３〜１５とした。すべてのそれらの構成物は、本研究におけるもののように、Ｐ・パストリスにおいて組換え切断変異体として生成したが、収率は非常に低かったので、認証は困難となるだろう。要するに、ここでＣ３ｂ、ＧＡＧまたは他の既知のリガンドについて結合部位を含まないＣＦＨにおけるモジュール８〜１０のＰｓｐＣによる直接の関与を支持する複数の証拠がある。これはこれらの部位を利用可能にしておくのは細菌に有利となるという概念と一致するだろう。
ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体の無視できるオフレートおよびよって顕著に高い親和性は、複合体形成時の両タンパク質パートナーによる安定な相互依存的な新構造の採用から誘導され得る。よって、そのＭＷはたった１１ｋＤであり、よって同時にいくつかのＣＣＰのみに接触し得るが、ＰｓｐＣＮはＣＦＨ（１５５ｋＤ）に極めて密接に結合し、このドメインはプロセスにおいて折り畳まれたタンパク質となる（我々は、このドメインが、ＰｓｐＣタンパク質の一部である場合、折り畳まれているかどうかを調査していない）。
全長ＣＦＨはＰｓｐＣＮに、ＣＦＨ８〜９より約１００００倍密接に、ＣＦＨ８〜１５より１０００倍密接に結合する。これは８、９および１０以外のＣＣＰがＰｓｐＣＮ結合に直接関与するという我々の研究からの証拠の欠如にかかわらずである。架橋により我々はＰｓｐＣＮ結合がより大きなタンパク質の構造に大きな変化をもたらすことがわかる。その拡大した柔軟な構造、および結果としての非隣接ＣＣＰモジュール間の相互作用の可能性により、遊離ＣＦＨは複数の構造的可能性を有し；我々の結果は、これらのいくつかが他より安定であるが、比較的高い活性化エネルギー障壁により互いに分離することを示す。ＰｓｐｃＮ結合は、ＰｓｐＣＮの非存在下でＣＦＨに動的にアクセス可能でない安定な構造体の形成を誘導し得る。こうした構造の存在は、自己表面特異的分子マーカー（例えばＧＡＧおよびシアル酸）も同様の戦略によってＣＦＨ構造体間の変化を促進するように作用し得ることを示す。宿主表面分子マーカー（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＣＱ，Ｈｅｒｂｅｒｔ ＡＰ，Ｋａｖａｎａｇｈ Ｄ，Ｇａｎｄｙ Ｃ，Ｆｅｎｔｏｎ ＣＪ，Ｂｌａｕｍ ＢＳ，Ｌｙｏｎ Ｍ，Ｕｈｒiｎ Ｄ，Ｂａｒｌｏｗ ＰＮ．Ａ ｎｅｗ ｍａｐ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ Ｃ３ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ａｕｇ １５；１８１（４）：２６１０−９）と同様に、他の細菌タンパク質が（ＰｓｐＣとは異なり）ＣＦＨの同じ領域（ＣＣＰ７および２０）に直接結合するという興味深い観察（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＶＰ，Ｐａｎｇｂｕｒｎ ＭＫ，Ｃｏｒｔeｓ Ｃ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈ：ｔｈｅ ｇｏｏｄ，ｔｈｅ ｂａｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；４７（１３）：２１８７−９７）は、それらもこのように作用し得ることを示す。
これまで議論された結果は、１：１のＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体において観察される架橋に関する。これはＳＥＣ−ＭＡＬＳ（５００ｍｇｍＬ−１または〜３ｍＭでサイズ排除カラム上に充填）による分析によるとＣＦＨおよびＰｓｐＣＮの混合物において優勢な種である。しかし架橋データは、ＰｓｐＣＮが、ＣＦＨが（おそらく異なる単量体からの）ＣＣＰ５および７を密接させ、ＣＣＰ１８および２０の間に二量体特異的架橋もある、二量体を形成する傾向を増加させたことを示した。ＣＦＨの２つの分子は同じＰｓｐＣＮ分子と直接相互作用し得るが、これはＰｓｐＣＮの小さなサイズ、およびＮＭＲ試料中で観察された１：１複合体であると考えられるものにおけるＣＣＰ８〜９とのその大きな相互作用表面を考慮すると起こりそうにないと思われる。他方で、ＰｓｐＣＮにより安定させたＣＦＨ構造変化は、架橋により捕捉することができる弱い自己結合に関与するＣＦＨの以前埋没した領域の露出をもたらすことが可能であり；観察された二量体特異的架橋に基づき、これらはＣＣＰ５〜７、場合によってはＣＣＰ１８〜２０を含む可能性が高い。この効果は２つの可溶性ＰｓｐＣＮ：ＣＦＨ複合体間の（架橋により捕捉される）遭遇の生成物であり得る。この結果は、ヘパリンのような、可溶性ＧＡＧ代替物が、同じＧＡＧに結合する複数のＣＦＨ分子により説明することができず、新生露出部位を介して自己結合する可溶性ＣＦＨ：ＧＡＧ複合体からも生じ得た、可溶性ＣＦＨの多量体化を誘導したという以前のレポートと一致する。ＣＦＨ／ＰｓｐＣ二量体が細菌表面上で形成されるかどうかは知られていない。
この研究において我々は、センサーチップのカルボキシメチル化表面上に化学的に固定したＣ３ｂについてのＦＨおよびＦＨ：ＰｓｐＣＮの親和性を測定するのにＳＰＲを用いた。この実験設定はおそらく自己表面の非常に劣ったモデルであり、よってＳＰＲの例で観察される親和性は、「ランダムな」補体活性化表面（例えば微生物）上で観察されるだろうものと同様であり得る。本研究において、組換えおよび血漿精製ＣＦＨの両方は、他の報告値と一致するＫＤ（０．６ｍＭ）で、ＳＰＲセンサーチップの表面上に固定した、Ｃ３ｂと相互作用した。これはＦＨ１〜４（ＫＤ＝〜１０ｍＭ）またはＦＨ１９〜２０（ＫＤ＝２〜３ｍＭ）と比較して、それぞれ、１５倍および４倍強い（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＣＱ，Ｈｅｒｂｅｒｔ ＡＰ，Ｋａｖａｎａｇｈ Ｄ，Ｇａｎｄｙ Ｃ， Ｆｅｎｔｏｎ ＣＪ，Ｂｌａｕｍ ＢＳ，Ｌｙｏｎ Ｍ，Ｕｈｒiｎ Ｄ，Ｂａｒｌｏｗ ＰＮ．Ａ ｎｅｗ ｍａｐ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ Ｃ３ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ａｕｇ １５；１８１（４）：２６１０−９）。我々はまた、全長ＣＦＨが、Ｃ３ｂへのＣＦＨもしくはＣＦＨ１９〜２０結合、またはＣ３ｄへのＣＦＨ１９〜２０結合と比較した場合、ＳＰＲセンサーチップ上に固定したＣ３ｂに不十分に結合するという我々の観察において以前の研究（３８および２２）の著者らと同意した。以前の研究において、Ｃ３ｂを、そのチオエステルを介するものを含む、さまざまな方法でチップ上に沈着させ、同様の結果を得た（３９）ことは注目すべきである。よって無傷ＣＦＨのＣ末端のＣ３ｂ／ＴＥＤ結合部位は、ＣＦＨがＳＰＲチップ表面上にＣ３ｄを含む場合、完全には利用可能でない。
これは、Ｃ３ｄに結合するのに利用不可能である、ＣＦＨのＣ末端のＣ３ｂ／ｄ結合部位が、それにもかかわらずＣＦＨおよびＣ３ｂの間の遭遇後に展開されるかについての重要な質問を回避する。興味深いことには、本研究において、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）は、断片ＣＦＨ１９〜２０（Ｄ１１１９Ｇ）がＣ３ｂまたはＣ３ｄについての親和性を実質的にまったく有さないという事実（３９）にもかかわらず、ＳＰＲセンサーチップ上でＣ３ｂにＣＦＨ（ｗｔ）とほぼ同程度に良好に結合する。これは、Ｃ３ｂへのＣＦＨ結合のＳＰＲベースのアッセイ（およびＣ３ｄへの結合を測定するもの）において、Ｃ末端部位は効果的にはまったく関与しないことを示す。他方で、ＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）は（ＣＦＨ（ｗｔ）同様）ＣＦＨ１〜４より１５倍強く結合する。追加のＣＣＰ（すなわちＣＣＰ５〜１８）は分子間相互作用に関与する場合があり得、実際に組換えＣＦＨ６〜８はＣ３ｂに非常に弱く結合することが以前示され（１５）、補体因子Ｈ上の３つの結合部位のそれぞれはＣ３ｂ上の異なる部位と相互作用する（Ｊｏｋｉｒａｎｔａ ＴＳ，Ｈｅｌｌｗａｇｅ Ｊ，Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ Ｖ，Ｚｉｐｆｅｌ ＰＦ，Ｍｅｒｉ Ｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ ８；２７５（３６）：２７６５７−６２）。あるいは、ＣＦＨ：Ｃ３ｂ複合体は（ＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体との類似により）遊離ＣＦＨ中には存在しない分子内相互作用により好まれ得る。いずれの例でも、我々は、全長ＣＦＨ中のＣ末端のＣ３ｂ／Ｃ３ｄ結合部位がデフォルトによりマスキングまたは塞がれていると結論し得る。
対照的に、これは、ＦＨ１９〜２０のＣ３ｄ結合親和性と等しい、未変性ＣＦＨと比較して、＞５０倍良好なそのＣ３ｄ結合についての唯一の理路整然とした説明であるので、Ｃ３ｂ／Ｃ３ｄ結合部位がＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ複合体において利用可能であることは明らかである。また、Ｃ３ｂへのＣＦＨ：ＰｓｐＣＮの２部位結合も、Ｃ３ｂについてのその比較的高い（ＦＨ１〜４単独より６０倍高く、ＦＨ１９〜２０単独より１８倍高い）親和性を説明するのに役立つ。ＣＦＨおよびＣＦＨ：ＰｓｐＣＮの間の（Ｃ３ｂについての）親和性の差は「わずか」４倍であるが、これは細菌にとってはかなり顕著であり得る。ＣＦＨがその「隠れた」構造中に捕捉される場合、（Ｃ３ｂ：ＣＦＨ複合体についての）０．６μＭのＫＤは、Ｃ３ｂ集団閾値を超えると制御剤を圧倒することができる二元オンオフプロセスであるＣ３ｂ増幅の制御には不適切であり得；他方でＣＦＨ：ＰｓｐＣＮ−Ｃ３ｂ複合体についての０．１５μＭのＫＤは、表面上の結合Ｃ３ｂ分子数を暴走活性化の閾値未満に維持するのに十分であり得る。こうした概念は、崩壊促進活性の１０倍の向上とともに、本研究において観察されたＰｓｐＣＮ結合ＣＦＨの顕著に向上した溶血防止特性と一致する。ＣＦＨ（野生型）およびＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）の１：１混合物を補充したＣＦＨ欠乏血清において溶血保護を回復するＰｓｐＣＮの能力はその治療的可能性を示す。
これらの観察は、他の細菌タンパク質がＰｓｐＣＮの結合により誘導されるものと同一または類似のＣＦＨの活性化構造を誘導することを強く示す。細菌タンパク質の大部分はＣＦＨに他の場所で結合するが、それらはそれにもかかわらず類似構造を安定させ得る。架橋は、ＣＣＰ７および２０がＰｓｐＣＮ複合体において密接し、多数の細菌タンパク質がこれらの部位両方に関与し、それらを結合させる可能性があることを示す。したがって本研究において我々が用いたものと同様の方法を用い、他の細菌タンパク質：ＣＦＨ複合体の構造を調査することは重要であるだろう。興味深いさらなる可能性は、自己表面上の分子マーカーがＣＦＨの同じ活性化構造を安定させることである。ポリアニオン性マーカー（ヘパリンにより実験的モデル化）がＣＣＰ７および２０に結合し（１５）、より最近では、（ＣＦＨを損傷細胞にリクルートするのに重要であると考えられる）酸化特異的エピトープもこれらの２つのＣＣＰと相互作用する（３４）ことは注目すべきである。この可能性は、本明細書において我々のＣＦＨ（Ｄ１１１９Ｇ）のＣ３ｂ結合研究で例示したように、そうでなければいくつかが見逃されるので、疾患関連ＳＮＰおよびＣＦＨにおける変異の機能的影響を評価するために生体模倣表面を用いる重要性を強調する。
結論としては、ここでＣＦＨが隠れた形態で循環し、そのＣ３ｂ結合能力のいくらかが封じられ、Ｃ３ｂ増幅の非常に効果的な制御剤となることが阻まれ、したがって補体活性化をまとめて自発的に停止することを示す強力な証拠がある。因子Ｈは、そのＣ３ｂ結合部位が利用可能であり、そのＣ３ｂ（またはＣ３ｂ．Ｂｂ）標的に二価で、したがって密に結合するように隣接する「活性」形態でも存在し得る。細菌タンパク質ＰｓｐＣはこの活性構造を誘導することができ、他の細菌タンパク質が（ＣＦＨとの異なる関与形態によってではあるが）同じ戦略を用いることが可能である。こうした構造が存在し、細菌により利用されることは、これが自己表面上の活性構造でもあることを大いに示す。これが実際に脊椎動物の補体系の重要な可溶性調節剤による自己と非自己の区別のための分子基盤であるかを試験するさらなる研究がここで必要となる。
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（実施例２−ＰｓｐＣＮおよび関連タンパク質のさらなる調査）
さらなる実験を行い、ＰｓｐＣＮの特性、ＰｓｐＣＮの変異体およびこうしたタンパク質の治療的使用を調査した。
方法：
ＰＮＨ様赤血球の溶血に対する保護
ＰＮＨ様ヒト赤血球はＥｚｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）の修正版に従って用意した。簡潔には、ヒト全血はドナーから静脈切開により入手し、アルセバー液中に４℃で保存した。細胞はＲＢＣ洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１４５ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％ｗ／ｖのゼラチン、ｐＨ７．３）で３回洗浄し、ＰＢＳ中で最終洗浄後に再懸濁させた。各洗浄ステップ後、細胞ペレットの上部１０％を吸引し、白血球含有バフィーコートを除去した。１ｍｌアリコートの充填細胞を、ＨＣｌを用いてｐＨ８．０まで滴定した臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム（ＡＥＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液の８％ｗ／ｖ溶液に添加した。細胞懸濁液を９分間３７℃で、一定に撹拌しながらインキュベートし、この時間後ＥＤＴＡを含有しないＲＢＣ洗浄緩衝液で３回細胞を洗浄した。
ＰＮＨ様細胞は次に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１４５ｍＭのＮａＣｌ；０．１％ｗ／ｖのゼラチン、ｐＨ６．４で１回洗浄した。これらの細胞は次に、３７℃で、酸性化正常ヒト血清、５ｍＭのマグネシウムＥＧＴＡ、および適切な濃度の血漿精製ＣＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または精製組換えＰｓｐＣＮで、５０μｌの合計反応体積でインキュベートした。３０分後、反応物を２００μｌの氷冷クエンチ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１４５ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％ｗ／ｖのゼラチン；ｐＨ７．３）の添加によりクエンチした。細胞および細胞破片を３，０００ｘｇ、１０分間、４℃での遠心分離により除去し、この後１００μｌアリコートを除去し、その吸光度を４１０ｎｍで記録した。
因子Ｈ結合に必要な最小限のＰｓｐＣＮ配列の決定
ＰｓｐＣ（５２〜１４０）、ＰｓｐＣ（６２〜１４０）、ＰｓｐＣ（７２〜１４０）、ＰｓｐＣ（３７〜１３０）、ＰｓｐＣ（３７〜１２０）およびＰｓｐＣ（３７〜１１０）のコード配列を含有する構成物を、ＰｓｐＣＮ（３７〜１４０）配列を生成するのに用いた方法に従って生成した。次に、ＣＦＨ結合を、ＰｓｐＣＮ（３７〜１４０）タンパク質のＣＦＨ結合親和性を決定するように開発された同じＳＰＲアッセイを用いて評価した。
ＰｓｐＣＮの修飾
ＰｓｐＣＮのＮおよびＣ末端を、システインおよび柔軟なペプチドリンカーセグメントを含有するように修飾した。Ｎ末端でＣｙｓ修飾したＰｓｐＣＮ（Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮ）の例では、含まれる追加の残基は：ＣＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧ−ＰｓｐＣＮ（配列番号７）であり、Ｃ末端でＣｙｓ修飾したＰｓｐＣＮ（ＰｓｐＣＮ−Ｃｙｓ）の例では、含まれる追加の残基は：ＰｓｐＣＮ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＣ＊（配列番号８）であった。ＰｓｐＣＮのこれらの修飾バージョンをクローニングし、ＰｓｐＣＮのために開発されたものと同じ方法を用いて大腸菌においてＳＵＭＯ融合タンパク質として発現させた。これらのタンパク質の精製も、システイン残基のチオール基を保存するための精製の全ステップ中にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含んだ以外、ＰｓｐＣＮに用いたものと同様であった。
Ｃｙｓ変異タンパク質がＦＨ結合能力を保持するかを決定するＳＰＲ実験
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮおよびＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＰｓｐＣＮ−ＣｙｓをＳＰＲ実験におけるリガンドとして、ならびに市販の血漿精製ＣＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州タイラー）を用い、ｓＰｓｐＣＮのＣＦＨ結合能力を評価するのに用いたものと同じ方法を用いてＳＰＲを行った。
Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮのＰＥＧ化
Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮを２０倍モル過剰のメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合し、２．５時間室温で、１ｍＭのＴＣＥＰを補充したＰＢＳ中で撹拌しながらインキュベートした。推定ＰＥＧ化Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮのアリコートに還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。うまくＰＥＧ化したタンパク質は未処理のタンパク質に対するバンドシフトを示したものであると判断された。
正常ヒト血清中のＣＦＨレベルの定量化
正常ヒト血清中のＣＦＨレベルを定量化するＥＬＩＳＡ型アッセイを標準的な平底９６ウェルプレートにおいて行った。ウェルはｓＰｓｐＣＮ（１００μｌ；８μｇ／ｍｌ）で一晩、４℃でコーティングし、その後５％ｗ／ｖの乾燥無脂肪乳粉末を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてブロックした。ウェルは０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳで３回洗浄した。ウェルは次に１時間室温で、一次抗体（ＯＸ２４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳ−Ｃ６２８７８））の１：８００希釈物とインキュベートした。ウェルは次に０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳで３回洗浄した。ウェルは次に１時間室温で、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ超感受性ポリマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ−２４３８）の１：２５０希釈物とインキュベートした。ウェルは次に０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳで３回洗浄した。ウェルを次に２０分間、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質とインキュベートした後、等体積の２．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加した。ウェルの吸光度を４９０ｎｍで読み取った。
結果：
ＰｓｐＣＮは酸性化血清による「ＰＮＨ様」赤血球の溶血を阻害することができる。図９ＡおよびＢにおける溶血アッセイの結果は、ＣＦＨの添加により溶血を効果的に阻害することができることを示す。また、反応物へのＰｓｐＣＮの添加は溶血をさらにより効果的に阻害した（ＩＣ５０値は２８ｎＭであると計算された）。この観察のもっとも可能性のある説明は、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄへのＣＦＨの結合のアッセイの結果と組み合わせた場合、ＰｓｐＣＮの添加が血清中の内因性ＣＦＨを活性化するということである。
野生型因子Ｈ結合に必要な最小限の配列は６２〜１４０である
図１０Ａ〜Ｆにおいて示されるセンサーグラムは、Ｃ末端からのＰｓｐＣＮ（残基３７〜１４０）の切断が少なくとも１０００倍の結合親和性の低下をもたらすが、Ｎ末端から少なくとも２４個の残基を除去し、依然として非常に高いＣＦＨ結合親和性を保持することが可能であることを示す。他方で、ＰｓｐＣ（７１〜１４０）タンパク質は少なくとも１０００倍の結合低下を示す。６２〜１４０構成物もＣＦＨを活性化構造で安定させる能力を保持することはまだ確認されていない。
Ｃｙｓ修飾ＰｓｐＣＮは因子Ｈに天然配列ＰｓｐＣＮと同様の親和性で結合する
図１１において示される曲線の形状は、野生型ＰｓｐＣＮの例と同様に、Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮ（図１０Ａ）およびＰｓｐＣＮ−Ｃｙｓ（図１０Ｂ）の両方がＣＦＨに事実上不可逆的に結合する能力を有し、検出可能なオフレートを示さないことを示す。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて行ったＣｙｓ−ＰｓｐＣＮおよびＰｓｐＣＮ−Ｃｙｓの相互作用の動的分析は、（相互作用はＳＰＲを用いて正確なＫＤを計算するには強すぎたが）相互作用のＫＤが約１０−１３Ｍであることを示した。この計算されたＫＤは未修飾ＰｓｐＣＮについて計算されたものと同じ桁数である。
さらに、図１５はシステインタグをつけたＰｓｐＣＮの表面へのチオール基を介した結合がそれらのＣＦＨ結合親和性を損なわないことを示す。
また、図１６を参照すると、システインタグをつけたＰｓｐＣＮタンパク質は、システインタグを含まないＰｓｐＣＮと同様の崩壊促進活性を示す。したがって、ＰｓｐＣＮ上のシステインタグの存在は、ＰｓｐＣＮおよびＣＦＨの間の相互作用に対して最小限の効果を有することが示された。
Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮはメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドで効果的にＰＥＧ化することができる
メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドは、図１２においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ下での移動度シフトにより見ることができるように、穏やかな条件下でＣｙｓ−ＰｓｐＣＮに効果的に結合する。１５ｋＤａおよび２０ｋＤａマーカーの間を移動する下方バンドは未修飾ＰｓｐＣＮを表す。ＰＥＧ化反応後、依然として顕著な量のＰｓｐＣＮがＰＥＧ化されずに残る。２５ｋＤａマーカーのすぐ上を移動する上方バンドは、他方でうまくＰＥＧ化されたＰｓｐＣＮを表す。ＰｓｐＣＮジスルフィド結合二量体、または複数のＰＥＧ部分を含むＰｓｐＣＮ種の形成の証拠はほとんどない。全体的にこのＰｓｐＣＮのＰＥＧ化方法は、約５０％収率のＰＥＧ化ＰｓｐＣＮをもたらし；収率パーセントをより正確に決定するにはより多くの定量的研究が必要となるだろう。
ＣＦＨは「ＥＬＩＳＡ型」アッセイにおいてＰｓｐＣＮを用いて効果的に定量化することができる
既知の濃度で、血漿精製ＣＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて標準曲線（図１３）を構築し、これは少なくとも二桁にわたる良好な直線検出をもたらした。標準曲線と比較した場合、正常ヒト血清中のＣＦＨレベルを決定することができ、現在許容される基準範囲内であることがわかった。
ＰｓｐＣＮアフィニティークロマトグラフィー樹脂の調製
Ｎ末端のＣｙｓ残基および残基ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧ（Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮ）からなるリンカーを含有するように修飾したＰｓｐＣＮ（３７〜１４０）を、Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌクロマトグラフィー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にそのＮ末端のＣｙｓ残基を介して結合した。結合は製造業者の指示に基づいて行った。Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ樹脂（１０ｍｌ）は、５０ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）で、重力供給式クロマトグラフィーカラムを用いて洗浄した。２．５ｍＭのＴＣＥＰを補充した結合緩衝液中のＣｙｓ−ＰｓｐＣＮ（２ｍｇ／ｍｌで２０ｍｌ）の溶液を、重力供給式クロマトグラフィーカラムにおいてＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ樹脂と１５分間室温で混合した。カラムを次に直立させ、さらに３０分間室温でインキュベートした。次に流体相を排出し、カラムを３０ｍｌの結合緩衝液で洗浄することにより、未結合Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮを除去した。樹脂上の未反応ヨードアセチル基をブロックするため、樹脂を次に結合緩衝液中の５０ｍＭのＬ−システイン．ＨＣｌ２０ｍｌと１５分間室温で混合した。カラムを次に直立させ、さらに３０分間室温でインキュベートした。樹脂は次に１ＭのＮａＣｌ６０ｍｌ、その後０．０５％のＮａＮ３を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）６０ｍｌで洗浄した。この方法を用い、各１ｍｌの樹脂に約１〜１．５ｍｇのＣｙｓ−ＰｓｐＣＮを結合した。
ヒト血漿からのＦＨの精製
アルセバー液中のヒト血漿（正常混合プール）をＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＰｓｐＣＮ樹脂（５ｍｌ）を１００ｍｌのヒト血漿と４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を空の重力供給式クロマトグラフィーカラムに適用し、血漿を排出した。樹脂を次に３×５０ｍｌのＨＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）で洗浄し、その後２×５０ｍｌの４ＭのＮａＣｌでのさらなる洗浄を行った。高度に精製したＦＨをカラムから０．１Ｍのグリシン緩衝液、ｐＨ２．５を用いて溶出した。
ＦＨをヒト血漿からうまく分離したことは図１７のゲルにおいて示され、明確なＣＦＨバンドを上記精製プロセスの各段階について観察することができる。
表面を保護するためのＰｓｐＣＮの使用
図１８を参照すると、システインタグをつけたＰｓｐＣＮを、製造業者の指示に従い、示されるような結合緩衝液中の異なる濃度のＣｙｓ−ＰｓｐＣＮを用いてマレイミド活性化ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）上に固定した。ウェルをその後新鮮な正常ヒト血清と室温でインキュベートし、補体沈着を引き起こした。表面へのＣ３ｂの沈着は従来のＥＬＩＳＡプロトコルに類似した方法で抗Ｃ３抗体を用いて検出した。沈着したＣ３ｂは結合緩衝液中のＰｓｐＣＮの濃度の関数として測定した。Ｎ末端およびＣ末端でシステインタグをつけたＰｓｐＣＮの両方について、Ｃ３ｂの沈着は１００μｇ／ｍｌのＰｓｐＣＮをコーティングした表面上で約５０％減少した。
よって、表面でのＰｓｐＣＮコーティングの存在は、その表面上でのＣ３ｂの沈着を顕著に低減、したがってその表面への免疫反応を低減し得る。
抗ＦＨ自己抗体の存在を検出するための診断としてのＰｓｐＣＮの使用
図１９を参照すると、Ｃｙｓ−ＰｓｐＣＮを、製造業者の指示に従い、５０μｇ／ｍｌの結合緩衝液中のある濃度のＰｓｐＣＮを用いてマレイミド活性化９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）上に固定した。プレートをその後精製ヒト因子Ｈとインキュベートした後、抗ＦＨ自己抗体について陽性であることが知られる患者または正常な対照に由来する精製ＩｇＧとインキュベートした。その後、ビオチンに結合した抗ヒトＩｇＧ特異的抗体、次にストレプトアビジンペルオキシダーゼを標準的なＥＬＩＳＡに類似した方法で用い、抗ＦＨ自己抗体を検出した。その後のインキュベーション間でウェルはリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。
ＴＩＧＲ４株
ここではＴＩＧＲ４ ＰｓｐＣと称される、ストレプトコッカス・ニューモニエのＴＩＧＲ４株のＰｓｐＣタンパク質の断片は、ＣＦＨに強く結合することが示された。ＴＩＧＲ４ ＰｓｐＣ（３７〜１７９）はＣＦＨに１０−１６ＭのＫＤで結合し、ＴＩＧＲ４ ＰｓｐＣ（６８〜１４８）はＣＦＨに１０−１５ＭのＫＤで結合する。
（Ｓ・ニューモニエＴＩＧＲ４株からのＰｓｐＣＮ（ＣｂｐＮ）のＣＦＨに結合してこれを活性化する能力）
図２０を参照すると、Ｓ・ニューモニエのＴＩＧＲ４株からのＰｓｐＣＮは、Ｄ３９株からのＰｓｐＣＮを試験するのに用いたものと同一の方法で、Ｂｉａｃｏｒｅ ＮＴＡチップに結合した。残基３７〜１７９または残基６８〜１４８からなるＴＩＧＲ４株からのＰｓｐＣＮの断片への結合を示すセンサーグラムを取得した。各例において、ＴＩＧＲ４由来のＰｓｐＣＮ配列へのＦＨの結合は、各例で計算された１０−１６Ｍ台のＫＤでの、Ｄ３９株について観察されたものと同様に強い結合をもたらした。
図２１を参照すると、ＦＨへのＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４）結合の崩壊促進活性に対する効果を試験するため、Ｂｉａｃｏｒｅベースの崩壊促進アッセイをＤ３９株由来のＰｓｐＣＮ断片を試験するのに用いたものと同一の方法で行った。ＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４残基３７〜１７９）およびＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４残基６８〜１４８）の両方の例において、ＦＨへのＰｓｐＣＮ断片の結合は、Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）の崩壊を促進するＦＨの能力の増加をもたらした。ＰｓｐＣＮ断片単独では内因性の崩壊促進活性を示さなかった。
図２２および表３を参照すると、ＦＨへのＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４）結合がＣ３ｂおよびＣ３ｄについてのＦＨの親和性に対して有する効果を試験するため、Ｂｉａｃｏｒｅベースの結合アッセイをＤ３９株由来のＰｓｐＣＮ断片を試験するのに用いたものと同一の方法で行った。各例において、ＣＦＨへのＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４残基３７〜１７９）またはＰｓｐＣＮ（ＴＩＧＲ４残基６８〜１４８）いずれかの結合は、Ｃ３ｂ結合の顕著な増加およびそうでなければ検出不能なＣＦＨのＣ３ｂ結合親和性の大きな増加をもたらした。
実施例２の参考文献：
−Brooks-Walter et al. (1999) Infect Immun. 1999 December; 67(12): 6533-6542.
−Ezzell, JL et al. (1991) Blood 77:2764-2773
関連配列
Ｄ３９ＰｓｐＣ遺伝子配列−完全ＣＤＳ（配列番号３）
1 atgcttgtca ataatcacaa atatgtagat catatcttgt ttaggacagt aaaacatcct
61 aattactttt taaatattct tcctgagttg attggcttga ccttgttgag tcatgcttat
121 gtgacttttg ttttagtttt tccagtttat gcagttattt tgtatcgacg aatagctgaa
181 gaggaaaagc tattacatga agttataatc ccaaatggaa gcataaagag ataaatacaa
241 aattcgattt atatacagtt catattgaag taatatagta aggttaaaga aaaaatatag
301 aaggaaataa acatgtttgc atcaaaaagc gaaagaaaag tacattattc aattcgtaaa
361 tttagtattg gagtagctag tgtagctgtt gccagtcttg ttatgggaag tgtggttcat
421 gcgacagaga acgagggaag tacccaagca gccacttctt ctaatatggc aaagacagaa
481 cataggaaag ctgctaaaca agtcgtcgat gaatatatag aaaaaatgtt gagggagatt
541 caactagata gaagaaaaca tacccaaaat gtcgccttaa acataaagtt gagcgcaatt
601 aaaacgaagt atttgcgtga attaaatgtt ttagaagaga agtcgaaaga tgagttgccg
661 tcagaaataa aagcaaagtt agacgcagct tttgagaagt ttaaaaaaga tacattgaaa
721 ccaggagaaa aggtagcaga agctaagaag aaggttgaag aagctaagaa aaaagccgag
781 gatcaaaaag aagaagatcg tcgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt
841 gaaattgctg agttcgatgt gaaagttaaa gaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa
901 gctaaagaat ctcgaaacga gggcacaatt aagcaagcaa aagagaaagt tgagagtaaa
961 aaagctgagg ctacaaggtt agaaaacatc aagacagatc gtaaaaaagc agaagaagaa
1021 gctaaacgaa aagcagatgg taagttgaag gaagctaatg tagcgacttc agatcaaggt
1081 aaaccaaagg ggcgggcaaa acgaggagtt cctggagagc tagcaacacc tgataaaaaa
1141 gaaaatgatg cgaagtcttc agattctagc gtaggtgaag aaactcttcc aagctcatcc
1201 ctgaaatcag gaaaaaaggt agcagaagct gagaagaagg ttgaagaagc tgagaaaaaa
1261 gccaaggatc aaaaagaaga agatcgccgt aactacccaa ccaatactta caaaacgctt
1321 gaccttgaaa ttgctgagtc cgatgtgaaa gttaaagaag cggagcttga actagtaaaa
1381 gaggaagcta aggaacctcg agacgaggaa aaaattaagc aagcaaaagc gaaagttgag
1441 agtaaaaaag ctgaggctac aaggttagaa aacatcaaga cagatcgtaa aaaagcagaa
1501 gaagaagcta aacgaaaagc agcagaagaa gataaagtta aagaaaaacc agctgaacaa
1561 ccacaaccag cgccggctac tcaaccagaa aaaccagctc caaaaccaga gaagccagct
1621 gaacaaccaa aagcagaaaa aacagatgat caacaagctg aagaagacta tgctcgtaga
1681 tcagaagaag aatataatcg cttgactcaa cagcaaccgc caaaaactga aaaaccagca
1741 caaccatcta ctccaaaaac aggctggaaa caagaaaacg gtatgtggta cttctacaat
1801 actgatggtt caatggcaac aggatggctc caaaacaacg gttcatggta ctatctaaac
1861 gctaatggtg ctatggcgac aggatggctc caaaacaatg gttcatggta ctatctaaac
1921 gctaatggtt caatggcaac aggatggctc caaaacaatg gttcatggta ctacctaaac
1981 gctaatggtg ctatggcgac aggatggctc caatacaatg gttcatggta ctacctaaac
2041 agcaatggcg ctatggcgac aggatggctc caatacaatg gctcatggta ctacctcaac
2101 gctaatggtg atatggcgac aggatggctc caaaacaacg gttcatggta ctacctcaac
2161 gctaatggtg atatggcgac aggatggctc caatacaacg gttcatggta ttacctcaac
2221 gctaatggtg atatggcgac aggttgggtg aaagatggan atacctggta ctatcttaaa
2281 gcatcaggtg ctatgaaagc aagccaatgg ttcaaagtat cagataaatg gtactatgtc
2341 aatggctcag gtgcccttgc agtcaacaca actgtagatg gctatggagt caatgccaat
2401 ggtgaatggg taaactaaac ctaatataac tagttaatac tgacttcctg taagaacttt
2461 ttaaagtatt ccctacaaat accatatcct ttcagtagat aatataccct tgtaggaagt
2521 ttagattaaa aaataactct gtaatctcta gccggattta tagcgctaga gactacggag
2581 tttttttgat gaggaaagaa tggcggcatt caagagactc tttaagagag ttacgggttt
2641 taaactatta agccttctcc aattgcaaga gggcttcaat ctctgctagg gtgctagctt
2701 gcgaaatggc tccacggagt ttngc
配列番号３から転写したアミノ酸配列（配列番号４）−ＰｓｐＣＮ配列（アミノ酸３７〜１４０）を太字（本明細書では下線）で示す：
MFASKSERKVHYSIRKFSIGVASVAVASLVMGSVVHATENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADGKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPATQPEKPAPKPEKPAEQPKAEKTDDQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQYNGSWYYLNSNGAMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWLQNNGSWYYLNANGDMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGXTWYYLKASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN
ＰｓｐＣＮの発現に用いた合成コドン最適化ＤＮＡ配列を以下に示す（配列番号５）：
GCAACCGAAAATGAAGGTAGCACCCAGGCAGCAACCAGCAGCAATATGGCAAAAACCGAACATCGTAAAGCAGCCAAACAGGTTGTGGATGAGTATATCGAAAAAATGCTGCGTGAAATTCAGCTGGATCGTCGTAAACATACCCAGAATGTTGCACTGAACATTAAACTGAGCGCCATCAAAACCAAATATCTGCGTGAACTGAATGTGCTGGAAGAGAAAAGCAAAGATGAACTGCCGAGCGAAATTAAAGCAAAACTGGATGCAGCCTTTGAAAAATTCAAAAAAGATACCCTGAAACCGGGTGAGAAATAA
ヒトＣＦＨアミノ酸配列−シグナルペプチド下線−未処理形態（配列番号６）：
10 20 30 40 50 60
MRLLAKIICL MLWAICVAED CNELPPRRNT EILTGSWSDQ TYPEGTQAIY KCRPGYRSLG

70 80 90 100 110 120
NVIMVCRKGE WVALNPLRKC QKRPCGHPGD TPFGTFTLTG GNVFEYGVKA VYTCNEGYQL

130 140 150 160 170 180
LGEINYRECD TDGWTNDIPI CEVVKCLPVT APENGKIVSS AMEPDREYHF GQAVRFVCNS

190 200 210 220 230 240
GYKIEGDEEM HCSDDGFWSK EKPKCVEISC KSPDVINGSP ISQKIIYKEN ERFQYKCNMG

250 260 270 280 290 300
YEYSERGDAV CTESGWRPLP SCEEKSCDNP YIPNGDYSPL RIKHRTGDEI TYQCRNGFYP

310 320 330 340 350 360
ATRGNTAKCT STGWIPAPRC TLKPCDYPDI KHGGLYHENM RRPYFPVAVG KYYSYYCDEH

370 380 390 400 410 420
FETPSGSYWD HIHCTQDGWS PAVPCLRKCY FPYLENGYNQ NYGRKFVQGK SIDVACHPGY

430 440 450 460 470 480
ALPKAQTTVT CMENGWSPTP RCIRVKTCSK SSIDIENGFI SESQYTYALK EKAKYQCKLG

490 500 510 520 530 540
YVTADGETSG SITCGKDGWS AQPTCIKSCD IPVFMNARTK NDFTWFKLND TLDYECHDGY

550 560 570 580 590 600
ESNTGSTTGS IVCGYNGWSD LPICYERECE LPKIDVHLVP DRKKDQYKVG EVLKFSCKPG

610 620 630 640 650 660
FTIVGPNSVQ CYHFGLSPDL PICKEQVQSC GPPPELLNGN VKEKTKEEYG HSEVVEYYCN

670 680 690 700 710 720
PRFLMKGPNK IQCVDGEWTT LPVCIVEEST CGDIPELEHG WAQLSSPPYY YGDSVEFNCS

730 740 750 760 770 780
ESFTMIGHRS ITCIHGVWTQ LPQCVAIDKL KKCKSSNLII LEEHLKNKKE FDHNSNIRYR

790 800 810 820 830 840
CRGKEGWIHT VCINGRWDPE VNCSMAQIQL CPPPPQIPNS HNMTTTLNYR DGEKVSVLCQ

850 860 870 880 890 900
ENYLIQEGEE ITCKDGRWQS IPLCVEKIPC SQPPQIEHGT INSSRSSQES YAHGTKLSYT

910 920 930 940 950 960
CEGGFRISEE NETTCYMGKW SSPPQCEGLP CKSPPEISHG VVAHMSDSYQ YGEEVTYKCF

970 980 990 1000 1010 1020
EGFGIDGPAI AKCLGEKWSH PPSCIKTDCL SLPSFENAIP MGEKKDVYKA GEQVTYTCAT

1030 1040 1050 1060 1070 1080
YYKMDGASNV TCINSRWTGR PTCRDTSCVN PPTVQNAYIV SRQMSKYPSG ERVRYQCRSP

1090 1100 1110 1120 1130 1140
YEMFGDEEVM CLNGNWTEPP QCKDSTGKCG PPPPIDNGDI TSFPLSVYAP ASSVEYQCQN

1150 1160 1170 1180 1190 1200
LYQLEGNKRI TCRNGQWSEP PKCLHPCVIS REIMENYNIA LRWTAKQKLY SRTGESVEFV

1210 1220 1230
CKRGYRLSSR SHTLRTTCWD GKLEYPTCAK R

Claims (48)

  1. 補体因子Ｈ（ＣＦＨ）に結合し、これにより未結合ＣＦＨと比較して、結合ＣＦＨによる向上したＣ３ｄおよびＣ３ｂの結合を誘導することができる、組換えタンパク質。
  2. 野生型ＣＦＨに結合し、１×１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する複合体を形成することができる、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 野生型ＣＦＨに結合し、１×１０−１３Ｍ以下のＫＤを有する複合体を形成することができる、請求項２に記載のタンパク質。
  4. 細菌病原性因子に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 肺炎球菌表面タンパク質に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. ストレプトコッカス・ニューモニエからの肺炎球菌表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ）に由来する、請求項５に記載のタンパク質。
  7. Ｓ・ニューモニエのＤ３９（ＮＣＴＣ ｎｏ７４６６）株のＰｓｐＣに由来する、請求項６に記載のタンパク質。
  8. Ｓ・ニューモニエのＴＩＧＲ４（ＮＣＴＣ ｎｏ７４６５）株のＰｓｐＣに由来する、請求項６に記載のタンパク質。
  9. ７０〜１５０個のアミノ酸長である、ＰｓｐＣの断片、またはその変異体からなる、請求項６〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  10. 配列：
    ＡＴＥＮＥＧＳＴＱＡＡＴＳＳＮＭＡＫＴＥＨＲＫＡＡＫＱＶＶＤＥＹＩＥＫＭＬＲＥＩＱＬＤＲＲＫＨＴＱＮＶＡＬＮＩＫＬＳＡＩＫＴＫＹＬＲＥＬＮＶＬＥＥＫＳＫＤＥＬＰＳＥＩＫＡＫＬＤＡＡＦＥＫＦＫＫＤＴＬＫＰＧＥＫ（配列番号１）、またはその機能的変異体もしくは断片；または
    ＫＱＶＶＤＥＹＩＥＫＭＬＲＥＩＱＬＤＲＲＫＨＴＱＮＶＡＬＮＩＫＬＳＡＩＫＴＫＹＬＲＥＬＮＶＬＥＥＫＳＫＤＥＬＰＳＥＩＫＡＫＬＤＡＡＦＥＫＦＫＫＤＴＬＫＰＧＥＫ（配列番号２）、またはその機能的変異体もしくは断片を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. 配列：
    ＡＴＥＮＥＧＡＴＱＶＰＴＳＳＮＲＡＮＥＳＱＡＥＱＧＥＱＰＫＫＬＤＳＥＲＤＫＡＲＫＥＶＥＥＹＶＫＫＩＶＧＥＳＹＡＫＳＴＫＫＲＨＴＩＴＶＡＬＶＮＥＬＮＮＩＫＮＥＹＬＮＫＩＶＥＳＴＳＥＳＱＬＱＩＬＭＭＥＳＲＳＫＶＤＥＡＶＳＫＦＥＫＤＳＳＳＳＳＳＳＤＳＳＴＫＰＥＡＳＤＴＡＫＰＮＫＰＴＥＰＧＥＫ（配列番号９）、またはその機能的変異体もしくは断片を含む、前請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
  12. ＰｓｐＣ、またはその機能的変異体の少なくともアミノ酸６８〜１３６を含む、請求項７に記載のタンパク質。
  13. ＣＦＨに結合した請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を含む複合体であって、ＣＦＨがＣＦＨ単独で用いられる構造より活性な構造で保持される複合体。
  14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  15. 請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  16. 発現する組換えタンパク質をコードする請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えタンパク質を発現することができる細胞。
  17. 請求項１６に記載の細胞からなる細胞培養物。
  18. 表面上に固定された請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. その表面が請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質で少なくとも部分的にコーティングされた、医療機器。
  20. 機器（すなわち体組織および／または体液と接触するもの）の外面の実質的にすべてが前記タンパク質でコーティングされた、請求項１９に記載の医療機器。
  21. 埋め込み型医療機器またはマイクロカプセルである、請求項１９又は２０に記載の医療機器。
  22. ＣＦＨに結合した請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の複合体でコーティングされた、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医療機器。
  23. −医療機器を用意するステップ；
    −請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を用意するステップ；および
    −前記タンパク質を医療機器の表面の少なくとも一部に結合させるステップ
    を含む医療機器の処理方法。
  24. −試料を用意するステップ；
    −請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を用意するステップ；
    −前記試料を前記タンパク質と接触させるステップ；および
    −前記試料中に存在するＣＦＨへの前記タンパク質の結合を検出するステップ
    を含む、試料中のＣＦＨの存在または量の検出方法。
  25. 対象からの生物学的試料中のＣＦＨの存在を検出する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記生物学的試料が血液の試料および血漿のような血液の分画の１つである、請求項２５に記載の方法。
  27. −試料を用意するステップ；
    −ＣＦＨを用意するステップ；
    −前記試料を前記ＣＦＨと接触させるステップ；および
    −前記試料中に存在する前記ＣＦＨへのＰｓｐＣＮの結合を検出するステップ
    を含む、試料中のＰｓｐＣＮの存在または量の検出方法。
  28. −表面上に固定された請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を用意するステップ；
    −試料を用意するステップ；
    −前記試料を表面上に通すステップ；および
    −前記表面に結合したＣＦＨを回収するステップ；ならびに／または
    −ＣＦＨを失った前記試料を回収するステップ
    を含む、試料からのＣＦＨの精製または分離方法。
  29. 前記表面が容器、導管、マトリックス、ビーズ、ゲル、またはクロマトグラフィーに用いられるいずれかの充填材料の表面の１つである、請求項２８に記載の方法。
  30. −表面上に固定されたＣＦＨを用意するステップ；
    −試料を用意するステップ；
    −前記試料を前記表面上に通すステップ；および
    −前記表面に結合したＰｓｐＣ、ＰｓｐＣＮもしくはＰｓｐＣＮ合および別のタンパク質の融合を回収するステップ；ならびに／または
    −ＰｓｐＣを失った前記試料を回収するステップ
    からなる、試料からのＰｓｐＣ、ＰｓｐＣＮまたはＰｓｐＣＮおよび別のタンパク質の融合の精製または分離方法。
  31. 疾患の治療または予防に有用な請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  32. 対象または補体活性の低減が有益である場合における異常な補体調節活性に関連する疾患（症状）または他の内科的合併症の治療または予防に有用な請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  33. 前記疾患（症状）または他の内科的合併症が：
    −発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
    −非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；
    −密沈積症（ＤＤＤ）；
    −加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）；
    −全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；
    −敗血症；および
    −アルツハイマー病
    の１つ以上である、請求項３２に記載のタンパク質。
  34. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質またはこれをコードする核酸を含む医薬製剤。
  35. 医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 適切な賦形剤溶液を希釈剤として用い、凍結乾燥物として製剤される、請求項３４または３５に記載の医薬組成物。
  37. ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  38. ベシクル中で送達される、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  39. 請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキット。
  40. ヒト投与用の製造、使用または販売の機関による承認を反映する、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の注意書きをさらに含む、請求項３９に記載のパックまたはキット。
  41. 効果的な量の請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物の対象への投与による、対象における疾患の治療または予防方法。
  42. 対象における異常な補体活性に関連する疾患の治療または予防を提供する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記対象が哺乳類である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象がヒトである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記疾患が：
    −発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
    −非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；
    −密沈積症（ＤＤＤ）；
    −加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）；
    −全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；
    −敗血症；および
    −アルツハイマー病
    の１つ以上である、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 医薬的に効果的な量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を含む医薬組成物、またはインビボで医薬的に効果的な量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現することができる核酸からなる組成物を投与するステップを含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の前記医薬的に効果的な量が、タンパク質約１μｇ／対象の体重１ｋｇ〜タンパク質約５００ｍｇ／対象の体重１ｋｇであり得る、請求項４５に記載の方法。
  48. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の対象における特定の部位または組織への標的化を含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
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