CN114031676A - 具有诊断和治疗用途的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有诊断和治疗用途的蛋白质。本发明提供了重组蛋白质，其能够与补体因子H(CFH)结合，并因此与未结合CFH相比，诱导已结合CFH与C3d和C3b之结合的提高。还描述了用于使用所述重组蛋白质的方法和医学装置。

Description

具有诊断和治疗用途的蛋白质

本申请是申请号为201480056203.0的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年10月13日提交的PCT国际申请PCT/GB2014/053072于2016年4月12日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及能够与补体因子(complement factor)H相互作用并且调节其活性的蛋白质。本发明还涉及在治疗、诊断和其他应用中使用这样的蛋白质的方法。

背景技术

补体系统是血液中对感染提供第一防线的一组40至50种蛋白质。不恰当调节的补体系统可损害宿主或自身细胞和细菌细胞。因此，其可能造成或加剧许多疾病的症状。因此，对于开发监测或调节补体系统蛋白质的试剂有很大的兴趣。

人补体因子H(complement factor H，CFH)是选择性作用于自身表面(self-surface)以保护其免受补体系统介导的损伤的蛋白质。然而，许多病原体可将宿主CFH用于其自身目的。对CFH(由20个补体控制蛋白(complement control protein，CCP)模块组成，所述模块也称为短共有序列重复(short consensus repeat，SCR)或sushi结构域)如何与相关微生物蛋白相互作用的研究已经提供了关于如何通过实验室中产生的多肽捕获CFH以及调节其活性的线索。

PspC是肺炎球菌表面蛋白的四个名称中的一个，所述蛋白的基因存在于全部肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株中的约75％中。在名称SpsA下，已示出该蛋白质结合分泌性免疫球蛋白A(S.Hammerschmidt，S.R.Talay，P.Brandtzaeg和G.S.Chhatwal，Mol.Microbiol.25：1113-1124，1997)。在名称CbpA下，已示出蛋白质与人上皮细胞和内皮细胞相互作用(C.Rosenow等，Mol.Microbiol.25：819-829，1997)。改基因与肺炎链球菌中的PspA基因旁系同源，并因此称为PspC(A.Brooks-Walter，R.C.Tart，D.E.Briles和S.K.Hollingshead，1997年美国微生物学会第97届全体大会的摘要(Abstracts of the97th General Meeting of the American Society for Microbiology 1997))。在名称HIC下，已示出蛋白质与人因子H相互作用(Janulczyk R.，Iannelli F.，Sjoholm A.G.，Pozzi G.，Bjorck L.J.Biol.Chem.275：37257-37263，2000)。以下中提供了对PspC的详细描述：Brooks-Walter等，“The pspC Gene of Streptococcus pneumoniae Encodes aPolymorphic Protein，PspC，Which Elicits Cross-Reactive Antibodies to PspA andProvides Immunity to Pneumococcal Bacteremia”Infect Immun.1999年12月；67(12)：6533-6542.PMCID：PMC97064。在该论文中，5个已公开的和7个新的等位基因的序列比较揭示，该基因是镶嵌结构，模块化结构域在进化过程中有助于基因多样性。存在两个主要进化枝：进化枝A等位基因较大并且包含与许多PspA等位基因共有的额外模块；进化枝B等位基因较小并且缺少该PspA样结构域。所有等位基因具有富脯氨酸结构域和胆碱结合重复结构域，其示出与PspA蛋白中的类似结构域0％的趋异性。

本发明人制备了肺炎链球菌PspC截短物(PspCN)，其主要通过与CCP 8-10的相互作用来不可逆地(在生物学时间标尺上)结合CFH。PspCN捕获的CFH采用这样的构象，其中化学交联剂可以使其CCP 5和CCP 18以及其CCP 7和CCP 20结合；有趣的是，CCP 7和CCP 20介导其自身表面识别，并且是多种其他CFH相互作用细菌的双重结合位点。

在使用表面等离子体共振进行的实验中，发现PspCN：CFH复合物与固定化C3b的结合是CFH的至少三倍，C3b是补体成分C3的活性形式。PspCN：CFH复合物与蛋白水解的C3b片段C3d的结合是CFH的许多倍。PspCN：CFH复合物与C3转化酶C3b.Bb(将C3切割成C3a和C3b的酶)的解离比CFH更有效10倍。这些观察结果据推测归因于复合物形成后暴露出了CFH的CCP19-20内堵塞的表面相互作用和C3d/C3b结合位点。

为了支持该概念，发现CFH(D1119G)(其缺少C3d/C3b：CCP 19界面内关键残基并且与肾病非典型溶血尿毒综合征(atypical haemolytic uraenic syndrome)相关)与固定在表面等离子体共振芯片上的C3b结合，并且类似地恰如CFH(野生型)一样有效地使固定化C3b.Bb衰减；然而，该突变体并不阻止补体介导的具有唾液酸的红细胞的溶血，意味着CCP19-20被用于自身表面上CFH的调节作用，但是其对于使C3b结合在表面等离子体共振芯片上没有贡献。

重要地，PspCN：CFH(D1119G)与C3d的结合比PspCN：CFH(野生型)弱许多倍，并且与单独CFH(D1119G)相比，几乎不表现出对C3b.Bb衰减加速的增强。因此，本发明人假设，CFH“隐藏”调节位点以避免细菌利用，但是PspC使它们暴露。类似的FH构象开关可在自身表面上操作。

对于使补体成分(特别是CFH)选择性与固体支持物结合以及调节补体活性的方法和组合物具有未满足的需求。调节补体活性的能力打开了尤其是用于治疗与异常补体活性相关疾病的机会。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了重组蛋白质，其能够与补体因子H(CFH)结合，并因此与未结合CFH相比，诱导已结合CFH与C3d和C3b之结合的提高。

所述重组蛋白质能够与CFH结合，并因此诱导与未结合的CFH相比提高的结合的CFH对C3d和C3b的亲和力。

因此，本发明的蛋白质能够通过其与CFH的相互作用而充当替代补体途径(alternative complement pathway)中C3b扩增的抑制剂。

优选地，所述蛋白质能够以1×10^-10M或更低的K_D、更优选地以1×10^-11M或更低的K_D、更优选地以1×10^-12M或更低的K_D、最优选地以1×10^-13M或更低的K_D与野生型CFH结合以形成复合物。

下文给出了评估任何蛋白质实现该要求的能力的合适测定。

合适地，蛋白质来自于细菌蛋白。例如，蛋白质可以是细菌蛋白的片段。

已经表明募集因子H的病原体包括：曲霉属(Aspergillus spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、达氏疏螺旋体(B.duttonii)、回归热螺旋体(B.recurrentis)、白色念球菌(Candida albicans)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。

因此，来自所述病原体的蛋白质可用于开发根据本发明的蛋白质。

在本发明的一些优选实施方案中，蛋白质来自于细菌毒力因子，例如，其相当于毒力因子的片段或变体。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明蛋白质来自于肺炎球菌表面蛋白，尤其是来自肺炎链球菌的肺炎球菌表面蛋白C(PspC)。

多种形式的PspC是已知的，例如，来自于于不同肺炎链球菌菌株的变体。这些变体中的任意一种可用于本发明。来自于菌株D39和TIGR4的PspC是特别充分研究的变体，并且是以下描述的特定实验的焦点。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明蛋白质可来自于肺炎链球菌菌株D39(NCTC no 7466)的PspC。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明蛋白质可来自于菌株TIGR4(NCTC no 7465)的CbpA。但是，可以使用来自任何其他菌株的PspC蛋白，只要其能够与CFH结合并增强CFH的补体调节活性即可。

来自多种不同菌株的PspC核苷酸序列的GenBank/EMBL登录号如下：D39，AF068646；EF6796，U72655；DBL6A，AF068645；E134，AF068647；BG8090，AF068648；L81905，AF068649；以及BG9163，AF068650。

合适地，本发明蛋白质包含PspC的片段，其中所述片段包含PspC的N末端区域的一部分。

在本发明的一个实施方案中，本发明蛋白质包含PspC的片段，所述片段包含PspC的从N末端编号的前250个氨基酸的一部分，或者其功能性变体。优选地，本发明蛋白质不包含来自PspC的额外序列。也就是说，所述蛋白质包含PspC的前250个氨基酸的一部分，并且可包含除此之外的其他序列，但是这些序列优选地不是来自PspC的序列。

合适地，所述蛋白质包含PspC的片段或者其变体，其长度为70至150个氨基酸残基，合适地长度为80至130个氨基酸残基，通常长度为90至120个氨基酸。

合适地，根据本发明的整个蛋白质的长度为70至150个氨基酸残基，合适地为80至130个氨基酸残基，并且任选地为90至120个氨基酸残基，但是在许多情况下(例如，融合蛋白)，其可以更长。

在一些实施方案中，本发明的蛋白质在生理环境(例如，血清)中是可溶的。在另一些情况下，其可以是不溶的或者与表面结合或吸附于表面。

在一个优选实施方案中，本发明蛋白质包含以下序列：

ATENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEK(SEQ ID NO 1)

或者其功能性变体或片段。

该特定序列包含PspC的第37-140位氨基酸残基并且在下文称为PspCN。氨基酸编号基于Genbank登录号AF068646中给出的PspC的全长序列。

PspCN表示来自于N末端区域的PspC片段，其能够非常强烈地与CFH结合并且使其活化。事实上，其与CFH结合得如此之强以至于其看来对于所有意图和目的都是不可逆的。

在另一个优选实施方案中，本发明蛋白质包含以下序列：

KQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEK(SEQ ID NO 2)

或者其功能性变体或片段。

该特定序列代表了与PspCN相比另一种截短形式的PspC，其包含PspC的氨基酸62-140，并且将被称为PspCN(62-140)。看来PspCN(62-140)代表了能够以高亲和力与CFH结合的最小或近乎最小的PspC片段。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明蛋白质包含以下序列：

ATENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEK(SEQ ID NO 9)

或者其功能性变体或片段。

可能的是稍小的PspC片段也可以能够以高亲和力与CFH结合，但是使PspCN(62-140)的N末端或C末端缩短10个氨基酸表现为严重损害CFH结合亲和力。

因此，在本发明的一些优选实施方案中，所述蛋白质至少包含PspC的第68-136位、并且更优选地第65-138位、更优选地第62-140位氨基酸残基或者其功能性变体。

当然可能的是，可以移除或替换PspCN(62-140)内的一部分而不会不利地影响蛋白质的功能，确定哪些区域可以被移除或替换在本领域技术人员的常规技能范围内。如下文更详细讨论的，移除或替换了第62-140位氨基酸内的一部分但是依然保留功能的蛋白质也在本发明的范围内。

本发明蛋白质的一个特别有趣的性质是其看来对CFH具有高选择性。例如，看来相对于相关蛋白质CFH样蛋白1或其他CFH相关蛋白，根据本发明的蛋白质能够优先选择性地结合CFH。这在蛋白质的治疗、诊断和其他用途方面具有启示。

本发明蛋白质优选地主要在CFH的CCP 8-15之间的位置，优选地CCP 8-10内的位置处与CFH结合。

另外，上述片段可以是较大蛋白质的一部分并且保留其结合特性(例如，作为融合蛋白或者PspC的较大片段的一部分)。

因此，对于技术人员来说明显的是，本发明不限于SEQ ID NO 1或2的精确序列，保留了PspCN的生物学活性(即，保留了对于CFH结合和活化的功能)的其变体或片段也落入本发明的范围。

特别地，当与野生型CFH复合时，K_D为10nM或更低、更优选地1nM或更低、更优选地100pM或更低、更优选地10pM或更低、最优选地1pM或更低的变体或片段是本发明的一些优选实施方案。出人意料地，已经测量了蛋白质如PspCN和PspCN(62-140)，其K_D低至5×10^{- 14}M，因此，本发明尤其优选的蛋白质具有以5×10^-13M或更低的K_D表示的亲和力。几乎不需要说的是，较高亲和力对应较低K_D。

本文中使用的术语“蛋白质”可与“肽”或“多肽”互换使用，意指通过肽键连接的至少两个共价连接的α氨基酸残基。术语蛋白质涵盖了纯化的天然产物或化学产物，其可以部分地或完全地使用重组或合成技术产生。术语蛋白质可以指超过一个多肽的复合物，例如二聚体或其他多聚体、融合蛋白、蛋白质变体或其衍生物。该术语还包括经修饰蛋白质，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、泛素化等修饰的蛋白质。蛋白质可包含不由氨基酸密码子编码的氨基酸。

明显的是，在序列中具有小修饰的蛋白质同样可用，只要其是功能性的即可，因此本发明还提供了包含与SEQ ID NO 1所示氨基酸序列具有至少50％相似性的氨基酸序列的蛋白质或者其功能性片段。本发明优选地提供了包含与SEQ ID NO 1的序列具有至少60％、或优选地至少70％、更优选地80％、更优选地90％、更优选地至少99％、最优选地100％相似性的多肽序列的蛋白质或其功能性片段。

术语“相似性”是指从氨基酸差异方面来看蛋白质之间的相似性程度，但是所述不同氨基酸在考虑到几乎相同的大小、亲脂性、酸性等时是功能相似的。相似性百分比可以通过最佳序列比对使用相似性计分矩阵计算，例如Henikoff S.和Henikoff J.G.，P.N.A.S.USA 1992，89：10915-10919中描述的Blosum62矩阵。可以使用Genetics ComputerGroup(GCG，Madison，WI，USA)的GAP程序用程序的缺省参数来使用Blosum62相似性矩阵以及Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.1970，48：443-453)进行两个序列的百分比相似性计算和最佳比对。

本发明中用于氨基酸比较的示例性参数使用Blosum62矩阵(Henikoff andHenikoff，同上)并且结合GAP程序的以下设置：

-缺口罚分：8

-缺口长度罚分：2

-末端缺口不罚分。

PspC的多晶型形式也包括在本发明内。同样形成本发明的一部分的蛋白质变体是天然变体或合成变体，其可以由于序列中一个或更多个氨基酸残基的缺失、替换、插入、倒位或添加或者由于与蛋白质化学连接的部分的改变而在所述氨基酸残基序列中包含变化。例如，蛋白质变体可以是连接与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本发明蛋白质可包含至少一种这样的蛋白质修饰。

蛋白质的替换变体是其中氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被移除并且在其位置插入不同氨基酸残基的蛋白质。本发明蛋白质可包含保守替换或非保守替换。

术语“保守替换”涉及用一个或更多个氨基酸残基替换具有相似生化特性的氨基酸残基。通常来说，保守替换对于所得蛋白质的活性只有很小影响或没有影响。例如，本发明蛋白质中的保守替换可以是基本上不影响蛋白质与CFH结合并且使其活化之能力的氨基酸替换。本发明蛋白质变体的筛选可用于鉴定哪些氨基酸残基可以耐受氨基酸残基替换。在一个实例中，当产生一个或更多个保守氨基酸残基替换时，与PspCN相比，经修饰蛋白质的相关生物活性降低不超过25％，优选地不超过20％，尤其是不超过10％。

本发明蛋白质中可以包含一个或更多个保守替换。在一个实例中，蛋白质中包含10个或更少个保守替换。因此，本发明蛋白质可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守替换。可以通过使用例如标准程序(例如位点定向诱变、基因合成或PCR)对编码该多肽的核苷酸序列进行操作来产生多肽，以包含一个或更多个保守替换。或者，可以通过使用例如本领域已知的肽合成方法产生多肽，以包含一个或更多个保守替换。

可以替换蛋白质中的原始氨基酸残基并且可以视作保守替换的氨基酸的实例包括：Ser替换Ala；Lys替换Arg；Gln或His替换Asn；Glu替换Asp；Asn替换Gln；Asp替换Glu；Pro替换Gly；Asn或Gln替换His；Leu或Val替换Ile；Ile或Val替换Leu；Arg或Gln替换Lys；Leu或Ile替换Met；Met、Leu或Tyr替换Phe；Thr替换Ser；Ser替换Thr；Tyr替换Trp；Trp或Phe替换Tyr；以及Ile或Leu替换Val。在一个实施方案中，替换发生在Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；Lys和Arg之间；和/或Phe和Tyr之间。关于保守替换的进一步信息可以在其他位置找到，Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169：751-7，1987)，O′Regan等(Gene 77：237-51，1989)，Sahin-Toth等(Protein Sci.3：240-7，1994)，Hochuli等(Bio/Technology 6：1321-5，1988)，WO 00/67796(Curd等)以及遗传学和分子生物学的标准教材中。

其他变体可以是例如功能性变体，例如盐、酰胺、酯(特别是C末端酯)，以及N-酰基衍生物。还包括在体内或体外修饰的肽，例如，通过糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化。

根据本发明的蛋白质可以通过多种化学技术修饰以产生具有与未修饰蛋白质几乎相同的活性并且任选地具有其他期望特性的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团(无论是末端羧基或侧链)均可以以可药用阳离子盐的形式提供；或者酯化，以例如形成C1-C6烷基酯；或者转化成酰胺，例如式CONR1R2，其中R1和R2各自独立为H或C1-C6烷基；或者组合以形成杂环，例如5或6元环。肽的氨基(无论是末端氨基还是侧链氨基)均可以是可药用酸加成盐的形式，例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸以及其他有机酸的盐；或者可以修饰成C1-C6烷基或二烷基氨基或者进一步转化成酰胺。肽侧链的羟基可以使用公知的技术转化成烷氧基或酯基，例如C1-C6烷氧基或C1-C6烷基酯。肽侧链的苯环和酚环可以被一个或更多个卤素原子(例如F、Cl、Br或I)，或者被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羧酸及其酯或者此类羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可以延伸至同系C2-C4亚烷基。巯基可以用若干公知的保护基中的任意一种(例如，乙酰胺基团)保护。本领域技术人员还认识向本公开内容的肽中引入环状结构的方法，以便选择导致增强的稳定性的结构和为其提供构象限制。

仅包含PspCN的功能性片段或其变体的蛋白质也形成本发明的一部分。功能性片段是这样的片段，其至少代表了蛋白质的对于蛋白质能够结合和活化CFH必要的部分，并且例如当单独使用或者以多亚基形式使用时可实现该功能。因此，这样的功能性片段可以是本身功能性的多肽，或者片段可以在与其他多肽连接(例如以获得嵌合蛋白)时是功能性。应理解这样的功能性片段落入了本发明的范围。可以使用本文中所述的多种生物测定来确定片段是否是功能性的。

尤其可以使用用于DNA的限制性内切酶和用于多肽的蛋白酶通过前体分子的酶促切割来产生片段。其他方法包括片段的化学合成以及通过DNA编码的肽片段的产生。

本发明蛋白质可以是融合蛋白。将两个或更多个亚基连接到一起以形成融合蛋白的多种方式是技术人员公知的。这样的融合蛋白可以包含接头或不具有接头。合适的接头是本领域中公知的，并且相关信息尤其可见于：George RA和Heringa J.‘An analysis ofprotein domain linkers：their classification and role in protein folding’.Protein Eng，2002年11月；15(11)871-9。

可以使用合适的生物测定在体外测量根据本发明的蛋白质的生物活性。合适的生物测定在下文中进行了详细描述，并且包括使用表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)以测量蛋白质与CFH的结合，以及测量蛋白质结合的CFH与其他相关补体成分相互作用的能力(例如，与C3b或C3d结合，或者诱导C3b.Bb的衰减)。

通常来说，本发明的蛋白质是重组蛋白。例如，可以通过在合适的细胞系(例如酵母或大肠杆菌)中表达来制备所述蛋白质。

在另一个方面，本发明提供了包含与CFH结合的本发明蛋白质的复合材料(composite)，其中CFH保持为比单独CFH所采用的构象更有活性的构象。这样的复合物可用作治疗剂以提高对象中的CFH活性水平。

在本发明的另一个方面，提供了编码本发明蛋白质的核酸。

在另一个方面，本发明因此提供了包含根据本发明的多核苷酸的重组载体。合适的重组载体包括细菌或酵母质粒、粘粒、噬菌粒、F粘粒(fosmid)、宽宿主范围质粒以及来自于质粒和噬菌体或病毒DNA的组合的载体。复制起点和/或显性选择标记可合适地存在于载体中。

根据本发明的载体适合转化宿主细胞。合适的克隆载体的实例是质粒载体如pBR322、各种pUC、pEMBL和Bluescript质粒，或者病毒载体。

当用于表达编码本发明蛋白质的基因时，根据本发明的载体通常包含与编码蛋白质的核酸序列可操作地连接的表达控制序列，以控制相关多核苷酸的表达。这样的表达控制序列通常包含启动子序列以及调节转录和翻译和/或增强表达水平的额外序列。合适的表达控制序列是本领域中公知的，并且包括真核、原核或病毒启动子或者聚A信号。表达控制和其他序列当然可以根据所选择的宿主细胞变化，并且可以是组成型的或可以是诱导型的。合适的启动子的实例是SV-40启动子(Science 1983，222：524-527)、金属硫蛋白启动子(Nature 1982，296：39-42)、热休克启动子(Voellmy等，P.N.A.S.USA 1985，82：4949-4953)、PRV gX启动子(Mettenleiter和Rauh，J.Virol.Methods 1990，30：55-66)、人CMV IE启动子(US 5,168,062)、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus)LTR启动子(Gorman等，P.N.A.S.USA 1982，79：6777-6781)或人延长因子1α或泛素启动子。许多其他合适的控制序列是本领域中已知的，对于技术人员来说选择用于所使用的表达系统的合适序列是常规的。

在将多核苷酸克隆到合适的载体中后，可以通过合适的方法如电穿孔、CaCl₂转染或lipofectin将构建体转移到细胞(例如，动物细胞、细菌或酵母)中。当使用杆状病毒表达系统时，包含多核苷酸的转移载体(transfer vector)可以与完整杆状病毒基因组一起转染。

这些技术是本领域中公知的，并且分子生物材料的制造商(例如，Clontech、Stratagene、Promega和/或Invitrogen)提供了合适的试剂以及如何使用它们的说明书。另外，有多种标准参考教材对此提供了进一步的信息，例如，Rodriguez，R.L.和D.T.Denhardt编辑，″Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses″，Butterworths，1988；Current protocols in Molecular Biology，编辑：F.M.Ausubel等，Wiley N.Y.，1995；Molecular Cloning：a Laboratory Manual，同上；以及DNA Cloning，第1-4卷，第2版1995，编辑：Glover和Hames，Oxford University Press)。

在另一个方面，本发明还提供了能够表达重组蛋白的细胞，其特征在于所述细胞包含根据本发明的多核苷酸，所述多核苷酸编码待表达的重组蛋白。合适地，细胞是用上述多核苷酸或载体转化的宿主细胞。根据本发明的多核苷酸或载体可以稳定整合到细胞的基因组材料中或者可以是自主复制载体的一部分。本文中的“重组”是指在天然细胞中不表达的蛋白质。

因此，所述细胞可以能够产生重组蛋白。

可以在常规营养培养基中培养宿主细胞，所述培养基可以是改良的，例如，用于适当地选择、扩增或诱导转录并因此表达重组蛋白。

宿主细胞可以是原核的或真核的。合适的原核细胞包括例如大肠杆菌(E.coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。合适的真核细胞包括例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞、HeLa、BHK、HEK-293T、CHO或COS-7细胞。

用于多种合适的细胞类型的合适的培养条件是本领域技术人员公知的。

在另一个方面，本发明提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含根据本发明的细胞。

在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的蛋白质，其用于治疗或预防疾病。

在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的蛋白质，其用于治疗或预防与对象中异常的补体调节活性相关或者其中降低补体活性有益的疾病(病症)或者其他医学并发症。

本发明蛋白质特别可用于治疗其中补体活性不合适(例如过度活跃)的疾病。

本发明蛋白质特别可用于治疗其中替代补体途径活性不合适的疾病。

本发明蛋白质特别可用于治疗其中CFH不能充分调节补体活性的疾病，例如由于血浆中低的CFH水平或者编码CFH的基因(或者其调节区域)中的突变或SNP，其降低CFH的产生或调节活性，或者由于例如随着年龄或病理状况而发生的自身表面标记的变化，或者由于CFH与CFH相关蛋白竞争表面结合。另外，当补体的调节机制由于一些其他原因而超限时，例如当其他补体调节物在一些方面不足或者当补体激活的触发物(其包括外来物和宿主细胞损伤或死亡的产物二者)丰富时，本发明蛋白质可能是有用的。这样的疾病是本领域技术人员公知的。如本领域中已知的，通过具有对于因子I介导的C3b切割的辅因子活性以及对抗替代途径C3转化酶C3b.Bb的衰减加速活性二者，CFH调节流体相中以及自身细胞和表面上的补体活化。

合适地，疾病是以下一种或更多种：

-阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria，PNH)；

-非典型溶血尿毒综合征(Atypical Haemolytic Uremic Syndrome，aHUS)；

-致密沉积物病(Dense Deposit Disease，DDD)；

-年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)；

-系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)；

-脓毒症(Sepsis)；和

-阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)。

这组疾病中特别感兴趣是PNH、aHUS、DDD和AMD，其中考虑本发明蛋白质特别有用。

合适地，上述疾病与CFH中的突变或影响CFH的突变相关。但是，上述疾病中的一些(例如，PNH)并不涉及CFH中的突变或SNP，并且对于涉及CFH中的突变或SNP的那些疾病，并不是所有出现的上述疾病均是由这样的CFH中的突变或SNP造成(完全地或部分地)的。本发明蛋白质明确地适用于直接涉及CFH的情况。但是，即使是在不存在CFH中的突变或SNP的情况下，本发明蛋白质依然可用于治疗这样的病症。

本发明蛋白质增强CFH的活性，因此，可用于在CFH活性不足导致病症的病理状况的病症中增强CFH活性。

鉴于其中对疾病进行特性分析(profiled)并且根据所述特性分析选择合适的治疗的分层/个性化医药的出现，本发明蛋白质可在其中疾病(例如，上述疾病中的一种)涉及异常CFH水平或活性或者其中替代补体途径过度活跃的情况下施用。这允许将利用本发明的治疗集中于可能发生积极效果的病症。

根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明蛋白质或者编码本发明蛋白质的核酸的药物制剂。

药物组合物可合适地包含可药用载体。

本文中使用的“可药用载体”包括任何以及全部在生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，载体适合用于胃肠外施用。载体可适用于静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用。在另一个实施方案中，载体适用于经口施用。可药用载体包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。使用这样的介质和试剂用于药物活性物质是本领域中公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明融合蛋白不相容，否则考虑其在本发明药物组合物中的使用。若期望，组合物还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。补充的活性化合物也可以并入到所述组合物中。

通常来说，这样的药物组合物的制剂需要将活性剂与缓冲剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA)、谷胱甘肽和其他稳定剂和/或赋形剂组合。中性缓冲盐水或者与同种血清白蛋白混合的盐水是用于蛋白质治疗剂的示例性的合适稀释剂。

在一个优选的实施方案中，使用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂将组合物配制成冷冻干燥物。

组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、持续释放制剂等形式。口服制剂可以包含标准载体，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

多个参考文献可用于帮助选择可药用载体或赋形剂。参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences和US Pharmacopeia：National Formulary，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1984)；Hardman等.(2001)Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，andWilkins，New York，NY；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：ParenteralMedications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical DosageForms：Tablets，Marcel Dekker，New York，NY；Lieberman等(编辑)(1990)PharmaceuticalDosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner，Wang，E.，Int.J.Pharm.185：129-188(1999)和Wang W.Int.J.Pharm.203：1-60(2000)，以及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，New York，NY。

这样的组合物可以包含治疗有效量的本发明蛋白质，优选地为纯化形式，以及适量的载体以提供用于适合向患者施用的形式。制剂应适合施用形式。

在一些实施方案中，本发明蛋白质以与CFH的复合物的形式提供。例如，当待治疗对象产生功能性CFH的能力降低，并因此在对象中可能存在不足的CFH时，这样的复合物对于蛋白质结合和活化可能特别有价值。

在一个优选实施方案中，根据常规程序将组合物配制成适于向人静脉内施用的药物组合物。通常来说，用于静脉内施用的组合物是无菌等张水性缓冲剂中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常来说，成分单独提供或者在单位剂型中混合在一起提供，例如作为密封容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩物，所述容器例如为标明活性剂的量的安瓿或药囊(sachette)。当组合物通过输注施用时，可以用包含无菌药用级水或盐水的输液瓶发放。当组合物通过注射施用时，可以提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿以使得可在施用前将成分混合。

本发明组合物可配制成中性或盐形式。可药用盐包括利用游离羧基形成的那些，例如来自于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；利用游离胺基形成的那些，例如来自于异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些；以及来自于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙和氢氧化feme等的那些。

多种递送系统是已知的，并且可用于施用本发明蛋白质，例如封装在脂质体、微颗粒和微囊中；使用能够表达本发明蛋白质的重组细胞，使用受体介导的胞吞(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)；构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的治疗性核酸等。

在另一个实施方案中，本发明药物组合物可以在囊泡(特别是脂质体)中递送(Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等，1989，In：Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler，编辑，Liss，New York，第353-365页；Lopez-Berestein，ibid.，第317-327页；一般地参见同上)。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以通过受控释放系统递送。

在本发明药物组合物为编码蛋白质的核酸的一个特定实施方案中，可以通过将核酸构建成合适的核酸表达载体的一部分并且将其施用以使得其进入细胞内来体内施用核酸以促进其所编码蛋白的表达，例如通过使用逆转录病毒载体(美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微颗粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或通过用脂质、细胞表面受体或转染剂涂覆，或通过与已知进入细胞核的同源框样肽连接等来施用(例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-868)。或者，可以将核酸引入细胞内并且在宿主细胞DNA中同源重组并入以用于表达。

对治疗特定疾病或病症有效的本发明药物组合物的量将取决于疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。可以通过试验确定合适的剂量。根据合适的行业标准，还可以添加防腐剂，例如苯甲醇。当然，施用量和频率将取决于诸如被治疗的适应证(indication)的性质和严重程度、期望的响应、患者的状况等因素。此外，可任选地使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中待使用的精确剂量也将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且根据从业者的判断和每位患者的情况来确定。但是，用于静脉内施用的合适剂量范围通常为每千克体重约1-500微克活性化合物。有效剂量可以由来自于体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推测。

本发明还提供了药包(pharmaceutical pack)或药盒(kit)，其包含一个或更多个容器，所述容器填充有本发明药物组合物的一种或更多种成分。任选地，与这样的容器相关联的可以是管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的公告(notice)，所述公告反映所述机构批准用于人施用的制造、使用或销售。

本发明提供了通过向对象施用有效量的本发明药物组合物来治疗或预防对象中的疾病的方法。特别地，本发明提供了对与对象中异常补体活性相关的疾病的治疗和预防。

对象优选地为动物，优选哺乳动物，并且最优选人。

合适地，所述疾病是以下的一种或更多种：

-阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；

-非典型溶血尿毒综合征(aHUS)；

-致密沉积物病(DDD)；

-年龄相关性黄斑变性(AMD)；

-系统性红斑狼疮(SLE)；

-脓毒症；和

-阿尔茨海默病。

这组疾病中特别感兴趣是PNH、aHUS、DDD和AMD，其中考虑本发明蛋白质特别有用。

本发明考虑以包含本发明蛋白质和可药用稀释剂或载体的药物组合物的形式向有此需要的对象(例如，哺乳动物，特别是人)施用本发明蛋白质。本发明还提供了利用这样的组合物治疗人疾病的方法。

引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。化合物可以通过任何方便的途径施用，例如，通过输注、通过推注、通过经上皮或黏膜内衬(例如，口腔、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。

施用可以是全身性的或局部的。可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及具有雾化剂的制剂。

通常来说，本发明方法将包括施用包含药学上有效量的本发明蛋白质的药物组合物或者包含能够在体内表达药学上有效量的本发明蛋白质的核酸的组合物。所使用的药学上有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素改变。

药学上有效量的本发明蛋白质可以是约1μg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约10μg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约10mg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约100mg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约10mg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约100mg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重、或约100μg蛋白质/1kg对象体重至约25mg蛋白质/1kg对象体重、或约1mg蛋白质/1kg对象体重至约25mg蛋白质/1kg对象体重、或约5mg蛋白质/1kg对象体重至约25mg蛋白质/1kg对象体重、或约10mg蛋白质/1kg对象体重至约25mg蛋白质/1kg对象体重、或约15mg蛋白质/1kg对象体重至约25mg蛋白质/1kg对象体重、或约100μg蛋白质/1kg对象体重至约10mg蛋白质/1kg对象体重、或约1mg蛋白质/1kg对象体重至约10mg蛋白质/1kg对象体重、或约2.5mg蛋白质/1kg对象体重至约10mg蛋白质/1kg对象体重、或约5mg蛋白质/1kg对象体重至约10mg蛋白质/1kg对象体重、或约7.5mg蛋白质/1kg对象体重至约10mg蛋白质/1kg对象体重。

在一些实施方案中，药学上有效量的本发明蛋白质可以是0.5mg蛋白质/1kg对象体重、1mg蛋白质/1kg对象体重、2mg蛋白质/1kg对象体重、3mg蛋白质/1kg对象体重、4mg蛋白质/1kg对象体重、5mg蛋白质/1kg对象体重、6mg蛋白质/1kg对象体重、7mg蛋白质/1kg对象体重、8mg蛋白质/1kg对象体重、9mg蛋白质/1kg对象体重、或10mg蛋白质/1kg对象体重。

单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗哺乳动物对象的物理离散单位，每个单位包含与必要的药用载体联合的计算为产生期望治疗效果的预定量的本发明蛋白质。本发明蛋白质的单位剂型可以是约1mg至约1000mg、约25mg至约1000mg、约50mg至约1000mg、约100mg至约1000mg、约250mg至约1000mg、约500mg至约1000mg、约100mg至约500mg、约200mg至约500mg、约300至约500mg、或约400mg至约500mg。本发明蛋白质的单位剂型可以是约100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg或700mg。

本发明组合物可以包含组合物总重的以下水平的本发明蛋白质：约0.1wt％至约20wt％、约0.1wt％至约18wt％、约0.1wt％至约16wt％、约0.1wt％至约14wt％、约0.1wt％至约12wt％、约0.1wt％至约10wt％、约0.1wt％至约8wt％、约0.1wt％至约6wt％、约0.1wt％至约4wt％、约0.1wt％至约2wt％、约0.1wt％至约1wt％、约0.1wt％至约0.9wt％、约0.1wt％至约0.8wt％、约0.1，wt％至约0.7wt％、约0.1wt％至约0.6wt％、约0.1wt％至约0.5wt％、约0.1wt％至约0.4wt％、约0.1wt％至约0.3wt％、或约0.1wt％至约0.2wt％。

本发明药物组合物可以包含组合物总重的以下水平的一种或更多种本发明蛋白质：约1wt％至约20wt％、约1wt％至约18wt％、约1wt％至约16wt％、约1wt％至约14wt％、约1wt％至约12wt％、约1wt％至约10wt％、约1wt％至约9wt％、约1wt％至约8wt％、约1wt％至约7wt％、约1wt％至约6wt％、约1wt％至约5wt％、约1wt％至约4wt％、约1wt％至约3wt％、或约1wt％至约2wt％。本发明药物组合物可包含基于组合物总重以下水平的一种或更多种本发明蛋白质：约0.1wt％、约0.2wt％、约0.3wt％、约0.4wt％、约0.5wt％、约0.6wt％、约0.7wt％、约0.8wt％、约0.9wt％、约1wt％、约2wt％、约3wt％、约4、约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、或约9wt％。

可以调节给药方案以提供最佳治疗响应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用多个分剂量，或者剂量可按比例减小或提高，如通过治疗形势的紧迫性指示的。尤其有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物，以用于容易施用以及剂量均匀性。可以配制本发明组合物并通过静脉内、肌内或皮下注射施用。在一些实施方案中，本发明组合物可以皮下或肌内施用。

在一些实施方案中，给药方案可需要施用重复剂量，例如，施用周剂量。治疗方案可需要在一段时间(例如，四周)为周剂量，然后低频率“维持”给药方案(例如，每个月一次或每两个月一次)。可以调节给药方案以实现期望的治疗结果。

合适地，方法涉及将本发明蛋白质靶向至对象的特定部位或组织。靶向方法是本领域公知的，并通常包括提供包含靶向部分或以其他方式连接靶向部分的融合蛋白。典型的靶向部分是受体的抗体或配体。例如，PspCN与胶原蛋白IV之抗体片段的融合将使PspCN靶向肾小球，这可用于治疗aHUS。

在本发明的另一个方面，提供了固定在表面上的根据本发明的蛋白质。所述表面可以是任何合适的表面，并且包括例如珠子、容器、医学装置、微胶囊或生物组织的表面。

通过将本发明蛋白质连接在表面上，允许表面与CFH结合。这可用于许多不同应用。例如，结合的CFH可用于保护表面C3b扩增的结果。或者，所述表面可用于选择性地结合CFH以用于诊断目的，从混合物中提取或纯化CFH，或者结合CFH以鉴定与捕获的CFH相互作用并因此与其结合的分子。

合适地，根据本发明的蛋白质可共价连接在表面上。本领域技术人员可以使用许多合适的技术来实现共价连接。例如，向其N末端或C末端添加Cys残基可提供在与血液或血清接触的表面上连接的便捷方法。以下描述了本发明的多种Cys修饰的蛋白质，其保持了CFH结合和活化特性。

或者，蛋白质可以通过非共价方式连接，例如，被动吸附、蛋白质/蛋白质相互作用、离子相互作用等。例如，可以用生物素/亲和素涂覆表面，并且本发明蛋白质可以是与相应生物素/亲和素分子的融合物以使其能够与表面结合。

用于修饰医学装置的表面以有助于蛋白质涂覆的已知方法包括物理修饰、化学修饰、光化学修饰和等离子体处理，参见例如Vasita，Rajesh；Shanmugam i，K；Katt，DS(2008).″Improved biomaterials for tissue engineering applications：surfacemodification 0f polymers″.Current Topics in Medicinal Chemistry 8(4)：341-353，以及Morra，M.；Cassinelli，C.(2006).″Biomaterials surface characterization andmodification″.The International Journal of Artificial Organs 29(9)：824-833。

在本发明的另一个方面，提供了医学装置，其中所述医学装置的表面至少部分地涂覆有根据本发明的蛋白质。

合适地，装置基本上所有的外表面(即，与身体组织和/或体液接触的那些)均涂覆有所述蛋白质。

所述医学装置可以是基本上任何暴露于对象的身体组织的医学装置，例如用于干细胞递送的微胶囊、支架、支架移植物、矫形外科植入物、导管、导丝、心脏瓣膜修复装置和体外循环装置。

本发明特别适合植入式医学装置，例如微胶囊、支架、血管移植物、矫形外科植入物、起搏器等，以及体外循环装置，例如用于血液透析、血浆去除术、体外膜氧化及相关操作的装置。

蛋白质吸附在暴露于血液的植入式医学装置表面以及随之的补体活化是一个常见问题，并且驱动了炎性反应。通过用根据本发明的蛋白质涂覆这样的医学装置表面的至少一部分，预期可以降低与这样的表面相关联的补体活性/活化。根据本发明的固定化蛋白质可以从血液/血清募集因子H并且降低表面上或与表面相关联的补体活化。

在另一个实施方案中，可以用与CFH结合的本发明蛋白质的复合材料涂覆所述装置。

在本发明的一个相关方面，提供了处理医学装置的方法，所述方法包括：

-提供医学装置；

-提供根据本发明的蛋白质；以及

-使所述蛋白质与所述医学装置表面的至少一部分结合。

当然，根据本发明的蛋白质与医学装置的结合可以通过任何合适的技术进行，包括上述的那些。

在本发明的另一个方面，提供了检测样品中CFH的存在或量的方法，所述方法包括：

-提供样品；

-提供根据本发明的蛋白质；

-使所述样品与本发明的蛋白质接触；以及

-检测所述蛋白质与所述样品中存在的CFH的结合。

合适地，根据本发明的蛋白质可以固定在表面并且用于在类似于常规“ELISA”的方法中吸附CFH。PspCN的高亲和力和选择性使得其成为用于量化CFH水平的有吸引力的试剂。以下描述了根据本发明的蛋白质的实例，其用于量化正常人血清中CFH水平。

当与PspCN的修饰(例如共价修饰)结合以有助于标记/检测(可通过引入的半胱氨酸残基或其他方式连接荧光标记，或者通过在基因表达和蛋白质产生水平与酶融合)时，这使得经标记的PspCN成为用于量化CFH水平的理想选择。

方法可合适地为诊断方法，并因此可涉及检测来自对象的生物样品中CFH的存在，所述生物样品为例如血样或血液级分，例如血浆。例如，可允许CFH和PspCN-辣根过氧化物酶融合蛋白形成复合物，所述复合物随后被抗体捕获并且量化。或者，荧光标记的PspCN可用于测定，其中通过热泳(thermophoresis)或另外的合适方式监测与CFH的复合物的形成。

在本发明的另一个方面，提供了检测样品中PspCN的存在或量的方法，所述方法包括：

-提供样品；

-提供CFH；

-使样品与CFH接触；以及

-检测PspCN与所述样品中存在的所述CFH的结合。

所述方法可以是检测表面上PspCN的存在的方法。表面可以是细菌的膜。因此，所述方法可以是检测细菌(例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或肺炎链球菌)的存在的方法。

在本发明的另一个方面，提供了从样品中纯化或分离CFH的方法，所述方法包括：

-提供固定在表面上的根据本发明的蛋白质；

-提供样品；

-使所述样品从所述表面上经过；以及

-回收与所述表面结合的CFH；和/或

-回收缺少或耗尽CFH的样品。

所述表面可以是例如容器、导管、基体(例如，多孔基体或纤维基体)、珠子、凝胶或者色谱中使用之任何填充材料的表面。

在本发明的另一个方面，提供了从样品中纯化或分离PspC、PspCN或包含PspCN的融合蛋白的方法，所述方法包括：

-提供固定在表面上的CFH或截短的CFH构建体；

-提供样品；

-使所述样品从所述表面上经过；

-回收与所述表面结合的PspC、PspCN或包含PspCN的融合蛋白；和/或

-回收缺少或耗尽PspC的样品。

所述表面可以是例如容器、导管、基体(例如，多孔基体或纤维基体)、珠子、凝胶或者色谱中使用之任何填充材料的表面。

在本发明的另一个方面，提供了用根据本发明的蛋白质涂覆植入式微胶囊的方法，其包括以下步骤：

-提供合适的微胶囊；以及

-将根据本发明的蛋白质固定在所述微胶囊上。

因此，如此涂覆的微胶囊具有降低的补体活化和随后排斥的可能性。这样的微胶囊的实例包括但不限于多种海藻类微胶囊，其被设计成用于封装细胞(例如，胰岛细胞)，用于随后向具有I型糖尿病的患者中植入。

所述方法还可包括提供与涂覆微胶囊的蛋白质结合的CFH或其功能性变体的步骤。

以下定义可用于理解本发明的适当的范围：

本文中使用的“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分，并且涉及天然存在的或合成的分子。本文中所述的“氨基酸序列”以及类似术语(例如“多肽”或“蛋白质”)并未意在将氨基酸序列限制为与所述的蛋白质分子相关的完全天然氨基酸序列。

本文中使用的“细胞培养物”是指细胞增殖物(proliferating mass)，其可以是未分化状态或分化状态。

本文中使用的“融合蛋白”是指包含来自两种不同蛋白质中每一种的氨基酸序列的蛋白质，其可以通过重组基因的表达形成，在所述重组基因中，两个编码序列已被连接在一起以使得其阅读框协调。这种类型的杂交基因可以在体外构建以便用更容易测定的蛋白质标记特定基因的产物(例如，在大肠杆菌中与lacZ融合以获得具有β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白的基因)。或者，蛋白质可与信号肽连接以允许其由细胞分泌。或者，蛋白质可与肽连接以有助于纯化(例如，多组氨酸标签)。或者，蛋白质可与肽连接以改善在宿主细胞中的表达(例如，与SUMO蛋白融合)。

术语“分离的”意指这样的生物学组分(例如，核酸分子或蛋白质)，其已经从所述组分天然存在的有机体细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)中基本上分离或纯化。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸、蛋白质和肽。

本文中使用的“核酸”或“核酸序列”是指核苷酸的聚合物，其中一个核苷酸糖的3′位通过磷酸二酯桥连接在下一个的5′位。在线性核酸链中，一端通常具有游离的5′磷酸基，另一端具有游离的3′羟基。核酸序列可以在本文中用于指寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及基因组的或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链，并且代表正义链或反义链。

结合本发明的特定各方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开的所有特征和/或所公开的任何方法或过程的所有步骤可以任意组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤互相排斥的组合。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开的特征中任何新的一个或者任何新的组合，或者所公开的任何方法或过程的步骤中的任何新的一个或者任何新的组合。

读者的注意力集中于本申请提到的并且对公众公开的所有论文和文献，并且所有这些论文和文献的内容均通过引用并入本文。

现在将参照附图以非限制性实例的方式描述本发明的一些实施方案。

附图说明

图1.本研究中研究的蛋白质和复合物。上：C3转化酶C3b.Bb(通过C3b：CFB前转化酶复合物的CFD催化的蛋白酶解形成)将C3切割成C3b加C3a；C3b通过其硫酯结构域(thioester domain，TED)连接于表面。其可以在需要CFH或其他(膜缔和)辅因子的反应中被补体因子I(complement factor I，CFI)降解为iC3b加C3f，然后降解为C3c加C3d(g)。C3d(g)降解为C3d，其相当于C3b的TED。中：从血浆中纯化人CFH(以椭圆示出20个CCP)，同时从巴斯德毕赤酵母中产生重组(r)CFH(和rCFH(D1119G))，如示出的多种rCFH片段。在最终纯化之前用Endo H_f处理所有巴斯德毕赤酵母产生的糖蛋白。表示出了CFH上对于一些配体的结合位点(虚线意味着其为堵塞的，如正文中讨论的)。下：重组(大肠杆菌产生的)sPspCN和sPspCNR1分别是对应于PspC的第37-140位和第37-292位残基之多肽的N末端六His标记的SUMO融合体；将经切割的形式称为PspCN(R1和R2是重复1和重复2；CBD是胆碱结合结构域)。

图2.PspCN与CFH形成稳定复合物。所示浓度的(A)血浆纯化的CFH、(B)重组CFH(D1119G)以及(C)重组CFH(wt)均与固定化sPspCN(NTA/Ni²⁺传感器芯片上的144RU)结合以形成稳定的复合物，所述复合物经过约25分钟没有明显解离。在各测量之间将传感器芯片剥离并且重新装载。计算的K_D值示于表1中。

图3.PspCN主要与CC P8和CCP 9结合。如图2制备具有sPspCN的传感器芯片。(A)50nM血浆纯化的CFH、CFH 8-9、CFH 8-15、CFH 10-15(接近基线)和CFH 19-20(接近基线)获得的结合曲线的比较。(B)(A)中传感器图(sensorgram)的放大段，以揭示对于CFH 19-20和CFH 10-15获得的非常低的响应。(C)使系列浓度的CFH 8-9在固定化PspCN上流动以允许评估(通过平衡法)K_D值(参见表1)。

图4.通过¹H，⁵N HSQC(NMR)谱的比较指示了CFH 8-9与PspCN的复合物中大的接触表面。(A)游离PspCN表现出的谱指示具有小化学位移分散的未折叠蛋白质。(B)向A中的PspCN样品中添加CFH 8-9造成PspCN在与CFH 8-9结合时谱的急剧变化。该复合物谱表现出良好分散的尖峰，指示紧凑折叠的蛋白质。游离CFH 8-9(C)和PspCN结合的CFH 8-9(D)谱之间具有明显的多个化学位移扰动。两个CFH 8-9谱表现出良好分散的尖峰，指示紧凑折叠的蛋白质，但是，谱之间大的变化指示许多CFH 8-9氨基酸残基参与同PspCN的相互作用。

图5.PspCN使CFH的新构象稳定。(A)利用交联剂BS3在CFH和CFH：PspCN上进行的SDS-PAGE的结果，指示进行了质谱分析的带(s1-s5)。MWM＝如所指示的分子量标记(kD)；泳道1和2：0.5∶1的BS3∶CFH产生两条带(s1，s2)，对应于交联单体CFH以及交联CFH二聚体/寡聚体的梯(ladder)；泳道3和4：4∶1的BS3∶CFH，表现为消耗单体CFH以及提高的推测的CFH二聚体(s3)和低聚物的表示。泳道5和6：4∶1比例的BS3∶(CFH+PspCN)产生与PspC复合的单体CFH的单带(s4)，以及对应于与不确定数目的PspCN分子复合的CFH的二聚体(s5)、三聚体等的更高级的带。(B)s1-s5中成簇交联的图。代表CFH中交联的弧线是颜色编码(根据色调)以指示(i)在与PspCN结合后变得更加稀少或者不再可检测的CFH中交联；(ii)在二聚化和/或PspCN结合后变得更加常见或刚刚可检测的交联；(iii)在s1-s5中未表现出变化的交联；(iv)二聚体独特的交联；(v)CFH：PspCN复合物独特的交联。

图6：单独CFH和CFH：PspcN复合物与C3b和C3d之结合的比较。通过SPR证明，(A)血浆纯化的CFH具有比血浆纯化的CFH：PspCN复合物更低的对于固定化C3b的亲和力。(B)血浆纯化的CFH具有非常低的对于C3d(其相当于C3b的TED)的亲和力，但是在与PspCN复合时，其与C3d良好结合。计算的亲和常数总结在表2中。

图7：PspCN提高CFH的衰减加速活性。2.5nM CFH∶PspCN是比10nM CFH更好的C3b.Bb的衰减加速剂，所述C3b.Bb通过使C3、CFB和CFD在加载有少量C3b的CM5芯片上流动形成(参见正文)。

图8：CFH(D1119G)的特性。(A)SDS-PAGE示出了在还原性和非还原性条件下PspCN、rCFH(D1119G)以及血浆纯化的CFH(Complement Technologies)和rCFH的纯度。(B)在C3b.Bb的加速衰减上，rCFH(D1119G)与CFH同等地一样好；PspCN在加强CFH的衰减加速活性上大幅超过rCFH(D1119G)。(C)CFH和rCFH(D1119G)(以及两者的混合物)均不保护(不具有唾液酸的)兔红细胞；PspCN诱导对于CFH和1∶1的CFH∶rCFH(D1119G)混合物的一些防护能力。(D)与CFH相比，rCFH(D1119G)无法很好地保护绵羊红细胞(其为唾液酸化的，因此是人红细胞的替代品)免受稀释的人血浆(x坐标)的溶血(由y坐标上与释放的血红蛋白成比例的吸光度读数指示)。PspCN的添加改善了CFH(D1119G)的保护功率。1μM∶1μM的CFH和rCFH(D1119G)的混合物不提供全面保护，除非添加PspCN。

图9A-9B示出了展示使用本发明蛋白质营救阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的图。用AET处理红细胞以制备“PNH样”细胞。PNH样细胞以与PNH红细胞类似的方式对酸化血清裂解敏感。图9A：添加提高浓度的因子H抑制PNH样红细胞的裂解。图9B：添加提高浓度的PspCN以28nM的IC₅₀抑制PNH样红细胞的裂解。PspCN活化已经存在于血清中的CFH并且有效抑制裂解。

图10示出了传感器图，其表示片段PspC(52-140)(A)，PspC(62-140)(B)，PspC(72-140)(C)对于PspC(37-130)(D)，PspC(37-120)(E)和PspC(37-110)(F)的结合亲和力。

图11示出了传感器图，其指示，与野生型PspCN的情况一样，Cys-PspCN(A)和PspCN-Cys(B)二者均能够几乎不可逆地与CFH结合，未表现出可检测的脱离率(off rate)。

图12示出了凝胶，其指示，如通过SDS-PAGE下迁移率转移看到的，在温和条件下甲氧基-PEG-马来酰亚胺与Cys-PspCN高效低偶联。

图13A-13B示出了使用基于PspCN的夹心ELISA来量化所使用的PBS中的纯化CFH以制备标准曲线(A)，以及量化稀释的正常人血清中存在的CFH(B)。

图14示出了质粒pE-SUMO Kan的示意图，其用于表达根据本发明的SUMO融合蛋白(http：//www.lifesensors.com)。

图15表明半胱氨酸标记的PspCN在通过其巯基偶联时保持其CFH结合能力。

图16表明半胱氨酸标记的PspCN表现出与不具有半胱氨酸标记的PspCN类似的CFH衰减加速活性。

图17表明可以通过使用固定化半胱氨酸标记的PspCN在一步法中产生高度纯化的CFH。

图18表明，固定在马来酰亚胺活化的聚苯乙烯上的半胱氨酸标记的PspCN在暴露于正常人血清后以依赖于偶联密度的程度保护表面远离补体。

图19示出了在ELISA型测定中使用PspCN检测抗FH自身抗体以将FH偶联至聚苯乙烯板。使用来自先前对于抗FH自身抗体表现出阳性的患者的纯化IgG以及来自正常人血清的纯化IgG。该图清楚地显示，以依赖于测定中所使用的纯化IgG浓度的水平，在阳性样品中检测出了比对照显著更多的信号。

图20示出了SPR传感器图，其表示与FH结合的来自菌株TIGR4的固定化PspCN。A：固定化TIGR4第37-179位残基的传感器图。B：固定化TIGR4第68-148位残基的传感器图。在每一种情况下，传感器图指示了与D39菌株类似的不可逆方式，对TIGR4第37-179位和第68-148位残基分别计算了1×10^-16M和8×10^-16M的K_D，并且指示了类似的结合机制。

图21示出了来自TIGR4第37-179位残基或第68-148位残基的与PspCN的复合物中FH的衰减加速活性的提高。还很清楚的是，同D39一样，其不具有固有的衰减延迟活性。

图22传感器图，其表明来自肺炎链球菌的PspCN(CbpA)能够通过提高FH：PspCN复合物对于C3b和C3d的亲和力来活化CFH。

A：示出了与偶联的C3b结合的FH和FH：TIGR4(第37-179位残基)的传感器图；

B：示出了与偶联的C3d结合的FH和FH：TIGR4(第37-179位残基)的传感器图；

C：示出了与偶联的C3b结合的FH和FH：TIGR4(第68-148位残基)的传感器图；以及

D：示出了与偶联的C3d结合的FH和FH：TIGR4(第68-148位残基)的传感器图。明显地是，如来自肺炎链球菌菌株D39的PspCN的情况一样，未复合FH与C3d的结合是可忽略的，而与PspCN复合的FH造成C3b亲和力的显著提高以及C3d亲和力的大幅提高。这些相互作用的K_D列在表3中。

具体实施方式

本发明人发现，本发明蛋白质能够在生物学时间标度(数小时至数天)上以有效地不可逆的方式连接在替代补体活化途径的关键调节物人补体因子H(CFH)上。此外，PspCN结合的CFH对于其天然配体C3b具有至少3倍高的亲和力，并且对于C3d(C3b的重要降解产物)具有非常远远更高的亲和力。

CFH与PspCN之间的亲和力非常强，使得PspCN有效地永久性与因子H偶联。推断这解释了肺炎链球菌使用PspC来保护自身免受补体介导的破坏(参见下文)。PspC活化CFH的能力使得其成为甚至更有效的自我保护方式。

因此，根据本发明的PspCN及其他蛋白质代表了以高生物活性形式捕获CFH的简练(elegant)的方式。如果PspCN是固定的，其可用于从复杂的混合物(例如血清)中分离CFH。

PspCN与CFH结合以及还增强CFH对其配体的亲和力并因此增强其调节活性的能力还表明其作为主要病因为CFH活性不足的病症的治疗剂的潜力。这样的病症包括非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、致密沉积物病(DDD)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。

可以对该顺序进行改进以有利于标记/检测标签的连接或者用于共价表面连接。

实施例1-在被肺炎链球菌蛋白PspC不可逆地捕获后，人因子H的“活性”构象被稳 定化

引言

补体系统是给予脊椎动物中的一组40-50种血液蛋白的名称，它们之间以及它们与其他免疫组分之间协作以识别、标记和消除潜在的危险材料，例如外来细胞以及细胞凋亡和氧化损伤的产物⁽¹⁾。细菌用来逃避补体系统的策略是新抗体和疫苗的潜在靶标，而补体系统的治疗性调节正在范围广泛的临床背景中积极探索⁽²⁾。

激活补体系统的所有途径的中心是正反馈回路的不常见实例，其中调理素(opsonin)和促炎蛋白分子C3b通过C3b.Bb复合物的形成而扩增，所述复合物酶促切割C3分子以形成过敏毒素(anaphylatoxin)C3a加额外的C3b(图1)⁽³⁾。初生的C3b具有通过含硫酯的结构域(thioester-containing domain，TED)与任何局部表面共价结合的瞬时能力⁽⁴⁾。因此，宿主(或“自体”)与外来物(“非自体”)表面具有被C3b分子覆盖的潜在风险。

补体因子H^(5-8)由20个CCP构成^(9，10)，是该关键事件的重要可溶性调节物，因为其与补体因子B(CFB，Bb的前体)竞争与C3b的结合，加速了C3b.Bb复合物的不可逆解离(也称为衰减)，并且是补体因子I(CFI)催化的C3b切割以形成iC3b的辅因子，所述iC3b不能与CFB结合，但是持续充当调理素(类似于另外的连续表面结合蛋白质降解产物C3dg和C3d)。最终切割产物C3d(相当于C3b的TED)(图1)长期保持与表面化学连接。通过将2型补体受体连接在B细胞上，iC3b或C3d(g)的存在降低了产生抗体的阈值⁽¹¹⁾。因此，CFH对于补体系统辨别自身和非自身是关键的，因为其阻止了流体相中和自身表面上的C3b扩增，并且促进iC3b/C3d(g)产生，而且允许调理作用、释放过敏毒素以及在别处进行细胞裂解。

CFH对于调节C3b扩增的重要性由CFH基因中的等位变异与不适当调节的补体系统相关的多种疾病的风险之间的联系来强调⁽¹²⁾。CFH的常见的(每三个等位基因中一个)“单体型2”是估计50％的年龄相关性黄斑变性风险的原因⁽¹³⁾；其包括CCP 7中第402位用组氨酸替换酪氨酸，有助于CFH识别自身表面特异性分子标记(例如，GAG结构域和唾液酸簇)^(14-17)。与潜在的致死性肾病非典型溶血尿毒综合征(aHUS)相关的突变的发生遍及CFH，但是集中于同样有助于表面识别的CCP 19和CCP 20中⁽¹⁸⁾，但是还包含C3b及其降解产物的结合位点⁽¹⁵⁾。CFH的N末端四个CCP结合C3b(但是不结合iC3b或C3d)对于辅因子和衰竭加速活性是必要的⁽¹⁹⁾，并且具有与年龄相关性黄斑变性(AMD)、aHUS和膜增生性肾小球肾炎II型相关的突变和SNP⁽²⁰⁾。旨在并入CCP 1-4⁽²¹⁾或CCP 1-4和CCP 19-20二者^(22，23)的潜在治疗性蛋白质处于不同的开发阶段。

作为补体系统的主要可溶性调节物，CFH不可避免地易受微生物攻击的影响。不出意外的是，许多细菌表面蛋白与血浆CFH结合^(24，25)。例如，来自鼻咽共生细菌肺炎链球菌的荚膜下蛋白PspC(也称为SpsA、CbpA和Hic)在衣壳表面捕获来自于宿主的CFH^(26-28)。肺炎链球菌侵入下呼吸道或血液可造成肺炎、脑膜炎和败血症。越来越多的且令人担忧的认识是疫苗抗性菌株可定殖于鼻咽道，代替了荚膜血清型存在于疫苗中的菌株[Weinberger DM，Malley R，Lipsitch M.Serotype replacement in disease after pneumococcalvaccination.Lancet.2011Dec 3；378(9807)：1962-73.doi：10.1016/S0140-6736(10)62225-8]。因此非常感兴趣的是，血清型侵袭力似乎主要由结合CFH的能力决定。PspC产生水平的差异或等位变异同样地是CFH捕获中这些变化的原因⁽²⁹⁾。

CFH的一个有趣的方面是其调节特性根据C3b背景而调节。在流体相中，CFH限制C3b产生达到免疫监视所需水平(通过初生C3b与任何局部表面共价结合的瞬时能力)，但是重要的是阻止将耗尽血浆C3和因子B的失控活化(runaway activation)^(3，30)。在健康宿主组织的表面，CFH与膜集合调节物协作⁽³¹⁾以几乎完全地关闭C3b扩增。另一方面，在衰老的或受损的细胞和细胞碎片的情况下，CFH促进中等水平的C3b沉积和iC3b形成，导致非炎性清除^(32-34)。最后，CFH并不抑制细菌细胞上的C3b扩增(缺少CFH结合蛋白或其他对抗补体的措施)，从而允许补体系统对于微生物侵入物的全面猛攻，涉及非常迅速的调理作用、释放促炎性C3a和C5a，以及细胞裂解。

为什么CFH活性根据C3b(以及C3b.Bb)的背景变化？这似乎不太可能仅仅是CFH浓度在需要保护的那些表面选择性富集的问题，因为这样的机制将留下非常易被微生物利用的CFH。本发明人打算测试宿主与病原体之间的进化军备竞赛是否可以阐明知之甚少的CFH结构与其作为C3b扩增的自身表面特异性调节物的功能之间的关系。根据一种假设，如果大部分或全部的其余13或14个CCP作用是使CFH对细菌蛋白的成功攻击不太敏感，则在CFH分子中的20个CCP中仅6或7个(朝向其N末端或C末端定位)与配体直接接合(engage)⁽¹⁵⁾的事实容易解释。因此，根据该理念，仅细菌表面(或宿主表面)的富集对于有效的细菌(或宿主细胞)保护是不够的。相反，CFH的完全调节潜力可仅在通过与特异性自身表面分子特征或者其在细菌表面的模拟物相互作用引起的构象重排后揭示。为了测试这种假设，本发明人探究了CFH与PspC之间的相互作用。这揭示，PspC与CFH非常紧密地结合并且使CCP重排稳定，所述重排暴露出位于其C末端附近的先前堵塞的C3b/C3d结合位点。本发明人提出，其他细菌蛋白以及事实上宿主表面分子标记也可以用于使CFH的这种“活化”形式稳定。

材料和方法

蛋白质的制备

人补体蛋白(从混合血浆中纯化)获自Complement Technologies Inc(Tyler，Texas)，根据供应商的说明储存，邻近稀释前解冻并且不经进一步纯化而直接使用。重组CFH模块-截短突变体的文库已经如先前的描述从巴斯德毕赤酵母制备并表征⁽³⁵⁾，并且储存在-80℃。

如先前的描述在生长在发酵罐中的重组巴斯德毕赤酵母中产生具有野生型序列(CFH(wt))的全长重组人CFH，并且纯化为酶促去糖基化形式⁽³⁵⁾。通过Geneart-LifeTech合成编码CFH的D1119G突变体(CFH(D1119G))的表达优化DNA，并且亚克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαB中。随后如先前对于CFH(wt)描述的进行CFH(D1119G)的产生和纯化。

代表了PspC的第37-140位残基(D39)的基因对于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达是最佳的(参见下文中的SEQ ID NO 4)并且购自GeneArt-LifeTech。然后将所得构建体克隆到pE-SumoProKan大肠杆菌表达载体(LifeSensors，Malvern，PA，参见图14)中并且在溶原性肉汤(lysogeny broth，LB)中的BL21(DE3)大肠杆菌中表达。通过添加0.25mM异丙基β-D-1硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃下过夜诱导蛋白质产生。所得六His-SUMO标记的蛋白质被命名为“sPspCN”，并且捕获在固定在HisTrap固定的Ni²⁺亲和柱(GE Healthcare)上并且用线性梯度的0-0.5M咪唑洗脱。通过尺寸排阻色谱在利用磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)平衡的HiPrep Superdex 75柱(GE Healthcare)上对sPspCN样品进行进一步纯化。使用类似策略制备具有相邻R1结构域(参见图1)(第基37-292位残)的称为sPspCNR1的更长构建体。

对于大部分实验，将来自SUMO特异性蛋白酶ULP1的催化结构域用于从sPspCN(或sPspCNR1)(不具有来自于载体的残基)中移除六His-SUMO标签，然后通过第二Ni²⁺-亲和色谱步骤除去标签。然后在HiPrep Superdex 75柱上如上在PBS中对切割的材料PspCN(或PspCNR1)进行进一步纯化。通过SDS-PAGE判断蛋白质是同源的，并且通过质谱确定蛋白质的完整性和同一性(未示出)。

与sPspCN结合的CFH的SPR衍生测量

在25℃下，在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上使用补充有50μM乙二胺四乙酸(EDTA)的10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4(HBS-P⁺)进行所有表面等离子体共振实验。将Ni²⁺(51RU)和随后sPspCN(144)(通过其N末端六His-SUMO标签)固定在Biacore NTA传感器芯片上。使来自全长CFH(来自血浆或来自重组肺炎链球菌)或CFH片段之溶液的等分试样在所示浓度以100μl/min在芯片上流动180秒，然后是1500秒的解离阶段。由于CFH的不可逆结合，在测量之间通过用1M NaCI中的350mM EDTA注射30秒两次，然后用50mM NaOH，接着0.5(w/v)％十二烷基硫酸钠(SDS)注射30秒来使传感器芯片再生。使用Biacore评估软件对数据进行分析，基于1∶1结合模型对曲线进行拟合和动力学参数估计。

使用NTA传感器芯片测量CFH对于sPspCN的亲和力避免了对胺偶联的需要，其具有蛋白质的异源沉积以及掩蔽配体识别位点之危险的相关潜力。此外，使得能够在测量之间相当简单地对SPR传感器表面进行再生。这种方法的缺点是六His标记的分析物从芯片表面逐渐被冲走(leaching)，以及CFH及其片段与Ni²⁺直接结合的潜力(Nan R，Gor J，LengyelI，Perkins SJ.Uncontrolled zinc-and copper-induced oligomerisation of thehuman complement regulator factor H and its possible implications forfunction and disease.J Mol Biol.2008Dec31；384(5)：1341-52.)。事实上，我们观察到(数据未示出)CFH与负载Ni²⁺的NTA传感器芯片表面(不存在PspCN)的弱结合以及CFH 6-8与该表面的紧密结合。通过背景减除极大绕过了这些困难。

C3b、C3c和C3d结合亲和力的SPR测量

如上进行实验，不同之处在于使用标准胺偶联将C3b(272RU)、C3c(166RU)和C3d(69RU)固定在Biacore C1传感器芯片的三个不同流动池(flow cell)上(第四个流动池用于背景减除)。因子H(用或未用二倍摩尔的过量PspCN预孵育)以所示浓度注射经过芯片(90秒，30μl/分钟)，然后是400秒解离阶段。通过用1M NaCl注射30秒两次来再生传感器芯片。使用Biacore评估软件分析数据并且使用1∶1结合亲和力模型计算平衡亲和力参数。

衰减加速测定

如先前描述的(REF)在基于SPR的测定中测量CFH或CFH：PspCN的衰减加速活性。简言之，通过胺偶联将535RU的C3b固定在BiacoreCM5传感器芯片上。随后，通过以10μl/min注射CFB加CFD(分别为500nM+50nM)120秒来将C3转化酶(C3b.Bb)装配到芯片上。观察(通过SPR)C3b.Bb(至145RU)的形成，接着是初始解离阶段(200s)以允许监测固有C3转化酶衰减(Bb离开)的速率。此后，以所示浓度注射CFH或CFH：PspCN复合物(120秒，10μl/min)，然后是另外的解离阶段。在注射0.2μM CFH 30秒，然后注射1M NaCl 30秒两次的周期之间进行芯片再生。

溶血测定

绵羊和兔全血购自TCS Biosciences(Buckingham，UK)，耗尽CFH的血清购自Complement Technology。基于Pangburn描述的方法⁽³⁶⁾在96孔板上进行溶血测定，不同之处是使用HEPES代替更传统的veronal缓冲剂⁽³⁷⁾。将来自5ml全血的红细胞用20mM HEPES、145mM NaCl、10mM EDTA、0.1％(w/v)明胶(猪皮肤，Fluka)，pH 7.3(缓冲液H1)洗涤三次，并且用20mM HEPES、145mM NaCl、100μM EDTA、0.1％(w/v)明胶，pH 7.3(缓冲液H2)再洗涤三次。将耗尽CFH的血清用CFH构建体重构至2μM并且以指示的终浓度使用。红细胞以当用水完全裂解时得到1(兔)或1.2(绵羊)的最终A₄₁₂的浓度使用。然后将用CFH重构的血清在冰上以指示的最终浓度与红细胞和缓冲液H2组合，以得到45μl的最终体积。通过添加5μl的50mMMg²⁺、50mM乙二醇四乙酸的pH 7.3的溶液来开始裂解。将反应在37℃孵育30分钟，然后通过添加200μl缓冲液H1淬灭。随后通过在4℃下以1500g离心10分钟来使未裂解细胞沉淀，然后取出100μl上清液并且记录A₄₁₂。

肝素-亲和色谱

将蛋白质样品(～0.5μM)在pH 7.5的20mM磷酸钾中施加到1-ml HiTrap肝素色谱柱(GE Healthcare)，并且用20倍柱体积的1M NaCl线性梯度洗脱。

核磁共振波谱学

在配备有5-mm TCI冷冻探针(Bruker)的Avance II 800MHz光谱仪(Bruker)上获得NMR谱。NMR数据用TopSpin 3.1(Bruker)处理并且使用CCPNMR分析软件集进行分析[Vranken WF，Boucher W，Stevens TJ，Fogh RH，Pajon A，Llinas M，Ulrich EL，MarkleyJL，Ionides J，Laue ED.The CCPN data model for NMR spectroscopy：development ofa software pipeline.Proteins.2005Jun 1；59(4)：687-96.]。使用¹⁵N标记的FH 8-9以及¹⁵N-标记的PspCN样品通过将NaCl浓度改变为从0至150mM，pH为从4至6.5，温度为从15℃至70℃进行条件优化。随后，使用20mM pH 6.2的磷酸钾中的40μM ¹⁵N标记的FH 8-9的样品记录310K的¹H，¹⁵N HSQC光谱，然后将PspCN添加至100μM的终浓度并且重新记录谱。在单独的实验中，使用20mM，pH 6.0的磷酸钾中的30μM ¹⁵N标记的PspCN的样品记录298K的¹H，¹⁵NHSQC光谱，然后将FH 8-9添加至40μM的终浓度并且重新记录光谱。

交联和质谱分析法(MS)

使新鲜解冻的血浆纯化的CFH(20μg)或血浆纯化的CFH加上PspCN(20μg CFH，与PspCN为1∶1.15摩尔比)的样品与双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯(BS3)以1∶4的蛋白质-BS3质量比交联，反应混合物中的最终[CFH]＝0.56μg/μl。对交联产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[(NuPAGE 4-12％，Bis-Tris凝胶，MOPS电泳缓冲液(Invitrogen)]。用Instantblue(Expedeon)对凝胶带染色，选择对应于5种不同交联产物的带(参见图5的A)并且从聚丙烯酰胺凝胶上切下。如[Chen ZA，Jawhari A，Fischer L，Buchen C，Tahir S，Kamenski T，Rasmussen M，Lariviere L，Bukowski-Wills JC，NilgesM，Cramer P，Rappsilber J.Architecture of the RNA polymerase II-TFIIF complexrevealed by cross-linking and mass spectrometry.EMBO J.2010 Feb 17；29(4)：717-26.]所述对它们进行凝胶内胰蛋白酶消化。对于每种样品，使用SCX-StageTip对交联肽分级(fractionated)[Ishihama Y，Rappsilber J，Mann M.Modular stop and goextraction tips with stacked disks for parallel and multidimensional Peptidefractionation in proteomics.J Proteome Res.2006 Apr；5(4)：988-94.]；未交联肽应主要在低盐(60mM乙酸铵)洗脱，而交联肽应在高盐级分(500mM乙酸铵)中富集。使用QExactive仪器(Thermo Fisher Scientific)通过液相色谱-MS/MS分析高盐级分。将肽在填充有C18材料(ReproSil-Pur C18-AQ 3μm；Dr Maisch GmbH，Germany)的分析柱上分离到PicoTip发射器(New Objective，Woburn，MA)中。使用从1.6％(v/v)乙腈水溶液到32％(v/v)乙腈水溶液的线性梯度运行109分钟，然后迅速提高到76％(v/v)乙腈。以依赖数据的设置进行质谱获取：在每次MS1扫描后，分离十个最强烈离子并且通过较高能量C阱解离片段化。将MS1和MS2谱二者记录在Orbi-trap分析仪中，对于MS1扫描具有70000分辨率，MS2扫描具有35000分辨率。“动态排除”设置为60秒，并且“重复计数”为1。

使用内部书写的软件鉴定交联多肽。从这些五个样品中鉴定了总计50个连接。在如下连接水平进行无标记量化。对于每个独特的连接，使用Pinpoint软件(Thermo FisherScientific)恢复所有相应交联肽的质谱色谱信号强度并且求和。为了确保实现样品之间公平比较，将独立连接对的信号强度使用在所有5个样品中观察到的23个交联和29个未交联CFH肽的总和信号强度归一化。因此5个样品之间交联强度变化反映在每个样品中的其相对强度，通过观察到的强度和5个样品中该交联的平均强度的商的以5为底的对数计算。此外，使用Cluster 3.0[de Hoon MJ，Imoto S，Nolan J，Miyano S.Open source clusteringsoftware.Bioinformatics.2004Jun 12；20(9)：1453-4.]，将50所观察到的交联基于其在5个样品中的相对强度成簇，以说明其强度变化和位置之间的相关性。这些交联不是沿着CFH序列均匀分布，其位置的偏爱(bias)提供了对全长CFH的构象及在与PspCN相互作用后其构象的变化的有价值的理解。

结果

PspCN的N末端区域与CFH不可逆地结合

先前已经表明(Dave S等.Indian J Med Res.2004May；119Suppl：66-73，以及Hammerschmidt S等.The host immune regulator factor H interacts via twocontact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediatesadhesion to host epithelial cells.J Immunol.2007May 1；178(9)：5848-58)，来自肺炎链球菌(菌株D39)的PspC的N末端区域(图1)包含CFH结合位点，但是其精确边界仍然不清楚。我们在大肠杆菌中产生了两种N末端六His-SUMO标记的蛋白质，对应于PspC第37-140位残基(sPspCN)和第37-292位残基(sPspCNR1)(即，包含R1结构域，图1)。使用SPR，我们发现SUMO融合伴侣(数据未示出)和R1结构域的存在(数据未示出)均不显著影响与CFH或CFH片段的结合。SUMO本身并不与CFH结合(数据未示出)。我们制备了浓度系列并且使用SPR测量血浆纯化的CFH和重组CFH(来自巴斯德毕赤酵母)⁽³⁵⁾对于固定在羧甲基化葡聚糖涂覆的芯片上的sPspCN的亲和力，所述芯片用次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)预固定并且用Ni²⁺加载(图2，表1)。在这两种情况下，结合有效地不可逆，具有太低而不能测量的脱离率和pM以下的K_D。结合的CFH不能通过高盐洗涤移除，只有在测量之间通过用EDTA、NaOH和SDS溶液连续处理剥离NTA芯片才能够使sPspCN涂覆的表面再生。然而，再生的sPspCN涂覆表面在两个响应单元内是可再现的。

表1

表2

PspCN与CFH的中央位点结合

先前报道PspC结合在CFH的多个位点，包括CCP 8-11、13-15和19-20(Dave S等.2004年5月以及Hammerschmidt S等.2007)；Duthy TG等.Infect Immun.2002年10月；70(10)：5604-11)。我们使用sPspCN和来自我们文库的相关重组CFH片段重新探讨了这个问题⁽¹⁵⁾(图1)。发现(未示出)，CFH 6-8(即，对应于CFH CCP 6-8的重组构建体)比全长CFH和其他测试片段更强地结合在NTA芯片上的Ni²⁺上，但是未对此进行进一步研究。

我们发现(图3，表1)，CFH 8-15非常紧密地(K_D＝1-2nM)与sPspCN结合，并且sPspCN：CFH 8-15复合物解离非常慢，但是其不如sPspCN：CFH复合物稳定。另一方面，CFH10-11(数据未示出)和CFH 10-15对sPspCN均具有可忽略的亲和力，这意味着CCP 8和CCP 9对于结合至关重要。事实上双模块CFH 8-9也非常紧密(K_D＝～26nM)地结合，具有相对低的脱离率。没有通过CFH 6-8结合sPspCN的证据(考虑到其对于Ni²⁺加载的NTA传感器芯片表面的亲和力，数据未示出)，而CFH 19-20瞬时结合并且比CFH 8-9或CFH 8-15弱得多(图13A-13B)。

PspCN与CCP 8-9紧密相互作用表明在复合物形成后大量分子间界面消失。为了进一步研究，我们记录了具有和不具有未经标记的PspCN的¹⁵N CFH 8-9的¹H，¹⁵N HSQC NMR谱。这揭示了预期的非常大量的¹H和¹⁵N化学位移扰动(图4的A)。有趣的是，同位素标记的PspCN的¹H，¹⁵N HSQC谱并不与添加CFH 8-9之前折叠蛋白质相一致。通过其与8-苯胺基-1-萘磺酸结合倾向(数据未示出)确认PspCN的熔球样特征。在与FH8-9形成复合物后，结合的PspCN产生¹H，¹⁵N HSQC谱，其特征在于良好分散和解析的相对尖锐的交叉峰。似乎PspCN在与CFH 8-9复合时作为折叠蛋白质存在(图4的B)。

为了询问由PspCN和全长CFH形成的复合物的结构，我们使用化学交联和质谱(MS)的组合。向与PspCN混合的血浆纯化的CFH样品中添加BS3，其为同双官能团的并且在伯胺之间形成多至

间距的交联。我们然后通过SDS-PAGE解析交联产物，切下带并且对其进行胰蛋白酶消化。然后，我们应用MS/MS以鉴定交联肽对。在SDS-PAGE上迁移的分子量(MW)似乎对应于1∶1PspCN∶CFH复合物的交联产物(带s4，图5的A)中，在PspCN中的肽和CFH中的肽之间鉴定了5个分子间交联；这些均位于CCP 9或CCP 10中(图5的B)。该结果完全符合我们使用CFH片段的研究(上文)。

尽管这些实验并不排除其他CCP的直接参与，综合起来其暗示CCP 8、CCP 9和CCP10主要负责CFH与PspCN之间的相互作用。尽管PspCN(与其小的尺寸(12kDa)相应)可以直接结合在仅几个中央CCP(各自为～7kDa)，其与CFH显著紧密的复合物可通过其他CCP的协作式空间重排来优化，通过新的分子内模块间相互作用来稳定。为了测试这种假设，我们比较了添加PspCN前后CFH内的化学交联数据。

通过交联和质谱分析CFH结构

在不存在交联剂的情况下，不出所料，在血浆纯化的CFH样品的SDS-PAGE之后，检测到了孤立带。在用3.9mM BS3孵育相同CFH样品(0.56μg/μL)的60分钟后，显示了两条SDS-PAGE带，二者均是单体CFH的候选(图5的A)。迁移更慢的带包含更多头对尾(例如，CCP 20对CCP 4，以及CCP 19对CCP 5)交联(图5的B)，反映了捕获CFH的后曲构象(bent-backconformation)。不知道原始样品中此类构象的相对丰度，因为即使其相对稀少，其也可以随时间积累。

在加入与0.56μg/μL CFH的摩尔比为1.15∶1的PspCN然后用3.9mM BS3孵育后，这些双带收缩为一个(图5的B)。如所讨论的，该带包含PspCN和CFH二者。分析表明，与缺少PspCN时捕获的相比，交联捕获不同的CFH的紧密构象。重要地，在添加PspCN后，得到了CCP20与CCP 7以及CCP 18与CCP 5的交联，而CCP 20与CCP 4以及CCP 19与CCP 5的交联不再能够检测到(图5的B)。另外，在用PspCN和交联剂孵育CFH后，出现了一个显著的新带，其迁移符合二聚体CFH的MW。这种推测的PspCN诱导的CFH二聚体独特的交联包括CCP 5与CCP 7以及CCP 18与CCP 20。

从这些研究，我们推测PspCN与中央CFH的结合有助于CFH采用新的稳定构象，有助于解释双分子复合物的可忽略的理解速率。经PspCN稳定的CFH构象可具有初生暴露的自缔合位点，这可以解释交联剂捕获的二聚体的提高。但是通过尺寸排阻色谱-多角光散射(SEC-MALS)的分析示出占主导地位的血浆纯化CFH∶PspCN的1∶1的复合物，并且在加入PspCN之前(以710ug/ml加载)和之后(以520ug/ml加载)无法检测到任何CFH二聚体。意料之外地，在与CFH混合之前在向SEC-MALS递交的样品中形成了少量二聚体PspCN，并且相应出现了FH：PspCN₂复合物。但是这些物质以少量存在并且几乎一定是假象。更重要的是，我们假设在经PspCN稳定的CFH构象中具有新暴露的配体结合位点，我们打算通过功能性测定来测试这种假设。

通过PspCN与CFH的结合暴露的新的TED/C3d结合位点

使用标准胺偶联将商业来源的血浆纯化的人C3b、C3c和C3d固定在同一C1 SPR芯片(Biacore)的不同通道。随后，已经证明PspCN并不与C3b、C3c和C3d结合(数据未示出)，相同实验中测量CFH或者CFH：PspCN复合物对于C3b及其多种降解产物的亲和力(图6)。获得了固定化C3b对于重组CFH和血浆纯化CFH的显著一致的亲和力，与0.5-0.6mM(表1)的文献K_D值极好地匹配。有趣的是，CFH：PspCN复合物以三倍高与C3b结合，K_D＝0.15-0.2mM。对于PspCNR1获得了几乎相同的结合(数据未示出)。

我们发现，CFH(单独)并不地与SPR芯片上的C3c或C3d很好地结合(图6)。这很好地符合其他最近报道^{(22，23，38)}。另一方面，已经确定，重组片段CFH 19-20以～2μM的K_D同样好地(并使用同样的氨基酸残基)与C3d和C3b结合^(15，39)。清楚地，在这种SPR基测定中，位于CCP19-20中的C3b/C3d结合位点在完整CFH中并不是可充分接近的。因此，显著地，CFH：PspCN以比单独CFH好约两个数量级与C3d结合(图6，表2)。这种相互作用的K_D(2μM)可与FH 19-20同C3d或C3b的结合相比较。该结果与我们的假设相一致，PspCN结合带来了CFH的构象重排，暴露出新配体结合位点。

CFH：PspCN的功能性测定

考虑到PspCN已经进化了与CFH非常紧密结合并且改变其构象的能力，出现了问题，PspCN结合对作为C3b扩增抑制剂的CFH的功能特性具有什么样的影响。我们通过在SPR芯片上装配转化酶并且观察添加CFH(或CFH：PspCN)之前和之后其解离成其组分(FIG 7)。明显的是，10nM CFH对衰减具有明显的加速影响(如预期的)，但是2.5nM CFH和2.5nMPspCN的混合物使其超过2倍。

PspCN揭示了CFH中疾病相关突变的隐秘作用

我们在巴斯德毕赤酵母中产生了突变体CFH(D1119G)(图8的A)。CCP 19中这种与aHUS相关的突变先前在纯化的全长CFH背景下并没有充分表征。另一方面，在C末端片段的背景下，报道了CFH 19-20(D1119G)造成C3d和C3b结合的几乎完全损失⁽³⁹⁾。另外，在FH 19-20：C3d复合物中，D1119占据了分子间界面的关键位置⁽³⁹⁾。有趣地，我们发现CFH(D1119G)以与CFH(wt)大致相同的亲和力同SPR芯片表面的C3b结合(表2)。如预期的，CFH(D1119G)对于iC3b或C3d没有显著的亲和力。

我们制备了PspCN：CFH(D1119G)复合物并且测试了其与C3b和C3d的结合。与单独CFH(D1119G)相比，复合物在C3b结合中表现出一些改善(表2)，但是与CFH(wt)：PspCN复合物不同，其未表现出C3d结合增强。因此，PspCN结合揭示了CFH(wt)与CFH(D1119G)之间的显著差异，这在SP芯片上缺少PspCN的情况下进行的C3b/C3d结合研究中是不明显的。这再次确认了我们的假设，PspCN可挖掘出CFH的部分或完全埋藏的C末端C3d/C3b结合位点。

我们接下来要问CFH(D1119G)与C3b的TED结构域结合能力的潜在不足(其可以通过PspCN揭露)是否造成该种突变体加速3b.Bb衰减的能力的结果。我们发现，CFH(D1119G)本身加速C3b.Bb的解离与CFH(wt)大致相同(图8的B)。该结果与突变CFH中近似于野生型C3b结合亲和力(在SPR芯片上)的保留相一致。但是，在与PspCN复合时，CFH突变体的行为显著不同于CFH(wt)；仅记录了衰减加速率的小的改善，与之相反，在野生型CFH的情况下与PspCN结合后观察到改善了约10倍。

接下来，我们研究了D1119G突变干扰CFH在替代宿主细胞表面作用的程度。在添加到缺少CFH的人血清后，血浆纯化的人CFH保护绵羊红细胞(图8的C)(同人红细胞一样，具有富含唾液酸的表面)免受补体介导的溶血，但是不保护兔红细胞(具有缺少唾液酸的表面)；这与先前的发现相一致⁽⁴⁰⁾。在另一个方面，CFH(D1119G)(单独)不能保护兔或绵羊红细胞，这与非典型溶血尿毒综合征中的因果作用相一致。这表明，尽管CFH(D1119G)同CFH(wt)一样与SPR传感器芯片表面上的C3b结合，但是这种与疾病相关的突变体并不与自身表面的CFH(wt)一样好地起作用。PspCN的添加稍微改善了CFH(D1119G)保护绵羊红细胞的能力(图8的C)，这与上述的与CFH(D1119G)相比spCN：CFH(D1119G)的C3b结合的小的改善相一致。与单独的血浆纯化的CFH相比，CFH：PspCN复合物仅表现出对(缺少唾液酸)兔红细胞之保护的中等提高(图8的D)。因此，尽管PspCN诱导了CFH中C末端C3d/TED结合位点的可用性，对于兔红细胞上C3b扩增的控制依然不足。清楚地，在PspCN：CFH复合物中CFH采用的活化构象对于通过完整PspC的胆固醇结合结构域锚定于细胞表面或宿主表面是不足的，CFH与(例如)唾液酸的结合也是必要的。

最后，我们尝试通过使用1μM CFH(wt)和1μM CFH(D1119G)的混合物通过进行相同的溶血测定以部分地重新产生具有CFH(D1119G)突变的杂合个体的情况(图8的C和图8的D)。在这种1∶1的情况下，如对于2μM CFH(wt)观察的，对于兔红细胞获得了出人意料的类似的高水平溶血；在PspCN的存在下，对于1∶1混合物和CFH(wt)，观察到兔红细胞溶血中类似的中等降低。但是，有趣的是，1∶1“杂合”混合物不能完全保护绵羊红细胞免受补体介导的裂解，直到在反应中包含PspCN。因此，PspCN能够充分活化1∶1混合物(相当于杂合个体)中的CFH以抑制裂解。

讨论

CFH是控制C3b增殖的关键，后者是补体系统运行的关键事件。CFH必须区分宿主上的C3b和外来物上的C3b。这不太可能是在需要保护的那些表面选择性富集CFH的唯一问题；其将使得CFH非常容易被微生物攻击，使得补体系统作为防御感染的第一道防线几乎无效。因此，CFH可能已经进化出“隐藏”其一些补体调节位点并且仅在某些分子标记的存在下才暴露它们。我们推断，这样的假设策略可以解释为什么CFH具有那么多似乎不与配体直接结合的CCP模块。其可以允许CFH响应于表面特异性分子特征而采用不同构象(暴露出不同配体结合位点)。基于对PspCN和CFH之间形成的复合物的研究，我们在这里提出的结果强烈支持这种模型。

我们使用SPR发现，来自肺炎链球菌(D39)的N末端104个氨基酸残基(加工前蛋白的第37-140位残基)在生物学时间标尺上对于与重组人CFH以及从血液纯化的CFH的不可逆结合是足够的。该观察与先前报道的血浆纯化的CFH(Lu L，Ma Y，Zhang JR.Streptococcuspneumoniae recruits complement factor H through the amino terminus of CbpA.JBiol Chem.2006Jun2；281(22)：15464-74)与PspCN的类似长度的N末端构建体的结合一致，所述结合使用等温滴定量热法在溶液中评估，并且发现太紧密而无法测量(＜1nM)。我们的PspCN∶CFH复合物比先前在使用稍微延长的PspC构建体(第39-152位残基)进行的SPR基实验中观察到的复合物显著更稳定(Hammerschmidt S，Agarwal V，Kunert A，Haelbich S，Skerka C，Zipfel PF.The host immune regulator factor H interacts via twocontact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediatesadhesion to host epithelial cells.J Immunol.2007May1；178(9)：5848-58)。另一方面，我们未观察到显著更长的构建体(第39-259位残基)的亲和力的任何损失或提高，并且可能的是PspCN包含了全长PspC内的整个CFH结合位点。

来自于血浆的CFH具有由双唾液酸化双触角聚糖占据的9个潜在N-糖基化位点中的8个，主要在中央CCP中(Fenaille F，Le Mignon M，Groseil C，Ramon C，Riandé S，SiretL，Bihoreau N.Site-specific N-glycan characterization of humau complementfactor H.Glycobiology.2007Sep；17(9)：932-44)。已经对用于本研究的重组CFH(野生型和D1119G二者)进行了酶促去糖基化。CFH的所有这些变体对PspCN具有相当的亲和力，表明血浆CFH的N-聚糖在PspCN结合中不具有显著作用。其对于与C3b结合或者对于参与体外进行的一系列测定似乎都不是必要的(Jouvin MH，Kazatchkine MD，Cahour A，BernardN.Lysine residues，but not carbohydrates，are required for the regulatoryfunction of H on the amplification C3 convertase of complement.JImmunol.1984Dec；133(6)：3250-4)。

假设细菌表面上的PspC对于CFH具有与PspCN类似的亲和力，则细菌将获得并且保持(推测在其在血流中度过的一段时间内)连接在其每个表面所展示PspC分子上的CFH分子。已经表明(Agarwal V，Asmat TM，Luo S，Jensch I，Zipfel PF，HammerschmidtS.Complement regulator Factor H mediates a two-step uptake of StreptococcuSpneumoniae by human cells.J Biol Chem.2010Jul 23；285(30)：23486-95；Quin LR，Onwubiko C，Moore QC，Mills MF，McDaniel LS，Carmicle S.Factor H binding to PspCof Streptococcus pneumoniae increases adherence to human cell lines in vitroand enhances invasion of mouse lungs in vivo.Infect Immun.2007Aug；75(8)：4082-7)，肺炎链球菌不仅将这种分子用于避免C3b扩增，还在入侵之前用于定位在具有CFH配体的宿主表面。因此，关于这种显著紧密的复合物的结构和功能特征，有兴趣了解更多。

基于三种正交方法(截短突变体的结合亲和力，NMR化学位移扰动和化学交联)我们发现PspCN在CCP 8-10内的位点与CFH的中部区域非常紧密地结合。我们没有获得其他CCP明显直接参与的证据。然而全长CFH比FH 8-15远远更紧密地与PspCN结合，因此，如下文将进一步讨论的，其他CCP在复合物形成中发挥作用，即使是间接作用。我们的结果与流式细胞术研究(Dave S等.2004)一致，其暗示CCP 6-10中的一些或全部对于CFH通过PspCN的N末端225个氨基酸与14种不同菌株的肺炎球菌分离株结合是至关重要的。我们的结果还与Hammerschmidt等(Hammerschmidt S，等.2007)在很大程度上一致，他们使用来自菌株ATCC33400(血清型1)的被他们称为SH2的PspC的250个残基的片段。他们通过斑点印迹和SPR(尽管未报道K_D值)表明CCP 8-11与SH2结合，而FH 1-7、FH 11-15和FH 16-20不表现出或表现出非常少的与SH2的结合。这些作者证明，肝素(根据我们的观察，其与CFH的CCP 7和20相互作用，但是也结合PspCN)抑制SH2-CFH相互作用，而CCP 19-20的单克隆抗体抑制SH2与FH8-20结合。这向作者提出，第二直接PspCN结合位点必定位于C末端模块上。我们的研究(虽然它们表现出非常弱的FH 19-20：PspCN相互作用)表明，这些抑制剂更有可能通过阻断二元复合物的分子内组件来间接起作用，如下文进一步讨论的。另一个研究(Duthy TG等.2002)也报道了FH 8-15和FH 8-13与PspC的结合(通过ELISA)，但是没有FH 1-7、FH 10-12或FH 16-20的结合，这与我们的数据一致。但是，它们不能直接与FH 8-12直接结合，仅很弱地与FH 8-14结合，因此它们分配了FH 13-15的结合位点。他们的所有构建体与本研究中的一样作为重组截短突变体在巴斯德毕赤酵母中产生，但是产率非常低，因此难以鉴定。总之，目前有多条证据支持CFH中不含C3b、GAG或其他已知配体的结合位点的模块8-10与PspC直接接合。这与以下理念相一致：留下这些可用位点对于细菌是有益的。

CFH：PspCN复合物可忽略的脱离率和因此显著高的亲和力可来自于复合物形成后两个蛋白质伴侣采用了稳定的相互依赖的新构象。因此，虽然其MW仅为11kD，并因此其仅能够与很少的CCP同时接触，但是，PspCN与CFH(155kD)极其紧密地结合并且该结构域在这个过程中变成了折叠蛋白(我们还没有研究在这个结构域作为完整PspC蛋白的一部分时是否是折叠的)。

全长CFH以比CFH 8-9紧密约4个数量级，比CFH 8-15紧密三个数量级与PspCN结合。尽管缺少来自我们研究的证据，但是这说明8、9和10以外的CCP直接参与PspCN结合。交联告诉我们，PspCN结合造成更大蛋白质结构的大的变化。由于其长的且柔性的结构，以及随后不相邻CCP模块之间相互作用的可能性，游离CFH具有多种构象可能性；我们的研究表明，这些中的一些比另一些更稳定，但是彼此通过相当高的活化能壁垒隔离。PspcN结合可诱导形成在不存在PspCN时在动力学上不容易接近CFH的稳定构象异构体。这样的构象的存在提示，自身表面特异性分子标记(例如，GAG和唾液酸)也可能以类似策略作用以有利于CFH构象异构体之间的转变。有趣的观察是，如同宿主表面分子标记那样(Schmidt CQ，Herbert AP，Kavanagh D，Gandy C，Fenton CJ，Blaum BS，Lyon M，Uhrín D，Barlow PN.Anew map of glycosaminoglycan and C3b binding sites on factor H.JImmunol.2008Aug 15；181(4)：2610-9)，与CFH的相同区域(CCP 7和CCP 20)直接结合的另一些细菌蛋白(不同于PspC)(Ferreira VP，Pangburn MK，Cortés C.Complement controlprotein factor H：the good，the bad，and the inadequate.Mol Immunol.2010Aug；47(13(：2187-97)表明，它们也可能以这种方式作用。

到目前为止讨论的结果涉及在1∶1的PspCN∶CFH复合物中观察到的交联。根据SEC-MALS分析(以500mg mL^-1或～3mM上样到尺寸排阻柱上)，这是CFH和PspCN混合物中的优势物质。而且，交联数据表明PspCN提高了CFH形成二聚体的趋势，其中使CCP 5和CCP 7(假设来自不同的单体)靠近并且在CCP 18和CCP 20之间也有二聚体特异性交联。虽然两个CFH分子可以与同一个PspCN分子直接相互作用，这似乎不可能得到小尺寸的PspCN，其与CCP 8-9的大的相互作用表面似乎是在NMR样品中观察到的1∶1复合物。另一方面，可行的是，通过PspCN稳定的改变的CFH构象导致先前埋藏的CFH区域暴露，其参与可以通过交联捕获的弱自缔合；基于观察到的二聚体特异性交联，这些可能涉及CCP 5-7以及可能涉及CCP 18-20。这种效果可以是两个可溶性PspCN：CFH复合物相遇(通过交联捕获)的结果。该结果与先前的报道平行：可溶性GAG替代物(例如肝素)诱导可溶性CFH的寡聚化，其可能不能通过多个CFH分子与同一GAG结合来解释，其也可能是由可溶性CFH：GAG复合物通过初期暴露的位点自缔合自缔合引起的。不知道是否在细菌表面上形成CFH/PspC二聚体。

在本研究中，我们使用SPR来测量FH和FH：PspCN对于化学地固定在传感器芯片的羧甲基化表面上的C3b的亲和力。这种实验设置可能是非常差的自身表面模型，并因此在SPR中观察的亲和力可与在“随机”补体活化表面(例如，微生物)上观察到的那些类似。在本研究中，重组的CFH和血浆纯化的CFH二者均以K_D(0.6mM)与固定在SPR传感器芯片表面上的C3b相互作用，这与其他报道值一致。与FH1-4(K_D＝～10mM)或FH 19-20(K_D＝2-3mM)相比，分别更紧密了15倍和4倍(Schmidt CQ，Herbert AP，Kavanagh D，Gandy C，Fenton CJ，BlaumBS，Lyon M，Uhrín D，Barlow PN.A new map of glycosaminoglycan and C3b bindingsites on factor H.J Immunol.2008Aug15；181(4)：2610-9)。我们还与先前研究^(38和22)的作者在我们的观察结果中一致：当同CFH或CFH 19-20与C3b的结合或者CFH 19-20同C3d的结合相比时，全长CFH与固定在SPR传感器芯片上的C3d非常差地结合。值得注意的是，在先前的研究中，多种方式使C3b沉积在芯片上(包括通过其硫酯)，并且获得了类似结果⁽³⁹⁾。因此，当CFH在SPR芯片表面上被呈递C3d时，完整CFH的C末端的C3b/TED结合位点并不完全可用。

这引起了关于以下的重要的问题，在CFH与C3b相遇之后，CFH的对于结合C3d来说不可用的C末端C3b/d结合位点是否仍然展开。有趣的是，在本研究中，CFH(D1119G)几乎与CFH(wt)一样好地同SPR传感器芯片上的C3b结合，尽管具有片段CFH 19-20(D1119G)对于C3b或C3d几乎没有亲和力的事实⁽³⁹⁾。这表明在CFH与C3b结合的SPR基测定(以及测量与C3d之结合的那些)中，C末端位点未有效地产生贡献。另一方面，CFH(D1119G)(同CFH(wt)一样)比CFH 1-4紧密十五倍地结合。可能的是额外的CCP(即，CCP 5和18)对分子间相互作用具有贡献，事实上先前已经发现，重组CFH 6-8非常弱地与C3b结合⁽¹⁵⁾以及Jokiranta TS，Hellwage J，Koistinen V，Zipfel PF，Meri S.Each of the three binding sites oncomplement factor H interacts with a distinct site on C3b.J Biol Chem.2000Sep8；275(36)：27657-62)。或者，可能通过在游离CFH中不存在的分子内相互作用来有利于CFH：C3b复合物(类似于CFH：PspCN复合物。在任一种情况下，我们可以推断全长CFH中的C末端C3b/C3d结合位点在默认的情况下被掩藏或占据。

相比之下，清楚的是，CFH：PspC复合物中的C3b/C3d结合位点是可用的，因为这是对于其与完整CFH相比＞50倍的更好C3d结合的唯一相干的解释，其与FH 19-20的C3d结合亲和力相等。另外，CFH：PspCN与C3b的二位点结合可有助于解释其相对高的对C3b的亲和力(为单独FH 1-4的60倍，为单独FH 19-20的18倍)。尽管CFH和CFH：PspCN的亲和力(对于C3b)差异“仅”为四倍，但是这对于细菌来说可能是非常显著的。当CFH以其“隐藏”构象被捕获，0.6μM(对于C3b：CFH复合物)的K_D可能不足以控制C3b扩增，其为一旦打破C3b生产阈值能够压垮调节物的二元开关过程；另一方面，CFH：PspCN-C3b复合物0.15μM的K_D可足以维持表面上结合的C3b分子的数目低于脱离活化的阈值。这样的概念以及衰减加速活性十倍的改善与在本研究中观察到的PspCN结合CFH的显著改善的溶血预防特性相一致。在补充有CFH(野生型)和FH(D1119G)的1∶1混合物的耗尽CFH的血清中，PspCN恢复溶血保护的能力提示了其治疗潜力。

这些观察结果强烈表明，其他细菌蛋白诱导与PspCN结合诱导的相同或类似的CFH活化构象。很大一部分细菌蛋白在别处与CFH结合，虽然如此，但是其可以使类似构象稳定。交联表明，CCP 7和CCP 20在PspCN复合物中靠在一起，并且许多细菌蛋白质与这两个位点接合，潜在地使其在一起。因此，重要的是使用与我们在本研究中开发的那些类似的方法来探索其他细菌蛋白质：CFH复合物的结构。吸引人的另外的可能性是，自身表面上的分子标记使CFH的相同的活化构象稳定。值得注意的是，多阴离子标记(肝素为实验性模型)与CCP7和CCP 20⁽¹⁵⁾结合，而最近，氧化特异性表位(认为对于将CFH募集到损伤细胞来说很重要)也与这两种CCP相互作用⁽³⁴⁾。这种可能性突出了使用生物模拟表面来评估疾病相关SNP的功能性影响以及CFH中的突变的重要性，因为否则的话一些将会错过，如利用我们CFH(D1119G)的C3b结合研究所例示的。

总之，现在有了有力证据表明，CFH以隐藏形式循环，其中其一些C3b结合能力被隐藏，阻止其成为C3b扩增的高度有效调节物，因此自发地完全关闭补体活化。因子H也可以以“活化”形式存在，其中其C3b结合位点是可用的并且以这样的方式并列以使得与其C3b(或C3b.Bb)靶标双价地结合并且因此强烈地结合。细菌蛋白PspC可以诱导这种活性构象，可能的是另一些细菌蛋白使用相同策略(尽管通过不同形式与CFH接合)。这样的构象存在并且被细菌利用，这强烈地表明其也是自身表面上的活性构象。现在需要进行进一步的研究以测试这是否确实是通过脊椎动物补体系统的关键可溶性调节物区分自身和非自身的分子基础。

实施例1的参考文献

1.Ricklin，D.，and Lambris，J.D.(2013)Complement in immune andinflammatory disorders：pathophysiological mechanisms，Journal of immunology190，3831-3838.

2.Ricklin，D.，and Lambris，J.D.(2013)Complement in immune andinflammatory disordefs：therapeutic interventions，Journal of immunology 190，3839-3847.

3.Lachmann，P.J.(2009)The amplification loop of the complementpathways，Adv Immunol 104，115-149.

4.Gadjeva，M.，Dodds，A.W.，Taniguchi-Sidle，A.，Willis，A.C.，lsenman，D.E.，and Law，S.K.(1998)The covalent binding reaetion of complement component C3，Journal of immunology 161，985-990.

5.Schmidt，C.Q.，Herbert，A.P.，Hocking，H.G.，Uhrin，D.，and Barlow，P.N.(2008)Translational Mini-Review Series on Complement Factor H：Structural andfunctional correlations for factor H，Clin Exp Immunol.151，14-24.

6.Ferreira，V.P.，Pangburn，M.K.，and Cortes，C.(2010)Complement controlprotein factor H：the good，the bad，and the inadequate，Mol Immunol 47，2187-2197.

7.Perkins，S.J.，Nan，R.，Li，K.，Khan，S.，and Miller，A.(2011)ComplementFactor H-ligand interactions：Self-association，multivalency and dissociationconstants，Immunobiology.

8.Makou，E.，Herbert，A.P.，and Barlow，P.N.(2013)FunctionaI Anatomy ofComplement Factor H，Biochemistry.

9.Ripoche，J.，Day，A.J.，Harris，T.J.，and Sim，R.B.(1988)The completeamino acid sequence of human complement factor H，Biochem J.249，593-602.

10.Soares，D.C.，and Barlow，P.N.(2005)Complement Control ProteinModules in the Regulators of Complement Activation，In Structural Biology ofthe Complement System(Morikis，D.，and Lambris，J.D.，Eds.)，pp 19-62，CRC Press，Taylor&Francis Group，Boca Raton.

11.Matsumoto，A.K.，Kopicky-Burd，J.，Carter，R.H.，Tuveson，D.A.，Tedder，T.F.，and Fearon，D.T.(1991)Intersection of the complement and immune systems：asignal transduction complex of the B lymphocyte-containing complementreceptor type 2and CD19，The Journal of experimental medicine 173，55-64.

12.de Cordoba，S.R.，and de Jorge，E.G.(2008)Translational mini-reviewseries on complement factor H：genetics and disease associations of humancomplement factor H，Clin Exp Immunol.151，1-13.

13.Hageman，G.S.，Anderson，D.H.，Johnson，L.V.，Hancox，L.S.，Taiber，A.J.，Hardisty，L.I.，Hageman，J.L.，Stockman，H.A.，Borchardt，J.D.，Gehrs，K.M.，Smith，R.J.，Silvestri，G.，Russell，S.R.，Klaver，C.C.，Barbazetto，I.，Chang，S.，Yannuzzi，L.A.，Barile，G.R.，Merriam，J.C.，Smith，R.T.，Olsh，A.K.，Bergeron，J.，Zemant，J.，Merriam，J.E.，Gold，B.，Dean，M.，and Allikmets，R.(2005)A common haplotype in thecomplement regulatory gene factor H(HF1/CFH)predisposes individuals to age-related macular degeneration，Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 102，7227-7232.Epub 2005 May 7223.

14.Blackmore，T.K.，Sadlon，T.A.，Ward，H.M.，Lublin，D.M.，and Gordon，D.L.(1996)Identification of a heparin binding domain in the seventh shortconsensus repeat of complement factor H，Journal of immunology 157，5422-5427.

15.Schmidt，C.Q.，Herbert，A.P.，Kavanagh，D.，Gandy，C.，Fenton，C.J.，Blaum，B.S.，Lyon，M.，Uhrin，D.，and Barlow，P.N.(2008)A new map of glycosaminoglycan andC3b binding sites on factor H，Journal of immunology 181，2610-2619.

16.Clark，S.J.，Bishop，P.N.，and Day，A.J.(2010)Complement factor H andage-related macular degeneration：the role of glycosaminoglycan recognition indisease pathology，Biochem Soc Trans 38，1342-1348.

17.Clark，S.J.，Ridge，L.A.，Herbert，A.P.，Hakobyan，S.，Mulloy，B.，Lennon，R.，Wurzner，R.，Morgan，B.P.，Uhrin，D.，Bishop，P.N.，and Day，A.J.(2013)Tissue-specific host recognition by complement factor h is mediated by differentialactivities of its glycosaminoglycan-binding regions，Journal of immunology190，2049-2057.

18.Richards，A.，Buddles，M.R.，Donne，R.L.，Kaplan，B.S.，Kirk，E.，Venning，M.C.，Tielemans，C.L.，Goodship，J.A.，and Goodship，T.H.(2001)Factor H mutationsin hemolytic uremic syndrome cluster in exons 18-20，a domain important forhost cell recognition，Am J Hum Genet 68，485-490.

19.Gordon，D.L.，Kaufman，R.M.，Blackmore，T.K.，Kwong，J.，and Lublin，D.M.(1995)Identification of complement regulatory domains in human factor H，JImmunol.155，348-356.

20.Appel，G.B.，Cook，H.T.，Hageman，G.，Jennette，J.C.，Kashgarian，M.，Kirschfink，M.，Lambris，J.D.，Lanning，L.，Lutz，H.U.，Meri，S.，Rose，N.R.，Salant，D.J.，Sethi，S.，Smith，R.J.，Smoyer，W.，Tully，H.F.，Tully，S.P.，Walker，P.，Welsh，M.，Wurzner，R.，and Zipfel，P.F.(2005)Membranoprolifer8tive glomerulonephritistypell(dense deposit disease)：an update，J Am Soc Nephrol 16，1392-1403.

21.Fridkis-Hareli，M.，Storek，M.，Mazsaroff，I.，Risitano，A.M.，Lundberg，A.S.，Horvath，C.J.，and Holers，V.M.(2011)Design and development of TT30，a novelC3d-targeted C3/C5 convertase inhibitor for treatment of human complementalternative pathway-mediated diseases，Blood 118，4705-4713.

22.Schmidt，C.Q.，Bai，H.，Lin，Z.，Risitano，A.M.，Barlow，P.N.，Ricklin，D.，and Lambris，J.D.(2013)Rational Engineering of a Minimized Immunelnhibitorwith Unique Triple-Targeting Properties，Journal of immunology Jun 1；190(11)：5712-21.

23.Hebecker，M.，Alba-Dominguez，M.，Roumenina，L.T.，Reuter，S.，Hyvarinen，S.，Dragon-Durey，M.A.，Jokiranta，T.S.，Sanchez-Corral，P.，and Jozsi，M.(2013)AnEngineered Construct Combining Complement Regulatory and Surface-RecognitionDomains Represents a Minimal-Size Functional Factor H，Journal of immunology.

24.Blom，A.M.，Hallstrom，T.，and Riesbeck，K.(2009)Complement evasionstrategies of pathogens-acquisition of inhibitors and beyond，Mol Immunol 46，2808-2817.

25.Zipfel，P.F.，Skerka，C.，Hellwage，J.，Jokiranta，S.T.，Meri，S.，Brade，V.，Kraiczy，P.，Noris，M.，and Remuzzi，G.(2002)Factor H family proteins：oncomplement，microbes and human diseases，Biochem Soc Trans 30，971-978.

26.Janulczyk，R.，lannelli，F.，Sjoholm，A.G.，Pozzi，G.，and Bjorck，L.(2000)Hic，a novel surface protein of Streptococcus pneumoniae that interferes withcomplementfunction，The Journal of biological chemistry 275，37257-37263.

27.Dave，S.，Brooks-Walter，A.，Pangburn，M.K.，and McDaniel，L.S.(2001)PspC，a pneumococcal surface protein，binds human factor H，Infection andimmunity 69，3435-3437.

28.Jarva，H.，Janulczyk，R.，Hellwage，J.，Zipfel，P.F.，Bjorck，L.，and Meri，S.(2002)Streptococcus pneumoniae evades complement attack andopsonophagocytosis by expressing the pspC locus-encoded Hic protein thatbinds to short consensus repeats 8-11 of factor H，Journal of immunology 168，1886-1894.

29.Hyams，C.，Trzcinski，K.，Camberlein，E.，Weinberger，D.M.，Chimalapati，S.，Noursadeghi，M.，Lipsitch，M.，and Brown，J.S.(2012)Streptococcus pneumoniaecapsular serotype invasiveness correlates with the degree of factor H bindingand opsonisation with C3b/iC3b，Infection and immunity.

30.Bexborn，F.，Andersson，P.O.，Chen，H.，Nilsson，B.，and Ekdahl，K.N.(2008)The tick-over theory revisited：formation and regulation of the solublealternative complement C3 convertase(C3(H2O)Bb)，Mol Immunol 45，2370-2379.

31.Kirkitadze，M.D.，and Barlow，P.N.(2001)Structure and flexibility ofthe multiple domain proteins that regulate complement activation，Immunol Rev180，146-161.

32.Trouw，L.A.，Bengtsson，A.A.，Gelderman，K.A.，Dahlback，B.，Sturfelt，G.，and Blom，A.M.(2007)C4b-binding protein and factor H compensate for the lossof membrane-bound complement inhibitors to protect apoptotic cells againstexcessive complement attack，The Journal of biological chemistry 282，28540-28548.

33.Leffler，J.，Herbert，A.P.，Norstrom，E.，Schmidt，C.Q.，Barlow，P.N.，Blom，A.M.，and Martin，M.(2010)Annexin-II，DNA，and histones serve as factor H ligandson the surface of apoptotic cells，The Journal of biological chemistry 285，3766-3776.

34.Weismann，D.，Hartvigsen，K.，Lauer，N.，Bennett，K.L.，Seholl，H.P.，Charbel lssa，P.，Cano，M.，Brandstatter，H.，Tsimikas，S.，Skerka，C.，Superti-Furga，G.，Handa，J.T.，Zipfel，P.F.，Witztum，J.L.，and Binder，C.J.(2011)Complement factorH binds malondialdehyde epitopes and protects from oxidative stress，Nature478，76-81.

35.Schmidt，C.Q.，Slingsby，F.C.，Richards，A.，and Barlow，P.N.(2011)Production of biologically active complement factor H in therapeuticallyuseful quantities，Protein Expr Purif 76，254-263.

36.Pangburn，M.K.(2002)Cutting edge：localization of the hostrecognition functions of complement factor H at the carboxyl-terminal：implications for hemolytic uremic syndrome，Journal of immunology 169，4702-4706.

37.Blaum，B.S.，Deakin，J.A.，Johansson，C.M.，Herbert，A.P.，Barlow，P.N.，Lyon，M.，and Uhrin，D.(2010)Lysine and arginine side chains inglycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR，cross-linking，andmass spectrometry：a case study of the factor H-heparin interaction，Journal ofthe American Chemical Society 132，6374-6381.

38.Goicoechea de Jorge，E.，Caesar，J.J.，Malik，T.H.，Patel，M.，Colledge，M.，Johnson，S.，Hakobyan，S.，Morgan，B.P.，Harris，C.L.，Pickering，M.C.，and Lea，S.M.(2013)Dimerization of complement factor H-related proteins modulatescomplement activation in vivo，Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 110，4685-4690.

39.Morgan，H.P.，Schmidt，C.Q.，Guariento，M.，Blaum，B.S.，Gillespie，D.，Herbert，A.P.，Kavanagh，D.，Mertens，H.D.，Svergun，D.I.，Johansson，C.M.，Uhrin，D.，Barlow，P.N.，and Hannan，J.P.(2011)Structural basis for engagement bycomplement factor H of C3b on a self surface，Nat Struct Mol Biol 18，463-470.

40.Kazatchkine，M.D.，Fearon，D.T.，and Austen，K.F.(1979)Humanalternative complement pathway：membrane-associated sialic acid regulates thecompetition between B and beta1 H for cell-bound C3b，Journal of immunology122，75-81.

实施例2-PspCN和相关蛋白的进一步研究

进行了进一步的工作以研究PspCN、PspCN变体的特性以及此类蛋白质的治疗用途。

方法：

保护PNH样红细胞免于溶血

根据Ezzell等(1991)的改进形式制备PNH样红细胞。简单地说，通过静脉切开术从捐献者获得全人血并且储存在4℃的Alsever溶液中。将细胞用RBC洗涤缓冲液(20mMHEPES；145mM NaCl；10mM EDTA；0.1％w/v明胶，pH 7.3)洗涤三次并且在最终洗涤后重悬在PBS中。在每次洗涤步骤之后，将细胞沉淀的上部10％吸出以除去含白细胞的血沉棕黄层(buffy coat)。将浓集细胞的1ml等分试样加入到8％w/v的2-氨乙基异硫脲溴化物(AET，Sigma-Aldrich)溶液中，所述溶液已经使用HCl滴定到pH 8.0。细胞悬液在37℃下恒定搅拌孵育9分钟，在该时间之后，将细胞用不含EDTA的RBC洗涤缓冲液洗涤三次。

然后将PNH样细胞用pH 6.4的20mM HEPES、145mM NaCl、0.1％w/v明胶洗涤一次。在37℃下用50μl总反应体积的酸化正常人血清、5mM EGTA镁和适当浓度的血浆纯化的CFH(Complement Technology)或纯化的重组PspCN孵育这些细胞。30分钟后，通过加入200μl冰冷的淬灭缓冲液(20mM HEPES；145mM NaCl；10mM EDTA；0.1％w/v明胶；pH 7.3)淬灭反应。通过在4℃下以3,000×g离心10分钟来除去细胞和细胞碎片，之后取出100μl的等分试样并且记录其在410nm的吸光度。

用于因子H结合所必需的最小PspC序列的确定

根据用于制备PspCN(37-140)序列的方法制备包含PspC(52-140)、PspC(62-140)、PspC(72-140)、PspC(37-130)、PspC(37-120)和PspC(37-110)的编码序列的构建体。然后使用开发用来确定PspCN(37-140)蛋白结合亲和力的相同SPR测定来评估CFH结合。

PspCN的修饰

对PspCN的N末端和C末端进行修饰以包含半胱氨酸和柔性肽接头段。在N末端Cys修饰的PspCN(Cys-PspCN)的情况下，所包含的额外残基是CGSGSGSGSGG-PspCN(SEQ ID NO7)，在C末端Cys修饰的PspCN(Cys-PspCN)的情况下，所包含的额外残基是PspCN-GSGSGSGSGGC＊(SEQ ID NO 8)。使用开发用于PspCN的相同方法在大肠杆菌中将PspCN的这些修饰形式克隆并且表达为SUMO融合蛋白。这些蛋白质的纯化也类似于用于PspCN的那些，只是在所有纯化步骤中包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)以保存半胱氨酸残基的巯基。

确定Cys突变蛋白是否保留FH结合能力的SPR实验

使用用于评估sPspCN的CFH结合能力的相同方法，使用作为SPR实验中配体的His-SUMO-Cys-PspCN和His-SUMO-PspCN-Cys以及市售血浆纯化的CFH(ComplementTechnology，Tyler TX)进行SPR。

Cys-PspCN的PEG化

将Cys-PspCN与20倍摩尔的过量甲氧基-PEG-马来酰亚胺(Sigma-Aldrich)混合并且在补充有1mM TCEP的PBS中于室温搅拌孵育2.5小时。在还原条件下对推定PEG化的Cys-PspCN的等分试样进行SDS-PAGE。判断成功PEG化蛋白质为表现出相对于未处理蛋白的带移的那些。

正常人血清中CFH水平的量化

在标准平底96孔板中进行ELISA形式的测定以量化正常人血清中的CFH水平。孔在4℃下用sPspCN(100μl；8μg/ml)包被过夜，并且随后使用补充有5％w/v脱脂干奶粉的磷酸缓冲盐水(PBS)封闭。将孔用补充有0.05％v/v Tween20的PBS洗涤三次。然后将孔用1∶800稀释的一抗(OX24-Biotin(Lifespan Biosciences LS-C62878))在室温下孵育1小时。然后将孔用补充有0.05％v/v Tween 20的PBS洗涤三次。然后将孔用1∶250稀释的链霉亲和素-过氧化物酶聚合物超灵敏剂(ultrasensitive)(Sigma-Aldrich S-2438))在室温孵育1小时。然后将孔用补充有0.05％v/v Tween 20的PBS洗涤三次。然后将孔用邻苯二胺二盐酸盐(o-phenylenediamine，OPD)底物孵育20分钟，然后添加等体积的2.5M H₂SO₄。在490nm下读取孔的吸光度。

结果：

PspCN能够抑制“PNH样”红细胞被酸化血清溶血。图9A和图9B中溶血测定的结果表明，可以通过添加CFH有效地抑制溶血。此外，向反应中添加PspCN甚至更高效地抑制溶血(计算的IC₅₀值为28nM)。当结合CFH与C3b和C3d的结合测定的结果时，这种观察结果的最可能的解释是，PspCN的添加活化了血清中的内源CFH。

用于野生型因子H结合所必需的最小序列是62-140

图10的A-F中示出的传感器图表明，从C末端截短PspCN(第37-140位残基)造成结合亲和力降低至少三个数量级，而可以从N末端移除至少24个残基并且依然保持非常高的CFH结合亲和力。另一方面，PspC(71-140)蛋白表现为结合降低至少三个数量级。还确定62-140构建体也保持了使CFH稳定在活性构象的能力。

Cys修饰的PspCN以与天然序列PspCN类似的亲和力与因子H结合

图11中示出的曲线的形状表明，与野生型PspCN的情况一样，Cys-PspCN(图10的A)和PspCN-Cys(图10的B)具有与CFH有效地不可逆结合的能力，未表现出可检出的脱离率。使用Biacore评估软件进行Cys-PspCN和spCN-Cys相互作用的动力学分析，表明相互作用的K_D为约10^-13M(尽管对于精确K_D，相互作用太紧密而不能使用SPR计算)。该K_D计算值与未修饰PspCN的计算值为相同数量级。

此外，图15表明，通过巯基将半胱氨酸标记的PspCN偶联至表面并不损害其CFH结合亲和力。

另外，参考图16，半胱氨酸标记的PspCN蛋白表现出与无半胱氨酸标记的PspCN类似的衰减加速活性。因此，已经表明PspCN上半胱氨酸标签的存在对PspCN与CFH之间的相互作用有最小的影响。

Cys-PspCN可以用甲氧基-PEG-马来酰亚胺有效地PEG化。

在温和条件下，甲氧基-PEG-马来酰亚胺高效地与Cys-PspCN偶联，如可以通过图12中SDS-PAGE下迁移率的改变看到。在15-kDa和20-kDa标准之间迁移的下带代表未修饰的PspCN。在PEG化反应后，依然有显著量的PspCN保持未PEG化。另一方面，正好在25-kDa标记上方迁移的上带代表已被成功PEG化的PspCN。几乎没有形成PspCN二硫化物连接的二聚体或者具有多重PEG部分的PspCN物质的证据。总的来说，PspCN的这种PEG化方法得到约50％产率的PEG化PspCN；可需要更多定量研究以更准确地确定产率百分比。

可以在“ELISA型”测定中使用PspCN有效地量化CFH。

使用已知浓度的血浆纯化的CFH(Complement Technology)来建立标准曲线(图13A-13B)，其给出了在超过至少两个数量级的良好线性检测。当与标准曲线比较时，可以确定正常人血清中的CFH水平并且发现其在当前可接受的参考范围之内。

PspCN亲和色谱树脂的制备

使经修饰以包含N末端Cys残基和含残基GSGSGSGSGG之接头的PspCN(37-140)(Cys-PspCN)通过其N末端Cys残基偶联至Ultralink碘代乙酰基色谱树脂(ThermoScientific)。基于制造商的说明书进行偶联。使用重力进料色谱柱用50ml偶联缓冲液(50mM Tris，5mM EDTA，pH 8.5)洗涤Ultralink碘代乙酰基树脂(10ml)。将补充有2.5mMTCEP的偶联缓冲液中的Cys-PspCN溶液(20ml，2mg/ml)与Ultralink碘代乙酰基树脂在重力进料色谱柱中于室温混合15分钟。然后使柱直立并且在室温再孵育30分钟。然后通过排掉流体相并且用30ml偶联缓冲液洗涤柱来除去未结合的Cys-PspCN。为了封闭树脂上未反应的碘代乙酰基，将树脂随后与20ml偶联缓冲液中的50mM L-半胱氨酸.HCl在室温混合15分钟。然后使柱直立并且在室温再孵育30分钟。将树脂用60ml的1M NaCl洗涤，然后用补充有0.05％NaN₃的60ml磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。使用这种方法，每ml树脂上偶联约1-1.5mgCys-PspCN。

从人血浆中纯化FH

Alsever溶液中的人血浆(正常混合库)购自TCS Biosciences。将PspCN树脂(5ml)用100ml人血浆在4℃孵育1小时。在孵育后，将混合物施加到空的重力进料色谱柱中并且排掉血浆。然后将树脂用3×50ml的HBS(20mM HEPES；150mM NaCl；pH 7.5)洗涤，然后用2×50ml的4M NaCl进一步洗涤。使用0.1M pH 2.5的甘氨酸缓冲液从柱中洗脱高度纯化的FH。

图17的凝胶中示出了FH从人血浆中的成功分离，其中可以看到上述纯化过程的每个阶段的明显的CFH带。

使用PspCN保护表面

参考图18，如所示根据制造商说明书使用偶联缓冲液中的不同浓度Cys-PspCN将半胱氨酸标记的PspCN固定在马来酰亚胺活化的聚苯乙烯96孔板(Pierce)上。随后将孔用新鲜正常人血清在室温孵育以使得能够发生补体沉积。在类似于常规ELISA方案的方法中使用抗C3抗体检测3b在表面的沉积。作为偶联缓冲液中PspCN浓度的函数来测量沉积的C3b。对于N末端和C末端半胱氨酸标记的PspCN二者，以100μg/ml PspCN包被的表面上C3b的沉积降低约50％。

因此，表面上PspCN包被的存在可显著降低C3b在表面的沉积，并因此降低针对该表面的免疫应答。

使用PspCN作为诊断剂来检测抗FH自身抗体的存在：

参考图19，使用50ug/ml浓度的偶联缓冲液中的PspCN，根据制造商说明书将Cys-PspCN固定在马来酰亚胺活化的96孔板(Pierce)上。随后将板用纯化的人因子H孵育，之后用来自于已知对抗FH自身抗体呈阳性的患者或者正常对照的纯化IgG孵育。随后以类似于标准ELISA的方法使用与生物素缀合的抗人IgG特异性抗体然后是链霉亲和素过氧化物酶来检测抗FH自身抗体。在后续孵育之间用磷酸缓冲盐水洗涤孔三次。

TIGR4菌株

肺炎链球菌TIGR4菌株的PspC蛋白片段(在此称为TIGR4 PspC)表现为与CFH紧密结合。TIGR4 PspC(37-179)以10^-16M的K_D与CFH结合，并且TIGR4 PspC(68-148)以10^-15M的K_D与CFH结合。

来自肺炎链球菌菌株TIGR4的spCN(CbpN)与CFH结合并使其活化的能力

参考图20，来自肺炎链球菌菌株TIGR4的PspCN以与测试来自菌株D39的PspCN相同的方式偶联至Biacore NTA芯片。获得传感器图，其示出了与来自菌株TIGR4的包含第37-179位残基或第68-148位残基的PspCN片段的结合。在每一种情况下，FH与来自TIGR4的PspCN序列的结合导致与D39菌株的观察类似的紧密结合，每一种情况下所计算的KD在10^{- 16}M范围。

参考图21，以用于测试来自于D39菌株的PspCN片段的那些相同的方法，进行基于Biacore的衰减加速测定以测试与FH结合的PspCN(TIGR4)对衰减加速活性的影响。在PspCN(TIGR4第37-179位残基)和PspCN(TIGR4第68-148位残基)二者的情况下，PspCN片段与FH的结合造成FH加速C3转化酶(C3bBb)衰减的能力提高。单独PspCN片段未表现出固有的衰减加速活性。

参考图22和表3，以用于测试来自D39的PspCN片段的那些相同的方法，进行基于Biacore的结合试验以测试与FH结合的PspCN(TIGR4)对FH与C3b和C3d的亲和力的影响。在每种情况下，PspCN(TIGR4第37-179位残基)或PspCN(TIGR4第68-148位残基)与CFH的结合造成C3b结合的显著提高以及CFH的C3b结合亲和力的大幅提高(否则的话将不可检出)。

表3

实施例2的参考文献：

-Brooks-Walter et al.(1999)Infect Immun.1999December；67(12)：6533-6542.

-Ezzell，JL et al.(1991)Blood 77：2764-2773

相关序列

D39 PspC基因序列-完整CDS(SEQ ID NO 3)

由SEQ ID NO 3转录的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)-PspCN序列(第37-140位氨基酸)以黑体字示出：

用于表达PspCN的合成的、密码子优化的DNA序列如下示出(SEQ ID NO 5)：

人CFH氨基酸序列-信号肽具有下划线-未处理形式(SEQ ID NO6)：

序列表

<110> 爱丁堡大学董事会

<120> 具有诊断和治疗用途的蛋白质

<130> P209986WO

<150> GB 1318170.6

<151> 2013-10-14

<160> 9

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 1

Ala Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met

1 5 10 15

Ala Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Ile Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr

35 40 45

Gln Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr

50 55 60

Leu Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys

85 90 95

Asp Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys

100

<210> 2

<211> 79

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 2

Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln

1 5 10 15

Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu

20 25 30

Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu

35 40 45

Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys

65 70 75

<210> 3

<211> 2725

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (2260)..(2260)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2723)..(2723)

<223> n为a、c、g或t

<400> 3

atgcttgtca ataatcacaa atatgtagat catatcttgt ttaggacagt aaaacatcct 60

aattactttt taaatattct tcctgagttg attggcttga ccttgttgag tcatgcttat 120

gtgacttttg ttttagtttt tccagtttat gcagttattt tgtatcgacg aatagctgaa 180

gaggaaaagc tattacatga agttataatc ccaaatggaa gcataaagag ataaatacaa 240

aattcgattt atatacagtt catattgaag taatatagta aggttaaaga aaaaatatag 300

aaggaaataa acatgtttgc atcaaaaagc gaaagaaaag tacattattc aattcgtaaa 360

tttagtattg gagtagctag tgtagctgtt gccagtcttg ttatgggaag tgtggttcat 420

gcgacagaga acgagggaag tacccaagca gccacttctt ctaatatggc aaagacagaa 480

cataggaaag ctgctaaaca agtcgtcgat gaatatatag aaaaaatgtt gagggagatt 540

caactagata gaagaaaaca tacccaaaat gtcgccttaa acataaagtt gagcgcaatt 600

aaaacgaagt atttgcgtga attaaatgtt ttagaagaga agtcgaaaga tgagttgccg 660

tcagaaataa aagcaaagtt agacgcagct tttgagaagt ttaaaaaaga tacattgaaa 720

ccaggagaaa aggtagcaga agctaagaag aaggttgaag aagctaagaa aaaagccgag 780

gatcaaaaag aagaagatcg tcgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt 840

gaaattgctg agttcgatgt gaaagttaaa gaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 900

gctaaagaat ctcgaaacga gggcacaatt aagcaagcaa aagagaaagt tgagagtaaa 960

aaagctgagg ctacaaggtt agaaaacatc aagacagatc gtaaaaaagc agaagaagaa 1020

gctaaacgaa aagcagatgg taagttgaag gaagctaatg tagcgacttc agatcaaggt 1080

aaaccaaagg ggcgggcaaa acgaggagtt cctggagagc tagcaacacc tgataaaaaa 1140

gaaaatgatg cgaagtcttc agattctagc gtaggtgaag aaactcttcc aagctcatcc 1200

ctgaaatcag gaaaaaaggt agcagaagct gagaagaagg ttgaagaagc tgagaaaaaa 1260

gccaaggatc aaaaagaaga agatcgccgt aactacccaa ccaatactta caaaacgctt 1320

gaccttgaaa ttgctgagtc cgatgtgaaa gttaaagaag cggagcttga actagtaaaa 1380

gaggaagcta aggaacctcg agacgaggaa aaaattaagc aagcaaaagc gaaagttgag 1440

agtaaaaaag ctgaggctac aaggttagaa aacatcaaga cagatcgtaa aaaagcagaa 1500

gaagaagcta aacgaaaagc agcagaagaa gataaagtta aagaaaaacc agctgaacaa 1560

ccacaaccag cgccggctac tcaaccagaa aaaccagctc caaaaccaga gaagccagct 1620

gaacaaccaa aagcagaaaa aacagatgat caacaagctg aagaagacta tgctcgtaga 1680

tcagaagaag aatataatcg cttgactcaa cagcaaccgc caaaaactga aaaaccagca 1740

caaccatcta ctccaaaaac aggctggaaa caagaaaacg gtatgtggta cttctacaat 1800

actgatggtt caatggcaac aggatggctc caaaacaacg gttcatggta ctatctaaac 1860

gctaatggtg ctatggcgac aggatggctc caaaacaatg gttcatggta ctatctaaac 1920

gctaatggtt caatggcaac aggatggctc caaaacaatg gttcatggta ctacctaaac 1980

gctaatggtg ctatggcgac aggatggctc caatacaatg gttcatggta ctacctaaac 2040

agcaatggcg ctatggcgac aggatggctc caatacaatg gctcatggta ctacctcaac 2100

gctaatggtg atatggcgac aggatggctc caaaacaacg gttcatggta ctacctcaac 2160

gctaatggtg atatggcgac aggatggctc caatacaacg gttcatggta ttacctcaac 2220

gctaatggtg atatggcgac aggttgggtg aaagatggan atacctggta ctatcttaaa 2280

gcatcaggtg ctatgaaagc aagccaatgg ttcaaagtat cagataaatg gtactatgtc 2340

aatggctcag gtgcccttgc agtcaacaca actgtagatg gctatggagt caatgccaat 2400

ggtgaatggg taaactaaac ctaatataac tagttaatac tgacttcctg taagaacttt 2460

ttaaagtatt ccctacaaat accatatcct ttcagtagat aatataccct tgtaggaagt 2520

ttagattaaa aaataactct gtaatctcta gccggattta tagcgctaga gactacggag 2580

tttttttgat gaggaaagaa tggcggcatt caagagactc tttaagagag ttacgggttt 2640

taaactatta agccttctcc aattgcaaga gggcttcaat ctctgctagg gtgctagctt 2700

gcgaaatggc tccacggagt ttngc 2725

<210> 4

<211> 701

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (650)..(650)

<223> Xaa可以是任何天然氨基酸

<400> 4

Met Phe Ala Ser Lys Ser Glu Arg Lys Val His Tyr Ser Ile Arg Lys

1 5 10 15

Phe Ser Ile Gly Val Ala Ser Val Ala Val Ala Ser Leu Val Met Gly

20 25 30

Ser Val Val His Ala Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr

35 40 45

Ser Ser Asn Met Ala Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val

50 55 60

Val Asp Glu Tyr Ile Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg

65 70 75 80

Arg Lys His Thr Gln Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile

85 90 95

Lys Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys

100 105 110

Asp Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu

115 120 125

Lys Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala

130 135 140

Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu

145 150 155 160

Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu

165 170 175

Glu Ile Ala Glu Phe Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu

180 185 190

Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gln

195 200 205

Ala Lys Glu Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu

210 215 220

Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys

225 230 235 240

Ala Asp Gly Lys Leu Lys Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Asp Gln Gly

245 250 255

Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr

260 265 270

Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly

275 280 285

Glu Glu Thr Leu Pro Ser Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala

290 295 300

Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln

305 310 315 320

Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu

325 330 335

Asp Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu

340 345 350

Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile

355 360 365

Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg

370 375 380

Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys

385 390 395 400

Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln

405 410 415

Pro Gln Pro Ala Pro Ala Thr Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Pro

420 425 430

Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln

435 440 445

Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu

450 455 460

Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Thr Glu Lys Pro Ala Gln Pro Ser Thr

465 470 475 480

Pro Lys Thr Gly Trp Lys Gln Glu Asn Gly Met Trp Tyr Phe Tyr Asn

485 490 495

Thr Asp Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Asn Asn Gly Ser Trp

500 505 510

Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Asn

515 520 525

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ser Met Ala Thr Gly

530 535 540

Trp Leu Gln Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala

545 550 555 560

Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn

565 570 575

Ser Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Trp

580 585 590

Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Asp Met Ala Thr Gly Trp Leu Gln Asn

595 600 605

Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Asp Met Ala Thr Gly

610 615 620

Trp Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Asp

625 630 635 640

Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Gly Xaa Thr Trp Tyr Tyr Leu Lys

645 650 655

Ala Ser Gly Ala Met Lys Ala Ser Gln Trp Phe Lys Val Ser Asp Lys

660 665 670

Trp Tyr Tyr Val Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ala Val Asn Thr Thr Val

675 680 685

Asp Gly Tyr Gly Val Asn Ala Asn Gly Glu Trp Val Asn

690 695 700

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于表达PspCN的密码子优化的DNA序列

<400> 5

gcaaccgaaa atgaaggtag cacccaggca gcaaccagca gcaatatggc aaaaaccgaa 60

catcgtaaag cagccaaaca ggttgtggat gagtatatcg aaaaaatgct gcgtgaaatt 120

cagctggatc gtcgtaaaca tacccagaat gttgcactga acattaaact gagcgccatc 180

aaaaccaaat atctgcgtga actgaatgtg ctggaagaga aaagcaaaga tgaactgccg 240

agcgaaatta aagcaaaact ggatgcagcc tttgaaaaat tcaaaaaaga taccctgaaa 300

ccgggtgaga aataa 315

<210> 6

<211> 1231

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1 5 10 15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

20 25 30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

50 55 60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65 70 75 80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

100 105 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

115 120 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

130 135 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145 150 155 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

165 170 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

180 185 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

195 200 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

245 250 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

260 265 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

275 280 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

290 295 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

325 330 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

340 345 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

355 360 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

370 375 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385 390 395 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

405 410 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

420 425 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

435 440 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

450 455 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465 470 475 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys

485 490 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

500 505 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

515 520 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

530 535 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

565 570 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

580 585 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

595 600 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

610 615 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625 630 635 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

645 650 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

660 665 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

675 680 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

690 695 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705 710 715 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

725 730 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

740 745 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

755 760 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

770 775 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785 790 795 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

805 810 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

820 825 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

835 840 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

850 855 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865 870 875 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

885 890 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

900 905 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

915 920 925

Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His

930 935 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945 950 955 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

965 970 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

980 985 990

Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr

995 1000 1005

Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys

1010 1015 1020

Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr

1025 1030 1035

Gly Arg Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr

1040 1045 1050

Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro

1055 1060 1065

Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met

1070 1075 1080

Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu

1085 1090 1095

Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro

1100 1105 1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

1115 1120 1125

Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln

1130 1135 1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp Ser

1145 1150 1155

Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

1160 1165 1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

1175 1180 1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

1190 1195 1200

Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

1205 1210 1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

1220 1225 1230

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N末端Cys修饰的PspCN

<400> 7

Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Glu Asn Glu

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala Lys Thr Glu His

20 25 30

Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu Lys Met Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn Val Ala Leu

50 55 60

Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg Glu Leu Asn

65 70 75 80

Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala

85 90 95

Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys Pro

100 105 110

Gly Glu Lys

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C末端Cys修饰的PspCN

<400> 8

Ala Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met

1 5 10 15

Ala Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Ile Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr

35 40 45

Gln Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr

50 55 60

Leu Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys

85 90 95

Asp Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Cys

115

<210> 9

<211> 143

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 9

Ala Thr Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gln Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg

1 5 10 15

Ala Asn Glu Ser Gln Ala Glu Gln Gly Glu Gln Pro Lys Lys Leu Asp

20 25 30

Ser Glu Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys

35 40 45

Ile Val Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile

50 55 60

Thr Val Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu

65 70 75 80

Asn Lys Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gln Leu Gln Ile Leu Met

85 90 95

Met Glu Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys

100 105 110

Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala

115 120 125

Ser Asp Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys

130 135 140

Claims (48)

1.重组蛋白质，其能够与补体因子H(CFH)结合，并因此与未结合CFH相比，诱导已结合CFH与C3d和C3b之结合的提高。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质能够以1×10^-10M或更低的K_D与野生型CFH结合以形成复合物。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述蛋白质能够以1×10^-13M或更低的K_D与野生型CFH结合以形成复合物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质来自于细菌毒力因子。

5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质来自于肺炎球菌表面蛋白。

6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述蛋白质来自于来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌表面蛋白C(PspC)。

7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中所述蛋白质来自于肺炎链球菌的菌株D39(NCTCno 7466)的PspC。

8.根据权利要求6所述的蛋白质，其中所述蛋白质来自于肺炎链球菌的菌株TIGR4(NCTC no 7465)的PspC。

9.根据权利要求6至权利要求8中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含长为70至150个氨基酸的PspC片段或其变体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含以下序列：

ATENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEK(SEQ ID NO 1)

或者其功能性变体或片段；或者

KQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEK(SEQ ID NO 2)

或者其功能性变体或片段。

11.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含以下序列：

ATENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEK(SEQID NO 9)

或者其功能性变体或片段。

12.根据权利要求7所述的蛋白质，其中所述蛋白质至少包含PspC的第68-136位氨基酸或者其功能性变体。

13.包含与CFH结合的权利要求1至12中任一项所述蛋白质的复合材料，其中CFH保持为比单独CFH所采用的构象更有活性的构象。

14.核酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的蛋白质。

15.重组载体，其包含根据权利要求14所述的多核苷酸。

16.能够表达重组蛋白的细胞，其特征在于所述细胞包含编码待表达的重组蛋白的根据权利要求14所述的多核苷酸。

17.细胞培养物，其包含根据权利要求16所述的细胞。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质，其固定在表面上。

19.医学装置，其中所述医学装置的表面至少部分地涂覆有根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质。

20.根据权利要求19所述的医学装置，其中所述装置的基本上所有的外表面(即，将与身体组织和/或体液接触的那些)均涂覆有所述蛋白质。

21.根据权利要求19和权利要求20中任一项所述的医学装置，其中所述医学装置是植入式医学装置或微胶囊。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的医学装置，其中所述装置涂覆有与CFH结合的权利要求1至12中任一项所述蛋白质的复合材料。

23.处理医学装置的方法，所述方法包括：

-提供医学装置；

-提供根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质；以及

-使所述蛋白质与所述医学装置表面的至少一部分结合。

24.检测样品中CFH的存在或量的方法，所述方法包括：

-提供样品；

-提供根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质；

-使所述样品与所述蛋白质接触；以及

-检测所述蛋白质与所述样品中存在的CFH的结合。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法检测来自对象的生物样品中CFH的存在。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述生物样品是血液样品和血液级分如血浆中的一种。

27.检测样品中PspCN的存在或量的方法，所述方法包括：

-提供样品；

-提供CFH；

-使所述样品与CFH接触；以及

-检测PspCN与所述样品中存在的CFH的结合。

28.从样品中纯化或分离CFH的方法，所述方法包括：

-提供固定在表面上的根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质；

-提供样品；

-使所述样品从所述表面上经过；以及

-回收与所述表面结合的CFH；和/或

-回收缺少或耗尽CFH的样品。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述表面是容器、导管、基体、珠子、凝胶或者色谱中使用之任何填充材料的表面中的一种。

30.从样品中纯化或分离PspC、PspCN或者PspCN与其他蛋白质的融合物的方法，所述方法包括：

-提供固定在表面上的CFH；

-提供样品；

-使所述样品从所述表面上经过；以及

-回收与所述表面结合的PspC、PspCN或者PspCN与其他蛋白质的融合物；和/或

-回收缺少或耗尽PspC的样品。

31.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质，其用于治疗或预防疾病。

32.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质，其用于治疗或预防与对象中异常的补体调节活性相关或者其中降低补体活性有益的疾病(病症)或者其他医学并发症。

33.根据权利要求32所述的蛋白质，其中所述疾病(病症)或者其他医学病症是以下的一种或更多种：

-阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；

-非典型溶血尿毒综合征(aHUS)；

-致密沉积物病(DDD)；

-年龄相关性黄斑变性(AMD)；

-系统性红斑狼疮(SLE)；

-脓毒症；和

-阿尔茨海默病。

34.药物制剂，其包含权利要求1至12中任一项所述的蛋白质或者编码所述蛋白质的核酸。

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其还包含可药用载体。

36.根据权利要求34或权利要求35中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物用合适的赋形剂溶液作为稀释剂配制成冷冻干燥物。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物配制成适于向人静脉内施用的药物组合物。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在囊泡中递送。

39.药包或药盒，其包括一个或更多个容器，所述容器填充有根据权利要求34至38中任一项所述的药物组合物的一种或更多种成分。

40.根据权利要求39所述的药包或药盒，其还包含管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的公告，所述公告反映所述机构批准用于人施用的制造、使用或销售。

41.通过向对象施用有效量的根据权利要求34至38中任一项所述的药物组合物来治疗或预防对象中疾病的方法。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述治疗方法提供对与对象中异常补体活性相关的疾病的治疗或预防。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述对象是人。

45.根据权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述疾病是以下的一种或更多种：

-阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；

-非典型溶血尿毒综合征(aHUS)；

-致密沉积物病(DDD)；

-年龄相关性黄斑变性(AMD)；

-系统性红斑狼疮(SLE)；

-脓毒症；和

-阿尔茨海默病。

46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其包括以下步骤：施用包含药学上有效量的根据权利要求1至12中任一项所述蛋白质的药物组合物或者包含能够在体内表达药学上有效量的根据权利要求1至12中任一项所述蛋白质的核酸的组合物。

47.根据权利要求45所述的方法，其中药学上有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质可以是约1μg蛋白质/1kg对象体重至约500mg蛋白质/1kg对象体重。

48.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述方法包括将根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质靶向所述对象中的特定部位或组织。

Images