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Description
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって前記対象にsiNAコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法に関する。本明細書において使用される句「ミオスタチンレベルを低減する」は、ミオスタチン遺伝子の発現を低減することまたはミオスタチンタンパク質レベルを低減することを指す。対象に全身的に投与されるミオスタチンsiNAコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、RNA干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象の筋肉量の増加をもたらす。「筋肉増強」および「筋肉を増強する」という用語は、本明細書において交換可能であることが意図され、過形成の誘導(筋線維数の増加)、肥大の誘導(筋線維直径の増加)、またはその両方を含むが、これらに限定されない。増加は、1型および/または2型筋線維におけるものとすることができる。本発明の本態様は、本明細書において記載されるミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を全身的に送達するによって、損傷した筋骨組織の再生を、それを必要とする対象において行う方法にさらに関する。
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、前記対象にsiNAコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンsiNAコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、RNA干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象における筋肉の性能の増加をもたらす。「筋肉の性能の増強」は、萎縮の減少、筋肉耐久性の増加、および全体的な筋肉強度の増加(例えば収縮力の増加)のうちの1つまたは複数を含むが、これらに限定されない。本発明のさらなる態様は、対象において筋肉の性能を増強するのに使用するためのミオスタチンsiNAコンジュゲートを含む。
本発明の別の実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および/または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害(例えば筋力低下、筋萎縮症)の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および/または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害(例えば筋力低下、筋萎縮症)の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンsiNAコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、siNAコンジュゲートが、親油性部分(例えばコレステロール)に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするsiNA分子を含み、siNAコンジュゲートがRNA干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンsiNAコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、RNA干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現における減少は、対象における筋肉量の増加および/または筋肉の性能の増強をもたらす。
親油性部分は、siNA分子の末端(例えばsiNA分子のセンス鎖の3’もしくは5’末端)への連結を通してまたはsiNA分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンsiNA分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンsiNA分子のパッセンジャー鎖(センス鎖)の3’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンsiNA分子のパッセンジャー鎖の5’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンsiNA分子のガイド鎖(アンチセンス鎖)の3’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンsiNAコンジュゲートが、2つ以上の付加された親油性部分(例えば、パッセンジャー鎖の3’および5’末端の両方に付加された親油性部分;ガイド鎖の3’末端およびパッセンジャー鎖の5’末端に付加された親油性部分)を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、siNA分子が、親油性部分に連結される。別の実施形態では、親油性部分が、コレステロールである。別の実施形態では、親油性部分が、siNA分子の3’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、siNA分子の5’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、siNA分子の3’および5’末端のそれぞれに付加される。
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンsiNAコンジュゲートのsiNA分子部分が、アンチセンス鎖の5’末端でリン酸化される。リン酸基は、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートとすることができる。
親油性部分は、siNA分子の末端(例えばsiNA分子のオリゴヌクレオチド鎖の3’もしくは5’末端)への付加を通してまたはsiNA分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンsiNA分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンsiNA分子のパッセンジャー鎖(センス鎖)の3’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンsiNA分子のパッセンジャー鎖の5’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンsiNA分子のガイド鎖(アンチセンス鎖)の3’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンsiNA分子のガイド鎖(アンチセンス鎖)の5’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンsiNAコンジュゲートが、2つ以上の付加された親油性部分(例えば、パッセンジャー鎖の3’および5’末端の両方に付加された親油性部分;ガイド鎖の3’末端およびパッセンジャー鎖の5’末端に付加された親油性部分)を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
Mstn siRNAおよび非ターゲティングコントロールsiRNAのヌクレオチド配列を表3に示す。表3の二本鎖siRNA分子は、センス鎖(パッセンジャー鎖としても知られている)およびアンチセンス鎖(ガイド鎖としても知られている)を含有し、各鎖は21ヌクレオチド(第1位(5’)〜第21位(3’))で構成され、内部および末端化学修飾ヌクレオチドの両方を含有する。それぞれのsiRNA分子の名称は、第1列に提供され、分子が標的にされるマウスMstn mRNA領域に対応する。表3の第2列の「鎖」は、示される行の特定の配列が二本鎖のセンス(S)であるかアンチセンス(A/S)鎖であるかを示す。表3の第3列の「5’−第1位ヌクレオチド」は、示されるsiRNA分子のセンスおよびアンチセンス鎖の第1位を記述し、それぞれ、5’キャップ成分の付いたヌクレオチドで構成される。5’−第1位ヌクレオチドのそれぞれの化学構造は以下の表6aに提供される。siRNA分子のセンスおよびアンチセンス鎖のそれぞれの第2〜20位にわたるヌクレオチド配列は表3の第4列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第4列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表6bに提供される。表3の第5列の「ヌクレオチド位置21−3’」はsiRNAのセンスまたはアンチセンス鎖の最3’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「omeU−iB」または「omeUSup」によって表される(構造については以下の表6cを参照)。表3のsiRNA分子の各鎖(第1〜21位)の配列番号は第6列に提供される。表3の各siRNA分子は、分子の両末端に2つのヌクレオチドから構成される3’オーバーハングを有する。
実施例2:Mtsn siRNAコレステロールコンジュゲート
コレステロールコンジュゲーション − 単一のコレステロール要素を、表3に記載されるそれぞれのsiRNA分子のセンス鎖の3’末端に付加した。3’末端上にコレステロール単位を有するオリゴヌクレオチドの調製のために、ジメトキシトリチル(DMT)保護第一級アルコールも含有するあらかじめ負荷されたコハク酸コレステロールを有するデオキシシチジリル(deoxycytidylyl)−デオキシグアノシン(CpG)(構造については以下表6dを参照)は、対応するオリゴヌクレオチド配列の合成のために使用した(実施例1を参照)。典型的に、最後の5’−DMT保護基は、オリゴ合成の間に除去した。次いで、オリゴヌクレオチドは、メチルアミン水などの塩基性溶液による処理によってCpGから切断し、C18などの逆相樹脂を有するクロマトグラフィによって精製した。この精製オリゴは、所望のオリゴヌクレオチド二重鎖を調製するために、その対応する相補鎖にアニールさせた。
コレステロールコンジュゲーション − 単一のコレステロール要素を、表3に記載されるそれぞれのsiRNA分子のセンス鎖の3’末端に付加した。3’末端上にコレステロール単位を有するオリゴヌクレオチドの調製のために、ジメトキシトリチル(DMT)保護第一級アルコールも含有するあらかじめ負荷されたコハク酸コレステロールを有するデオキシシチジリル(deoxycytidylyl)−デオキシグアノシン(CpG)(構造については以下表6dを参照)は、対応するオリゴヌクレオチド配列の合成のために使用した(実施例1を参照)。典型的に、最後の5’−DMT保護基は、オリゴ合成の間に除去した。次いで、オリゴヌクレオチドは、メチルアミン水などの塩基性溶液による処理によってCpGから切断し、C18などの逆相樹脂を有するクロマトグラフィによって精製した。この精製オリゴは、所望のオリゴヌクレオチド二重鎖を調製するために、その対応する相補鎖にアニールさせた。
結果 − 筋肉におけるコレステロールコンジュゲートの取込みの潜在的なメカニズムおよびリポタンパク質粒子とのコンジュゲートの関連が取込みに必要とされるかどうかを検査するために、パッセンジャー鎖の3’または5’末端に付加された単一のコレステロール要素を有するCtnnb1 siRNA分子の効能を、野生型、LDL受容体(LDLR)−/−、およびApoE−/−マウスにおいて検査した。マウスは、14mpkでのCtnnb1:1797[3’Chol]siRNAの単回i.v.注射により治療し、Ctnnb1 mRNAを、72時間後に腓腹筋において測定した(図7A)。最大60%のmRNAノックダウンが、wtマウスにおいて観察された。ApoE−/−マウスにおいてmRNA KDの低下があり(50%のKD)、LDLR−/−マウスにおいてKDの低減の傾向がある。データは、Ctnnb1コレステロールコンジュゲートの取込みが、筋肉においてLDL受容体を通してまたは任意のApoE含有リポタンパク質を介して部分的にだけ媒介されることを示唆する。
パッセンジャー鎖上のコレステロールの位置がコレステロールコンジュゲートの効能にとって本質的かどうかを決定するために、パッセンジャー鎖の3’または5’末端上にコレステロールを有するCtnnb1−cholコンジュゲートをインビボにおいて検査した(図7B)。CD−1マウスを、15mpkの一方のバージョンのCtnnb1−cholにより治療し、3’位にコレステロールを有するPBSコントロールおよびプラセボ5−cholと比較した。Ctnnb1 mRNAレベルは、注射の72時間後に腓腹筋において検査した。データは、筋肉において非常に効果的なコレステロールコンジュゲートを作成するために両方の位置を使用することができることを示唆する。
Claims (21)
- 親油性部分とミオスタチン遺伝子を標的とするsiNA分子を含み、siNA分子が親油性部分に連結されており、かつRNA干渉を媒介する、全身投与により対象におけるミオスタチン遺伝子の発現を調整するための、ミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記親油性部分が、コレステロールである、請求項1に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記親油性部分が、前記siNA分子の3’末端または5’末端に付加される、請求項1または2に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記siNA分子が、1つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記siNA分子が、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖分子であり、前記アンチセンス鎖が、前記センス鎖に対して相補的である、請求項1から4のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記アンチセンス鎖および前記センス鎖がそれぞれ独立して、15〜30ヌクレオチドの長さである、請求項5に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記siNA分子が、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の鎖において1つまたは複数の3’オーバーハングヌクレオチドを含む、請求項5または6に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記親油性部分が、前記siNA分子の前記センス鎖の3’末端、前記siNA分子の前記センス鎖の5’末端、または前記siNA分子の前記アンチセンス鎖の3’末端のいずれかに付加される、請求項5から7のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記siNA分子が、前記分子の3’末端上にキャップを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記対象が、ヒトである、請求項1から9のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 前記対象が、家畜である、請求項1から9のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲート。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲートを含み、全身投与される、対象における筋肉量を増強するための組成物。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲートを含み、全身投与される、対象における筋肉の性能を増強するための組成物。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のミオスタチンsiNAコンジュゲートを含み、全身投与される、ヒトまたは動物用医薬組成物。
- 対象における筋骨格系疾患もしくは障害、または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害の処置に用いられる、請求項14に記載の医薬組成物。
- ミオスタチンの発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸(siNA)分子であって、
(a)前記siNAが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
(b)各鎖が、独立して、15〜30ヌクレオチドの長さであり、および
(c)前記アンチセンス鎖が、
5’−AUGGCAAAGAACAAAUAAU−3’(配列番号1)、
5’−GGCAAAGAACAAAUAAUAU−3’(配列番号2)、
5’−ACUCCAGAAUAGAAGCCAU−3’(配列番号3)、または
5’−UUUGGAAGAUGACGAUUAU−3’(配列番号4)
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも15ヌクレオチドを含む、
二本鎖低分子干渉核酸(siNA)分子。 - ミオスタチンの発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸(siNA)分子であって、
(a)前記siNAが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
(b)各鎖が、独立して、15〜30ヌクレオチドの長さであり、および
(c)前記アンチセンス鎖が、
5’−AUUAUUUGUUCUUUGCCAU−3’(配列番号18)、
5’−AUAUUAUUUGUUCUUUGCC−3’(配列番号19)、
5’−AUGGCUUCUAUUCUGGAGU−3’(配列番号20)、または
5’−AUAAUCGUCAUCUUCCAAA−3’(配列番号21)
の少なくとも15ヌクレオチド配列を含み、
前記ヌクレオチドの1つまたは複数が、化学的に修飾されていてよい、
二本鎖低分子干渉核酸(siNA)分子。 - 前記siNA分子が、
5’−AUGGCAAAGAACAAAUAAU−3’(配列番号1)および
5’−AUUAUUUGUUCUUUGCCAU−3’(配列番号18)、
5’−GGCAAAGAACAAAUAAUAU−3’(配列番号2)および
5’−AUAUUAUUUGUUCUUUGCC−3’(配列番号19)、
5’−ACUCCAGAAUAGAAGCCAU−3’(配列番号3)および
5’−AUGGCUUCUAUUCUGGAGU−3’(配列番号20)、または
5’−UUUGGAAGAUGACGAUUAU−3’(配列番号4)および
5’−AUAAUCGUCAUCUUCCAAA−3’(配列番号21)
のいずれかを含む、請求項16または17に記載の二本鎖siNA分子。 - 前記siNA分子が、親油性部分に連結される、請求項16から18のいずれか一項に記載の二本鎖siNA分子。
- 前記親油性部分が、コレステロールである、請求項19に記載の二本鎖siNA分子。
- 前記親油性部分が、前記siNA分子の3’末端または5’末端に付加される、請求項19または20に記載の二本鎖siNA分子。
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