JP2017209019A - 核酸増幅反応方法、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応用試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる核酸増幅反応方法を提供する。
【解決手段】蛍光標識プローブを含む反応液に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与する工程を含み、前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であり、前記反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【選択図】図１１

Description

本発明は、核酸増幅反応方法、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応用試薬に関する。

近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。

ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。

例えば特許文献１には、反応液（液滴）と、反応液と混和せず反応液よりも比重の小さい液体（オイル等）とが、充填された反応容器を、回転軸の回りに回転させ、比重差により反応液を移動させて熱サイクルを行う核酸増幅反応装置が記載されている。特許文献１では、核酸が増幅したことを検知するために、蛍光標識プローブを用いている。

特開２０１２−１１５２０８号公報

ところで、ＰＣＲによる産物の生成時間の短縮化が求められている。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、ＰＣＲの反応時間（変性反応のための時間や、アニーリング反応／伸長反応のための時間）を短縮させると（ＰＣＲを高速化させると）、例えば核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションせず、核酸の増幅を高感度で検知することができない場合があった。

本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる核酸増幅反応方法を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる核酸増幅反応用試薬を提供することにある。

本発明に係る核酸増幅反応方法は、
蛍光標識プローブを含む反応液に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であり、
前記反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である。

このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる（詳細は後述する「４． 実験例」参照）。

本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記蛍光標識プローブの濃度は、２．４μＭ以上４８μＭ以下であってもよい。

このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をより高感度で検知することができる。

本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記蛍光標識プローブの濃度は、６μＭ以上４８μＭ以下であってもよい。

このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をよりいっそう高感度で検知することができる。

本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記蛍光標識プローブの濃度は、１２μＭ以上４８μＭ以下であってもよい。

このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をさらによりいっそう高感度で検知することができる。

本発明に係る核酸増幅反応装置は、
蛍光標識プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり前記反応液と混和しない液体と、を収容する核酸増幅反応用カートリッジを装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応用カートリッジの第１領域を第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記核酸増幅反応用カートリッジの前記第１領域とは異なる第２領域を前記第１の温度とは異なる第２温度に加熱する第２加熱部と、
核酸を増幅するための熱サイクルを付与するように、前記反応液を前記第１領域と前記第２領域との間を往動させる移動機構と、
を含み、
前記移動機構は、前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間が１秒以上１０秒以下となるように、前記反応液を移動させ、
前記反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である。

このような核酸増幅反応装置では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる。

本発明に係る核酸増幅反応用試薬は、
核酸を増幅するための熱サイクルが付与される反応液に含まれる核酸増幅反応用試薬であって、
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であり、
前記核酸増幅反応用試薬は、蛍光標識プローブを含み、
前記反応液に含まれる前記蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である。

このような核酸増幅反応用試薬では、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる。

本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す斜視図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す斜視図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す分解斜視図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。 本実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。 本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。 アニーリング反応および伸長反応のための時間を６秒としたときのＰＣＲ結果を示すグラフ。 アニーリング反応および伸長反応のための時間を１０秒としたときのＰＣＲ結果を示すグラフ。 アニーリング反応および伸長反応のための時間を２０秒としたときのＰＣＲ結果を示すグラフ。 アニーリング反応および伸長反応のための時間が６秒の場合の反応液と２０秒の場合の反応液との電気泳動の結果。 蛍光標識プローブの濃度が０．６μＭ、２４μＭ、４８μＭの場合の反応液の電気泳動の結果。

以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

１． 核酸増幅反応用試薬
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬について説明する。核酸増幅反応用試薬は、核酸増幅反応用カートリッジに収容されている。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジ１０を模式的に示す断面図である。

核酸増幅反応用カートリッジ１０は、図１に示すように、容器１２と、キャップ１４と、を含む。

容器１２は、図１に示すように、例えば、円筒状の側壁部１２ａと、半球状の底部１２ｂと、を有している。容器１２は、流路１６を有する。流路１６は、容器１２によって形成されている。流路１６は、円筒状の側壁部１２ａの中心軸（図示せず）に沿って延在している。キャップ１４は、容器１２の底部１２ｂに対向する端部の開口を塞ぐ。キャップ１４は、容器１２に対して、着脱可能である。容器１２およびキャップ１４の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。

容器１２の底部１２ｂに、例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が固定されている。このような核酸増幅反応用カートリッジ１０に、図２に示すようにキャップ１４を外してピペット２等を用いて鋳型核酸溶液２２を導入すると、導入された鋳型核酸溶液２２は、図３に示すように底部１２ｂまで沈降し、核酸増幅反応用試薬２４と接触する。核酸増幅反応用試薬２４は、鋳型核酸溶液２２の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液２２に取り込まれ、図４に示すように反応液２０となる。したがって、反応液２０は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬２４を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。

反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置される。反応液２０は、液体３０中に液滴の状態で保持される。図示の例では、反応液２０の形状は、球状である。反応液２０は、例えば、液体３０よりも比重が大きい。反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の移動に伴い、流路１６を、容器１２に対して相対的に移動する。

鋳型核酸溶液２２は、鋳型核酸を含む溶液である。鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入するときは、キャップ１４は、容器１２から取り外され、鋳型核酸溶液２２の導入後に再び容器１２に取り付けられる。

鋳型核酸溶液２２は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液２２における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。

核酸増幅反応用試薬２４は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、例えば、容器１２の底部１２ｂに凍結乾燥（フリーズドライ）されている。核酸増幅反応用試薬２４は、核酸の（標的核酸の）増幅反応に使用される試薬である。核酸増幅反応用試薬２４は、例えば、プライマー、ポリメラーゼ、蛍光標識プローブ、およびｄＮＴＰを含む。

プライマーは、鋳型核酸にアニールするよう設計されている。核酸増幅反応用試薬２４は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応液２０に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上３．２μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応液２０に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、例えば、同じである。

ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。反応液２０に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上４Ｕ以下であり、好ましくは１Ｕ以上４Ｕ以下である。

蛍光標識プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる。蛍光標識プローブは、例えば、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブである。加水分解プローブである蛍光標識プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーション（アニーリング）して二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによって蛍光標識プローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。

反応液２０に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下であり、好ましくは２．４μＭ以上４８μＭ以下であり、より好ましくは６μＭ以上４８μＭ以下であり、さらにより好ましくは１２μＭ以上４８μＭ以下である。上記の範囲であれば、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅を高感度で検知することができる（詳細は「４． 実験例」参照）。

ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、およびｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する。反応液２０に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．１２５ｍＭ以上１ｍＭ以下であり、好ましくは０．２５ｍＭ以上１ｍＭ以下である。

なお、反応液２０は、さらに、水やバッファー（例えば、ＭｇＣｌ_２とＴｒｉｓ−ＨＣｌとＫＣｌとを混合させたもの）を含んでいてもよい。

液体３０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置されている。図示の例では、流路１６は、反応液２０および液体３０で充填されている（満たされている）。液体３０は、反応液２０とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体３０は、さらに鋳型核酸溶液２２および核酸増幅反応用試薬２４とも混和しない。液体３０は、反応液２０とは比重が異なる。具体的には、液体３０は、反応液２０よりも比重が小さい。そのため、反応液２０は、重力の作用によって、重力の作用する方向に移動する。液体３０は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。

なお、上記では、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が容器１２の底部１２ｂに固定されおり、鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入して、鋳型核酸溶液２２が核酸増幅反応用試薬２４と接触することにより反応液２０が形成される例について説明した。しかしながら、鋳型核酸と核酸増幅反応用試薬２４とを含む溶液を、容器１２外で調製し、該溶液を、液体３０によって充填された容器１２内に導入されることで、容器１２内に反応液２０が配置されてもよい。

２． 核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図５および図６は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す斜視図であり、図５は、蓋体６０を開いた状態を示し、図６は、蓋体６０を閉じた状態を示している。図７は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の本体部５０を模式的に示す分解斜視図である。図８および図９は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す図６のＡ−Ａ線断面図である。図１０は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の機能ブロック図である。

なお、便宜上、図５では、核酸増幅反応用カートリッジ１０を簡略化して図示している。また、図５および図６では、蛍光測定器８０の図示を省略している。また、図８および図９においては、矢印ｇの方向が重力の作用する方向（重力作用方向）である。図８では、加熱部５２，５３の配置が第１配置である状態を示し、図９では、加熱部５２，５３の配置が第２配置である状態を示している。また、便宜上、図１０では、本体部５０および蓋体６０の図示を省略している。

核酸増幅反応装置１００は、図５〜図１０に示すように、本体部５０と、蓋体６０と、移動機構７０と、蛍光測定器８０と、処理部９０と、操作部９２と、表示部９４と、記憶部９６と、を含む。核酸増幅反応装置１００は、例えば、昇降式ＰＣＲ装置である。

本体部５０は、図７に示すように、装着部５１と、第１加熱部５２と、第２加熱部５３と、スペーサー５４と、底板５５と、フランジ５６と、固定板５７と、を有している。

装着部５１は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着可能な構造を有している。具体的には、装着部５１は、図５に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１０を差し込んで（挿入して）装着する構造を有している。図７に示す例では、装着部５１は、第１加熱部５２の第１ヒートブロック５２ｂ、スペーサー５４、および第２加熱部５３の第２ヒートブロック５３ｂを貫通する貫通孔である。装着部５１の数は、複数であってもよく、図示の例の例では、２０個である。

第１加熱部５２は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、図８および図９に示すように、流路１６の第１領域１６ａを第１温度に加熱する。図示の例では、第１加熱部５２は、第２加熱部５３よりも蓋体６０側に位置している。

第１加熱部５２は、例えば、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材と、を有している。図７に示す例では、第１加熱部５２は、第１ヒーター５２ａと、第１ヒートブロック５２ｂと、を有している。第１ヒーター５２ａは、例えば、カートリッジヒーターであり、導線５８によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター５２ａは、第１ヒートブロック５２ｂに設けられた穴に挿入されており、第１ヒーター５２ａが発熱することで第１ヒートブロック５２ｂが加熱される。第１ヒートブロック５２ｂは、第１ヒーター５２ａから発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材である。第１ヒートブロック５２ｂは、例えば、アルミニウム製のブロックである。流路１６の第１領域１６ａは、第１ヒートブロック５２ｂによって囲まれる領域である。

第２加熱部５３は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、流路１６の第１領域１６ａとは異なる第２領域１６ｂを、第１温度とは異なる第２温度に加熱する。第２加熱部５３は、第２ヒーター５３ａと、第２ヒートブロック５３ｂと、を有している。第２加熱部５３は、加熱する核酸増幅反応用カートリッジ１０の領域および加熱する温度が第１加熱部５２と異なる以外は、第１加熱部５２と同様の構造および機能を有している。流路１６の第２領域１６ｂは、第２ヒートブロック５３ｂによって囲まれる領域である。

第１加熱部５２および第２加熱部５３の温度は、図示しない温度センサー（例えば熱電対）および処理部９０によって制御される。例えば、第１加熱部５２を第１温度に、第２加熱部５３を第２温度に制御することで、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａを第１温度に、第２領域１６ｂを第２温度に加熱することができる。加熱部５２，５３は、例えば、第１領域１６ａから第２領域１６ｂに向けて温度が変化する温度勾配を形成する温度勾配形成部である。

スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間に設けられている。スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間を断熱する機能を有している。

底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を保持する部材である。底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の高さ方向の位置を決定する。すなわち、核酸増幅反応用カートリッジ１０を底板５５に接触する位置まで差し込むことで、加熱部５２，５３に対して核酸増幅反応用カートリッジ１０を所定の位置に保持することができる。底板５５には、蛍光測定器８０からの励起光、および反応液２０の蛍光を通すための貫通孔５５ａが設けられている。

フランジ５６および固定板５７は、加熱部５２，５３およびスペーサー５４を固定するための部材である。図示の例では、２枚の固定板５７がフランジ５６に嵌め合わされており、加熱部５２，５３、スペーサー５４、および底板５５は、固定板５７に固定されている。

蓋体６０は、装着部５１を覆っている。図５に示す例では、固定板５７には磁石部６２が設けられ、蓋体６０は、磁石部６２によって本体部５０に固定されることができる。なお、スペーサー５４、底板５５、フランジ５６、固定板５７、および蓋体６０の材質は、例えば、断熱材である。

移動機構７０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、本体部５０を回転させる機構である。これにより、移動機構７０は、加熱部５２，５３を第１配置（図８参照）と第２配置（図９参照）とに切換えることができる。その結果、移動機構７０は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与するように、反応液２０を移動させることができる。具体的には、移動機構７０は、反応液２０を核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの間を往動させる。第１配置では、第１加熱部５２が第２加熱部５３よりも、重力作用方向において下方に位置している。第２配置では、第２加熱部５３が第１加熱部５２よりも、重力作用方向において下方に位置している。移動機構７０は、例えば、図示しないモーターおよび駆動軸を有している。駆動軸は、本体部５０のフランジ５６に接続されている。駆動軸は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体部５０が回転する。

蛍光測定器８０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容される反応液２０の蛍光強度（蛍光輝度）を測定する測定器である。蛍光測定器８０は、図９に示すように第２配置において、核酸増幅反応用カートリッジ１０の底部１２ｂに対して、所定距離を隔てて対向して配置されている。蛍光測定器８０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、反応液２０に含まれる蛍光標識プローブの蛍光色素に対応する励起光を反応液２０に照射し、反応液２０で発光する蛍光強度を測定する。なお、蛍光測定器８０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよいし、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよい。

処理部９０は、図１０に示すように、例えば記憶部９６に記憶されているプログラムに従って、移動機構７０や蛍光測定器８０を制御するための処理を行う。処理部９０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。

操作部９２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部９０に送る処理を行う。操作部９２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。

表示部９４は、処理部９０によって生成された画像を表示する。表示部９４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ Ｒａｙ Ｔｕｂｅ）等により実現される。

記憶部９６は、処理部９０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部９６は、処理部９０の作業領域として用いられ、処理部９０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部９６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。

３． 核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１１は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。以下では、一例として、核酸増幅反応装置１００を用いた核酸増幅反応方法について説明する。

まず、核酸増幅反応用カートリッジ１０を、核酸増幅反応装置１００の装着部５１に装着する（ステップＳ２）。具体的には、液体３０が充填された容器１２に反応液２０を導入した後、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着部５１に装着する。例えば、装着部５１に核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着したら、蓋体６０によって装着部５１を覆う。

ここで、加熱部５２，５３の配置は、図８に示すように、第１配置である。第１配置においては、重力作用方向における流路１６の最下部に第１領域１６ａが位置する。そのため、液体３０よりも比重の大きい反応液２０は、第１領域１６ａに位置する。

次に、処理部９０は、操作部９２から熱サイクル処理を開始する旨の信号を受けると、加熱部５２，５３を制御して、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａおよび第２領域１６ｂを加熱させ、流路１６に温度勾配を形成する（ステップＳ４）。具体的には、第１加熱部５２は、第１領域１６ａを第１温度に加熱し、第２加熱部５３は、第２領域１６ｂを第１温度よりも低い第２温度に加熱する。これにより、流路１６の第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、加熱部５２，５３は、第１領域１６ａから第２領域１６ｂに向けて温度が低くなる温度勾配を形成する温度勾配形成部である。

第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、９５℃以上１１０℃以下である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５０℃以上７５℃以下である。加熱部５２，５３の配置は、第１配置であるので、核酸増幅反応用カートリッジ１０を加熱すると、反応液２０は、第１温度に加熱される。

次に、処理部９０は、第１加熱部５２が第１温度に到達して第１の時間（第１の期間）が経過したら、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第１配置から第２配置へ切換える（ステップＳ６）。処理部９０は、タイマーを内蔵していてもよい。第１の時間は、変性反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。移動機構７０は、処理部９０によって制御され、第１の時間が１秒以上１０秒以下となるように、反応液２０を移動させる。具体的には、処理部９０は、移動機構７０を制御して本体部５０を１８０°回転させる。これにより、加熱部５２，５３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。

第２の配置は、図９に示すように、第２領域１６ｂを重力作用方向において流路１６の最下部に位置させる配置である。第２配置では、第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの重力作用方向における位置関係が第１配置とは逆になる。そのため、反応液２０は、重力の作用によって第１領域１６ａから第２領域１６ｂへと移動する。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置とした後に移動機構７０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。これにより、加熱部５２，５３の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間であり、１秒以上１０秒以下である。移動機構７０は、処理部９０によって制御され、第２の時間が１秒以上１０秒以下となるように、反応液２０を移動させる。

次に、処理部９０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数）が、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する（ステップＳ８）。処理部９０は、第１配置から第２配置への切換えを行うたびに、サイクル数を記憶部９６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数と、を比較する。

処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図１１において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。

一方、処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図１１において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１０に移行する。ステップＳ１０では、処理部９０は、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第２配置から第１配置へ切換える。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第１配置とした後に移動機構７０の動作を、第１の時間停止させる。

そして、処理部９０は、再び、ステップＳ６へ移行し、加熱部５２，５３の配置を第１配置から第２配置へ切換える。

以上のように、処理部９０は、サイクル数が所定の回数となるまで、第１配置と第２配置との位置を入れ替えながら加熱部５２，５３を（本体部５０を）回転させることにより、反応液２０を流路１６において往復運動させる。これにより、核酸増幅反応装置１００は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与することができる。

処理部９０は、さらに、上記の熱サイクル処理と同時期に増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置１００では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置に保持するごとに蛍光測定器８０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部９０は、蛍光測定器８０の測定結果として蛍光測定器８０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部９６に記憶する。

さらに、処理部９０は、操作部９２から入力される信号に基づいて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を記憶部９６から読み出し、該蛍光強度に基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成してもよい。処理部９０は、該増幅曲線に基づいて核酸の増幅効率に対する良否を判定し、判定結果や増幅曲線を表示部９４に表示させてもよい。

なお、上記では、ステップＳ８において、処理部９０は、サイクル数が所定の回数に達したか否かを判定したが、処理部９０は、取得した蛍光強度が、予め記憶部９６に記憶された所定値に達しか否かを判定してもよい。そして、処理部９０は、取得した蛍光強度が所定値に到達したと判定した場合は、処理を終了し、取得した蛍光強度が所定値に到達していないと判定した場合は、ステップＳ１０に移行してもよい。

また、上記では、第２温度をアニーリング反応および伸長反応のための温度としたが、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための温度とし、第２の時間を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための加熱時間としてもよい。この場合、図示はしないが、核酸増幅反応装置１００は、流路１６の第３領域（第１領域および第２領域と異なる領域）を、第３温度（第１温度および第２温度と異なる温度）に加熱する第３加熱部を有している。第３温度は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための温度であり、第３の時間は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための加熱時間である。ただし、ＰＣＲの高速化のためには、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のための温度とすることが好ましい。

４． 実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。

４．１． 試料の調製
鋳型核酸として、アデノウイルスの培養ウイルスから抽出したゲノムＤＮＡ（市販品、Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）１００コピー（１反応チューブ）を用いた。上記鋳型核酸を、核酸増幅反応用試薬に添加して下記の混合試薬溶液を調製した。蛍光標識プローブ（１０μＭ〜１００μＭ）を用いて蛍光標識プローブの体積Ｘを変化させ、蛍光標識プローブの濃度が、０．３μＭ、０．６μＭ、１．２μＭ、２．４μＭ、６μＭ、１２μＭ、２４μＭ、４８μＭと異なる８種類の混合試薬溶液を調製した。

なお、下記における各試薬の液量（体積）は、混合試薬１０μＬに対する値である。すなわち、例えば、ポリメラーゼは、混合試薬容器１０μＬ中に０．４μＬ含まれている。

＜混合試薬溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ ０．４μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ） ０．５μＬ
バッファー ２．０μＬ
アデノウイルス検出用フォワードプライマー（２０μＭ） ０．８μＬ
アデノウイルス検出用リバースプライマー（２０μＭ） ０．８μＬ
アデノウイルス検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ〜１００μＭ） ＸμＬ
アデノウイルスＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ） １．０μＬ
水 ｕｐ ｔｏ １０μＬ

なお、上記の混合試薬溶液において、ポリメラーゼは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製を用いた。ｄＮＴＰは、Ｒｏｃｈｅ社製を用いた。フォワードプライマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製の「Ａｄ−Ｆ１」を用いた。リバースプライマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製の「Ａｄ−Ｒ１」を用いた。蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ「Ａｄ−Ｐ１」を用いた。水は、Ｒｏｃｈｅ社製を用いた。

バッファーの組成は、下記のとおりである。

ＭｇＣｌ_２：２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：２５０ｍＭ
ＫＣｌ：１２５ｍＭ

フォワードプライマー、リバースプライマー、および蛍光標識プローブの配列は、下記表１のとおりである。なお、表１において、「ＦＡＭ」は、レポーター色素であり、「ＢＨＱ１」は、クエンチャー色素である。

４．２． ＰＣＲ結果
上記混合試薬溶液の各々から反応液として、１．６μＬを抽出し、シリコーンオイルが充填されている核酸増幅反応用カートリッジに注入した。なお、混合試薬溶液から得た反応液に含まれるポリメラーゼの量は、２Ｕに相当する。

第１温度（変性反応のための温度）を９８℃、第２温度（アニーリング反応および伸長反応のための温度）を５８℃として、各反応液に対して、核酸増幅反応装置１００のような昇降式ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、９８℃で１０秒間加熱させてホットスタートさせた。

第１高速条件として、第１の時間（変性反応のための時間）を４秒、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための時間）を６秒とした。第２高速条件として、第１の時間を４秒、第２の時間を１０秒とした。標準条件として、第１の時間を４秒、第２の時間を２０秒とした。

図１２は、第２の時間を６秒としたとき（第１高速条件）のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１３は、第２の時間を１０秒としたとき（第２高速条件）のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１４は、第２の時間を２０秒としたとき（標準条件）のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１２〜図１４において、横軸は、熱サイクルのサイクル数を示し、縦軸は、蛍光測定装置で測定した蛍光強度を示している。

図１２および図１３に示すように、反応液に含まれる蛍光標識プローブが０．６μＭ以上４８μＭ以下の範囲では、０．３μＭの場合に比べて、蛍光強度が高くなった。そのため、反応液に含まれる蛍光標識プローブを０．６μＭ以上４８μＭ以下とすることにより、第２の時間が１０秒という高速条件のＰＣＲでも（ＰＣＲを高速化させても）、核酸の増幅を高感度で検知することができることがわかった。

表２は、図１２〜図１４に示すＰＣＲ結果の各濃度における５０回目（サイクル数が５０回目）の蛍光強度を示す表である。表３は、表２のデータに基づいて、６秒、１０秒、２０秒の各々における蛍光標識プローブ濃度０．３μＭの蛍光強度を「１」として、各濃度の蛍光強度を標準化させた表（標準化蛍光強度を示す表）である。

表３に示すように、反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度が２．４μＭ以上４８μＭ以下の範囲において、第２の時間が６秒および１０秒の標準化蛍光強度は、２０秒の標準化蛍光強度よりも大きかった。したがって、反応液に含まれる蛍光標識プローブを２．４μＭ以上４８μＭ以下とすることにより、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をより高感度で検知することができることがわかった。さらに、表３より、反応液に含まれる蛍光標識プローブを６μＭ以上４８μＭ以下とすることにより、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をよりいっそう高感度で検知することができることがわかった。さらに、表３より、反応液に含まれる蛍光標識プローブを１２μＭ以上４８μＭ以下とすることにより、ＰＣＲを高速化させても、核酸の増幅をさらによりいっそう高感度で検知することができることがわかった。

表３に示すように、例えば反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度が２．４μＭ以上４８μＭ以下の範囲において、第２の時間が６秒の標準化蛍光強度は、１０秒の標準化蛍光強度よりも高かった。したがって、蛍光標識プローブの濃度を２．４μＭ以上４８μＭ以下の範囲とすることは、第２の時間が短いほど、有効であるといえる。第２の時間が２０秒の場合にも蛍光標識プローブの濃度を高くすると標準化蛍光強度は高くなるが、６秒および１０秒の場合の方が、標準化蛍光強度をより高くすることができた。そのため、蛍光標識プローブの濃度を高くすることは、特に、ＰＣＲを高速化した場合に、有効であるといえる。

なお、第２の時間を１秒未満とすると、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が困難となる。すなわち、第２の時間を１秒以上とすることにより、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が容易となり、設計の自由度を高めることができる。

４．３． 電気泳動評価
４．３．１． 第１評価
蛍光標識プローブの濃度０．３μＭで第２の時間が６秒（第１高速条件）の熱サイクルを５０回付与した反応液と、蛍光標識プローブの濃度０．３μＭで第２の時間が２０秒（標準条件）の熱サイクルを５０回付与した反応液と、において、電気泳動を行った。図１５は、電気泳動の結果である。

図１５に示すように、第２の時間が６秒の反応液と２０秒の反応液とにおいて、電気泳動評価における差異は確認できなかった。一方、図１２および図１４に示すように、蛍光標識プローブの濃度が０．３μＭの場合では、２０秒の反応液の方が６秒の反応液よりも蛍光強度は高かった。以上の結果より、蛍光標識プローブの濃度が０．３μＭの場合において、６秒の場合の蛍光強度が２０秒の場合の蛍光強度よりも低いことは、核酸が増幅されていないのではなく、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションできていないことが要因であると考えられる。反応液に含まれる蛍光標識プローブを０．６μＭ以上４８μＭ以下とすると、ＰＣＲを高速化させても、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションし、核酸の増幅を高感度で検知することができる。

４．３．２． 第２評価
蛍光標識プローブの濃度が０．６μＭ、２４μＭ、４８μＭの反応液において、電気泳動を行った。第２の時間が６秒（第１高速条件）の熱サイクルを５０回付与した反応液を用いた。図１６は、電気泳動の結果である。

図１６に示すように、蛍光標識プローブの濃度が０．６μＭ、２４μＭ、４８μＭの反応液において、電気泳動評価における差異は確認できなかった。図１６から、蛍光標識プローブの濃度を０．６μＭ以上４８μＭ以下としても、核酸が増幅されていることがわかった。

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

２…ピペット、１０…核酸増幅反応用カートリッジ、１２…容器、１２ａ…側壁部、１２ｂ…底部、１４…キャップ、１６…流路、１６ａ…第１領域、１６ｂ…第２領域、２０…反応液、２２…鋳型核酸溶液、２４…核酸増幅反応用試薬、３０…液体、５０…本体部、５１…装着部、５２…第１加熱部、５２ａ…第１ヒーター、５２ｂ…第１ヒートブロック、５３…第２加熱部、５３ａ…第２ヒーター、５３ｂ…第２ヒートブロック、５４…スペーサー、５５…底板、５５ａ…貫通孔、５６…フランジ、５７…固定板、５８…導線、６０…蓋体、６２…磁石部、７０…移動機構、８０…蛍光測定器、９０…処理部、９２…操作部、９４…表示部、９６…記憶部、１００…核酸増幅反応装置

配列番号１は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓの蛍光標識プローブの配列である。

Claims (6)

1. 蛍光標識プローブを含む反応液に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与する工程を含み、
   前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であり、
   前記反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応方法。
2. 請求項１において、
   前記蛍光標識プローブの濃度は、２．４μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応方法。
3. 請求項２において、
   前記蛍光標識プローブの濃度は、６μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応方法。
4. 請求項３において、
   前記蛍光標識プローブの濃度は、１２μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応方法。
5. 蛍光標識プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり前記反応液と混和しない液体と、を収容する核酸増幅反応用カートリッジを装着可能な装着部と、
   前記核酸増幅反応用カートリッジの第１領域を第１温度に加熱する第１加熱部と、
   前記核酸増幅反応用カートリッジの前記第１領域とは異なる第２領域を前記第１の温度とは異なる第２温度に加熱する第２加熱部と、
   核酸を増幅するための熱サイクルを付与するように、前記反応液を前記第１領域と前記第２領域との間を往動させる移動機構と、
   を含み、
   前記移動機構は、前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間が１秒以上１０秒以下となるように、前記反応液を移動させ、
   前記反応液に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応装置。
6. 核酸を増幅するための熱サイクルが付与される反応液に含まれる核酸増幅反応用試薬であって、
   前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であり、
   前記核酸増幅反応用試薬は、蛍光標識プローブを含み、
   前記反応液に含まれる前記蛍光標識プローブの濃度は、０．６μＭ以上４８μＭ以下である、核酸増幅反応用試薬。