JP2017207312A - タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 - Google Patents
タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017207312A JP2017207312A JP2016098326A JP2016098326A JP2017207312A JP 2017207312 A JP2017207312 A JP 2017207312A JP 2016098326 A JP2016098326 A JP 2016098326A JP 2016098326 A JP2016098326 A JP 2016098326A JP 2017207312 A JP2017207312 A JP 2017207312A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydroxy
- nitrobenzoic acid
- peptide
- acid
- matrix
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
- C07K1/128—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
- C07C205/49—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
- C07C205/57—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups having nitro groups and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
- C07C205/59—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups having nitro groups and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
- C07C205/49—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
- C07C205/57—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups having nitro groups and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
- C07C205/59—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups having nitro groups and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
- C07C205/60—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups having nitro groups and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms in ortho-position to the carboxyl group, e.g. nitro-salicylic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/004—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn
- H01J49/0045—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction
- H01J49/0059—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction by a photon beam, photo-dissociation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】タンパク質及びペプチドのペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖を特異的に切断する方法、及びタンパク質及びペプチドのアミノ酸配列を決定する方法を提供する。
【解決手段】３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断する方法。上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断し、生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
【選択図】図２
【解決手段】３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断する方法。上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断し、生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
【選択図】図２
Description
本発明は、タンパク質及びペプチドのペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法に関する。さらに、本発明は、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて、タンパク質及びペプチドを質量分析法、特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）により測定し、タンパク質及びペプチドのアミノ酸配列を決定する方法に関する。
特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）及び非特許文献１には、ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ；3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いて、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析を行うことが開示されている。しかしながら、これらのマトリックスによって、タンパク質及びペプチドのペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び側鎖を特異的に切断することについては開示も示唆もなされていない。
国際公開ＷＯ２０１１／００７７４３号公報（特許文献２）及び非特許文献２には、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ；5-amino salicylic acid）をマトリックスとして用いて、ＭＡＬＤＩ質量分析を行い、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合を特異的に切断する方法が開示されている。
特開２０１３−１３０５７０号公報（特許文献３）及び非特許文献３には、１−ヒドロキシ−５−官能基置換ナフタレン化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合を特異的に切断する方法が開示されている。１−ヒドロキシ−５−官能基置換ナフタレン化合物として、１−ヒドロキシ−５−アミノナフタレン、１，５−ジヒドロキシナフタレンが用いられている。
非特許文献４には、５-ニトロサリチル酸（５−ＮＳＡ；5-nitro salicylic acid）、４−ニトロサリチル酸（４-ＮＳＡ; 4-nitro salicylic acid）、３−ニトロサリチル酸（３-ＮＳＡ; 3-nitro salicylic acid）、５−ホルミルサリチル酸（５−ＦＳＡ；5-formyl salicylic acid）を用いて、ＭＡＬＤＩ質量分析を行い、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合を特異的に切断する方法が開示されている。
ＭＡＬＤＩ質量分析におけるIn-Source Decay（ＩＳＤ：インソース分解）法は、イオン源内でサンプルイオンのフラグメンテーションを誘発し、生成したフラグメントイオンを分析する方法である。また、ペプチド鎖のアミノ酸配列情報を得るためには、質量分析において、ａ−，ｂ−，ｃ−，ｘ−，ｙ−，ｚ−いずれか１種類の、あるいは複数種類のseries（系列）イオン種が連続的に検出されることが必要となる。
ペプチド及びタンパク質の分析におけるＭＡＬＤＩ−ＩＳＤでの主流は、還元マトリックス（非特許文献５）を用いるものである。この場合、マトリックスがサンプルと共存している状況でレーザー光照射により誘引されたマトリックス分子由来の水素ラジカルがサンプル分子に与えられ（還元マトリックス）、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合の開裂(cleavage)が誘引され、主にc-seriesイオン及びz-seriesイオンのイオン種が生成される（非特許文献５、非特許文献６）。しかしながら、還元マトリックスを用いると、アミノ酸Proline（Pro, P）の左側の開裂が極めて起こり難く、Proline（Pro, P）の左側の開裂によるc-seriesイオンの生成がない。さらに、還元マトリックスを用いると、側鎖の開裂によるd-seriesイオンのイオン種が生成することはほとんどない。
c-series又はz-seriesイオン種を生成するマトリックスとして、例えば、１，５−ジアミノナフタレン（１，５−ＤＡＮ；1,5-Diaminonaphthalene）が知られている（非特許文献７）。１，５−ＤＡＮにより生じるc-seriesイオン種では、アミノ酸Proline（Pro, P）の左側の開裂が極めて起こり難く、Proline（Pro, P）の左側の開裂によるc-seriesイオンの生成がない。これは、Proline（Pro, P）が、c-series切断（Ｎ−Ｃα間を含む）部位で環状構造となっていることに起因する。そのため、Proline（Pro, P）含有部位の配列情報が入手困難になる。また、a-seriesイオン種を介し側鎖の開裂によって生じるd-seriesのイオン種の生成が困難なため、d-seriesのイオン種によるアミノ酸残基の質量が完全同一のLeucine（Leu, L）とIsoleucine（Ile, I）の判別ができない。１，５−ＤＡＮでは、ｚ-seriesのイオン種を介し側鎖の開裂によるw-seriesのイオン種の生成が生じる場合があり、その場合はLeucine（Leu, L）とIsoleucine（Ile, I）とを識別できる可能性があるが、ペプチドのＣ末端にArginine(Arg, R), Lysin(Lys, K)など塩基性アミノ酸がある場合に限定される。
ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤに多く用いられている１，５−ＤＡＮマトリックスの特徴は、以下にまとめられる：
[1] １，５−ＤＡＮはc-series,又はz-series及び／又はw-seriesイオン種を生成させる（a-series及び／又はd-seriesイオン種の生成が困難である）。
[2] １，５−ＤＡＮは発癌性が疑われている。
[3] １，５−ＤＡＮは真空中で昇華しやすい。そうすると、１，５−ＤＡＮを用いると、測定時間が限られ、定量性も損なわれやすい。また、昇華した１，５−ＤＡＮが他の測定時に混入するキャリーオーバーが発生しやすい。
[4] １，５−ＤＡＮは溶液状態で劣化（酸化）しやすい。例えば、溶媒に用いる水又はアセトニトリル中の酸素などで劣化しやすい。そうすると、溶液状態での１，５−ＤＡＮのストックが困難である。
[5] １，５−ＤＡＮを用いると、サンプル／マトリックス溶液混合滴下乾固後のサンプルプレート上での残渣の表面均一性が低く、位置による厚みの違いの差が大きい。そうすると、Rasterで良好なデータが得られ難くなり、TOFでは分解能と質量精度の低下を招く。
[6] １，５−ＤＡＮマトリックス由来のクラスターイオンの多量生成により、ペプチド鎖Ｎ末端側（通常は、Ｎ末端側の数残基）の情報が得られ難い。
[1] １，５−ＤＡＮはc-series,又はz-series及び／又はw-seriesイオン種を生成させる（a-series及び／又はd-seriesイオン種の生成が困難である）。
[2] １，５−ＤＡＮは発癌性が疑われている。
[3] １，５−ＤＡＮは真空中で昇華しやすい。そうすると、１，５−ＤＡＮを用いると、測定時間が限られ、定量性も損なわれやすい。また、昇華した１，５−ＤＡＮが他の測定時に混入するキャリーオーバーが発生しやすい。
[4] １，５−ＤＡＮは溶液状態で劣化（酸化）しやすい。例えば、溶媒に用いる水又はアセトニトリル中の酸素などで劣化しやすい。そうすると、溶液状態での１，５−ＤＡＮのストックが困難である。
[5] １，５−ＤＡＮを用いると、サンプル／マトリックス溶液混合滴下乾固後のサンプルプレート上での残渣の表面均一性が低く、位置による厚みの違いの差が大きい。そうすると、Rasterで良好なデータが得られ難くなり、TOFでは分解能と質量精度の低下を招く。
[6] １，５−ＤＡＮマトリックス由来のクラスターイオンの多量生成により、ペプチド鎖Ｎ末端側（通常は、Ｎ末端側の数残基）の情報が得られ難い。
一方、ペプチド及びタンパク質の分析におけるＭＡＬＤＩ−ＩＳＤにおいて、酸化マトリックス（非特許文献５）を用いることも知られている。この場合、マトリックスがサンプルと共存している状況でレーザー光照射を受けサンプル分子からの水素ラジカル脱離が起こり、脱離した水素ラジカルがマトリックス分子に与えられる（酸化マトリックス）(非特許文献５)。サンプル分子からの水素ラジカル脱離によりペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合の開裂が引き起こされると、a-seriesイオン及びx-seriesイオンのイオン種が生成され（非特許文献５，８，９）、さらに側鎖の開裂によるd-seriesイオンの生成が容易である（非特許文献５）。
水素ラジカル脱離を促進してa-seriesイオン種を生成するマトリックスとしては、例えば、官能基−ＣＨＯが付加した５−ＦＳＡ (非特許文献４、５、８)、官能基−ＮＯ2 が付加した５−ＮＳＡ（非特許文献４、５、８）が知られている（非特許文献４、５、８、９）。しかし、一般的なペプチドに対し、５−ＦＳＡや５−ＮＳＡによるa-seriesイオン種の生成効率は、１，５−ＤＡＮによるc-seriesイオン種の生成効率と比べ、比較的低い傾向がある。
"Selective detection of 2-nitrobenzenesulfenyl-labeled peptide by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry using a novel matrix", E. Matsuo, M. C. Toda, M. Watanabe, N. Ojima, S. Izumi, K. Tanaka, S. Tsunasawa, O. Nishimura: Proteomics (2006) Vol.6, pp2042-2049.
"In-source decay and fragmentation characteristics of peptide using 5-aminosalicylic acid as a matrix in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry", M. Sakakura, M. Takayama: J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2010) Vol.21, pp979-988.
"５−Amino-1-naphthol, a novel 1,5-naphthalene derivative matrix suitable for matrix-assisted laser desorption/ionization in-source decay of phosphorylated peptides", I. Osaka, M. Sakai, M. Takayama: Rapid Commun. Mass Spectrom. (2013) Vol.27, pp103-108.
"Influence of initial velocity of analyteson in-source decay products in MALDI mass spectrometry using salicylic acid derivative matrices", D. Asakawa, M. Sakakura, M.Takayama: Int. J. Mass spectrom. (2013) Vol. 337, pp29-33.
"Principles of Hydrogen Radical Mediated Peptide/Protein Fragmentation during Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry", D. Asakawa: Mass Spectrometry Reviews (2014) (DOI 10. 1002/mas).
"N-Ca bond cleavage of the peptide backbone via hydrogen abstraction", M. Takayama: J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2001) Vol.12, pp1044-1049.
"Rational selection of the optimum MALDI matrix for top-down proteomics by in-source decay", K. Demeure, L. Quinton, V. Gabelica, E.-D. Pauw: Anal. Chem. (2007) Vol.79, pp8678-8685.
"Cα-C Bond Cleavage of the Peptide Backbone in MALDI In-Source Decay Using Salicylic Acid Derivative Matrices", D. Asakawa, M. Takayama: J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) Vol. 22, pp1224-1233.
"Matrix Effect on In-Source Decay Products of Peptides in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization", D. Asakawa, M. Sakakura, M. Takayama, Mass Spectrometry (2012) Vol. 1, A0002.
上記のように、ペプチドやタンパク質の質量分析において、c-seriesイオン種を得るためには、１，５−ＤＡＮを用いることにより、生成効率や感度が高く、c-seriesイオン種を得ることができるが、a-series又はx-seriesのイオン種については、十分に高い生成効率や感度で、且つ、他のイオン種の混在が少なく、イオン種を生成することを可能とする酸化マトリックスがないのが現状である。また、c-series又はz-seriesイオン種を生成するマトリックスでは、質量が同一のアミノ酸であるLeucine（Leu, L）とIsoleucine（Ile, I）を判別できないのが現状である。このような現状において、タンパク質やペプチドのＣα−Ｃ結合を特異的に効率良く切断し、a-seriesなどのイオン種を、他のイオン種の混合が少なく、高感度に検出して、迅速に解析する方法が望まれる。さらに、側鎖を特異的に切断し、d-seriesイオンを高感度に検出し、それにより、タンパク質及びペプチドのアミノ酸配列を決定する方法が望まれる。
本発明の目的は、タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖を特異的に切断する方法、及びそれにより、タンパク質及びペプチドのアミノ酸配列を決定する方法を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸をマトリックスとして用いることにより、上記目的を達成できることを見出した。
本発明は、以下の発明を含む。
（１） ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸：
５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸：
及び
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断する方法。
（１） ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
（２） ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸：
５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸：
及び
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断し、
生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
（３） マトリックスとしての、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断し、
生成したフラグメントイオンをＭＡＬＤＩ質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
生成したフラグメントイオンをＭＡＬＤＩ質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
（４） 前記生成したフラグメントイオンとして、
ａ−系列イオン種及び／又はx−系列イオン種
を分析する、上記（２）又は（３）に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
ａ−系列イオン種及び／又はx−系列イオン種
を分析する、上記（２）又は（３）に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
（５） 前記生成したフラグメントイオンとして、
ａ−系列イオン種及びｄ−系列イオン種
を分析する、上記（２）又は（３）に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
ａ−系列イオン種及びｄ−系列イオン種
を分析する、上記（２）又は（３）に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
（６） ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸：
５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸：
及び
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸を含む、タンパク質又はペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断する試薬。
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
本発明において、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析では、一般的に通常の分析よりもレーザー強度を高くすることによってＩＳＤフラグメンテーションを促進させる。すなわち、本発明において、マトリックスとしての３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、分析すべきサンプルのタンパク質又はペプチドに、サンプル由来のプロトン付加分子［Ｍ＋Ｈ］+ 生成に必要な量及び密度よりも、ある程度高い強度のレーザー光を照射することにより、タンパク質又はペプチドからの水素ラジカル脱離反応を促進させ、主にa-series及び／又はx-seriesイオン種を生成させ、さらにd-seriesイオン種を生成させる。
本発明において、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することにより、タンパク質又はペプチドからの水素ラジカル脱離反応が促進させられ、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断することができる。
ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合が特異的に切断されると、フラグメントイオンとして主にa-series及び／又はx-seriesイオン種が生成し、さらにd-seriesイオン種も生成する。a-series及び／又はx-seriesイオン種を質量分析法により検出分析することにより、Proline（Pro, P）の左側での開裂を検出しProline（Pro, P）含有部位の配列情報を得ることができる。また、d-seriesイオン種を質量分析法により検出分析することにより、アミノ酸残基の質量が完全同一であるLeucine（Leu, L）とIsoleucine（Ile, I）とを判別することができる。このように、本発明によれば、分析すべきタンパク質又はペプチドについて、高感度に迅速に、高いカバレッジで、より多くのアミノ酸配列情報を入手することができる。特に、ＭＳ／ＭＳのような多段階分析を行うことなく、１回のＭＳ測定により、アミノ酸配列情報を入手することができる。
分析すべきタンパク質又はペプチドについて、ペプチド鎖のアミノ酸配列情報を得るためには、質量分析において、ａ−，ｂ−，ｃ−，ｘ−，ｙ−，ｚ−いずれか１種類の、あるいは複数種のseriesのイオン種が連続的に検出されることが必要条件である。次の化学構造式は、４残基からなるペプチドを例として、ペプチド主鎖のフラグメンテーションの命名規則を示す。Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、及びＲ4 は、アミノ酸残基側鎖を表す。
次に、化学スキームを参照して、ペプチド主鎖の開裂によるc-seriesイオン及びz-seriesイオン、a-seriesイオン及びx-seriesイオンの生成機構について説明する（引用文献８のスキーム１を参照）。
スキーム（ａ）は、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合の開裂によるc-seriesイオン及びz-seriesイオンの生成機構を示している。還元マトリックスを用いて、マトリックスがタンパク質又はペプチドサンプルと共存している状況でレーザー光照射を行うと、レーザー光照射により誘引されたマトリックス分子由来の水素ラジカルがサンプル分子に与えられ（還元マトリックス）、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合の開裂(cleavage)が誘引され、主にc-seriesイオン及び／又はz-seriesイオンのイオン種が生成される。Proline（Pro, P）は、c-series切断（Ｎ−Ｃα間を含む）部位で環状構造となっているために、Proline（Pro, P）の場合にはこのＮ−Ｃα結合の開裂が極めて起こり難く、Proline（Pro, P）の左側の開裂によるc-seriesイオンの生成がない。
スキーム（ｂ）は、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合の開裂によるa-seriesイオン及びx-seriesイオンの生成機構を示している。酸化マトリックスを用いて、マトリックスがタンパク質又はペプチドサンプルと共存している状況でレーザー光照射を行うと、レーザー光照射によりサンプル分子からの水素ラジカル脱離が起こり、脱離した水素ラジカルがマトリックス分子に与えられる（酸化マトリックス）。サンプル分子からの水素ラジカル脱離によりペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合の開裂が引き起こされると、a-seriesイオン及び／又はx-seriesイオンのイオン種が生成される。さらにa-seriesイオン種から側鎖の開裂によるd-seriesイオン種の生成が容易である。
［マトリックス］
本発明において、マトリックスとしての、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドサンプルにレーザー光を照射する。上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸は１種のみを用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記スキーム（ｂ）に従って、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合が特異的に切断される。以下にさらに詳細な化学スキームを、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（３Ｈ２ＮＢＡ）を例として示す。
本発明において、マトリックスとしての、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドサンプルにレーザー光を照射する。上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸は１種のみを用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記スキーム（ｂ）に従って、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合が特異的に切断される。以下にさらに詳細な化学スキームを、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（３Ｈ２ＮＢＡ）を例として示す。
マトリックスとしての、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドサンプルにレーザー光を照射すると、レーザー光照射によりサンプル分子からの水素ラジカル脱離が起こり、脱離した水素ラジカルが上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸分子に与えられる。上記特定のヒドロキシニトロ安息香酸は、ニトロ基により水素ラジカル受容能が高く、サンプル分子からの水素ラジカル脱離が起こりやすい。サンプル分子からの水素ラジカル脱離によりペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合の開裂が引き起こされると、a-seriesイオン及び／又はx-seriesイオンのイオン種が生成される。さらにa-seriesイオン種から側鎖の開裂によるd-seriesイオンのイオン種の生成が容易である。
生成したa-seriesイオン及び／又はx-seriesイオンのイオン種、及びさらに側鎖の開裂により生成したd-seriesイオンのイオン種を質量分析法により分析して、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
［質量分析用結晶の作成］
質量分析用結晶は、分析対象のタンパク質又はペプチドと、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸マトリックスとを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも分析対象、及びマトリックス）を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。
質量分析用結晶は、分析対象のタンパク質又はペプチドと、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸マトリックスとを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも分析対象、及びマトリックス）を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。
質量分析用ターゲットとしては、通常ＭＡＬＤＩ質量分析用として用いられる導電性を有する金属製プレートを使用することができる。具体的には、ステンレス製のプレートを用いることができる。
前記混合液の液滴をターゲットプレート上に用意する具体的方法としては特に限定されない。例えば、まず、分析対象を含むサンプル溶液とマトリックス溶液とをそれぞれ別々に調製する。次に、それら溶液を混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下する。又は、それら溶液をそれぞれターゲットプレート上の同じ位置に滴下することにより、ターゲットプレート上で混合させる（on-target mix法）。on-target mix法の場合、溶液の滴下順序は任意である。
前記混合液の溶媒としては、水、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）などからなる群から選ばれうる。より具体的には、混合液の溶媒としては、例えば、ＡＣＮ水溶液、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液、ＭｅＯＨ−ＴＦＡ、ＭｅＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ−ＴＦＡ水溶液、ＥｔＯＨ水溶液、ＴＨＦ−ＴＦＡ水溶液、ＴＨＦ水溶液、ＤＭＳＯ−ＴＦＡ水溶液、ＤＭＳＯ水溶液などが用いられ、より好ましくは、ＡＣＮ水溶液やＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液を用いることができる。ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０〜９０体積％、好ましくは２５〜７５体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５〜１体積％、好ましくは０．０５〜０．１体積％でありうる。
前記混合液の液滴の体積としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、０．１μＬ〜２μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。
次に、ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒を除去する。溶媒の除去には溶媒の自然蒸発が含まれる。蒸発によって生じる残渣（すなわち質量分析用結晶）１個当たりに含まれるマトリックスの量は、例えば１ｐｍｏｌ〜１，０００ｎｍｏｌ、好ましくは１０ｐｍｏｌ〜１００ｎｍｏｌを目安にすることができる。分析対象の量は、例えば、マトリックス１０ｎｍｏｌに対し、試料１ａｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、又は１００ａｍｏｌ〜５０ｐｍｏｌの範囲で許容される。
残渣は、ターゲットプレートとの接触面において、略円の形状をなす。すなわち、残渣の外縁は略円の形状である。前記の略円の平均直径は、試料量、滴下量、マトリックス量及び溶媒組成等によって異なりうるが、例えば０．１〜３ｍｍ、好ましくは０．５〜２ｍｍである。なお、平均直径とは、１個の残渣において、前記の略円の重心を通る直線が残渣の外縁で切り取られた線分の長さの平均である。
質量分析用ターゲットとして通常の金属製プレートを用いた場合には、溶媒の除去によって得られる略円形の残渣において、分析対象物質は主に前記略円内に存在する。そのため、イオン化の際のレーザー照射位置を特定することなく、分析対象物質のイオン化を容易に行うことができる。
［質量分析装置］
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ―Ｑ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−オービトラップ）型質量分析装置などが挙げられる。
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ―Ｑ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−オービトラップ）型質量分析装置などが挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
以下の実施例において、ペプチドサンプルとして、次の２種を用いた。
N-Acetyl-Renin Substrate （アミノ酸配列：Ac-DRVYIHPFHLLVYS）（配列番号１）
Amyloidβ[1-40] （アミノ酸配列：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）（配列番号２）
N-Acetyl-Renin Substrate （アミノ酸配列：Ac-DRVYIHPFHLLVYS）（配列番号１）
Amyloidβ[1-40] （アミノ酸配列：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）（配列番号２）
マトリックスとして、次の７種を用いた。
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ３ＮＢＡ（4-hydroxy-3-nitrobenzoic acid）本発明
５Ｈ２ＮＢＡ（5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ５ＮＢＡ（3-hydroxy-5-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ２ＮＢＡ（4-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
５−ＮＳＡ（5-nitrosalicylic acid）比較用
１，５−ＤＡＮ（1,5-Diaminonaphthalene）比較用
上記マトリックスのうち、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡ及び５−ＮＳＡは、官能基−ＮＯ2 を有している。この−ＮＯ2 基がレーザー光照射によりペプチドサンプルから水素ラジカルを引き抜く効果を発揮し、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合の開裂が引き起こされる。結果としてa-seriesイオン種やx-seriesイオン種を生成させ、さらにd-seriesイオン種を生成させる。
上記マトリックスのうち、１，５−ＤＡＮは、官能基−ＮＨ2 を有している。−ＮＨ2 基は、レーザー光照射により１，５−ＤＡＮ分子由来の水素ラジカルを発生させペプチドサンプルに該水素ラジカルを付加する効果を発揮し、ペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合の開裂が引き起こされる。結果としてc-seriesイオン種やz-seriesイオン種を生成させる。
サンプルプレート：ステンレス製２ｍｍ厚プレートを用いた。
質量分析装置：ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計［AXIMA-Performance（登録商標），島津製作所製］を用いた。
質量分析装置：ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計［AXIMA-Performance（登録商標），島津製作所製］を用いた。
［実施例１］
ペプチドサンプル：N-Acetyl-Renin Substrate（Ac-DRVYIHPFHLLVYS）（配列番号１）
マトリックス：
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ３ＮＢＡ（4-hydroxy-3-nitrobenzoic acid）本発明
５Ｈ２ＮＢＡ（5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ５ＮＢＡ（3-hydroxy-5-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ２ＮＢＡ（4-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
１，５−ＤＡＮ（1,5-Diaminonaphthalene）比較用
ペプチドサンプル：N-Acetyl-Renin Substrate（Ac-DRVYIHPFHLLVYS）（配列番号１）
マトリックス：
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ３ＮＢＡ（4-hydroxy-3-nitrobenzoic acid）本発明
５Ｈ２ＮＢＡ（5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ５ＮＢＡ（3-hydroxy-5-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ２ＮＢＡ（4-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
１，５−ＤＡＮ（1,5-Diaminonaphthalene）比較用
［操作］
（１）ペプチド試料溶液として、上記N-Acetyl-Renin Substrateの20 pmol/μL waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、又は４Ｈ２ＮＢＡの10mg/mL 75% ACN, waterをそれぞれ作成し、比較用として、１，５−ＤＡＮの10 mg/mL 75% ACN, waterを作成した。
（３）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（２）のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。１ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
（４）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, 島津製作所製）］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形１辺1.2ｍｍ〜1.7ｍｍ内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
（１）ペプチド試料溶液として、上記N-Acetyl-Renin Substrateの20 pmol/μL waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、又は４Ｈ２ＮＢＡの10mg/mL 75% ACN, waterをそれぞれ作成し、比較用として、１，５−ＤＡＮの10 mg/mL 75% ACN, waterを作成した。
（３）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（２）のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。１ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
（４）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, 島津製作所製）］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形１辺1.2ｍｍ〜1.7ｍｍ内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
［結果］
図1は、マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ（最上段）、４Ｈ３ＮＢＡ（２段目）、５Ｈ２ＮＢＡ（３段目）、３Ｈ５ＮＢＡ（４段目）、４Ｈ２ＮＢＡ（５段目）、１,５−ＤＡＮ（最下段）を用いた場合のN-Acetyl-Renin substrate のＩＳＤマススペクトル全体図（m/z: 360-1840）であり、図２は、図１の低質量域部分拡大図（m/z: 530-1070）であり、図３は、図１の高質量域部分拡大図（m/z: 1030-1620）である。
図1は、マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ（最上段）、４Ｈ３ＮＢＡ（２段目）、５Ｈ２ＮＢＡ（３段目）、３Ｈ５ＮＢＡ（４段目）、４Ｈ２ＮＢＡ（５段目）、１,５−ＤＡＮ（最下段）を用いた場合のN-Acetyl-Renin substrate のＩＳＤマススペクトル全体図（m/z: 360-1840）であり、図２は、図１の低質量域部分拡大図（m/z: 530-1070）であり、図３は、図１の高質量域部分拡大図（m/z: 1030-1620）である。
図１及び２の最下段スペクトルに示されるように、１，５−ＤＡＮを用いると、低質量域にマトリックス由来のクラスターイオン（例えば、図２において、m/z：420〜650に存在する多数の高強度ピーク）が多種類及び多量に検出された。このため、たとえc-seriesイオン種が検出されていたとしても、解析に困難が伴いやすい。また、図２の最下段スペクトルに示されるように、 c6 イオンが検出されなかった。これは、N-Acetyl-Renin Substrate（アミノ酸配列：Ac-DRVYIH”P”FHLLVYS）のＮ末端から７番目がProline（Pro, P）であり、その手前の６番目のHistidine（His, H）との間のc-seriesイオンが検出されなかったためである。
これに対し、図１及び２の最上段から５段目のスペクトルに示されるように、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合には、クラスターイオンに埋没することなく a6 イオンも含めa-seriesイオン種が連続的に検出された。
図３の最下段スペクトルに示されるように、１，５−ＤＡＮを用いると、高質量域では、全てのc-seriesイオン種が検出されたが、質量分解能が低く質量精度も低い。この主な原因は、サンプルプレート上に１，５−ＤＡＮ溶液とサンプル溶液を滴下、乾固させた後の残渣の形態が不均一（例えば、後述の図９（Ｇ）参照）で針状の巨大な結晶成長と個別部位における厚みの違いがあり、飛行時間型質量分析で質量分解能と質量精度が低下したためと考えられる。これにより、例えば互いの質量差が１であるアミノ酸［例えば、Ile/Leu(113)←→Asn(114)←→Asp(115)，Gln/Lys(128)←→Glu(129)］の判別が困難になることが予想される。
これに対し、主に図１、２及び３に示されるように、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合には、a-seriesイオン種が全て検出されただけでなく、さらに、d5、d10，d11も検出されたため、N-Acetyl-Renin Substrate（アミノ酸配列：Ac-DRVY”I”HPFH“LL”VYS）のＮ末端から５番目がIsoleucine（Ile, I）であり、１０番目、及び１１番目が共にLeucine（Leu, L）であると決定できた。すなわち、Ｎ末端から５番目のアミノ酸が、質量数が同一のLeucine（Leu, L）ではなく、Isoleucine（Ile, I）である、さらに１０番目、及び１１番目のアミノ酸が、Isoleucine（Ile, I）ではなく、Leucine（Leu, L）であると判別できた。
図４に、N-Acetyl-Renin substrate のＩＳＤイオン理論値リストを示す。
［実施例２］
ペプチドサンプル：Amyloidβ[1-40]（アミノ酸配列：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）（配列番号２）
マトリックス：
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ３ＮＢＡ（4-hydroxy-3-nitrobenzoic acid）本発明
５Ｈ２ＮＢＡ（5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ５ＮＢＡ（3-hydroxy-5-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ２ＮＢＡ（4-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
５−ＮＳＡ（5-nitrosalicylic acid）比較用
ペプチドサンプル：Amyloidβ[1-40]（アミノ酸配列：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV）（配列番号２）
マトリックス：
３Ｈ２ＮＢＡ（3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ３ＮＢＡ（4-hydroxy-3-nitrobenzoic acid）本発明
５Ｈ２ＮＢＡ（5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
３Ｈ５ＮＢＡ（3-hydroxy-5-nitrobenzoic acid）本発明
４Ｈ２ＮＢＡ（4-hydroxy-2-nitrobenzoic acid）本発明
５−ＮＳＡ（5-nitrosalicylic acid）比較用
［操作］
（１）ペプチド試料溶液として、上記Amyloidβ[1-40]の20pmol/μL 50％ACN 0.1％TFA waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、又は４Ｈ２ＮＢＡの10mg/mL 75% ACN, waterをそれぞれ作成し、比較用として、５−ＮＳＡの10 mg/mL 75% ACN, waterを作成した。
（３）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（２）のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。１ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
（４）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, 島津製作所製）］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形１辺1.2ｍｍ〜1.7ｍｍ内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
（１）ペプチド試料溶液として、上記Amyloidβ[1-40]の20pmol/μL 50％ACN 0.1％TFA waterを作成した。
（２）マトリックス溶液として、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、又は４Ｈ２ＮＢＡの10mg/mL 75% ACN, waterをそれぞれ作成し、比較用として、５−ＮＳＡの10 mg/mL 75% ACN, waterを作成した。
（３）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に、（１）の試料溶液0.5 μLを滴下した後、（２）のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。１ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
（４）溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS ［AXIMA Performance（登録商標）, 島津製作所製）］の、ポジティブイオンモード、リニアモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形１辺1.2ｍｍ〜1.7ｍｍ内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
［結果］
図５は、マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ（最上段）、４Ｈ３ＮＢＡ（２段目）、５Ｈ２ＮＢＡ（３段目）、３Ｈ５ＮＢＡ（４段目）、４Ｈ２ＮＢＡ（５段目）、５−ＮＳＡ（最下段）を用いた場合のAmyloidβ[1-40]のＩＳＤマススペクトル全体図（m/z: 450-4450）であり、図６は、図５の低質量域部分拡大図（m/z: 1320-2060）であり、図７は、図５の高質量域部分拡大図（m/z: 3040-3780）である。
図５は、マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ（最上段）、４Ｈ３ＮＢＡ（２段目）、５Ｈ２ＮＢＡ（３段目）、３Ｈ５ＮＢＡ（４段目）、４Ｈ２ＮＢＡ（５段目）、５−ＮＳＡ（最下段）を用いた場合のAmyloidβ[1-40]のＩＳＤマススペクトル全体図（m/z: 450-4450）であり、図６は、図５の低質量域部分拡大図（m/z: 1320-2060）であり、図７は、図５の高質量域部分拡大図（m/z: 3040-3780）である。
図５のスペクトルに示されるように、５−ＮＳＡを用いると、低質量域にマトリックス由来のクラスターイオンが多種類及び多量に検出され、低質量域の配列情報入手に困難が伴いやすい。さらに、図６に示されるように、a-及びd-seriesイオン種以外のイオン種が比較的多く検出され、図７に示されるように、特に高質量域のd-seriesイオン種が検出困難なため、中質領域及び高質量域の配列情報入手に困難が伴いやすい。
これに対し、図６〜７の最上段〜５段目のスペクトルに示されるように、３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合には、a-seriesイオン種全てと、Isoleucine（Ile, I）とLeucine（Leu, L）を判別するd-seriesイオン種(d17,d31,d32,d34)が全て検出された。このため、配列情報の入手が容易である。
［実施例３］
マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合のさらなる利点を図９（Ａ）〜（Ｇ）を用いて示す。
マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ、４Ｈ３ＮＢＡ、５Ｈ２ＮＢＡ、３Ｈ５ＮＢＡ、４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合のさらなる利点を図９（Ａ）〜（Ｇ）を用いて示す。
図９（Ａ）は、サンプルプレート上に、マトリックスとして３Ｈ２ＮＢＡ溶液と、ペプチドサンプル溶液Amyloidβ[1-40]とを滴下し、その混合溶液を乾固した後の残渣の状態例を示す実体顕微鏡写真である。同様に、図９（Ｂ）は、マトリックスとして４Ｈ３ＮＢＡを用いた場合の写真である。図９（Ｃ）は、マトリックスとして５Ｈ２ＮＢＡを用いた場合の写真である。図９（Ｄ）は、マトリックスとして３Ｈ５ＮＢＡを用いた場合の写真である。図９（Ｅ）は、マトリックスとして４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合の写真である。
図９（Ｆ）は、サンプルプレート上に、マトリックスとして５−ＮＳＡ溶液と、ペプチドサンプル溶液Amyloidβ[1-40]とを滴下し、その混合溶液を乾固した後の残渣の状態例を示す実体顕微鏡写真である。同様に、図９（Ｇ）は、マトリックスとして１，５−ＤＡＮを用いた場合の写真である。
図９を見ると、マトリックスとして（Ａ）３Ｈ２ＮＢＡ、（Ｂ）４Ｈ３ＮＢＡ、（Ｃ）５Ｈ２ＮＢＡ、（Ｄ）３Ｈ５ＮＢＡ、又は（Ｅ）４Ｈ２ＮＢＡを用いると、正方形ラスタースキャンによってイオン化を行うべき残渣内側の形態が比較的均一であることが観察された。これに対し、（Ｇ）１，５−ＤＡＮを用いた場合は、細長い結晶が大きく成長することにより残渣の形態が不均一であることが観測された。
図９（Ｆ）を見ると、マトリックスとして５−ＮＳＡを用いると、マトリックスとして（Ａ）３Ｈ２ＮＢＡ、（Ｂ）４Ｈ３ＮＢＡ、（Ｃ）５Ｈ２ＮＢＡ、（Ｄ）３Ｈ５ＮＢＡ、又は（Ｅ）４Ｈ２ＮＢＡを用いた場合と同様に正方形ラスタースキャンによってイオン化を行うべき残渣内側の形態が比較的均一であることが観察されたが、残渣の厚みが厚い傾向がある。
Claims (6)
- ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
- ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - マトリックスとしての、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのヒドロキシニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合及び／又は側鎖結合を特異的に切断し、
生成したフラグメントイオンをＭＡＬＤＩ質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - 前記生成したフラグメントイオンとして、
ａ−系列イオン種及び／又はx−系列イオン種
を分析する、請求項２又は３に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - 前記生成したフラグメントイオンとして、
ａ−系列イオン種及びｄ−系列イオン種
を分析する、請求項２又は３に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - ３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
４−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016098326A JP6587976B2 (ja) | 2016-05-16 | 2016-05-16 | タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 |
| EP17170513.0A EP3246706A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-05-10 | Method for specific cleavage of c(alpha)-c bond and side chain of protein and peptide, and method for determining amino acid sequence |
| US15/594,461 US10626141B2 (en) | 2016-05-16 | 2017-05-12 | Method for specific cleavage of C alpha-C bond and side chain of protein and peptide, and method for determining amino acid sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016098326A JP6587976B2 (ja) | 2016-05-16 | 2016-05-16 | タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017207312A true JP2017207312A (ja) | 2017-11-24 |
| JP6587976B2 JP6587976B2 (ja) | 2019-10-09 |
Family
ID=58873599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016098326A Active JP6587976B2 (ja) | 2016-05-16 | 2016-05-16 | タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10626141B2 (ja) |
| EP (1) | EP3246706A1 (ja) |
| JP (1) | JP6587976B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021050915A (ja) * | 2019-09-20 | 2021-04-01 | 国立大学法人広島大学 | ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合および／または側鎖を特異的に切断する切断方法、分析方法および特異的切断試薬 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110297095A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-01 | 四川农业大学 | 一种昆虫致敏蛋白的筛选方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006010672A (ja) * | 2004-05-24 | 2006-01-12 | Shimadzu Corp | Ｍａｌｄｉ質量分析によって混合物から特定の物質を選択的に測定する方法 |
| US20070085040A1 (en) * | 2003-11-14 | 2007-04-19 | Indiana University Research And Technology Corporation | Methods and apparatus for mass spectral analysis of peptides and proteins |
| JP2013130570A (ja) * | 2011-11-21 | 2013-07-04 | Yokohama City Univ | タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合の特異的切断方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005100975A1 (ja) * | 2004-04-13 | 2005-10-27 | Shimadzu Corporation | 質量分析を用いる物質の測定方法及びキット |
| JP4165501B2 (ja) | 2004-04-13 | 2008-10-15 | 株式会社島津製作所 | Ｍａｌｄｉ質量分析装置による疎水性ペプチドの測定方法 |
| US20060243899A1 (en) * | 2004-05-24 | 2006-11-02 | Shimadzu Corporation | Method for selective measurement of specific substances from a mixture by maldi mass spectrometry |
| JPWO2011007743A1 (ja) | 2009-07-16 | 2012-12-27 | 公立大学法人横浜市立大学 | ペプチド主鎖Ｎ−Ｃα結合の特異的切断方法 |
-
2016
- 2016-05-16 JP JP2016098326A patent/JP6587976B2/ja active Active
-
2017
- 2017-05-10 EP EP17170513.0A patent/EP3246706A1/en not_active Withdrawn
- 2017-05-12 US US15/594,461 patent/US10626141B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070085040A1 (en) * | 2003-11-14 | 2007-04-19 | Indiana University Research And Technology Corporation | Methods and apparatus for mass spectral analysis of peptides and proteins |
| JP2006010672A (ja) * | 2004-05-24 | 2006-01-12 | Shimadzu Corp | Ｍａｌｄｉ質量分析によって混合物から特定の物質を選択的に測定する方法 |
| JP2013130570A (ja) * | 2011-11-21 | 2013-07-04 | Yokohama City Univ | タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合の特異的切断方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021050915A (ja) * | 2019-09-20 | 2021-04-01 | 国立大学法人広島大学 | ペプチド主鎖のＣα−Ｃ結合および／または側鎖を特異的に切断する切断方法、分析方法および特異的切断試薬 |
| JP7202554B2 (ja) | 2019-09-20 | 2023-01-12 | 国立大学法人広島大学 | ペプチド主鎖のＣα－Ｃ結合および／または側鎖を特異的に切断する切断方法、分析方法および特異的切断試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10626141B2 (en) | 2020-04-21 |
| EP3246706A1 (en) | 2017-11-22 |
| US20170327533A1 (en) | 2017-11-16 |
| JP6587976B2 (ja) | 2019-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Loo et al. | Tandem mass spectrometry of very large molecules. 2. Dissociation of multiply charged proline-containing proteins from electrospray ionization | |
| Stinson et al. | A method of coupling the Paternò–Büchi reaction with direct infusion ESI-MS/MS for locating the C [double bond, length as m-dash] C bond in glycerophospholipids | |
| Cook et al. | Characterization of tyrosine nitration and cysteine nitrosylation modifications by metastable atom-activation dissociation mass spectrometry | |
| JP2009002704A (ja) | 質量分析用基板、質量分析方法および質量分析装置 | |
| Matthiesen et al. | Introduction to mass spectrometry-based proteomics | |
| Chintalapudi et al. | An integrated electrocatalytic nESI-MS platform for quantification of fatty acid isomers directly from untreated biofluids | |
| Cook et al. | Metastable atom-activated dissociation mass spectrometry of phosphorylated and sulfonated peptides in negative ion mode | |
| JP6587976B2 (ja) | タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 | |
| Voinov et al. | Electron capture dissociation of sodium-adducted peptides on a modified quadrupole/time-of-flight mass spectrometer | |
| JP5084597B2 (ja) | 質量分析基板及び質量分析方法 | |
| JP6587962B2 (ja) | タンパク質及びペプチドのＣα−Ｃ結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 | |
| JP2009257844A (ja) | 混合液体マトリックスを用いたｍａｌｄｉ質量分析法 | |
| JP5947533B2 (ja) | 情報取得方法 | |
| Stutzman et al. | Covalent and non‐covalent binding in the ion/ion charge inversion of peptide cations with benzene‐disulfonic acid anions | |
| Cook et al. | Comparison of CID, ETD and metastable atom‐activated dissociation (MAD) of doubly and triply charged phosphorylated tau peptides | |
| Zhang et al. | Peptide photodissociation with 157 nm light in a commercial tandem time-of-flight mass spectrometer | |
| Matthiesen et al. | Introduction to proteomics | |
| JP6083595B2 (ja) | タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合の特異的切断方法 | |
| JP5518152B2 (ja) | 質量分析装置、質量分析用組成物及び質量分析方法 | |
| JP2013068598A (ja) | 質量分析用マトリックスの添加剤 | |
| He et al. | 157 nm photodissociation of a complete set of dipeptide ions containing C-terminal arginine | |
| JP2014235149A (ja) | Ｍａｌｄｉ質量分析方法 | |
| Pingitore et al. | Characterization of dipeptide isomers by tandem mass spectrometry of their mono-versus dilithiated complexes | |
| JP5706597B2 (ja) | マトリックスを用いる質量分析法 | |
| Yang et al. | Characterization of unknown compounds from stainless steel plates in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181127 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190828 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190903 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190911 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6587976 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |