JP2017203011A - 高活性アントシアニン類含有組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
また非特許文献2も、カテコールタイプのフラボノイドであるタキシフォリンが、アミロイドβに対し凝集抑制活性を示すこと、さらに、タキシフォリンに酸化剤を加えたところ、アミロイドβの凝集がより強く抑制されたことを報告している。
しかしながら、今なお、病気の原因となるタンパク質の凝集を強く抑制できる物質が求められている。
これまで、アントシアニンはその抗酸化作用が注目されており、生体内で活性酸素の生成を抑制する働きがあるため、血管拡張や毛細血管保護等の効果を発揮すると考えられていた。
これに対し、本発明者は、アントシアニンを酸化処理する(すなわち、アントシアニンの抗酸化作用を失わせる)ことによって得られた酸化型アントシアニンが、α-クリスタリン、α-シヌクレイン、SOD1、アミロイドβ(これらの変異体を含む。以下同じ)の凝集に対し、高い抑制作用を示すことを見い出した。
アントシアニン含有素材としては、好ましくはアントシアニンを含有する植物体が使用される。アントシアニンを含有する植物体としては、例えばビルベリー、ブルーベリー、クランベリー、コケモモ(カウベリー)、リンゴンベリー、ハックルベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ローガンベリー、サーモンベリー、ボイセンベリー、イチゴ(ストロベリー)、クワ(マルベリー)、エルダベリー、ハスカップ、ニワトコ、ハイビスカス、スグリ(カシス:ブラックカーラント、レッドカーラント)、クズベリー、アサイー、プルーン、サクランボ、リンゴ、マンゴー、シソ、有色イモ(サツマイモ、ジャガイモ、ヤマイモ)、赤キャベツ、赤ダイコン、ブドウ、紫トウモロコシ、紫タマネギ、ナス、有色米、黒豆、黒ゴマ、椿等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよいし、二種以上が組み合わされて用いられてもよい。アントシアニンを含有する上記植物体における適用部位としては特に限定されない。アントシアニンは色素成分であるため、好ましくは、果実、種、葉、花又はそれらの構成成分の一部を含有するものが用いられる。
本発明の組成物は人体への投与が予定されているため、特に、酸化剤として過酸化水素を使用し、酸化処理後にカタラーゼ処理により、過酸化水素を水と水素に分解する(2H2O2→O2+2H2O)ことが好ましい。使用する過酸化水素の量は、アントシアニン1モルに対して、30〜200モル程度が適切であり、50〜200モル程度がより好ましく、特に100〜200モルが好ましい。
サプリメントの形態としては、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、粉末等が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物は、経口投与用であっても、非経口投与用であってもよく、また、全身投与用(内服薬、注射剤、経腸投与剤等)であってもよく、局所投与用(点眼剤、塗り薬等)であってもよい。特に、白内障の治療を目的とする場合は、内服薬及び点眼剤が好ましい。内服薬の形態は特に限定されず、例としてソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、粉薬、水剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の組成物がサプリメント・医薬組成物(医薬品、医薬部外品等)である場合、賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等の添加剤が適宜配合されていてもよい。
一例をあげると、本発明の組成物は、酸化型アントシアニンを1回摂取量又は1日摂取量として1〜400mg、より好ましくは30〜250mg、特に好ましくは50〜180mg含有する経口投与用組成物(ソフトカプセル、錠剤、ドリンク剤等)である。
また別の例として、本発明の組成物は、酸化型アントシアニンの濃度が0.001〜30mg/mL、あるいは0.01〜20mg/mL、あるいは0.1〜10mg/mLである点眼剤である。
α-シヌクレインは140のアミノ酸からなる天然変性タンパク質であり、SOD1は、153アミノ酸からなる二量体タンパク質であり、アミロイドβは42のアミノ酸からなるタンパク質である。これらのタンパク質は、凝集してアミロイド線維を形成するという共通点はあるものの、酸化型アントシアニンが、これらのタンパク質の凝集を抑制するメカニズムは、それぞれ異なっている可能性が高い。
alpha- A crystallin;NP_000385.1
alpha- B crystallin;NP_001276737.1
α-シヌクレイン;P37840.1
SOD1;CAG46542.1
Amyloid Beta-Peptide (1-42);1IYT_A
本発明において、α-クリスタリン、α-シヌクレイン、SOD1、アミロイドβとは、特に明記されていなくても、上記アミノ酸配列を有するものだけでなく、それらの変異体(例えば、上記アミノ酸配列と少なくとも90%以上、あるいは95%以上の相同性を有する変異体)を含む意味で用いられる。
すなわち、上記タンパク質は、特定のアミノ酸に何らかの変異が起こった場合、凝集・線維化が生じやすくなっている。例えば家族性ALSは、SOD1の遺伝子変異の関連が指摘されており、構造異常を起こした変異型SOD1が凝集・アミロイド線維化して、神経細胞に蓄積することが疾患の原因の一つと言われている。本発明の組成物は、前記タンパク質の異常な凝集・線維化を防ぐことを目的とするため、前記GenBank受入番号によって提示されている前記タンパク質のアミノ酸配列が一部改変(アミノ酸の欠損、置換、付加など)あるいは修飾されている変異体であって、凝集・線維化を引き起こす変異体も対象となる。
実施例に示す「比」や「倍」は、特に断りのない場合はモル基準による。また、VMAおよび合成VMA等に関するモル表示は、それらに含まれるアントシアニン成分のモルを表す(アントシアニン成分の平均分子量を450として計算)。
α-クリスタリンが凝集する条件において、VMAを添加することによる凝集抑制効果を検証するため、及び、VMAを酸化、還元させた場合、α-クリスタリンの凝集抑制効果に違いがみられるかを調べるため、以下の実験を行った。
凍結乾燥品のαA-クリスタリン及びαB-クリスタリンを、0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7)に溶解し、エッペンチューブで混合して、37℃で1時間インキュベートすることによって、aAB-クリスタリンヘテロオリゴマーを作製した(αA:αB=3:1) (終濃度 0.1 mg/mL、5μM)。
なお、αA-クリスタリン及びαB-クリスタリンのモル比を3:1としたのは、大部分の脊椎動物の水晶体において、aAとaBは3:1の比で存在しており、3:1のヘテロポリマーの存在が、多様な条件下における水晶体の透明度維持に関して重要であるといわれているためである。また、本発明者の実験(65℃・1時間におけるクリスタリン凝集量を光散乱測定により確認)でも、3:1のヘテロポリマーが、ホモポリマーや、他の割合のヘテロポリマーと比べて、高い熱安定性を示すことが確認されている。
0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)で調製したVMAに対し、NaIO4(酸化剤)又はTCEP(還元剤)をエッペンチューブに混合し、室温で遮光して10分間静置し、得られたサンプルを酸化型VMAあるいは還元型VMAとした。
αABクリスタリンに対し、VMA、還元型VMA、酸化型VMAを5〜10等量(25μM〜50μM)添加し、その後70℃の温度(α-クリスタリンの熱凝集が生じる温度)で光散乱測定を行った。
光路長1 cmの石英セルに0.1 Mリン酸ナトリウムバッファーとサンプルを入れ、全量を3 mLとした。混合した後、蒸発を防ぐため、サンプルの上にミネラルオイルをかぶせ、JASCO 社製FP-6300を用いて360 nmにおける光散乱を60分間測定した。なお、セル内の温度がクリスタリンの凝集温度になるように温度調節を行い、設定温度になったところでオートゼロとし、測定を開始した。
このことから、VMAを酸化させるとα-クリスタリンの凝集抑制効果が高くなることが分かった。
次に、VMAと反応させる酸化剤の量を変え、酸化率を変えた場合に aAB-クリスタリンの凝集抑制効果に違いがみられるかを調べるため、以下の実験を行った。
光散乱測定における熱凝集1時間後の凝集量を相対比較した結果を図4に示す。
このことより、aAB-クリスタリンの凝集抑制効果はVMAの酸化による効果であると考えられた。
α-クリスタリンの凝集状態に対し酸化型VMAを添加した場合、凝集を可溶化する効果があるかを検証するため、以下の実験を行った。
VMAに含まれるどの成分がαABクリスタリンの凝集抑制に効果を示すか確認するために、以下の実験を行った。
そのため、8種類のアントシアニン成分(図2参照)、グルコール、フルクトースおよびクロロゲン酸を、VMA中に含まれる各成分の重量比に従って、約36:20:20:10(重量比)となるように混合し、合成VMAを調製した。
また、合成VMAをアントシアニンと、それ以外の成分(グルコース、フルクトース、クロロゲン酸の混合物)に分けたもの、及び、デルフェニジン3-ガラクトシド(Del-Gal)、及びシアニジン3-グルコシド(Cya-Glc)単独のもの(VMA中のアントシアニン36%すべてを一種類と仮定して添加量を計算)についても、試験を行った。
各成分は、すべてVMA 5当量相当になるよう、αABクリスタリン溶液に添加された。
また、本実験においても、酸化型VMAは、最も高いα-クリスタリン凝集抑止効果を示した。
[実施例5]
VMAは酸化した場合、α-クリスタリンの凝集を抑制する効果が大きくなったことから、 Del-Gal及びCya-Glcの酸化型についてもα-クリスタリンの凝集抑制効果を検証した。具体的には、酸化型VMAを調製したときと同じ方法で、NaIO4により酸化型Del-Gal及び酸化型Cya-Glcを作製し、実施例1と同じ方法で、αABクリスタリンの凝集に対する抑制効果を確認した。結果を図7に示す。
このことから、アントシアニンを積極的に酸化すると、αAB-クリスタリンの凝集抑制効果が高くなることがわかった。
以前の実験から、α-クリスタリンによるβ-クリスタリンの熱凝集抑制効果は明らかとなっているが、本実施例では、もう一種類の水晶体構成タンパク質であるγ-クリスタリンに対して、α-クリスタリン及びVMAが凝集を抑制する効果があるかどうかを検証した。
γD-クリスタリンを添加すると同時に、JASCO社製V-560を用いて350 nmにおける濁度を10分間測定した。結果を図8に示す。
これらの結果を総合すると、VMAは外来性ケミカルシャペロン(タンパク質高次構造の形成や安定化に関わる低分子化合物)として働きα-クリスタリンの凝集を抑制し、内在性分子シャペロンであるα-クリスタリンはβ-,γ-クリスタリンの凝集を抑制することで、VMAは水晶体タンパク質全体の安定化に寄与することが示唆された。
VMAおよびアントシアニンの酸化による構造変化を確認するために、以下の実験を行った。
また、0.1 M リン酸ナトリウムで調製した各サンプルをエッペンチューブに入れアルミホイルでふたをし、遮光して室温で一定時間静置した(自然酸化)。
その後、各成分の酸化による構造の変化を調べるために吸収スペクトルを測定した。
光路長1 cmの石英セルに、VMA終濃度50μM、アントシアニン(Del-Gal又はCya-Glc)終濃度100μMになるように0.1 M リン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)で調製し、全量を3 mLとした。完全に溶解していないものは0.22μmのフィルターでろ過した後、25℃において300〜800 nmにおける吸光度を測定した。
なお、酸化型アントシアニンが、α-クリスタリンの構造を安定化し凝集を抑制できる理由は明らかではないが、キノン構造にα-クリスタリンが結合することで凝集が抑制されている可能性がある。
これらの実験を総合すると、酸化型アントシアニンは、水晶体の透明性の維持および水晶体の白濁化の進行防止に有用であるため、白内障の予防・治療に効果があると考えられる。
酸化型VMAによる、α-シヌクレインの凝集(アミロイド線維形成)の抑制効果を確認するために、以下の実験を行った。
Excitation:450 nm、Emission:486 nm、Measurement time:0.1 sec、
Shaking duration:820.0 sec、Shaking speed:Fast, Shaking type:Orbital, Shaking diameter:5.0 mm
本発明の酸化型アントシアニンは、α-シヌクレインの凝集抑制効果が非常に高いため、パーキンソン病の予防や症状の悪化抑制に効果があると考えられる。
酸化型VMAによるSOD1のアミロイド線維形成の抑制効果を確認するために、以下の実験を行った。実験に使用したSOD1G93Aは、家族性ALSを発症する変異型SOD1である。
アミロイド線維形成を開始する24時間前に、150 mM NaClを含む50 mM Tris-HClバッファー(pH 7.4)にVMAを溶解させ、遮光し室温で静置した。
なお、酸化型VMAを用いてアミロイド線維形成抑制実験をする上で、酸化型VMA中のキノン構造が線維形成バッファー中の還元剤TCEPによって、再び酸化前のカテコール構造へと戻る可能性が考えられた。そこで24時間室温で空気酸化させたVMAに1 mM TCEPを添加し、吸収スペクトルの変化を確認したところ、スペクトルに多少の変化は見られたものの、VMAは酸化前のスペクトルに戻ることはなかった。このことから、酸化型VMAにTCEPを添加した場合においてもVMAは酸化前のカテコール型の構造に戻らないものと判断した。
酸化型VMAがSOD1の凝集(アミロイド線維化)を抑制することが確認できたため、その有効成分を特定するためにVMA中に含まれるアントシアニン成分(Delphinidin-3-Glucoside Chloride[Del]、Cyanidin-3-Glucoside Chloride[Cya]、Petunidin-3-Glucoside Chloride [Pet])の存在下でアミロイド線維形成を調べた。
具体的には、変異型SOD1(G93A apo)(62.5μM)に対し、24時間室温静置し空気酸化させたDel、Cya、Pet及びVMAをそれぞれ2倍等量 (125μM) 添加し、アミロイド線維形成を追跡した。結果を図16Aに示す。
図16Bに示されるように、酸化型VMA中のアントシアニン以外の成分に、変異型SODの線維形成を抑制する効果は見られなかった。このことから、酸化型VMA中の酸化型アントシアニンが、変異型SODの線維形成抑制効果を発揮することが確認された。
アントシアニンによるSOD1の凝集(線維形成)抑制メカニズムを解明するため、酸化型Del (Delphinidin-3-Glucoside Chloride)の存在下、不存在下のSOD1G93Aに対し、リジン後を認識・切断するリシルエンドペプチダーゼ(AP1)を添加して消化させ、逆相HPLCで比較し、TOF MSで分子量を同定した。Delの酸化は、室温で24時間静置することによって行った。
その結果、酸化型Delの添加によって消失したピークは、Cys残基(Cys6, 57, 111, 146)を含むペプチドであり、酸化型Delの添加によって出現した9本のピークを分子量で同定したところ、Cys残基間で様々な組み合わせのS-S結合が生じていることが確認された。また、このS-S結合スクランブル分子種のサイズ分析を行ったところ、SOD1G93Aはモノマーからオリゴマーまでの様々なサイズの可溶性分子種を形成していることが分かった。
このことから、酸化型アントシアニンはSOD1G93AのCys残基間でS-S結合のスクランブルを引き起こすことで、モノマーからオリゴマーまでの様々なサイズのSOD1G93A可溶性分子種を形成させ、この作用により線維形成の抑制が生じると考えられる。
酸化型VMAによるアミロイドβ(Aβ42;以下単にAβと表記する)のアミロイド線維形成の抑制効果を確認するために、以下の実験を行った。
また、非特許文献1では、アルツハイマー病発症モデルマウス(DTマウス)に、VMA入りのえさを摂取させることにより、通常の餌を摂取させたDTマウスと比べ、短期記憶力の低下が改善されたことを報告している(Y迷路テストにより確認)。
したがって、VMA(非酸化型)よりもAβのアミロイド線維形成抑制効果が有意に高い酸化型VMAは、インビボにおいても、非酸化型VMAと比べ、アルツハイマー病の症状を抑制する効果がより高いと考えられる。
凍結乾燥品のαA-クリスタリン及びαB-クリスタリンを、0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7)に溶解し、エッペンチューブで混合して、37℃で1時間インキュベートすることによって、αAB-クリスタリンヘテロオリゴマーを作製した(αA:αB=3:1) (終濃度 0.1 mg/mL、5μM)。
なお、αA-クリスタリン及びαB-クリスタリンのモル比を3:1としたのは、大部分の脊椎動物の水晶体において、αAとαBは3:1の比で存在しており、3:1のヘテロポリマーの存在が、多様な条件下における水晶体の透明度維持に関して重要であるといわれているためである。また、本発明者の実験(65℃・1時間におけるクリスタリン凝集量を光散乱測定により確認)でも、3:1のヘテロポリマーが、ホモポリマーや、他の割合のヘテロポリマーと比べて、高い熱安定性を示すことが確認されている。
次に、VMAと反応させる酸化剤の量を変え、酸化率を変えた場合に αAB-クリスタリンの凝集抑制効果に違いがみられるかを調べるため、以下の実験を行った。
このことより、αAB-クリスタリンの凝集抑制効果はVMAの酸化による効果であると考えられた。
Claims (8)
- タンパク質の凝集及び/又は線維化を抑制するための組成物であって、有効成分として酸化型アントシアニンを含有することを特徴とする組成物。
- 前記タンパク質が、α-クリスタリン、α-シヌクレイン、SOD1、アミロイドβ及びそれらの変異体からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 酸化型アントシアニンとアントシアニンのモル比が、70:30〜100:0であることを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記組成物が、白内障、パーキンソン病、家族性ALS及びアルツハイマー病からなる群より選択される疾患を予防及び/又は治療するための組成物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、白内障を予防及び/又は治療するための組成物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 食品・飲料、サプリメント、医薬組成物からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 酸化型アントシアニンを含有する組成物であって、酸化型アントシアニンとアントシアニンのモル比が70:30〜100:0であることを特徴とする組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物を製造する方法であって、アントシアニン又はアントシアニン含有素材を過酸化水素により酸化する工程、及び、その後カタラーゼにより前記過酸化水素を分解する工程を含むことを特徴とする、方法。
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