JP2017160190A - トランスグルタミナーゼ産生促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、トランスグルタミナーゼの産生を促進し、表皮角質細胞を正常化し、乾燥肌やアトピー性皮膚炎症状の軽減、及び魚鱗癬の予防や治療に有効な製剤を得ることにある。【解決手段】サガラメの抽出物、ヨモギの抽出物、エイジツの抽出物、オタネニンジンの抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分とすることによって、トランスグルタミナーゼの産生を促進する製剤を得ることができた。【選択図】図１

Description

本発明は、トランスグルタミナーゼ産生促進剤に関する。

トランスグルタミナーゼはヒトを含めた動物の臓器中に分布する。分子量は３万から１０万程度のタンパク質である。
主な作用は皮膚最外層に存在する遊離のグルタミン酸残基とリシン残基との反応を触媒し，ε−リシン（γ−グルタミル）結合からなる架橋を形成することにより，表面構造を緻密化することである。反応系の組成によって３つの反応様式がある。いずれの場合もペプチド鎖中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基がアシル供与体となるが，アミン化合物が存在する場合にはそのアミノ基がアシル受容体となり，アミン化合物のペプチドへの付加反応が起こる。ペプチド中のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体として反応すると，ε−リシン−イソププチド結合によるペプチド鎖間の架橋が形成される。
以上の反応は、角化過程でインボルクリンやロリクリンなど疎水性のタンパク質が共有結合で架橋されて、不溶性のコーニファイドエンベロップ(cornified envelope(角質肥厚膜))と呼ばれる細胞膜の裏打ちタンパク質となり角層の安定化に寄与する。この形成において最も重要な役割を担うトランスグルタミナーゼの活性欠乏は、魚鱗癬など皮膚バリアを失う重篤な疾患となる。近年は、セラミドも単独では充分なバリア効果を発揮できず当該酵素による架橋が角質バリアの充実に重要であることも明らかになりつつある。
したがって、トランスグルタミナーゼの発現の促進や活性の増強は、表皮角質細胞を正常化し、乾燥肌やアトピー性皮膚炎症状の軽減、及び魚鱗癬の予防や治療に有効である。
トランスグルタミナーゼ産生促進剤として、月見草抽出物、パントテインスルホン酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等の外用剤が提案されている。(特許文献１〜２)
しかし、さらなるトランスグルタミナーゼ産生促進剤が求められている。

サガラメ(Eisenia arborea Areschoug）は、褐藻類、コンブ科(Laminariaceae)、アラメ属(Eisenia）の海藻で、アラメとちがって一次側葉のみで、葉の途中から二次側葉が生えない。食材として用いられている。
さらに血管新生抑制剤、β−グルクロニダーゼ阻害剤、ＡＧＥ生成阻害剤、アクアポリン産生増強製剤等の用途が知られている。（特許文献３〜６参照）
ヨモギは（学名：Artemisia indica 又はArtemisia princeps ）、ニガヨモギ（Artemisia absinthium）、モウコヨモギ（Artemisia mongolia)の葉または全草を乾燥したもので、止血、鎮痛、下痢止め等に効く生薬（艾葉と称される）として用いられてきた。さらに保湿性、吸湿性、クローディン産生促進剤、オクルディン産生促進等に効果のある化粧料の原料として、さらに抗かゆみ外用、血液粘性低下剤、グリケーション阻害剤としても用いられている。（特許文献７〜１１）

エイジツ（営実）は、ノイバラ(Rosa multiflora)の果実で、古くより漢方薬として知られ、瀉下薬、利尿薬にとして利用されてきた。
さらに毛髪化粧料、くすみ防止用皮膚外用剤、エラスターゼ阻害剤、セラミド産生促進剤としても知られている。（特許文献１２〜１５）
オタネニンジン(Panax ginseng）はチョウセンニンジン（朝鮮人参）、コウライニンジン（高麗人参）、また単に人参とも呼ばれる。
『神皇本草経』にも記載がある古くより利用されてきた生薬で強壮,強心,健胃、補精、鎮痛等に利用されている。
さらにセラミド産生促進剤、育毛料、グルタチオン産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤、抗肥満剤、エラスチン産生促進剤等の用途が知られている。（特許文献１６〜２０）

特開２００４−９１３７６号公報 特開平１１−１００３２０号公報 特開２００６−０２２０３３号公報 特開２００６−０４５１８８号公報 特開２００８−２１４２４６号公報 特開２０１３−０８７０５７号公報 特開平０５−２７１０４７号公報 特開平０６−１７２１９６号公報 特開平０６−２１１６７９号公報 特開２００４−２５０４４５号公報 特開２００９−２５６２４４号公報 特開平１１−００５７１９号公報 特開平１１−３３５２３６号公報 特開２０００−１１９１８９号公報 特開２０００−１６９３５９号公報 特開２０００−１６９３５９号公報 特開２００３−２３８３６５号公報 特開２００９−１３２６６２号公報 特開２０１０−１５５７８７号公報 特開２０１２−０５６９３３号公報

本発明の目的はトランスグルタミナーゼの産生を促進し、表皮角質細胞を正常化し、乾燥肌やアトピー性皮膚炎症状の軽減、及び魚鱗癬の予防や治療に有効な皮膚外用剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、サガラメの抽出物、ヨモギの抽出物、エイジツの抽出物、オタネニンジンの抽出物が上記目的を達することがわかった。
サガラメ、ヨモギ、エイジツ、オタネニンジンは、必要に応じて乾燥した後、抽出効率を考えると、細切、粉砕等の処理を行った後に抽出する。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。

抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
本発明者らが検討した結果、本発明の効果を発揮する物質は、水にも、８０％のエタノール抽出されるので、ある程度精製する場合は、水で抽出したのち、不溶物を取り除き、等量〜５倍量のエタノールを加えてさらに抽出するとよいこともわかった。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００００１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５〜１．０重量％である。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
サガラメ（乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。

実施例２
ヨモギの葉（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。

実施例３
エイジツ（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。

実施例４
オタネニンジン（根、乾燥物、細断品）を５０ｇに２０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。

確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、illustra RNA Mini RNA Isolation Kit（GE Healthcare社）を用い、GE Healthcare社の添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
なお、対象遺伝子はトランスグルタミナーゼ１である。

確認試験の結果を図１に示す。

また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、乾燥肌、アトピー性皮膚炎に改善がみられた。

縦軸は実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。

Claims (1)

1. サガラメの抽出物、ヨモギの抽出物、エイジツの抽出物、オタネニンジンの抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するトランスグルタミナーゼ産生促進剤。