JP2017147997A

JP2017147997A - 柿発酵組成物および柿果実の処理方法

Info

Publication number: JP2017147997A
Application number: JP2016034366A
Authority: JP
Inventors: 千賀折居; Chika Orii
Original assignee: Toyo Institute of Food Technology
Current assignee: Toyo Institute of Food Technology
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2017-08-31

Abstract

【課題】柿の果実を簡便に処理して新たな機能を有する柿発酵組成物および柿果実の処理方法を提供する。【解決手段】柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、加熱処理した柿発酵組成物、および、柿の果実を麹菌で発酵処理する発酵工程と、発酵処理物を加熱する加熱工程と、加熱した発酵処理物に水或いはアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法。【選択図】図１

Description

本発明は、柿の果実の発酵処理によって得られた柿発酵組成物、および、柿果実の処理方法に関する。

柿は、通常、柿果実や柿果実を用いた加工食品を食用とするため、広く栽培されている。柿の果実を食用とする際には、果実以外の蔕（ヘタ）などを分離して果実部分を使用していた。柿の利用については、例えば以下のことが公知である。

特許文献１には、柿の乾燥果実を水または任意の果汁に浸漬して膨潤させ、膨潤した乾燥果実の果肉を破砕して泥漿化させたのちペクチン分解酵素を添加して液状化させ、得られた液状化物にアルコール発酵用糖源を補給するとともに酵母を加えてアルコール発酵を生起させる柿ワインの製造法が記載してある。

特許文献２には、柿をペースト状にして乳酸発酵させることが記載してある。この乳酸発酵は、植物由来の乳酸菌を用いて行われている。これにより、柿の抗酸化活性機能を増強させることができ、一方では、酸化ストレスによる、赤血球変形能の低下を抑制する能力を、劣化させることがないという効果を奏するとされている。

特開平１０−１９１９５５号公報特開２０１０−２５２７２６号公報

特許文献１，２は、何れも柿の果実を破砕したりすり潰したりした後、発酵の前処理としてのペクチン分解酵素、あるいは並行複発酵の手法として酵母や乳酸菌を用いた発酵と同時にセルラーゼ分解酵素を用いた処理も行っていた。即ち、酵素処理の前に果実を破砕したりすり潰したりする前処理を行う必要があり、煩雑であった。

また、柿は、果実に糖質、ビタミン、カリウム等を豊富に含み、さらに上述した抗酸化活性の他、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、抗アレルギー作用等を有することが知られている。そのため、柿の果実を処理して新たな機能を有する組成物を作出することが期待されている。

従って、本発明の目的は、柿の果実を簡便に処理して新たな機能を有する柿発酵組成物および柿果実の処理方法を提供することにある。

本発明者らは柿の果実の処理について鋭意検討した結果、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分とした柿発酵組成物を適温で加熱処理することにより、抗肥満作用および血圧上昇抑制作用を増強できることを見出した。

即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［７］に示す発明を提供する。
［１］柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、加熱処理した柿発酵組成物。
［２］１００〜１６０℃の前記加熱処理により、抗肥満作用および血圧上昇抑制作用が増強される［１］に記載の柿発酵組成物。
［３］前記麹菌がアスペルギルス属である［１］または［２］に記載の柿発酵組成物。
［４］前記麹菌が黒麹菌である［３］に記載の柿発酵組成物。
［５］柿の果実を麹菌で発酵処理する発酵工程と、発酵処理物を加熱する加熱工程と、加熱した発酵処理物に水或いはアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法。
［６］前記加熱工程が湿熱処理、或いは、乾熱処理の何れか一方である［５］に記載の柿果実の処理方法。
［７］前記加熱工程における加熱処理が１００〜１６０℃である［５］または［６］に記載の柿果実の処理方法。

本発明の柿発酵組成物は、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、柿発酵組成物を適温（１００〜１６０℃）で加熱処理するものである。
後述の実施例では、麹菌としてアスペルギルス属の黒麹菌を用いた態様を示し、実施例５では、抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）が加熱工程の温度によってどのように変化するかを調べ、前記加熱処理により抗肥満作用が増強されることが示されている。
また、実施例９では、血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性）が加熱工程の温度によってどのように変化するかを調べ、前記加熱処理により血圧上昇抑制作用が増強されることが示されている。

本発明では、柿発酵組成物の機能性（抗肥満作用、血圧上昇抑制作用など）を損なわない加熱工程の条件を検討している。一般の細菌（指標となる抗酸菌など）は高温には弱く、５５〜７５℃（１０〜３０分間）の加熱で殺菌することができることが知られている。そのため、通常の食品の加熱殺菌は８０℃程度であれば、通常の食品の加熱殺菌温度としての条件はクリアできるとされている。
さらに、本発明では、柿発酵組成物を医薬品や食品として利用することを鑑みると、医薬品や食品としての食味や形状を考慮する必要がある。そのため、滅菌処理等に使用される１２０℃程度の温度域では、医薬品や食品の加熱としては食味や品質の低下を招く虞があり、食味、品質および形状を考慮すれば商業的には行われない温度域である。
また、本発明の加熱工程の温度範囲は、発酵を止める温度域とする必要がある。

以上の条件を満たす加熱温度の温度範囲として、本発明者らは、柿発酵組成物を１００〜１６０℃で加熱処理することを見出した。

即ち、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、適温（１００〜１６０℃）で加熱処理することで、柿発酵組成物は、抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）および血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素阻害活性）を増強できるため、それぞれの柿発酵組成物を抗肥満剤および血圧上昇抑制剤として利用することができる。

抗肥満剤は、腸内でβ-リパーゼの働きを阻害し、脂肪の分解・吸収を阻害するβ-リパーゼ阻害活性を有することにより達成される。

血圧上昇抑制剤は、例えば血圧の上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するものであり、有効量の血圧上昇抑制剤を摂取することで、血圧の上昇を抑制することが期待される。

本発明で使用する柿は、食用の果実として広く栽培されているものであり、入手は容易である。柿の果実部分を発酵処理に供する際には、そのまま使用できるため、簡便に発酵処理（発酵工程）、加熱工程および抽出工程を行うことができる。

本発明の抽出工程でアルコールを使用する場合は、柿発酵組成物を医薬品や食品として利用することを鑑みると、入手が容易、かつ人体に対する安全性を備えたエタノール等を用いるのがよい。

尚、本発明は、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、当該処理物を加熱処理により機能性（抗肥満作用、血圧上昇抑制作用など）が増強されるものであるが、これら機能性が増強されるための具体的な成分は特定に至っていない。当該成分を特定するための実験や試験回数は非常に膨大なものとなり、その結果、著しく過大な時間と労力と経済的支出とを伴うものとなると考えられる。よって、一刻も早く出願をして先願の地位を確保しなければならない先願主義のもとでは、非実際的であると言わざるを得ないため、成分を特定するのが困難なため、加熱工程の温度範囲で「柿発酵組成物」を特定している。

柿果実の処理方法を示す流れ図である。ＬＣ−ＭＳ分析を行った結果を示す図である（未発酵物（富有柿幼果））。ＬＣ−ＭＳ分析を行った結果を示す図である（黒麹菌発酵物）。ＧＣ−ＭＳ分析を行った結果を示す図である。抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）が加熱工程の温度によってどのように変化するかを調べた結果を示した図である。ポリフェノール量を測定した結果を示した図である。抗酸化活性の定量を行った結果を示した図である。血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性）が加熱工程の温度によってどのように変化するかを調べた結果を示した図である。未発酵の富有柿幼果における加熱工程（乾熱処理）時の内部温度の変化を調べたグラフである。

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１に示したように、本発明は、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、加熱処理した柿発酵組成物である。当該柿発酵組成物は、柿の果実を麹菌で発酵処理する発酵工程と、発酵処理物を加熱する加熱工程と、加熱した発酵処理物に水或いはアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法によって得ることができる。

本発明で使用する柿の部位は、蔕部分を取り除いた果実部分である。果実部分が含まれていれば、果皮や種の有無は問わない。用いられる柿の品種に特に制限はなく、分類学上でDiospyros kakiに属するものであれば何れも用いることができるが、入手が容易である等の理由から、例えば富有柿や次郎柿等とするのがよい。柿は、通常の収穫時期よりも早い時期に収穫された幼果（着果後３０〜６０日程度）、或いは、通常の収穫時期に収穫された成熟果実（着果後１５０〜１８０日程度）を利用するのがよい。収穫した柿から蔕部分を取り除いた後、そのまま、好ましくは洗浄、果皮や種の除去、細断、殺菌処理を行って果実原料とし、発酵工程に供する。殺菌処理は、例えば煮沸、紫外線、薬品による殺菌など、公知の処理を行えばよい。

麹菌は、例えば焼酎製造用に供されるアスペルギルス属の麹菌を使用するのがよい。焼酎製造用に供される麹菌は、例えば蒸煮した大麦や米などの穀類などの固体原料を醗酵し、糖質からクエン酸を産生する糸状菌を指す。このような麹菌としては、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus Awamori））、白麹菌（アスペルギルス・カワチ（Aspergillus Kawachii））を使用することができる。
このような麹菌は、市販のものを使用することが可能であり、また、特許寄託機関に寄託してある菌株を使用することも可能である。寄託された菌株は、例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手可能であり、ＮＢＲＣ４０３３の寄託番号で表される黒麹菌を使用することができる。本発明においては、上述した菌株の変異株又は派生株であってもよく、このような菌株を使用して得られた柿発酵組成物が後述する作用を有する限り使用することができる。

本発明において使用する麹菌は、当該麹菌の固体培養に通常用いられる蒸煮した原料を使用して、適当な条件下で固体培養することにより調製することができる。原料としては、穀物として米、麦（大麦、小麦、ライ麦及びオート麦）など、豆類として大豆など、イモ類としてサツマイモなど、当該麹菌が効率よく生育する原料であればどのような原料でも用いることができる。これら原料は単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。或いは、本発明において使用する麹菌は、ポテトデキストロース寒天培地などの公知の真菌用培地を用いて調製してもよい。

培養後、得られた麹菌培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製、濾過等による固液分離、滅菌操作などを行ってもよい。また、麹菌は、２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。

発酵工程は、柿の果実部分、および、上述のように調製された麹菌を種菌として接触させて十分に攪拌混合し、約２０〜４５℃の範囲で送風、攪拌、静置を繰り返すことによって行う。発酵工程において柿の果実部分と接触させる麹菌の量は、通常、柿の果実部分に対して乾燥麹菌粉末が０．００１〜１０質量％程度となるようにするのがよいが、これに限定されるのではない。発酵工程を行う際のｐＨ、時間などは公知の条件で行えばよく、例えばｐＨ３〜８程度で１〜２０日間かけて行うとよい。発酵工程の後、例えば通風乾燥などによって培養物を４０〜４５℃程度で１日程度乾燥させる。

発酵工程の後、発酵処理物を加熱する加熱工程を行う。加熱工程は、例えば乾熱処理、或いは、湿熱処理といった公知の手法を適用することができるが、これに限定されるものではない。乾熱処理は、例えば加熱温度や時間を調節できる乾熱器を使用することができる。また、湿熱処理は、例えば湯浴の他、オートクレーブといった加熱温度や時間を調節できる高圧蒸気滅菌器を使用することができる。

加熱工程による加熱温度は、後述するように、１００〜１６０℃の前記加熱処理により抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）を増強することができる。この場合、好ましくは２０〜５０分の加熱時間とするのがよい。さらに好ましくは、１２０〜１６０℃、１０〜５０分とするのがよい。

さらに、加熱工程による加熱温度は、後述するように、１００〜１６０℃の前記加熱処理により血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性）を増強することができる。この場合、好ましくは１００℃の場合は５０分程度の加熱時間とするのがよい。好ましくは、１２０〜１６０℃、１０〜５０分の前記加熱処理により、さらに好ましくは１４０〜１６０℃、３０〜５０分とするのがよい。

加熱した発酵処理物に水或いはアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程を行う。水抽出は公知の手法で行えばよい。抽出工程でアルコールを使用する場合は、発酵処理物を、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の抽出溶媒であるアルコール中に浸漬、攪拌又は還流することにより、抽出液を得ることができる。アルコールは、これらアルコールおよび水の混合溶液、上述した複数のアルコールおよび水を混合した溶液、或いは、上述したアルコールの複数を混合した溶液を利用してもよい。アルコールおよび水の混合比率は特に限定されるものではない。

抽出条件として、抽出温度に関しては、抽出に用いる溶媒の凝固点以上から沸点以下であれば任意に設定が可能であり、好ましくは柿の果実中に含まれる成分の変性や反応による消失等が生じ難く、かつ抽出効率が比較的良好な常温〜溶媒の沸点の温度範囲とするのがよい。抽出圧力に関しては、具体的には１．０〜２．５ｋｇ／ｃｍ²の範囲内で適宜設定するのがよい。発酵処理物に対する溶媒の重量比率は、例えば発酵処理物：溶媒を２：１〜１：５０の範囲内で任意に設定することができるが、これに限定されるものではない。抽出時間に関しては特に制限はなく、好ましくは数時間から数日とするのがよい。

抽出工程では、必要に応じて溶媒を加えた発酵処理物に対して加熱処理を行うとよい。加熱処理は、例えば３０分〜３時間、２５〜３５℃の条件で行うのがよい。

上述した１００℃以上の加熱工程を経て得られた柿発酵組成物はそのまま利用してもよいが、当該柿発酵組成物を更に精製して用いることも可能である。精製方法としては、具体的には濾紙やメンブランフィルター等を用いた濾過法、分液操作法、蒸留法、昇華法、沈殿法、再結晶化法、遠心分離法、減圧濃縮法、ｐＨ調製、塩析等の方法が挙げられ、これらの方法の１種もしくは２種以上が選択されるが、これらの手法に限定されるものではない。

また、当該柿発酵組成物は、適当な溶媒で希釈したり、濃縮して用いてもよく、さらに減圧乾固する等して乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。

このようにして調製された柿発酵組成物に、水、アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、酸、アルカリ、増粘剤、賦形剤、防腐剤等を添加した組成物とすることも可能である。当該柿発酵組成物の形状として、液状である他、固形状、粉末状、顆粒状、ペレット状、ゲル状、粘液状等とすることができる。

当該柿発酵組成物は、医薬品として経口、経腸、経粘膜、注射等により投与できる。その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、上述した組成物に、さらに薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて添加することができる。投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の柿発酵組成物の含有量は、例えば０．１〜７０質量％程度とすることが好ましい。

医薬として使用する場合、成人１人当たりの１日の投与量は、年齢、体重、性別、投与方法などの種々の要因によって異なるが、経口投与の場合は上記植物体又はその抽出物（固形分換算）として、例えば０．１〜５０００ｍｇを１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。

当該柿発酵組成物は、食品として用いる場合の形態としては、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。また、前記柿発酵組成物は、種々の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品等に適宜配合してもよい。

種々の形態の食料品を調製するには、上述した柿発酵組成物に、さらに他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて添加することができる。当該食料品中の柿発酵組成物の含有量は、一般的に例えば０．００２〜５質量％程度とすることが好ましい。

本発明の柿果実の処理方法（１００℃以上の加熱工程を経て得られた）によって得られた柿発酵組成物は、血圧上昇抑制作用および抗肥満作用を有する。

抗肥満作用による抗肥満効果は、腸内でβ-リパーゼの働きを阻害し、脂肪の分解・吸収を阻害するβ-リパーゼ阻害活性を有することにより達成される。

血圧上昇抑制作用は、例えば血圧の上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することにより達成される。血圧上昇には昇圧機構（レニン・アンジオテンシン系）と降圧機構（キニン・カリクレイン系）が関与しており、アンジオテンシン変換酵素は両方の系に作用する酵素である。アンジオテンシン変換酵素により、アンジオテンシンＩは血管収縮作用を有するアンジオテンシンＩＩに変換される。さらに、同酵素は血圧を下げるブラジキニンを不活性化させる作用も有しており、これら２つの系の作用が血圧上昇に関与する。そのためアンジオテンシン変換酵素を阻害することで、血圧の上昇を抑制することができると考えられている。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) から切り出されてくる 3-Hydroxybutyric acid (3HB) を酵素法により検出することができる。

本発明の柿発酵組成物は、当該柿発酵組成物を有効成分として含有する医薬組成物又は機能性食品として供するのが好ましい。特に機能性食品の態様であれば、日常的に経口摂取できるため、手軽に血圧上昇および肥満を予防することができると考えられる。また、有効成分として含まれる柿発酵組成物は、高温処理や凍結乾燥処理をした後でも上述した諸作用を保持することから、食品などの加工処理に適している。さらに、柿発酵組成物は、添加しても食品自体の食味や風味に影響を殆ど与えないため、種々の食品に添加して継続的に摂取することができる。

当該機能性食品とは、例えば、特定保健用食品（体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、特定の効能が認められる食品）、栄養機能食品（栄養成分の補給・補完のために利用する食品）、健康補助食品、栄養補助食品などの態様で供されるものを指す。このような機能性食品であれば、広く市場に流通しており、容易かつ安価に入手ができる。当該機能性食品に含まれる本発明の柿発酵組成物の割合は、当業者が適宜設定すればよい。

〔実施例１〕
本発明の実施例について説明する。
柿の果実は、富有柿の幼果を使用した。幼果は皮・蔕・種を取り除き細断したのち、１００℃の熱水中で５秒間、煮沸による殺菌を行った（果実原料）。殺菌後、試料を滅菌済み３００ｍＬバッフルフラスコに４０．０ｇずつ移した。

麹菌は黒麹菌（ＮＢＲＣ４０３３）を使用した。黒麹菌は、ポテトデキストロース斜面培地にて３５℃で２日間培養したものを種菌とした。適当量の種菌を滅菌水１０ｍＬで懸濁後、２．０ｍＬを上記の果実原料に添加し、好気条件下、３５℃で７日間発酵を行った（発酵工程）。発酵処理物は０，７日目にサンプリングを行った。
また、発酵処理物を加熱する加熱工程（湿熱処理）は、８０℃（湯浴）、１２１℃（オートクレーブ）でそれぞれ２０分の処理を行った。抽出工程を行って柿発酵組成物を調製した。

抽出工程は、以下のようにして行った。
・１００％エタノール-水抽出
３０ｍＬのエタノールを用いて４日間抽出してエタノール抽出物を回収した後、３０ｍＬの水を用いて４日間抽出を行った。エタノール画分は減圧乾固後、水に可溶、エタノール不溶成分の析出が見られたため、エタノール可溶成分をエタノール画分とし、水に可溶、エタノール不溶成分は水画分と統合した。それぞれの成分を減圧乾固したのち、１０％（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれの溶媒に再溶解した。

〔実施例２〕
実施例１で作製した柿発酵組成物のβ-リパーゼ阻害活性について調べた。
本試験は、５０μＬの蛍光性のメチルウンベリフェロンオレイン酸エステル溶液に２５μＬの試料溶液（終濃度：２．５〜２５００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、２５μＬのβ−リパーゼを添加し、３７℃で３０分間酵素反応を行った。反応終了後、５０μＬの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにて、遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定した。残存活性を求めたのち５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀、μｇ／ｍＬ）を算出した。

β-リパーゼ阻害活性は、エタノール画分および水画分について行った。試料は、未発酵物（富有柿幼果）および黒麹菌発酵物（黒麹菌の発酵処理物）を使用した。エタノール画分の結果を表１に示した（値が小さいほど高い活性であることを示す）。

この結果、未発酵物（富有柿幼果）および黒麹菌の発酵処理物の何れも顕著なβ-リパーゼ阻害活性の増加は確認できなかった。

また、水画分の結果を表２に示した。

この結果、未発酵物（富有柿幼果）および黒麹菌の発酵処理物について、いずれも熱処理（１２１℃、２０分）に伴う阻害活性の変化が認められた。しかし、後述のＧＣ−ＭＳあるいはＬＣ−ＭＳ分析により、活性増加に関与する化合物が異なる可能性が考えられた。

〔実施例３〕
実施例１で作製した水画分について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。ＬＣ−ＭＳ分析は、使用カラムとしてScherzo SS-C18（１５０ｍｍ×φ２ｍｍ）（インタクト株式会社製）、溶媒Ａとして純水（０．２％酢酸＋０．２％ギ酸添加）、溶媒Ｂとして２００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液−メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）を使用した。流速は０．３ｍＬ／分、カラム温度は４５℃に設定した。溶媒Ｂ２％で３分間保持したのち，溶媒Ｂを１１分かけて２％から４５％に上げ，１０分かけて溶媒Ｂを１００％まで上げるグラジエントプログラムとした。注入量は３μＬとした。イオン化はＥＳＩ（Electrospray Ionization）法で，走査範囲はｍ／ｚ１００−１０００，フラグメンター電圧を１００Ｖ，乾燥窒素ガス（３５０℃）を毎分１０Ｌ，ネブライザー圧を５５ｐｓｉ，キャピラリー電圧はポジティブおよびネガティブともに４０００Ｖとした。結果を図２（未発酵物（富有柿幼果））、および、図３（黒麹菌発酵物（黒麹菌の発酵処理物））に示した。

その結果、未発酵の富有柿幼果、黒麹菌の発酵処理物ともに黒矢のピーク以外で熱処理にともなう顕著な成分の変化は見られなかった。ＬＣ−ＭＳ分析で検出された黒麹菌の発酵処理物のピークは顕著な増減、消失が見られなかったため、熱に安定であることが示唆された。また、未発酵の富有柿幼果の熱処理（１２１℃）および黒麹菌の発酵処理物の熱処理（１２１℃）を比較すると、ＬＣ−ＭＳ分析で検出された成分に限り、未発酵の富有柿幼果を熱処理したとしても発酵物の熱処理物とは異なる成分であると考えられた。

〔実施例４〕
実施例１で作製した水画分について、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。ＧＣ−ＭＳ分析では、減圧乾固した試料あるいは標品に対し１００μＬの無水ピリジン或いはメトキシアミン溶液（無水ピリジンに２％（ｗ／ｖ）ｏ−メトキシアミン塩酸塩を添加）を添加し、再溶した。同溶液に２００μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ，Thermo Fisher Scientific, Inc.）を添加し，室温で４時間反応させトリメチルシリル誘導体化したのち，ＧＣ−ＭＳ分析に供した。ＧＣ−ＭＳ分析条件を以下に示す。
ＧＧ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ（アジレントテクノロジー製）
検出器：Ａｇｉｌｅｎｔ５９７２（アジレントテクノロジー製）
カラム：Ｊ＆ＷＤＢ−５（アジレントテクノロジー製、３０ｍ×０．２５ｍｍ−i.d.，膜厚０．２５μｍ）；
キャリアーガス：ヘリウム（１．０ｍＬ／分）
注入口温度：２６０℃；オーブン８０℃で２．０分保持、１０℃／分で３２０℃まで昇温し、４．０分保持
溶媒待機時間４．０分
イオン化：ＥＩ（イオン化電圧７０ｅＶ）
結果を図４に示した。

ＧＣ−ＭＳ分析ではＬＣ−ＭＳ分析よりも成分の相違が認められた。特に未発酵の富有柿幼果の熱処理（１２１℃）と黒麹菌の発酵処理物の熱処理（１２１℃）のクロマトグラムには相違が顕著に認められた。これはＬＣ−ＭＳ分析における結果を裏付けるものであり、未発酵の富有柿幼果を熱処理して生成する化合物の多くは黒麹菌の発酵処理物の熱処理とは異なると考えられた。これは、熱処理物の機能性において関与する化合物が未発酵の富有柿幼果および黒麹菌の発酵処理物の熱処理では異なる可能性が示唆されている。

また、黒麹菌の発酵処理物の熱未処理とその黒麹菌の発酵処理物の熱処理（１２１℃）においてもクロマトグラムの相違がみられ、ミオイノシトール（３）、トレハロース（５）などの異なる成分が検出された。
具体的には、未発酵の富有柿幼果では、フルクトース（１）、グルコース（２）、ミオイノシトール（３）、スクロース（４）を同定した。未発酵の富有柿幼果の熱処理では、上記の幼果由来成分が消失、または減少した。
黒麹菌の発酵処理物の熱未処理では、フルクトース（１）を同定し、発酵に伴いグルコース（２）、ミオイノシトール（３）、スクロース（４）が消失した。
黒麹菌の発酵処理物の熱処理（１２１℃）では、フルクトース（１）は熱処理による消失は見られず、新たにミオイノシトール（３）、トレハロース（５）を検出した。

〔実施例５〕
実施例１にて準じた手法（水抽出）にて調整した柿発酵組成物を使用して、抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）が加熱工程（乾熱処理）の温度によってどのように変化するかを調べた。

処理温度は、８０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃とした。加熱処理は０分（未処理）および１０〜５０分とした。結果を図５に示した。

この結果、８０℃処理では、未処理の場合と比べて１０分〜４０分ではβ-リパーゼ阻害活性減少或いは横ばいとなり、５０℃でβ-リパーゼ阻害活性が増加した。
１００℃処理では、２０〜５０分の処理でβ-リパーゼ阻害活性が増加した。
１２０〜１６０℃処理では、１０〜５０分の処理でβ-リパーゼ阻害活性が増加した。

従って、１００〜１６０℃、２０〜５０分の加熱処理により、抗肥満作用が増強されるものと認められた。また、好ましくは、１２０〜１６０℃、１０〜５０分の加熱処理により、抗肥満作用がより増強されるものと認められた。

尚、加熱温度について、上限は１６０℃に限定されるものではなく、加熱時間についても上限は５０分に限定されるものではなく、本発明と同等の抗肥満作用が増強されるものと認められる範囲において有効である。

〔実施例６〕
実施例１にて調整した柿発酵組成物を使用して、ポリフェノール量を測定した。ポリフェノール量の定量は、公知の手法に従いフォーリン・チオカルト法を用いて測定した。各種子抽出液０．０９ｍＬに０．４５ｍＬの５０％フォーリン・チオカルト試薬を添加し、攪拌した。３分後、０．４Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．４５ｍＬを加えて攪拌後、５５℃で５分間インキュベートした。反応液を１時間放冷して気泡を除き、Ｕ−３２１０形自記分光光度計（日立）にて７６５ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき、ポリフェノール量は没食子酸を用いて検量線を作成し、抽出物１．０ｇあたりの没食子酸相当量（ｍｇ−没食子酸相当量／１．０ｇ）にて算出した。

加熱工程（乾熱処理）の処理温度は、８０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃とした。加熱処理は０分（未処理）および１０〜５０分とした。結果を図６に示した。

この結果、加熱により若干のポリフェノール量の増加傾向が認められたが、温度による明確な傾向は見られなかった。１２０℃条件下において最も顕著なポリフェノール量の増加傾向を示した。いずれの温度においても加熱による顕著なポリフェノール量の減少は見られなかった。

〔実施例７〕
実施例１にて調整した柿発酵組成物を使用して、抗酸化活性の定量を行った。抗酸化活性の定量は公知の手法に従って行った。試料溶液を適宜希釈後，９６穴プレートに１００μＬを添加した。０．２ＭＤＰＰＨエタノール溶液１００μＬを添加したのち攪拌し混合した。室温で３０分静置したのち、５２０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（μＱｕａｎｔ，ＢＩＯ−ＴＥＫ社製）で測定した。このとき、標準試薬としてトロロックスを用いた．検量線を作成したのち、抗酸化能をトロロックス相当量（μｍｏｌ−トロロックス相当量／１．０ｇ）で算出した。

加熱工程（乾熱処理）の処理温度は、８０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃とした。加熱処理は０分（未処理）および１０〜５０分とした。結果を図７に示した。

この結果、何れの温度条件下でも加熱にともなう抗酸化活性の増加が認められ、それらは温度に依存することが判明した。１２０〜１６０℃条件下（例えば１０〜５０分の加熱処理）では抗酸化活性の増加程度はほぼ同等であり、また、１００〜１６０℃条件下（例えば２０〜５０分の加熱処理）では抗酸化活性の増加程度はほぼ同等であり、加熱時間の増加による抗酸化活性の顕著な増減は確認されなかった。

〔実施例８〕
実施例１で作製した柿発酵組成物の血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性）について調べた。
本試験は、血圧上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害活性をエースキット−ダブルエスティー（アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定キット）（（株）同仁化学研究所）を用いて測定し、阻害率（ＩＣ₅₀）を求めた。本実施例では、１００％エタノール−水抽出物（水画分）の阻害活性を調べた。

試験はキットの使用方法に沿って行った。つまり、超純水で調製したアンジオテンシン変換酵素とアミノアシラーゼ混合液２０μＬ、基質溶液（3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)）２０μＬ、試料溶液２０μＬを混合し、３７℃で１時間反応させた。これに、３−ヒドロキシブチル酸デヒドロゲナーゼと補酵素の混合液２００μＬを添加して１０分間室温で反応させた。反応後４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに阻害率を算出した。結果を表３に示した（値が小さいほど高い活性であることを示す）。

未発酵の富有柿幼果の熱処理したものでは阻害活性は減少し、黒麹菌の発酵処理物（１２１℃、２０分処理）おいては最も阻害活性が増加したことが認められた。

〔実施例９〕
実施例１にて調整した柿発酵組成物を使用して、血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性）が加熱工程（乾熱処理）の温度によってどのように変化するかを調べた。

処理温度は、８０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃とした。加熱処理は０分（未処理）および１０〜５０分とした。結果を図８に示した（実験結果が確認できたデータのみ示した）。

この結果、８０℃処理では、未処理の場合と比べて１０分〜２０分ではＡＣＥ阻害活性減少或いは横ばいとなり、３０〜５０℃で活性が増加した。
１００℃処理では、５０分の処理でＡＣＥ阻害活性が増加した。
１２０〜１６０℃処理では、１０〜５０分の処理でＡＣＥ阻害活性が増加した。

従って、１００〜１６０℃の加熱処理により、血圧上昇抑制作用を増強することができるものと認められた。この場合、好ましくは１００℃の場合は５０分程度の加熱時間とするのがよい。好ましくは、１２０〜１６０℃、１０〜５０分の加熱処理により、さらに好ましくは１４０〜１６０℃、３０〜５０分とすることにより、血圧上昇抑制作用がより増強されるものと認められた。

〔実施例１０〕
未発酵の富有柿幼果における加熱工程（乾熱処理）時の内部温度の変化を調べた。
加熱時の内部温度変化について、未発酵の富有柿幼果を加熱処理時と同様に細断したものを用いて調べた。尚、１０〜５０分までほぼ同じ温度上昇の経過をたどったため、各処理温度において５０分処理時の結果を示した。結果を図９に示した。

乾熱処理（オーブン）の温度設定と実際の内部温度には差が見られた。１２０℃、１４０℃、１６０℃処理区では、２０分の時点でほぼ一定の温度に到達し、内部温度は１００℃〜１０４℃となった。８０℃では２０分以降は６２℃〜６４℃、１００℃では８９℃〜９０℃に留まった。未発酵の富有柿幼果はオーブン加熱において１４０℃以上では橙色となった。
尚、本発明の黒麹菌の発酵処理物では乾燥にともなう体積の減少はあったが色の変化は確認できなかった。黒麹菌の発酵処理物は未発酵の富有柿幼果よりも軟化しているため、内部温度や加熱にともなう変化は若干異なると考えられるが、水分がある限り同様の経過をたどると考えられた。また、これらの結果より、得られる抽出液は温度の違う部位（表面と内部）の混合物である可能性が示唆された。

本発明は、柿の果実の発酵処理に利用でき、発酵によって得られた柿発酵組成物は、抗肥満作用および血圧上昇抑制作用を有する医薬品および食品として利用できる。

Claims

柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有し、加熱処理した柿発酵組成物。
１００〜１６０℃の前記加熱処理により、抗肥満作用および血圧上昇抑制作用が増強される請求項１に記載の柿発酵組成物。
前記麹菌がアスペルギルス属である請求項１または２に記載の柿発酵組成物。
前記麹菌が黒麹菌である請求項３に記載の柿発酵組成物。
柿の果実を麹菌で発酵処理する発酵工程と、発酵処理物を加熱する加熱工程と、加熱した発酵処理物に水或いはアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法。
前記加熱工程が湿熱処理、或いは、乾熱処理の何れか一方である請求項５に記載の柿果実の処理方法。
前記加熱工程における加熱処理が１００〜１６０℃である請求項５または６に記載の柿果実の処理方法。