JP2017131240A - 網膜の変性疾患の処置のための改良されたモーダリティー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、網膜変性用の改良された細胞−ベースの療法のため、ならびにヒト胚性幹細胞およびヒト胚由来細胞を網膜色素上皮(RPE)細胞および他の網膜先祖細胞に分化させるための方法に関する。一つの実施形態において、本発明は、a)hES細胞の増殖およびRPE−様細胞へのトランス分化を支持する培地中でhES細胞を培養し;b)神経系に沿って分化の兆候を呈する工程a)の細胞を選択し;c)色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで、トリプシン、コラゲナーゼIV、コラゲナーゼI、およびジスパーゼよりなる群から選択される酵素を用いて工程b)で選択された細胞を継代し;次いで、d)高純度RPE−様培養の樹立のために、工程c)で継代した色素沈着または非−色素沈着細胞を選択する;ことを含む、RPE−様細胞を単離する方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般に、網膜変性および他の視覚障害についての改良された細胞−ベースの療法、ならびにパーキンソン病の治療のための、および哺乳動物胚性幹細胞および哺乳動物胚−由来細胞を、網膜色素上皮(RPE)細胞、および限定されるものではないが、桿体、錐体、二極、角膜、神経、虹彩上皮、および先祖細胞を含めた他の目の組織に分化させるための方法に関する。
中枢神経系(CNS)の多くの部分は層状組織化を呈し、神経病理学的プロセスは、一般には、1を超えるこれらの多くの細胞層を含む。CNSの病気は、頻繁には、ニューロン細胞の喪失を含む、内因性再集団化の不存在のために、CNS−関連病に続いての機能の効果的な回復は極端に制限されているか、または存在しない。特に、年齢−関連黄斑変性(AMD)として知られている通常の網膜疾患は、網膜色素上皮(RPE)と共に、内部核層(INL)の介在(「リレー」)ニューロンのさらなる可変関与と共に光受容体の喪失に由来する。中低度ないし高度な明瞭度視覚の回復は、従って、損傷した細胞層のいくつかまたは全ての機能的置換を必要とする。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
a)hES細胞の増殖およびRPE−様細胞へのトランス分化を支持する培地中でhES細胞を培養する工程;
b)神経系に沿って分化の兆候を呈する工程a)の細胞を選択する工程;
c)色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで、トリプシン、コラゲナーゼIV、コラゲナーゼI、およびジスパーゼよりなる群から選択される酵素を用いて工程b)で選択された細胞を継代する工程;および
d)高純度RPE−様培養物の樹立のために、工程c)で継代した色素沈着または非−色素沈着細胞を選択する工程;
を含む、RPE−様細胞を単離する方法。
(項目2)
工程c)における細胞の継代を少なくとも2回反復する、項目1記載の方法。
(項目3)
工程b)における細胞の選択が、ネスチンまたはPax6神経系−特異的マーカーを発現する細胞の選択である、項目1記載の方法。
(項目4)
該培地が血清置換物を含有する、項目1記載の方法。
(項目5)
該培地が、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1%非−必須アミノ酸溶液、2mM GlutaMAX I、0.1mMベータ−メルカプトエタノール、4ないし80ng/ml bFGF、および8.4%ないし20%血清置換物を補充したノックアウト高グルコールDMEMを含む項目4記載の方法。
(項目6)
該培地が10ないし100ng/mlヒトLIFをさらに含む、項目5記載の方法。
(項目7)
該培地がプラズマネートをさらに含む、項目5記載の方法。
(項目8)
増殖速度、色素の発現、培養における脱分化、培養における再分化よりなる群から選択される特徴の少なくとも1つにおいて樹立されたRPE細胞系から変化する、単離されたRPEまたはRPE様細胞系。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかであろう。
「胚」または「胚性」は、母親宿主の子宮膜に着床していない発生する細胞塊を意味する。「胚性細胞」は、胚から単離された、または胚に含まれる細胞である。これは、2−細胞段階のような早期に得られた分割球、および凝集した分割球も含む。
現在、RPE同種異系移植片の慢性的なゆっくりとした拒絶は、科学者がこのRPE移植の治療効果を判断するのを妨げる。いくつかの方法がこの傷害を克服すると考えられている。最も容易な方法は、癌および感染のようなひどい副作用に関連する、全身免疫抑制を用いることである。第2のアプローチは患者自身のRPE、すなわち、ホモグラフトを移植することであるが、これは、古い病気のRPEを用いて、より多くの病気のRPEを置き換える欠点を有する。しかしながら、3番目のアプローチは同一患者からの虹彩上皮(IPE)を用いることであるが、これは、IPEがRPEのすべての視覚関連機能を実行できない欠点を有する。
色素性網膜炎は、視覚受容体が異常な遺伝的プログラミングを介して徐々に破壊される遺伝的疾患である。いくつかの形態は比較的若い年齢において完全な盲目を引き起こし、ここに、他の形態は特徴的な「骨スピクラ」網膜変化を示し、視覚破壊はほとんど伴わない。この病気は世界中で約150万の人々に影響する。常染色体劣性RPを引き起こす2つの遺伝子の欠陥がRPEにおいて専ら発現される遺伝子で見出されており:1つはビタミンA代謝に関与するRPE蛋白質(シスレチンアルデヒド結合蛋白質)によるものである、第2のものはRPE、RPE65に対してユニークなもう1つの蛋白質を含む。非ヒト動物細胞を用いることなく培養されたhES細胞由来RPE細胞系の使用では、RPのこれらの形態の双方はRPE移植によって直ちに処理可能であるべきである。この処理は、RPが絶望的に処理できず、かつまだよく理解されていない盲目の形態であった数年前では考えることができなかった。
長期培養における色素沈着上皮細胞への自然分化
LIF、FGFおよびプラズマネート非存在下でhES細胞培養物をMEF上で過剰増殖させる場合、それらは細胞の厚い多層を形成する。約6週間後に、細胞の暗い島がより大きなクラスター内に出現する(図1)。これらの暗い細胞は、図1Aに示すように、裸眼で容易に見られ、細胞のプレートにおいて「小斑点」のように見えた。より高い倍率においては、これらの島は、細胞質における茶色色素と共に、上皮細胞に典型的な、丸石単層における密にパッキングされた多角形細胞として出現する(図1C)。細胞において色素の量に差があり、島の中央部分における細胞は最も多くの色素を有し、そのエッジ近くの細胞は最も少ない色素を有する(図1Eおよび1F)。(図1Eおよび1F)。
色素沈着上皮細胞の単離および培養
本発明者らは、双方の接着性hES細胞培養から、およびEBから色素沈着上皮細胞を単離した。色素沈着多角形細胞を酵素(トリプシン、および/またはコラゲナーゼ、および/またはジスパーゼ)で消化し、これらの色素沈着島からの細胞をガラスキャピラリーで選択的に拾った。色素沈着細胞のみを拾うように注意を払ったにも拘わらず、単離された細胞の集団はいくつかの非−色素沈着細胞を常に含んだ。細胞をゼラチンまたはラミニン上で1ないし2日間平板培養した後、細胞は初代培養(P0)と考えた。
RPEマーカーの検出
RPEとしてのこれらの分化したヒト細胞の予備的特徴付けは、従前に記載されたRPE培養物に対するそれらの同様性;主としてそれらの上皮形態および色素の保有に基づく。ヒト身体には3つのタイプの色素沈着上皮細胞:網膜色素沈着上皮および虹彩色素沈着上皮ならびにケラチノサイトがあるが、後者は色素を分泌しない。上皮構造および丸石形態は他の色素沈着細胞、例えば、メラノサイトによって保有されない。また、RPE細胞は培養で増殖させるとそれらの色素および上皮形態を喪失し、再獲得することが示されている(Zhao 1997,Opas and Driak,1994)ことは特筆すべきことであり、色素沈着細胞は同様に挙動し、従って、ES由来細胞はRPEであり得るという仮説を検定するために、それらをRPEに対する公知のマーカー:ベストロフィンおよびCRALBPに対する抗体で染色した。図3(左側パネル)はベストロフィン(A)およびCRALBP(C)の膜局所化を示し、双方は色素沈着上皮島で見出される。該細胞の全てがこれらの抗体で染色されるのではなく、染色の強度は色素発現およびコロニーの「緻密性」と相関し−細胞がより大きく、よりゆるくパッキングされた各色素沈着島の境界は、双方の蛋白質のより低い発現を示した。
Cyno−1 ES細胞からのhES細胞系ACT J−1から誘導されたRPE−様細胞の特徴付け、および既存のhES細胞系H1、H9およびH7からのRPE−様細胞の誘導
RPE−様細胞系を拡大培養し、凍結および回収についてテストし、以下の方法およびRPE細胞の分子マーカーを用いて特徴付けた:ウェスタンブロットおよび免疫蛍光によってベストロフィンならびにCRALBP、ELISAおよびウェスタンブロットによってPEDFおよびRT−PCRによってRPE65。細胞を対照としての未分化hESまたはCyno−1細胞と共にSCIDマウスに注入して、腫瘍形成性を評価した。RPE−様細胞のカリオタイピングは市販ベースにて臨床試験場によってなされる。次いで、RPE−様細胞の機能的特性の特徴付け、およびそれらの移植能力の試験を、本出願の別の箇所に記載されたようにまた当業者に公知の技術を用いて行う。
RPE−様細胞の高い収率を保証する分化培養系の最適化
ES細胞を、段階的添加を含めた因子、例えば、bFGF、インスリン、TGFベータ、IBMX、bmp−2、bmp−4、またはそれらの組合せの存在下で、フィーダー細胞上で、あるいは胚様体(EB)として培養する。別法として、ES細胞は、RPE形成におけるECMの役割の評価において、種々の細胞外マトリックス−被覆プレート(ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、Matrigelなど)上で増殖させる。初期RPE先祖の分子マーカーの発現(Pax6、Pax2、mitf)、およびRPE細胞の分子マーカーの発現(CRALBP、ベストロフィン、PEDF、RPE65)を、リアルタイムRT−PCRによって種々の時間間隔で評価して、首尾よい前記因子の組合せ、およびRPE−様細胞またはそれらの先祖において豊富化を生じる段階的手法を確認し、決定する。また、このアプローチを用いて、単離し、それらの分化能力についてさらに特徴付け、および移植実験で用いることができるRPEの共通の先祖、および光受容体または神経網膜のような他の目の組織を産生することもできる。
現存するES細胞系および新しいES細胞系からのRPEおよび他の目組織先祖の誘導
遺伝子発現プロファイリングからのデータを用い、RPE先祖マーカーの発現を表面蛋白質の発現と関連付けて、RPE先祖細胞に対する表面マーカーのユニークな組合せを見出す。もしそのようなマーカーが見出されれば、表面蛋白質に対する抗体を用いてRPE先祖の純粋な集団を単離することができ、これは、次いで、培養し、培養中にさらに分化させることができ、あるいは移植実験で用いて、グラフティング後のそれらの分化を可能とすることができる。
色素性網膜炎および黄斑変性の種々の動物モデルにおけるRPE−様細胞および先祖の治療的能力
霊長類ES細胞をカニクイザル(マカクザル)においてテストする。最初に、硝子体切除外科的処置を行い、細胞を動物の網膜下空間に移植する。第1の工程は懸濁液様式における細胞の移植であり、その後、基材またはマトリックスを用いて、単層移植を生じさせる。これは、ヒトES−細胞から由来する細胞を用いる免疫抑制ウサギにおいて、また、げっ歯類(rdマウス、RPE65ノックアウトマウス、タビー(tubby)様マウス、RCSラット)、ネコ(アビシニアンネコ)、イヌ(錐体変性「cd」イヌ、進行性桿体−錐体変性「prdc」イヌ、初期網膜変性「erd」イヌ、桿体−錐体形成異常1、2および3「rcd1、rcd2およびrcd3」イヌ、光受容体形成異常「pd」イヌ、およびBriard「RPE−65」イヌ)を含めた、色素性網膜炎の種々の他の動物モデルにおいて行うこともできる。評価は蛍光アンジオグラフィー、組織学(光受容体の回復およびおそらくはERGがあるかないかを問わない)を用いて行う。機能的テストも行い、これは、ファゴサイトーシス(光受容体断片)、ビタミンA代謝、密着結合導電率、および電子顕微鏡観察を含む。
ヒト胚−由来細胞からのRPE細胞の直接的分化
ヒト胚盤胞−段階の胚を、栄養外胚葉を除去する免疫外科的処置の有または無にてネズミまたはニワトリ胚線維芽細胞の存在下で平板培養するか、あるいは細胞外マトリックス蛋白質−被覆組織培養器具上で直接的に平板培養する。細胞を培養および継代して、ヒトES細胞系を生じさせる代わりに、細胞を直接的に分化させる。
MEF培地:2mMGlutaMaxI、および500u/mlペニシリン、500ug/mlストレプトマイシン(全てInvitrogenから)および16%FCS(HyCLone)を補足した高グルコースDMEM。hES細胞増殖培地:500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1%非―必須アミノ酸溶液、2mMGlutaMAX I、0.1mMベータ−メルカプトエタノール、4ng/ml bFGF(Invitrogen)、1−ng/mlヒトLIF(Chemicon,Temecula,CA)、8.4%の血清置換物(SR,Invitrogen)および8.4%プラズマネート(Bayer)を補足したノックアウト高グルコースDMEM。誘導培地は、増殖培地と比較して、より低い濃度のSRおよびプラズマネート(各々4.2%)および8.4%FCSおよび2×濃度のヒトLIFおよびbFGFをそれが有する以外は増殖培地と同一の成分を含有した。EB培地:bFGF、LIF、およびプラズマネートを除いて増殖培地に同じ;SR濃度は13%であった。RPE培地:50%EB培地および50%MEF培地。
分化実験は接着性hES細胞で、あるいは胚様体(EB)で行った。接着分化では、hESコロニーがそれらの密な境界を失い、その時点で、培養培地をEB培地で交換するまで(通常継代から8ないし10日後)hES細胞をMEF上で過剰増殖させた。培地を1ないし2日ごとに交換した。EB形成のためhES細胞をトリプシン処理し、低接着性プレート上でEB培地中で培養した(Coster)。
細胞を2%パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための0.1%NP−40で透過処理し、およびPBS(Invitrogen)中の10%ヤギ血清、10%ロバ血清(Jackson Immunoresearch Laboratories West Grove,PA)で少なくとも1時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションを4℃にて一晩行い、二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories West Grove,PA)を1時間で加えた。すべてのインキュベーションの間に、検体をPBS中の0.1%Tween−20(Sigma)で3ないし5回、各洗浄につき10ないし15分間洗浄した。DAPIを有するVectashield(Vector Labolatories,Burlingame,CA)を用いて検体をマウントし、蛍光顕微鏡(Nikon)下で観察した。用いた抗体:ベストロフィン(Novus Biologicals,Littleton,CO)、抗−CRALBP抗体は親切にもWashinton大学のSaari博士から贈られた。二次抗体はJackson Immunoresearch Laborotoriesからのものであり、ストレプトアビジン−FITCはAmershamから購入した。
hES細胞およびEBの接着性培養をPBSで2回濯ぎ、単層がゆるめられるまで、37℃にて0.25%トリプシン/1mM EDTA(Invitrogen)中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、MEF培地に移し、200×gで遠心し、RPE培地中のゼラチン−被覆プレート上に平板培養した。培地を、細胞が付着した後(通常、1ないし2日以内)、およびその後5ないし7日毎に交換し;細胞を0.05%トリプシン/0.53mM EDTA(Invitrogen)にて2ないし4週間毎に継代した。
試料を、5%メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を補足したLaemmli緩衝液(Laemmli,1970)中で調製し、5分間煮沸し、Mini−Protean装置を用いて8ないし16%グラジエントゲル(Bio−Rad,Hercules,CA)上に付加し;ゲルをゲル当たり25ないし30mAで流し;蛋白質を20ボルトにて一晩0.2ニトロセルロース膜(Schleicher and Shull,Keene,NH)に移した。ブロットをポンソレッド(Sigma)で軽く染色してバンドを可視化し、Milli−Q水で洗浄し、0.1%TBST中の5%無脂肪ドライミルク(Bio−Rad)で1時間ブロックした。ベストロフィン、CRALBPまたはPEDF(Chemicon)に対する一次抗体を2時間で加え、続いて、TBSTで3回15分間洗浄し;ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド二次抗体を1時間で加え、洗浄を反復した。Super−Signal試薬(Pierce)を備えたECLシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、PEDF ELISAキット(Chemicon)を用い、PEDF ELISAを細胞溶解物で行った。
2工程手法によって、全RNAを分化するES培養物から精製し、粗製RNAをTrizol試薬(Invitrogen)を用いて単離し、RNeasyミニカラム(Qiagen)でさらに精製した。製造業者(Qiagen)プロトコルに従い、RPE65検出のための市販のプライマー組(Assay on Demand # Hs00165642 ml,Applied Biosystems)およびQuantitect Probe RT−PCR試薬(Qiagen)を用いて、RPE65転写物のレベルをリアル−タイムPCRによってモニターした。
エクス・ビボで分化した正常な分化細胞を同定するためのトランスクリプトミックの使用
hES−細胞誘導体は、再生医学の将来において重要な役割を演じる可能性が高い。これらおよび他の幹細胞誘導体の定性的評価は、依然として、機能的ゲノミックスを用いてアプローチすることができる課題であり続けている。我々は、hES−RPEの転写プロフィールと、その移植の価値について広く研究されているそのイン・ビボカウンターパートの胎児RPE細胞とを比較した。次いで、双方のプロフィールをヒトRPE細胞系について既に公表された(Rogojina et al.,2003)トランスクリプトミックデータと比較した。
パーキンソン病の治療のためのRPE細胞の使用
hRPEはパーキンソン病の細胞療法のための細胞の代替源として用いることができる、なぜならばそれらはL−ドーパを分泌するからである。研究は、ゼラチン−被覆マイクロキャリアーに付着したそのような細胞が半パーキンソン病サルに首尾よく移植することができ、顕著な改善(標的当たり1万ないし5万細胞)を生じることを示しており、2000年に開始されたFDA−認可試験において、患者は有害効果なくしてhRPE線条体内移植を受けた。hES細胞−由来RPEを用いる多くの利点のうち1つは、それがドナーの目の組織の欠乏を回避することである。それは遺伝子療法の使用も容易とする。
光受容体の喪失を救済しまたは予防するための幹細胞由来RPE細胞系の使用
RPE細胞系の誘導
ヒト胚性幹(「hES」)細胞を、2mM GlutaMAX Iまたはグルタミン、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン(全てInvitrogenから)および16%FCS(8ないし20%の範囲とできる)(HyCLone)を補足した高グルコースDMEMを含有するMEF培地中で増殖させた。hES細胞は、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1%非−必須アミノ酸溶液、2mM GlutaMAX I、0.1mMベータ−メルカプトエタノール、4ng/ml(または80まで)bFGF(Invitorogen)、10ng/ml(または100まで)ヒトLIF(LIFは任意である)(Chemicon,Temecula,CA)、8.4%の血清置換物(20%まで用いることができる)(SR,Invitorogen)および8.4%プラズマネート(任意)(Bayer)を補足したノックアウト高グルコースDMEMを含有する増殖培地中で増殖させることができる。EB培地は、bFGF、LIF、およびプラズマネートが含まれておらず、SR濃度が13%である以外は増殖培地と同一である。RPE培地は50%EB培地および50%MEF培地である。別法として、hES細胞はヒト血清またはFBSの存在下で培養することができる。RPE培養では、その増殖、トランス分化および分化した表現型の再樹立を支援する異なる培地を用いることができる。その例は、限定されるものではないが、2mM GlutaMAX Iまたはグルタミン、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン(抗生物質は任意)(全てInvitrogenから)および16%FCS(8ないし20%の範囲とできる)(HyClone)またはヒト血清を補足した高グルコースDMEM;1.2g/L炭酸水素ナトリウム、2.5mM L−グルタミン、15mM HEPES 0.5mMピルビン酸ナトリウム;胎児ウシ血清、10%を含有するダルベッコの改変イーグル培地およびハムのF12培地の1:1混合物;(ATCCから、ヒトRPE細胞から樹立されたARPE−19細胞系の増殖用に推奨される)。ヒト網膜色素上皮の機能的に局化された単層への分化を支援する細胞培養培地もこの目的で使用することができる。
細胞を2%パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための0.1%NP−40で透過処理し、PBS(Invitrogen)中の10%ヤギ血清、10%ロバ血清、Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)で少なくとも1時間ブロックした。次いで、検体を一次抗体と共に4℃にて一晩インキュベートし、次いで、二次抗体Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)と共に1時間インキュベートした。全てのインキュベーションの間に、検体をPBS中の0.1%Tween−20(Sigma)で3ないし5回、各洗浄につき10ないし15分洗浄した。DAPIを備えたVectashield(Vector Laboratories,Burlingame,CA)を用いて検体をマウントし、蛍光顕微鏡(Nikon)下で観察した。用いた抗体は抗−ベストロフィン抗体(Novus Biologicals,Littleton,CO)、および抗−CRALBP抗体(Washington大学のSaari博士からの贈物)を含む。二次抗体はJackson Immunoresearch Laboratoriesから入手し、ストレプトアビジン−FITCはAmershamから購入した。
hES細胞またはEBの接着性培養をPBSで2回濯ぎ、37℃にて、単層が緩くなるまで0.25%トリプシン/1mM EDTA(Invitrogen)中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、MEF培地に移し、200×gで遠心し、RPE培地中のゼラチン−被覆プレート上に平板培養した。細胞が付着した後(通常、1ないし2日以内)、その後5ないし7日毎に、培地を交換した。細胞を0.05%トリプシン/0.53mM EDTA(Invitrogen)で2ないし4週間毎に継代した。
試料は、5%メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を補足したLaemmli緩衝液(Laemmli,1970)中で調製し、5分間煮沸し、Mini−Protean装置を用いて8ないし16%グラジエントゲル(Bio−Rad,Hercules,CA)に負荷し;ゲルをゲル当たり25ないし30mAで流した。次いで、蛋白質を20ボルトにて一晩、ゲルから0.2ニトロセルロース膜(Schleicher and Shull,Keene,NH)に移した。ブロットをポンソレッド(Sigma)で軽く染色して、バンドを可視化し、Milli−Q水で洗浄し、0.1%TBST中の5%無脂肪ドライミルク(Bio−Rad)で1時間ブロックした。ベストロフィン、CRALBPまたはPEDFに対する一次抗体(Chemicon)を2時間でブロットに加え、続いて、TBSTで3回15分間洗浄を行った。次いで、ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド二次抗体を1時間でブロットに加え、洗浄を反復した。Super−Signal試薬(Pierce)を備えたECLシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、PEDF ELISAキット(Chemicon)を用い、PEDF ELISAを細胞溶解物で行った。
2−工程手法によって、全RNAを分化するES培養から精製した。Trizol試薬(Invitrogen)を用いて粗製RNAを単離し、RNeasyミニカラム(Qiagen)でさらに精製した。製造業者(Qiagen)プロトコルに従い、RPE65検出(Assay on Demand # Hs00165642 ml,Applied Biosystems)についての市販のプライマー組およびQuantiTect Probe RT−PCR試薬(Qiagen)を用い、RPE65転写体のレベルをリアル−タイムPCRによってモニターした。
hES−由来RPE細胞系の移植
hES細胞系の培養を23日齢RCSラットの1つの目に対する移植細胞として用いて、光受容体の喪失を救済または予防することができる。異なる形態および/または分化の異なる程度の細胞を選択することができる。移植は記載されているように行った(その開示をここに引用して援用する、Lund et al.(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9942−47;Del Priore et al.Investigative Ophthalmology & Visual Science(2004) 45:985−992;Gouras et al.(2002) Ophthalmology & Visual Science 43:3307−11)。(前記したような)トリプシンまたは他の酵素での消化に続き、hES細胞を洗浄し、2μl注射当たり2×105細胞の密度にて懸濁液に経強膜送達した。送達は、約75ないし150μmの内径を持つ微細なガラスピペットを用いてハムのF−10培地中で達成した。注射は、機能的劣化および有意な光受容体死滅の前の時点で、麻酔した23日齢のジストロフィー−色素沈着RCSラットの1つの目の側頭背後網膜下空間に送達されるべきである。シャム−注射ラットはhES−由来細胞なくしてキャリアー媒体単独を受ける。手術後ラットの組織学的評価をより短い時点で(例えば、手術から1ケ月後に)行って、移植に関連する短期の変化を評価し、より長い時点で(例えば、手術後5ヶ月で)行って、ドナー細胞の生存を調べることができる。細胞は、移植前48時間、20μm BrdUrdを含有する培地中で培養することによってタグを付し、または標識することができる。
Lund et al.(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9942−47にも記載されているように、移植されたラットの挙動評価を、該動物を含有する静止保持チャンバーの周りに12度/秒の一定速度で回転する円形ドラムよりなる頭部−トラッキング装置で行うことができる。刺激の提示は、度当たり0.125、0.25および0.5サイクルのような種々の空間的周波数にて黒色および白色ストライプで被覆した相互交換可能なパネル上に置くことができる。動物は手術後10ないし20週間でテストすることができる。全ての動物評価は唯一のオペレーターによって盲検的に行うことができる。挙動データはANOVAを用いて分析することができる。
Lund et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
98:9942−47に記載されているように、動物は組織学的分析に付すべきである。動物はオイタナールで安楽死させ、PBS、続いて、過ヨウ素酸塩−リシン−パラホルムアルデヒド(PLP)で経心臓灌流した。目を切開し、クレジルバイオレットで染色すべきである。BrdU群の動物からの目を抗−BrdUrd抗体で標識し、適当な二次抗体および各試薬を用いて可視化すべきである。他の目は0.1Mカコジレート緩衝液中の2.5%パラホルムアルデヒド、2.5%グルタルアルデヒド、および0.01%ピクリン酸での注射によって固定することができる。目は1%四酸化オスニウム中でポスト固定し、引き続いて、エポキシプロパンに対する特級アルコールを通じて脱水することができる。組織を樹脂に包埋し、それから半−薄いセクションを切断し、1%ホウ酸緩衝液中のトルイジンブルーで染色することができる。
網膜変性の処理のための幹細胞由来神経先祖細胞の使用
神経先祖の生成
hES細胞(例えば、H1、H7およびH9、National Institutes of Health−WA01、WA07およびWA09として登録)を、MEF培地(2mM GlutaMAX Iまたはグルタミン、および500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン(抗生物質、任意)(全てInvitrogenから)および15%FCS(8%ないし20%の範囲とできる)HyClone)を補足した高グルコースDMEM)上で、あるいは細胞外マトリックス上で過剰増殖させた。次いで、継代から一週間またはそれ以上後に、hES細胞をトリプシン、コラゲナーゼまたはジスパーゼ、または2つの後者の酵素の組合せで分裂させ、EB培地中のゼラチン上で平板培養する(実施例11参照)。培地をそれが黄色となれば、通常は2ないし4日毎に交換する。これらの条件下で増殖する細胞の大部分は神経先祖として陽性である。なぜならば、それらはネスチンおよび/またはチューブリンベータIIIを発現し、神経先祖細胞の典型的な外観−細長い紡錘−様細胞を有するからである。それらは同一条件下で再度継代することができ、これはネスチン−およびチューブリンベータIII−陽性細胞での細胞集団の豊富化に導く。RT−PCRを使用して、そのような培養においてネスチン、Pax6、N−CAM、チューブリンベータIIIの存在を確認する。
hES細胞の実施例11に記載された分化条件は、ロドプシン、オプシン5、オプシン1、およびレコベリンの発現を確認する、分化する培養の組織学的調査によって(図9a、およびRT−PCR分析によって示される桿体および錐体−様構造の出現を可能とすることができる(図9b、9cおよび9d)。また、我々は、そのような培養はRT−PCR検出ケラチン12、角膜マーカーとして角膜細胞を含有することができることも示す(図9e)。
これまでの記載から、変形および修飾を本明細書中に記載された発明に対して行って、それを種々の用法および条件に適用することができるのは明らかである。
Claims (1)
- 明細書中に記載の発明。
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