JP2017128552A - 抗癌剤、抗癌剤の制御方法 - Google Patents
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本発明は、メトトレキサートと有機磁性体とを結合させた複合体を含む抗癌剤である。有機磁性体は、それ自身が磁場誘導可能な程度の磁性を備え、かつメトトレキサートを化学結合させることができる。従って、有機磁性体とメトトレキサートとを結合させた複合体を含むことにより、本発明は磁場誘導させることができる。本発明の磁性は、公知の磁気特性測定装置を用いて測定できる。公知の磁気特性測定装置の例として、米国カンタムデザイン社MPMS3(SQUID)等が挙げられる。
本発明の抗癌剤の製造方法は、特に限定されないが、図1に示すスキームを例として挙げられる。図1は、式(3)に示す金属サレン錯体化合物の製造方法の例を示すスキームである。
本発明は、上記の抗癌剤の蓄積領域を、磁場誘導により制御する抗癌剤の制御方法を包含する。本発明は、癌細胞がGap1と、Synthesisと、Gap2と、Mitosis and cytokinesisとのフェーズを移行する間、2以上のフェーズで、抗癌剤を癌細胞へと磁石を用いて誘導する。本発明の抗癌剤の制御方法は、癌細胞に抗癌剤を蓄積する工程や、正常細胞で構成される領域に流通する抗癌剤を回収し、正常細胞での蓄積量を有害事象を発現しない量になるまで低減する工程や、回収した抗がん剤を癌細胞へ誘導する工程等を含みうる。癌細胞を含む領域には、好ましくは600mT〜1.8T、より好ましくは800mT〜1.5Tの磁場をかける。これにより本発明の抗癌剤の正常細胞での蓄積を回避して抗癌剤の副作用を抑制できる。また癌細胞に高濃度で接触させ、癌細胞のDNA増殖を抑制しアポトーシスを誘導できる。さらに本発明の抗癌剤は、MRIでは造影効果を発揮する。そのためMRIで抗癌剤の分布を視認しながら磁場誘導する場合、一層的確に制御できる。
Compound 1 (10.05g、60.14mmol)に無水酢酸(61ml)とH2SO4(8 drops)とを加え、室温で1時間撹拌した。反応溶液を氷水で冷却し、0.5時間撹拌した。その後、反応溶液をろ過して白色固体を回収した。白色固体を乾燥させ、EA(Ethylamine)/PE(Polyethylene)で再結晶させ、Compound 2 (収量8.26g、収率44.12%)を得た。Compound 2の質量分析結果は、LC-MS(ESI):329[M+H2O]であった。
Compound 2 (8.26g、26.54mmol)に10%パラジウムを炭素に担持したもの(826mg)とメタノール(165ml)と酢酸エチル(165ml)を導入し2時間水素雰囲気で水素化した。溶液をろ過してすばやく濃縮し、Compound 3 (収量7.22g、収率96.78%)を得た。Compound 3 の質量分析結果は、LC-MS(ESI):299[M+ H2O]であった。
他方、メタノール(200ml)とCompound 4 (メトトレキサート、10g、22.0mmol)との混合物に、SOCl2(6.54g、55.0mmol)を0℃でゆっくり添加した。この溶液を窒素雰囲気下、室温で3時間撹拌した。溶媒を真空中で蒸発させて除去した後、得られた生成物をTHF/H2O(400ml)で再溶解した。さらにNH3とH2Oの混合液を添加してpH7〜pH8に中和した。混合液中の沈殿物をろ過し、40℃で真空乾燥を2回行った。さらに水で洗浄し、Compound 5 (収量10.5g、収率98.9%)を得た。Compound 5の質量分析結果は、LC-MS(ESI):483[M+H]+であった。
THF(80ml)とH2O(30ml)とにCompound 5 (2g、4.15mmol)の混合させた混合液にNH3・H2O(1ml)を0℃で添加し、さらにLiOH・H2Oを(174mg、4.15mmol)を加えた。混合液を室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムで精製した(H2O:MeOH中=1回目5%-2回目10%-3回目20%)。続いて、濃度1NのHClを添加してPH=6に中和し、固体を析出させた。固体を濾過して回収し、真空下で乾燥させ、Compound 6 (収量1.0グラム、収率51.5%)を得た。Compound 6 の質量分析結果は、LC-MS(ESI):469[M+H]+であった。
Compound 6 (672mg、1.44mmol)とHATU (1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate)(545mg、1.44mmol)とを乾燥DMF(20ml)中に添加し、窒素雰囲気下で室温で0.5時間で撹拌した。さらにCompound 3 (403mg、1.44mmol)とDIPEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン(N,N-diisopropylethylamine)(555mg、4.31mmol)とを添加した。この溶液を室温で4時間撹拌した。混合物を蒸発させ、残留物をDCM (dichloromethane)に再溶解し、濃度1NのHCl水溶液で洗浄した。有機層を濾過し、真空中で濃縮して、Na2SO4で乾燥させた。粗生成物をフラッシュカラムによって精製して(DCM /メタノール=1回目1%-2回目5%-3回目10%)、Compound 7 (収量300mg、収率28.5%)を得た。Compound 7 の質量分析結果は、LC-S(ESI):732[M+H]+であった。
濃縮HCl(32.5ml)およびメタノール(MeOH)(32.5ml)の混合物に、Compound 7 (1.3グラム、17.7mmol)を0℃で添加した。反応混合物を、40分間0℃で撹拌し、溶媒を蒸発させ、粗生成物を得た。粗生成物をフラッシュカラムによって精製し(H2O:ACN= 10%〜20%)、Compound 8 (収量662mg、収率63.5%)を得た。Compound 8 の質量分析結果は、LC-MS(ESI):588[M+H]+であった。
乾燥THF(Tetrahydrofuran)(43ml)とCompound 8 (331mg、0.564mmol)との混合物に、窒素ガス雰囲気下で0℃でEDA (Ethylenediamine)(136mg、2.255mmol)と乾燥NEt3 (triethylamine)(28drops)とを添加した。混合物を室温で一晩撹拌した後濾過し、乾燥THFで2回洗浄した。その後、乾燥THF(43ml)中の粗生成物に、窒素ガス雰囲気下0℃でCompound 8 (331mg、0.564mmol)と乾燥NEt3(28drops)とを添加した。混合物を窒素ガス雰囲気下、室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、乾燥THFで2回洗浄した。その後40℃の真空オーブンで乾燥させ、Compound 9 (収量670mg、収率99.1%)を得た。Compound 9の質量分析結果は、LC-MS(ESI):1199[M+H]+であった。
乾燥DMF (dimethylformamide)(30ml)とCompound 9 (670mg、0.559mmol)の混合物に、窒素雰囲気下、40℃でのFeCl3(91mg、0.559mmol)と乾燥NEt 3(565mg、5.59mmol)を添加した。混合物を40℃で40分間撹拌後、室温に冷却した。その後濾過して得られた生成物をEt2Oで2回洗浄した。さらに40℃の真空オーブンで乾燥させ、Compound 10 (670mg、95.7%)を得た。Compound 10 の質量分析結果は、LC-MS(ESI):1253[(M-O)+H]+であった。Compound 10 を本発明の実施例1とした。
実施例1を、丸型シャーレ内の精製水に添加し、丸型シャーレの底部にネオジム永久磁石(表面磁束密度800mT)を近づけて精製水中の各複合体の状態を観察した。図2は、観察時に撮影したシャーレ内の実施例1の状態である。図2(A)は、磁石を近づけていない丸型シャーレ内の状態である。図2(B)は、磁石を近づけた丸型シャーレ内の状態である。図2(A)では、実施例1は精製水中に分散した。一方、図2(B)では、実施例1は磁場が及ぶ領域に集合した。上記の実験により、実施例1が磁性を備え、磁場誘導させることができると確認できた。
実施例1と比較例1との抗癌作用確認試験を実施した。試験方法を以下に記載する。比較例には、市販のメトトレキサートを用いた。
上記のMCF-7は、理化学研究所から譲渡された。
American Type Culture Collection社(ATCC社)製の2,3,-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt (XTT)細胞増殖試験キット(XTT cell proliferation assay kit)を用いた。XTT標識混合液は、XTT reagent 5 mlとactivation solution 0.1 mlとを混合して調製した。
細胞増殖試験を、ATCC社の実験プロトコールに従い行った。また当該XTTアッセイの詳細については、本発明者が発表した参考文献1を参考にした。
[参考文献1]
Sato I, Umemura M, Mitsudo K, Kioi M, Nakashima H, Iwai T, Feng X, Oda K, Miyajima A, Makino A, Iwai M, Fujita T, Yokoyama U, Okumura S, Sato M, Eguchi H, Tohnai I, Ishikawa Y., Hyperthermia generated with ferucarbotran (Resovist(R)) in an alternating magnetic field enhances cisplatin-induced apoptosis of cultured human oral cancer cells. J Physiol Sci, 64 (2014) 177-183.
マイクロプレート(組織培養用、96穴、平底)の各ウェル(100μl)に培地としてRPMI-1640(Wako大阪)を添加した。また10%非働化ウシ血清(GIBCO、USA)、100units/mlペニシリン・ストレプトマイシン(Wako大阪)を添加した。乳癌の癌細胞株(MCF-7)を培地に播種し37°C、5%CO2の条件下で培養した。
実施例1と比較例1との水溶液を、それぞれ0μM、1μM、10μM、100μMの濃度で調製した。マイクロプレート(組織培養用、96穴、平底)の各ウェル(100μl)にRPMI-1640と、10%非働化ウシ血清(GIBCO、USA)、100units/mlペニシリン・ストレプトマイシンを添加し、培養細胞を3×105株播種した。さらに各濃度に調整した実施例1と比較例1との水溶液をウェルにそれぞれ添加し、37°C、5%CO2の条件下で、24時間培養した。
1.細胞株:乳癌の癌細胞株(MCF-7)(G0/G1期が80%)
上記のMCF-7は、理化学研究所から譲渡された。
2.フローサイトメトリー:
フローサイトメトリーは、FACScan (BD FACSCanto II)を使用した。試薬には、The CycletestTM Plus DNA Reagent Kit (BD Biosciencesを用いた。データ解析ソフトはBD FACSDiva software (BD Biosciences)を使用した。実験の詳細な手順は、装置メーカーまたは試薬メーカーの実験プロトコールに従って行った。また上記の参考文献1を参考にした。
実施例1のDMSO溶液と比較例1の水溶液とを、それぞれ0mM、1.25mM、2.5mM、5mMの濃度で調製し、放射線医学総合研究所分子イメージセンターに設置されるMRI(7.0T Burker社製)で撮影した。図6に実施例1と比較例1とのMRI造影効果を示す。図6(A)はT1強調画像であり、図6(B)はT2強調画像である。
Claims (11)
- メトトレキサートと有機磁性体とを結合させた複合体を含む抗癌剤。
- 有機磁性体が、中心金属と4座配位子として(N、N、O、O)とを含む金属サレン錯体化合物である請求項1に記載の抗癌剤。
- 有機磁性体が、式(1)で表される金属サレン錯体化合物であって、式(1)に示すa1とa2とa3とb1とb2とb3とからなる第一の結合部位群のいずれか一つ以上にメトトレキサートを結合させた複合体を含む、請求項1または請求項2に記載の抗癌剤。
- 有機磁性体が、式(2)で表される金属サレン錯体化合物であって、式(2)に示すd1とd2とd3とe1とe2とe3とからなる第二の結合部位群のいずれか一つ以上と、f1とf2とf3とg1とg2とg3とからなる第三の結合部位群のいずれか一つ以上とに、それぞれメトトレキサートを結合させた複合体を含む、請求項1または請求項2に記載の抗癌剤。
- 金属サレン錯体化合物の中心金属がFeである請求項2ないし請求項4のいずれか一項に記載の抗癌剤。
- 有機磁性体が式(2)で表される金属サレン錯体化合物であって、式(2)に示すd1とe1とf1とg1とにそれぞれメトトレキサートを結合させた複合体を含む、請求項5に記載の抗癌剤。
- 癌細胞がGap1と、Synthesisと、Gap2と、Mitosis and cytokinesisとのフェーズを移行する間、2以上のフェーズで、磁場誘導により、正常細胞での蓄積を回避できる、請求項1に記載の抗癌剤。
- 癌細胞が乳癌細胞である、請求項7に記載の抗癌剤。
- 癌細胞がトリプルネガティブ乳癌の癌細胞である、請求項8に記載の抗癌剤。
- 請求項1ないし請求項9のいずれか一項に記載の抗癌剤の蓄積領域を、磁場誘導により制御する抗癌剤の制御方法。
- 癌細胞がGap1と、Synthesisと、Gap2と、Mitosis and cytokinesisとのフェーズを移行する間、2以上のフェーズで、抗癌剤の蓄積領域を癌細胞へと磁場誘導により制御する請求項10に記載の抗癌剤の制御方法。
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