JP2017061419A - カルボキシメチル化されたセルロース繊維及び骨補填材を含有する構造体 - Google Patents
カルボキシメチル化されたセルロース繊維及び骨補填材を含有する構造体 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】骨再生能と線維芽細胞侵入阻止能力を併せ持つ構造体、これを用いた骨再生材料及び骨芽細胞培養足場材の提供。【解決手段】カルボキシメチル化された天然又は再生セルロース繊維、及び骨補填材を含有する構造体であって、該セルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．１４以上１．０以下であることを特徴とする前記構造体。【選択図】なし
Description
本発明は、カルボキシメチル化されたセルロース繊維及び骨補填材を含有する構造体に関する
近年、歯槽膿漏、虫歯、交通事故などの外傷などにより永久歯が欠損した場合、あごの骨に金属製の人工歯根を埋め込み、歯を再建するインプラント治療が広く行われている。
しかしながら、一般に歯が抜けた場合、歯が植わっていた部分の骨（歯槽骨）は萎縮、吸収してしまう。他方、インプラント治療を行うためには埋め込んだインプラントを安定させるために、足場となる歯槽骨にはある程度の高さ、幅が要求される。そのため、骨の移植や人工骨を利用するなどして歯槽骨を再生しなければ、インプラント治療を行うことができない場合がある。
しかしながら、一般に歯が抜けた場合、歯が植わっていた部分の骨（歯槽骨）は萎縮、吸収してしまう。他方、インプラント治療を行うためには埋め込んだインプラントを安定させるために、足場となる歯槽骨にはある程度の高さ、幅が要求される。そのため、骨の移植や人工骨を利用するなどして歯槽骨を再生しなければ、インプラント治療を行うことができない場合がある。
歯槽骨を再生する方法の一つにＧＢＲ法がある。ＧＢＲ法とは、新しい骨の元になる骨補填材を再生したい部分に配置し、その上から特殊な専用膜（遮蔽膜）を使用することで、歯槽骨の再生を誘導する手術である。このＧＢＲ法を用いれば約半年ほどで歯槽骨が十分な高さ、幅となり、インプラント手術を行うことができるようになる。かかる遮蔽膜はＧＢＲ膜と呼ばれ、骨補填材の漏出を防ぐためだけでなく、歯槽骨再生の妨げとなる線維芽細胞の侵入を抑制するために使用される。
しかしながら、現在広く使われている骨補填材では、歯の再生能力が十分でないため骨の再生に長時間を要するという問題、ＧＢＲ膜を設置することは非常に煩雑であるという問題、また、治療中にＧＢＲ膜がずれてしまい骨補填材が漏れ出るなどの問題がある。
これらの問題を解決すべく、骨補填材を含有する骨再生材料の研究開発が行われているが、現在、以下の特許文献１又は２に記載されるように、一般的な不織布などが使用されているため、生体内での分解速度を制御できないという問題がある。また、これらの骨再生材料を用いる場合には、従来の治療法と同様にＧＢＲ膜が別途必要となる。かかる状況下、骨再生能を更に向上でき、ＧＢＲ膜を必要とせず、口腔内での分解速度の制御も可能な新規な骨再生材料が望まれている。
前記した技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、骨再生能と線維芽細胞侵入阻止能力を併せ持つ新規骨再生材料を提供することである。
本発明者らは、骨補填材を含有する構造体において、カルボキシメチル化された天然又は再生セルロース繊維を含んでなる構造体が、骨芽細胞の分化を促進することから骨再生能力が非常に高いこと、さらには、セルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の置換度及び該構造体の空隙率を制御することで線維芽細胞の通過を抑制することができることを見出した。また、カルボキシメチル基のプロトン化度を制御することで骨再生時の構造体の分解速度を制御すことができることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］カルボキシメチル化された天然又は再生セルロース繊維、及び骨補填材を含有する構造体であって、該セルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．１４以上１．０以下であることを特徴とする前記構造体。
［２］カルボキシメチル化された置換基のプロトン化度が３０%以上であり、かつ、前記構造体の乾燥時の空隙率が１０％以上７８％以下である、前記［１］に記載の構造体。
［３］前記骨補填材が、ＨＡ（ハイドロキシアパタイト）、ＤＣＰＤ（第二リン酸カルシウム）、β-ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、α-ＴＣＰ（α−リン酸三カルシウム）、ＯＣＰ（オクタカルシウムフォスフェート）、４ＣＰ（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（ＣａＯ−Ａｌ２Ｏ３）、アルミノシリケート（Ｎａ２Ｏ−Ａｌ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、前記［１］又は［２］に記載の構造体。
［４］密度が、０．０５ｇ／ｃｍ３以上１．０ｇ／ｃｍ３以下である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の構造体。
［５］綿状、織物状又は不織布状の形態にある、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の構造体。
［６］織物状又は不織布状の形態にあり、厚みが０．０３ｍｍ以上５．０ｍｍ以下である、前記［５］に記載の構造体。
［７］前記骨補填材が石灰化を利用して導入されたものである、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の構造体。
［８］前記［１］〜［７］のいずれかに記載の構造体を含む骨再生用材料。
［９］前記［１］〜［７］のいずれかに記載の構造体を含む骨芽細胞培養足場材。
［１］カルボキシメチル化された天然又は再生セルロース繊維、及び骨補填材を含有する構造体であって、該セルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．１４以上１．０以下であることを特徴とする前記構造体。
［２］カルボキシメチル化された置換基のプロトン化度が３０%以上であり、かつ、前記構造体の乾燥時の空隙率が１０％以上７８％以下である、前記［１］に記載の構造体。
［３］前記骨補填材が、ＨＡ（ハイドロキシアパタイト）、ＤＣＰＤ（第二リン酸カルシウム）、β-ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、α-ＴＣＰ（α−リン酸三カルシウム）、ＯＣＰ（オクタカルシウムフォスフェート）、４ＣＰ（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（ＣａＯ−Ａｌ２Ｏ３）、アルミノシリケート（Ｎａ２Ｏ−Ａｌ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、前記［１］又は［２］に記載の構造体。
［４］密度が、０．０５ｇ／ｃｍ３以上１．０ｇ／ｃｍ３以下である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の構造体。
［５］綿状、織物状又は不織布状の形態にある、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の構造体。
［６］織物状又は不織布状の形態にあり、厚みが０．０３ｍｍ以上５．０ｍｍ以下である、前記［５］に記載の構造体。
［７］前記骨補填材が石灰化を利用して導入されたものである、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の構造体。
［８］前記［１］〜［７］のいずれかに記載の構造体を含む骨再生用材料。
［９］前記［１］〜［７］のいずれかに記載の構造体を含む骨芽細胞培養足場材。
本発明に係る構造体を含む骨再生用材料を用いて歯槽骨の再生を行えば、カルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣともいう。）により骨再生能力が向上し、また、口腔内の体液に接触することで構造体が膨潤し、ゲル化することで線維芽細胞の通過を抑制することができるため、ＧＢＲ膜無しでの歯槽骨再生が可能となる。さらには、膨潤したカルボキシメチルセルロース構造体はプロトン化されていることから骨再生の間は口腔内に留まることができ、その後、生体内で分解される。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に用いる天然又は再生セルロース繊維には特に制限はなく、銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨン、コットン、パルプ、ポリノジックなどの公知のセルロース繊維が用いられる。好ましくは銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨンであり、より好ましくは銅アンモニアレーヨンである。これらの繊維は連続長繊維又は短繊維のいずれでもよい。長繊維では連続長繊維が好ましい。
本実施形態に用いる天然又は再生セルロース繊維には特に制限はなく、銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨン、コットン、パルプ、ポリノジックなどの公知のセルロース繊維が用いられる。好ましくは銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨンであり、より好ましくは銅アンモニアレーヨンである。これらの繊維は連続長繊維又は短繊維のいずれでもよい。長繊維では連続長繊維が好ましい。
本実施形態の構造体は、どのような形態であってもよいが、綿状、織物状又は不織布状の形態であることが好ましい。より好ましい形態は、再生セルロース繊維の織物又不織布であり、さらに好ましい形態は再生セルロース繊維の不織布、よりさらに好ましい形態はキュプラの不織布である。キュプラの不織布であれば、結晶化度が低いためカルボキシメチル化の際の反応性が良く、かつ、形態安定性にも優れる。また、不織布の場合、バインダーを付与した不織布では溶液の浸透速度が遅く、また、バインダー成分の溶出が懸念されるため、ノーバインダーの不織布を用いることが好ましい。
また、本実施形態の構造体には、所望の作用効果を害さない範囲で天然又は再生セルロース繊維以外の繊維、例えば、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維等の合成繊維が含まれていてもよい。このような合成繊維は長繊維でも短繊維でもよい。本明細書中、長繊維とは、繊維長が１０ｍｍ以上のものをいい、繊維長は、好ましくは２０ｍｍ以上であり、連続長繊維がさらに好ましい。
本実施形態の構造体の密度（ｇ/ｃｍ３）、例えば、（不織布重量（ｇ)／不織布体積（ｃｍ３））は、０．０５ｇ／ｃｍ３以上１．０ｇ／ｃｍ３以下であることが好ましく、より好ましくは０．０５ｇ／ｃｍ３以上０．５ｇ／ｃｍ３以下、さらに好ましくは０．０５ｇ／ｃｍ３以上０．４ｇ／ｃｍ３以下である。密度が低すぎる場合、繊維間の距離が広くなってしまうため、口腔内体液を吸収し膨潤したとしても隙間ができてしまうことから、線維芽細胞の侵入を許してしまう可能性がある。他方、密度が高すぎる場合、形態を変えることが難しくなり、患部への配置が煩雑になる。
本実施形態の構造体の厚みは、織物状又は不織布状である場合、０．０３ｍｍ以上５．０ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０３ｍｍ以上３．０ｍｍ以下であり、さらに好ましくは０．０３ｍｍ以上１．０ｍｍ以下である。厚みが小さすぎる場合、形態を保持できず、線維芽細胞の通過を許してしまう可能性があり、他方、厚みが大きすぎる場合、適用される患部への配置が難しくなる。本明細書中、例えば、不織布の“厚み”とは、厚み方向に圧力をかけずに測定したときの厚みをいう。
カルボキシメチル化された構造体は以下の方法で製造することができる。
まず、天然又は再生セルロース繊維の構造体をアルコール含有水酸化ナトリウム水溶液中でアルカリ状態を維持しながら、常温で３０分攪拌する。その後、反応容器中の試薬を排液した後、アルコールを含むモノクロロ酢酸ナトリウムを添加し、３０℃〜５０℃で１〜３時間撹拌する。その際の、置換度の制御は、反応液と構造体の浴比、温度、及び時間により制御する。また、その他の反応条件は、生産コスト等も考慮しながら適宜変更することができる。得られた構造体を８０ｗｔ％エタノールで希釈した４ｗｔ％酢酸水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整した後、８０ｗｔ％、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行なう。少しでも水分を含むと硬くなるので、徐々にアルコール濃度を上げていくことで、アルコール置換を確実に行い、形態安定性を維持することができる。その後硝酸メタノール溶液に浸漬し、１時間撹拌し、８０ｗｔ％、１００ｗｔ％メタノールでアルコール置換を行ない、乾燥させ、プロトン化したシート状構造体を得る。
まず、天然又は再生セルロース繊維の構造体をアルコール含有水酸化ナトリウム水溶液中でアルカリ状態を維持しながら、常温で３０分攪拌する。その後、反応容器中の試薬を排液した後、アルコールを含むモノクロロ酢酸ナトリウムを添加し、３０℃〜５０℃で１〜３時間撹拌する。その際の、置換度の制御は、反応液と構造体の浴比、温度、及び時間により制御する。また、その他の反応条件は、生産コスト等も考慮しながら適宜変更することができる。得られた構造体を８０ｗｔ％エタノールで希釈した４ｗｔ％酢酸水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整した後、８０ｗｔ％、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行なう。少しでも水分を含むと硬くなるので、徐々にアルコール濃度を上げていくことで、アルコール置換を確実に行い、形態安定性を維持することができる。その後硝酸メタノール溶液に浸漬し、１時間撹拌し、８０ｗｔ％、１００ｗｔ％メタノールでアルコール置換を行ない、乾燥させ、プロトン化したシート状構造体を得る。
このようにして得られたカルボキシメチルセルロース構造体はカルボキシメチル化した際のセルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度（ＤＳ）は、口腔内体液を吸収し膨潤した際に線維芽細胞の通過を抑制するために０．１４以上１．０以下であり、好ましくは０．１８以上０．５未満である。置換度が０．１４以上であれば、水分を含有した際に膨潤することで、線維芽細胞の通過を抑制することができる。他方、置換度が１．０を超えると口腔内での溶解性が高すぎ、形態を保持することができないおそれがある。
また、本実施形態の構造体は、カルボキシメチル化した時点では、カルボキシメチル基の末端はナトリウム塩となっているが、酸で処理して一部又は全てのカルボキシメチル基をプロトン型にする。その際のカルボキシメチル基のプロトン化度は治療中に口腔内で形態を保持するために、３０％以上であることが好ましく、より好ましくは５０％以上である。上限は高い方が好ましいが、９５％以下が好ましい。
本実施形態の構造体に骨補填材を導入する方法には、特に制限はないが、交互浸漬法、濾過充填法、対向拡散法により製造されることが好ましく、より好ましくは交互浸漬法、対向拡散法である。また、骨補填材の導入方法としては、１種のみ使用しても問題はないが、複数の種類を組み合わせてもよい。交互浸漬法、対向拡散法により骨補填材を充填すれば、骨の石灰化を利用して骨補填材を導入することとなり、各繊維の周囲をコーティングする形で骨補填材を導入できるため、カルボキシメチルセルロースによる骨再生の促進が更に助長される。また“濾過充填”のように石灰化を利用せずに直接骨補填材を導入することもできる。本明細書中、“交互浸漬法”とは、カルシウムイオン、リン酸イオンなど、石灰化を誘発するために必要な成分を含む溶液に交互に浸漬することにより骨補填材を導入する方法をいう。また、“対向拡散法”とは、対向拡散装置を使用することにより骨補填材生成に使用するカルシウムイオン、リン酸イオンなど、石灰化を誘発するために必要な成分を含む溶液を、不織布を挟んで配置し、一定時間撹拌することで骨補填材を導入する方法である。また、“濾過充填法”とは、骨補填材を溶液中に懸濁させ、不織布を通して濾過により骨補填材を導入する方法である。ここで、カルシウムイオン、リン酸イオンなど、石灰化を誘発するために必要な成分を含む溶液としては、例えば、塩化カルシウム含有トリス緩衝液とリン酸水素二ナトリウム水溶液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
骨補填材導入後の構造体の乾燥時の空隙率は、水分含有時に骨再生の妨げになる線維芽細胞の通過を抑制するために、１０％以上７８%以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以上６０％以下であり、さらに好ましくは３０％以上６０％以下である。尚、構造体の“空隙率”とは、例えば、不織布の場合、得られたサンプルの面積を計算し、重さと厚みを測定した後に下記式（１）：
空隙率(％)=｛面積Ｓ×厚みｄ-(重量ｍ/密度ρ)｝／体積（面積Ｓ×厚みｄ）×１００ ．．． 式（１）
により計算される。
空隙率(％)=｛面積Ｓ×厚みｄ-(重量ｍ/密度ρ)｝／体積（面積Ｓ×厚みｄ）×１００ ．．． 式（１）
により計算される。
本実施形態の構造体に含まれる骨補填材としては、一般的に骨補填材として使用されるものであれば特に制限はないが、例えば、ＨＡ（ハイドロキシアパタイト）、ＤＣＰＤ（第二リン酸カルシウム）、β-ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、α-ＴＣＰ（α−リン酸三カルシウム）、ＯＣＰ（オクタカルシウムフォスフェート）、４ＣＰ（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（ＣａＯ−Ａｌ２Ｏ３）、アルミノシリケート（Ｎａ２Ｏ−Ａｌ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムなどを用いることができる。骨補填材としては１種のみ使用しても複数の種類を組み合わせて用いてもよい。
尚、本実施形態の構造体には、骨補填材として市販されているものを購入して用いてもよい。例えば、オスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）、ボーンセラム（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）、ネオボーン（（株）エム・エムティー）、オステオグラフト−Ｓ（日本メディカルマテリアル株式会社）、アパセラム（ペンタックス株式会社）等が例示される。
以下、ＣＭＣ繊維シート状構造体の物性値の測定方法を説明する。
１．平均置換度の測定
構造体１ｇを細かく切り、フラスコに入れ硝酸メタノール２５ｍＬL（硝酸１０ｍＬとメタノール１００ｍＬの混合溶液）を加え１時間撹拌する。次いで、ガラスフィルター（Ｇ３）で吸引ろ過することにより試料をトラップし、８０ｇ／Ｌメタノール水溶液（１００ｍＬメタノール、２０ｍＬ水の混合液）１２０ｍＬ（４０ｍＬ×３回）で試料を洗浄し、最後に１００％メタノール２５ｍＬで洗浄し、吸引ろ過し一日風乾させる。試料を１０５℃で２時間乾燥したのち、更にＨ型となった試料０．２gを精密に秤量し、８００ｇ／Ｌメタノール８ｍＬ、及び０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬを加え３０分間攪拌し、Ｈ型の試料をＮａ型にする。そして過剰の水酸化ナトリウムを、規定度既知の０．０５ｍｏｌ/Ｌの硫酸でフェノールフタレインを指示薬として滴定する。また、空試験（カルボキシメチル化していない繊維に対して行う同一試験）も同様の方法で行う。平均置換度は、下記式（２）：
平均置換度＝１６２Ｃ/（１−５８Ｃ） ．．． 式（２）
｛式中、Ｃは、試料１ｇをＮａ型にするために必要なＮａＯＨの量［ｍｏｌ］であり、下記式（３）：
Ｃ＝硫酸濃度×｛（空試験での滴定量−試料での滴定量）／試料の質量｝ ．．．式（３）
により求める。｝により求める。
１．平均置換度の測定
構造体１ｇを細かく切り、フラスコに入れ硝酸メタノール２５ｍＬL（硝酸１０ｍＬとメタノール１００ｍＬの混合溶液）を加え１時間撹拌する。次いで、ガラスフィルター（Ｇ３）で吸引ろ過することにより試料をトラップし、８０ｇ／Ｌメタノール水溶液（１００ｍＬメタノール、２０ｍＬ水の混合液）１２０ｍＬ（４０ｍＬ×３回）で試料を洗浄し、最後に１００％メタノール２５ｍＬで洗浄し、吸引ろ過し一日風乾させる。試料を１０５℃で２時間乾燥したのち、更にＨ型となった試料０．２gを精密に秤量し、８００ｇ／Ｌメタノール８ｍＬ、及び０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬを加え３０分間攪拌し、Ｈ型の試料をＮａ型にする。そして過剰の水酸化ナトリウムを、規定度既知の０．０５ｍｏｌ/Ｌの硫酸でフェノールフタレインを指示薬として滴定する。また、空試験（カルボキシメチル化していない繊維に対して行う同一試験）も同様の方法で行う。平均置換度は、下記式（２）：
平均置換度＝１６２Ｃ/（１−５８Ｃ） ．．． 式（２）
｛式中、Ｃは、試料１ｇをＮａ型にするために必要なＮａＯＨの量［ｍｏｌ］であり、下記式（３）：
Ｃ＝硫酸濃度×｛（空試験での滴定量−試料での滴定量）／試料の質量｝ ．．．式（３）
により求める。｝により求める。
２．プロトン化度の測定
構造体を1ｃｍ２以上の面積に切断する。その後ＦＴ-ＩＲ（ＡＴＲ）装置にセットし表面分析を行う。その後１５９０ｃｍ−１の波長でのピーク高さを測定し、プロトン化前後でのピーク高さの比から下記式（４）：
プロトン化度（％）＝｛(プロトン化前の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ)−(プロトン化後の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ)｝／（プロトン化前の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ）×１００ ．．． 式（４）
により、算出する。
構造体を1ｃｍ２以上の面積に切断する。その後ＦＴ-ＩＲ（ＡＴＲ）装置にセットし表面分析を行う。その後１５９０ｃｍ−１の波長でのピーク高さを測定し、プロトン化前後でのピーク高さの比から下記式（４）：
プロトン化度（％）＝｛(プロトン化前の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ)−(プロトン化後の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ)｝／（プロトン化前の１５９０ｃｍ−１のピーク高さ）×１００ ．．． 式（４）
により、算出する。
３．空隙率
前記したように、得られたサンプルの面積を計算し、重さと厚みを測定した後に下記(１)式：
空隙率(％)=｛面積Ｓ×厚みｄ-(重量ｍ/密度ρ)｝／体積（面積Ｓ×厚みｄ）×１００ ．．． 式（１）
により計算する。
前記したように、得られたサンプルの面積を計算し、重さと厚みを測定した後に下記(１)式：
空隙率(％)=｛面積Ｓ×厚みｄ-(重量ｍ/密度ρ)｝／体積（面積Ｓ×厚みｄ）×１００ ．．． 式（１）
により計算する。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１：サンプルの作製、置換度、プロトン化度の評価］
再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（幅２０ｃｍ、目付１００ｇ／ｍ２）１００gを反応容器に入れ、その後、水酸化ナトリウム含有エタノール水溶液（水：８７５ｇ、エタノール８７５ｇ、ＮａＯＨ：１６２.５ｇ）を加えた後、常温で３０分撹拌した。次に、反応容器中の試薬を排液した後、モノクロロ酢酸ナトリウム含有エタノール水溶液（水３００ｇ、エタノール９６０ｇ、モノクロロ酢酸ナトリウム１２２．５ｇ）を添加し、３０〜５０℃で１〜３時間攪拌した。その後、乾燥させ、カルボキシメチル化したシート状構造体を得た。上述で得たシート状構造体を８０ｗｔ％エタノールで希釈した４ｗｔ％酢酸水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整した後、８０ｗｔ％エタノール水溶液で２回洗浄し、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行った。その後硝酸メタノール溶液２５００ｇ（６０％硝酸：メタノール＝５：１６重量比）に浸漬し、１時間撹拌した後、８０ｗｔ％メタノール水溶液３３００ｇで３回洗浄、１００ｗｔ％メタノール２０００ｇでアルコール置換を行ない、乾燥させ、プロトン化したシート状構造体（サンプル１〜７）を得た。置換度（ＤＳ）、プロトン化度のデータをカルボキシメチル化反応条件と共に以下の表１に示す。
再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（幅２０ｃｍ、目付１００ｇ／ｍ２）１００gを反応容器に入れ、その後、水酸化ナトリウム含有エタノール水溶液（水：８７５ｇ、エタノール８７５ｇ、ＮａＯＨ：１６２.５ｇ）を加えた後、常温で３０分撹拌した。次に、反応容器中の試薬を排液した後、モノクロロ酢酸ナトリウム含有エタノール水溶液（水３００ｇ、エタノール９６０ｇ、モノクロロ酢酸ナトリウム１２２．５ｇ）を添加し、３０〜５０℃で１〜３時間攪拌した。その後、乾燥させ、カルボキシメチル化したシート状構造体を得た。上述で得たシート状構造体を８０ｗｔ％エタノールで希釈した４ｗｔ％酢酸水溶液でｐＨ６．０〜８．０に調整した後、８０ｗｔ％エタノール水溶液で２回洗浄し、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行った。その後硝酸メタノール溶液２５００ｇ（６０％硝酸：メタノール＝５：１６重量比）に浸漬し、１時間撹拌した後、８０ｗｔ％メタノール水溶液３３００ｇで３回洗浄、１００ｗｔ％メタノール２０００ｇでアルコール置換を行ない、乾燥させ、プロトン化したシート状構造体（サンプル１〜７）を得た。置換度（ＤＳ）、プロトン化度のデータをカルボキシメチル化反応条件と共に以下の表１に示す。
［実施例２：交互浸漬法における骨補填材の導入と空隙率測定］
実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体をＣａ液（２００ｍＭ塩化カルシウム含有トリス緩衝液）に２０秒間浸漬した。その後、Ｐ液（１２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液）に２０秒間浸漬した。上記工程を１〜４０回繰り返し、乾燥することで骨補填材導入サンプルを得た。得られたシート状構造体の空隙率の測定結果を以下の表２に示し、その際のＳＥＭで撮影した写真(倍率×２５０)を図１に示す。
実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体をＣａ液（２００ｍＭ塩化カルシウム含有トリス緩衝液）に２０秒間浸漬した。その後、Ｐ液（１２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液）に２０秒間浸漬した。上記工程を１〜４０回繰り返し、乾燥することで骨補填材導入サンプルを得た。得られたシート状構造体の空隙率の測定結果を以下の表２に示し、その際のＳＥＭで撮影した写真(倍率×２５０)を図１に示す。
シート状構造体の空隙率は浸漬回数を増やすごとに減少していき、２０回浸漬後は４９％、４０回浸漬後は３５％まで減少し、線維芽細胞の通過抑制に寄与できることが分かった。
［実施例３：対向拡散法における骨補填材の導入］
実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体を対向拡散装置の真ん中に挟んで、両側からＣａ液（２００ｍＭ塩化カルシウム含有トリス緩衝液）とＰ液（１２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液）を注入し、４時間撹拌した。途中懸濁液になったら新しい溶液へ交換した。４時間撹拌後シートを取り出して、凍結乾燥した。得られたサンプルのＳＥＭ画像(倍率×２５０、×５００)を図２に示す。
実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体を対向拡散装置の真ん中に挟んで、両側からＣａ液（２００ｍＭ塩化カルシウム含有トリス緩衝液）とＰ液（１２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液）を注入し、４時間撹拌した。途中懸濁液になったら新しい溶液へ交換した。４時間撹拌後シートを取り出して、凍結乾燥した。得られたサンプルのＳＥＭ画像(倍率×２５０、×５００)を図２に示す。
［実施例４：濾過充填法における骨補填材の導入］
ＨＡ（ヒドロキシアパタイト）をエタノールに懸濁させた。また、実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体を吸引濾過装置の漏斗の上に乗せ、エタノールに懸濁させたＨＡを滴下しながら吸引濾過することで骨補填材導入サンプルを得た。得られたサンプルのＳＥＭ画像(倍率×２５０、×３０００)を図３に示す。シート状構造体の繊維をコーティングする形で骨補填材を直接導入することができることが分かる。
ＨＡ（ヒドロキシアパタイト）をエタノールに懸濁させた。また、実施例１で作製したサンプル３のシート状構造体を吸引濾過装置の漏斗の上に乗せ、エタノールに懸濁させたＨＡを滴下しながら吸引濾過することで骨補填材導入サンプルを得た。得られたサンプルのＳＥＭ画像(倍率×２５０、×３０００)を図３に示す。シート状構造体の繊維をコーティングする形で骨補填材を直接導入することができることが分かる。
［実施例５：疑似唾液中での溶解性評価］
実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したキュプラシート状構造体（置換度：０．００、０．０４、０．１３、０．１８、０．４８、１．０、１．２）（サンプル１〜４、６、７に加え、置換度０．００を含む）を、疑似唾液（０．４ｇ/Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ/Ｌ ＫＣｌ、０．７９５ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.６９０ｇ/Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００５ ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、１．０ｇ/Ｌ 尿素）に浸漬した後、１週間ごとにシート状構造体を取り出し、乾燥後、重量を測定した。得られた重量の経時変化を図４に示す。置換度（ＤＳ）が１．０を超える場合、８週目以降９週目以内にサンプルが溶解してしまうことが分かった。他方、置換度（ＤＳ）が１．０以下のサンプルは、１５週目を過ぎてもほとんど溶解しなかった。これにより口腔内での分解速度の制御が可能であることがと分かった。
実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したキュプラシート状構造体（置換度：０．００、０．０４、０．１３、０．１８、０．４８、１．０、１．２）（サンプル１〜４、６、７に加え、置換度０．００を含む）を、疑似唾液（０．４ｇ/Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ/Ｌ ＫＣｌ、０．７９５ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.６９０ｇ/Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００５ ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、１．０ｇ/Ｌ 尿素）に浸漬した後、１週間ごとにシート状構造体を取り出し、乾燥後、重量を測定した。得られた重量の経時変化を図４に示す。置換度（ＤＳ）が１．０を超える場合、８週目以降９週目以内にサンプルが溶解してしまうことが分かった。他方、置換度（ＤＳ）が１．０以下のサンプルは、１５週目を過ぎてもほとんど溶解しなかった。これにより口腔内での分解速度の制御が可能であることがと分かった。
［実施例６：線維芽細胞通過数測定試験］
以下の手順により本実施形態の構造体に対する線維芽細胞の通過度を測定した。
ＳＩＬＰＯＴ１８４のプレカーサーポリマーと架橋材を９：１で混合後、５０℃で加熱しシート状構造体に塗布しても染み込まない硬さまで固化させ、これを、セルインサートに塗布し、これに、実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したキュプラシート状構造体（置換度：０．００、０．０４、０．１３、０．１４、０．１８、０．４８）（サンプル３〜７に加え、置換度０．００を含む）を固定した後、５０℃で一晩乾燥させた。次に、ＵＶで２時間以上照射滅菌した１２ｗｅｌｌプレートに培地（ＤＭＥＭ-Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＡ）を２ｍＬ／ｗｅｌｌずつ加え、各ｗｅｌｌに、前記シート状構造体を固定化したセルインサートを設置し、その上から１ｍｌずつ培地を添加して静置した。その後、細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を８×１０４ｃｅｌｌs／５００μＬに調整し、セルインサートの上から各ｗｅｌｌに播種した。２４時間静置後、セルインサートを取り出しＰＢＳで軽く洗浄後、ｗｅｌｌの底の細胞をトリプシンで回収し細胞数を測定した。得られた細胞の通過率を図５に示す。
図５から、構造体のカルボキシメチル化の置換度が０．１４以上であれば、線維芽細胞の通過がコントロールの１／２０程度まで減少したことが分かる。置換度が０．１４以上であれば、培地を吸収したシート状構造体が大きく膨潤することで空隙が無くなり、細胞が通過しなかったと考えられる。本実施形態の構造体は線維芽細胞の通過を抑制することで、骨再生材料として優れている。
以下の手順により本実施形態の構造体に対する線維芽細胞の通過度を測定した。
ＳＩＬＰＯＴ１８４のプレカーサーポリマーと架橋材を９：１で混合後、５０℃で加熱しシート状構造体に塗布しても染み込まない硬さまで固化させ、これを、セルインサートに塗布し、これに、実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したキュプラシート状構造体（置換度：０．００、０．０４、０．１３、０．１４、０．１８、０．４８）（サンプル３〜７に加え、置換度０．００を含む）を固定した後、５０℃で一晩乾燥させた。次に、ＵＶで２時間以上照射滅菌した１２ｗｅｌｌプレートに培地（ＤＭＥＭ-Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＡ）を２ｍＬ／ｗｅｌｌずつ加え、各ｗｅｌｌに、前記シート状構造体を固定化したセルインサートを設置し、その上から１ｍｌずつ培地を添加して静置した。その後、細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を８×１０４ｃｅｌｌs／５００μＬに調整し、セルインサートの上から各ｗｅｌｌに播種した。２４時間静置後、セルインサートを取り出しＰＢＳで軽く洗浄後、ｗｅｌｌの底の細胞をトリプシンで回収し細胞数を測定した。得られた細胞の通過率を図５に示す。
図５から、構造体のカルボキシメチル化の置換度が０．１４以上であれば、線維芽細胞の通過がコントロールの１／２０程度まで減少したことが分かる。置換度が０．１４以上であれば、培地を吸収したシート状構造体が大きく膨潤することで空隙が無くなり、細胞が通過しなかったと考えられる。本実施形態の構造体は線維芽細胞の通過を抑制することで、骨再生材料として優れている。
［実施例７：ＭＣ−３Ｔ３細胞分化誘導試験］
以下の手順により本実施形態の構造体の骨細胞分化促進効果を検証した。
対数増殖期にあるＭＣ−３Ｔ３細胞（マウス骨芽細胞様細胞）を３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに４ｍＬずつ播種し、インキュベーター（ＣＯ２ ５%, ３７℃）内で２４時間培養した。その後、予め２時間以上ＵＶ照射で滅菌した実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したシート状構造体サンプル４〜７（置換度：０．０４、０．１３、０．１４、０．１８）を培地に対して１.５μｇ／ｍＬずつ添加し、２１日間培養した。培地の交換は３日に１回行い、コントロールとしては材料非添加系で培養を行った。培養後にＴＲＩｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った後、成熟した骨芽細胞に特異的なマーカーであるオステオカルシン遺伝子のプライマーとＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮを用いたリアルタイムＰＣＲにより、オステオカルシン遺伝子の発現量を定量することで骨細胞への分化率を評価した。得られたデータはΔΔＣＴ法（比較対象：ＧＡＰＤＨ）により解析した。ΔΔＣＴ値は、下記式（５）：
ΔΔＣＴ値＝２―（Ａ−Ｂ） ．．． 式（５）
｛式中、Ａは、オステオカルシンＣＴ値であり、Ｂは、ＧＡＰＤＨのＣＴ値である。｝
により求めた。
結果を図６に示す。コントロールに比べ置換度０．１４以上の構造体では、骨の分化を示すマーカーの発現量が顕著に増加していた。これにより、本実施形態の構造体では、骨細胞の分化が促進されることが分かる。
以下の手順により本実施形態の構造体の骨細胞分化促進効果を検証した。
対数増殖期にあるＭＣ−３Ｔ３細胞（マウス骨芽細胞様細胞）を３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに４ｍＬずつ播種し、インキュベーター（ＣＯ２ ５%, ３７℃）内で２４時間培養した。その後、予め２時間以上ＵＶ照射で滅菌した実施例１に従ってカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したシート状構造体サンプル４〜７（置換度：０．０４、０．１３、０．１４、０．１８）を培地に対して１.５μｇ／ｍＬずつ添加し、２１日間培養した。培地の交換は３日に１回行い、コントロールとしては材料非添加系で培養を行った。培養後にＴＲＩｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った後、成熟した骨芽細胞に特異的なマーカーであるオステオカルシン遺伝子のプライマーとＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮを用いたリアルタイムＰＣＲにより、オステオカルシン遺伝子の発現量を定量することで骨細胞への分化率を評価した。得られたデータはΔΔＣＴ法（比較対象：ＧＡＰＤＨ）により解析した。ΔΔＣＴ値は、下記式（５）：
ΔΔＣＴ値＝２―（Ａ−Ｂ） ．．． 式（５）
｛式中、Ａは、オステオカルシンＣＴ値であり、Ｂは、ＧＡＰＤＨのＣＴ値である。｝
により求めた。
結果を図６に示す。コントロールに比べ置換度０．１４以上の構造体では、骨の分化を示すマーカーの発現量が顕著に増加していた。これにより、本実施形態の構造体では、骨細胞の分化が促進されることが分かる。
［実施例８：ｈＭＳＣ細胞分化誘導試験］
以下の手順により構造体の骨細胞分化促進効果を検証した。
対数増殖期にあるｈＭＳＣ細胞（ヒト間葉系幹細胞）を３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに４ｍＬずつ播種し、インキュベーター（ＣＯ２ ５%, ３７℃）内で２４時間培養した。その後、予め２時間以上ＵＶ照射で滅菌した実施例１の方法によりカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したシート状構造体サンプル４（置換度：０．１８）を培地に対して１.５μｇ／ｍＬずつ添加し、２１日間培養した。培地の交換は３日に１回行い、コントロールとしては材料非添加系で培養を行った。培養後にＴＲＩｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った後、成熟した骨芽細胞に特異的なマーカーであるオステリックス、オステオカルシンのプライマーとＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮを用いたリアルタイムＰＣＲにより、オステリックス遺伝子とオステオカルシン遺伝子の発現量を定量することで骨細胞への分化率を評価した。得られたデータはΔΔＣＴ法（比較対象：ＧＡＰＤＨ）により解析した。ΔΔＣＴ値は、下記式（６）：
ΔΔＣＴ値＝２―（Ａ−Ｂ） ．．． 式（６）
｛式中、Ａは、オステリックス又はオステオカルシンＣＴ値であり、Ｂは、ＧＡＰＤＨのＣＴ値である。｝
により求めた。
結果を図７に示す。置換度０．１４以上の構造体では、ヒト間葉系幹細胞でもＭＣ−３Ｔ３と同様に骨の分化を示すマーカーの発現量が増加していた。これにより、本実施形態の構造体では、骨細胞の分化が促進されることが分かる。
以下の手順により構造体の骨細胞分化促進効果を検証した。
対数増殖期にあるｈＭＳＣ細胞（ヒト間葉系幹細胞）を３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに４ｍＬずつ播種し、インキュベーター（ＣＯ２ ５%, ３７℃）内で２４時間培養した。その後、予め２時間以上ＵＶ照射で滅菌した実施例１の方法によりカルボキシメチル化し、その後、プロトン化したシート状構造体サンプル４（置換度：０．１８）を培地に対して１.５μｇ／ｍＬずつ添加し、２１日間培養した。培地の交換は３日に１回行い、コントロールとしては材料非添加系で培養を行った。培養後にＴＲＩｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った後、成熟した骨芽細胞に特異的なマーカーであるオステリックス、オステオカルシンのプライマーとＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮを用いたリアルタイムＰＣＲにより、オステリックス遺伝子とオステオカルシン遺伝子の発現量を定量することで骨細胞への分化率を評価した。得られたデータはΔΔＣＴ法（比較対象：ＧＡＰＤＨ）により解析した。ΔΔＣＴ値は、下記式（６）：
ΔΔＣＴ値＝２―（Ａ−Ｂ） ．．． 式（６）
｛式中、Ａは、オステリックス又はオステオカルシンＣＴ値であり、Ｂは、ＧＡＰＤＨのＣＴ値である。｝
により求めた。
結果を図７に示す。置換度０．１４以上の構造体では、ヒト間葉系幹細胞でもＭＣ−３Ｔ３と同様に骨の分化を示すマーカーの発現量が増加していた。これにより、本実施形態の構造体では、骨細胞の分化が促進されることが分かる。
［実施例９：In vivo骨再生能確認試験］
以下の手順により構造体の骨再生効果を検証した。
５７ＢＬ／６Ｊマウス（♂、８週齢）に麻酔薬を投与後、剃毛し、マウス頭部を１ｃｍ切開した。頭蓋冠を確認後、生検トレパン（直径４ｍｍ）でマーキングした。完全に打ち抜く前に、硬膜を傷つけないように注意し、メスで頭蓋骨を剥離した。その後、直径８ｍｍの実施例２の交互浸漬法で骨補填材を導入した（２０回浸漬）シート状構造体（置換度：０．４８、プロトン化度：９７．８％）で被覆し、皮膚を縫合して、１か月後に、安楽死させた後、欠損部を回収しμＣＴ撮影を行った。得られた試験結果を表３に示し、その際に骨の再生が確認できた検体のμＣＴ画像を図８に示す。未処置のマウスの欠損部では検体５匹すべてで骨の再生が確認できなかったが、本実施例のシート状構造体では５匹中４匹で骨の再生が確認できた。本実施例のシート状構造体では未処置群の骨再生が全く起こっていないのに対して、１か月という非常に短期間で骨の再生が進んでいることが分かった。
以下の手順により構造体の骨再生効果を検証した。
５７ＢＬ／６Ｊマウス（♂、８週齢）に麻酔薬を投与後、剃毛し、マウス頭部を１ｃｍ切開した。頭蓋冠を確認後、生検トレパン（直径４ｍｍ）でマーキングした。完全に打ち抜く前に、硬膜を傷つけないように注意し、メスで頭蓋骨を剥離した。その後、直径８ｍｍの実施例２の交互浸漬法で骨補填材を導入した（２０回浸漬）シート状構造体（置換度：０．４８、プロトン化度：９７．８％）で被覆し、皮膚を縫合して、１か月後に、安楽死させた後、欠損部を回収しμＣＴ撮影を行った。得られた試験結果を表３に示し、その際に骨の再生が確認できた検体のμＣＴ画像を図８に示す。未処置のマウスの欠損部では検体５匹すべてで骨の再生が確認できなかったが、本実施例のシート状構造体では５匹中４匹で骨の再生が確認できた。本実施例のシート状構造体では未処置群の骨再生が全く起こっていないのに対して、１か月という非常に短期間で骨の再生が進んでいることが分かった。
本発明における骨補填材を含有するカルボキシメチルセルロース繊維のシート状構造体を用いて歯槽骨の再生を行えば、カルボキシメチルセルロースが骨芽細胞への分化を促進することで骨再生能力が向上し、また口腔内の体液に接触することで膨潤し、ゲル化することで線維芽細胞の通過を抑制することができるため、ＧＢＲ膜なしでの歯槽骨再生を実施可能である。さらに、膨潤したカルボキシメチルセルロース繊維のシート状構造体は、プロトン化されていることから骨再生の間は口腔内にとどまることができ、その後、生体内で分解されるため、歯槽骨再生の際の骨再生材料として好適に利用可能であり、さらに、骨芽細胞培養足場材としても利用可能である。
Claims (9)
- カルボキシメチル化された天然又は再生セルロース繊維、及び骨補填材を含有する構造体であって、該セルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．１４以上１．０以下であることを特徴とする前記構造体。
- カルボキシメチル化された置換基のプロトン化度が３０%以上であり、かつ、前記構造体の乾燥時の空隙率が１０％以上７８％以下である、請求項１に記載の構造体。
- 前記骨補填材が、ＨＡ（ハイドロキシアパタイト）、ＤＣＰＤ（第二リン酸カルシウム）、β-ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、α-ＴＣＰ（α−リン酸三カルシウム）、ＯＣＰ（オクタカルシウムフォスフェート）、４ＣＰ（テトラカルシウムフォスフェート）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（ＣａＯ−Ａｌ２Ｏ３）、アルミノシリケート（Ｎａ２Ｏ−Ａｌ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、生体活性化ガラス、石英、及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の構造体。
- 密度が、０．０５ｇ／ｃｍ３以上１．０ｇ／ｃｍ３以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造体。
- 綿状、織物状又は不織布状の形態にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構造体。
- 織物状又は不織布状の形態にあり、厚みが０．０３ｍｍ以上５．０ｍｍ以下である、請求項５に記載の構造体。
- 前記骨補填材が石灰化を利用して導入されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の構造体。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の構造体を含む骨再生用材料。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の構造体を含む骨芽細胞培養足場材。
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