JP2017023135A - Auroraキナーゼプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Auroraキナーゼプロモーターの制御下にある、細胞毒性因子をコードする核酸および/または治療因子を含むベクター、好ましくはウイルスベクターを提供する。また、少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターで置換されているウイルスベクターを提供する。前記ベクターを含有する疾患治療剤、特にがん治療剤、並びにAuroraキナーゼプロモーターを含むベクターを含有する臨床診断剤、特にがん診断剤も提供される。
【選択図】なし
Description
最近、本発明者らは、独自に、次世代のがん特異的増殖型ウイルスというべき、多因子制御によるがん特異的アデノウイルスベクターを効率的に作製できる技術を開発し(特許文献1)、これらのアデノウイルスベクターによるがんの遺伝子治療技術の開発を進めている(特許文献2)。
具体的には、本発明は:
[1]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターで置換されていることを特徴とする細胞溶解性ウイルスベクター。
[2]Auroraキナーゼプロモーターが、ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターである、[1]に記載のウイルスベクター。
[3]ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1363〜1840番目のヌクレオチド配列を含む、[2]に記載のウイルスベクター。
[4]ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号1に記載の塩基配列からなるプロモーターである、[2]に記載のウイルスベクター。
[5]ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号2に記載の塩基配列からなるプロモーターである、[2]に記載のウイルスベクター。
[6]Auroraキナーゼプロモーターが、ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターである、[1]に記載のウイルスベクター。
[7]ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号3に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1595〜2140番目のヌクレオチド配列を含む、[6]に記載のウイルスベクター。
[8]ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号3に記載の塩基配列からなるプロモーターである、[6]に記載のウイルスベクター。
[9]ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号4に記載の塩基配列からなるプロモーターである、[6]に記載のウイルスベクター。
[10]更に、少なくとも1つの他のウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターで置換されていることを特徴とする、[1]〜[9]のいずれか1つに記載のウイルスベクター。
[11]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、およびE1BΔ55Kから選択される因子である、[1]〜[10]のいずれか1つに記載のウイルスベクター。
[12]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24から選択される因子である、[11]に記載のウイルスベクター。
[13]更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に結合した、AuroraキナーゼプロモーターまたはAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する[1]〜[12]のいずれか1つに記載のウイルスベクター。
[14]Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、または哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターである、[10]又は[13]に記載のウイルスベクター。
[15]臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミン、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原(PSA)、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)、ミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)、または神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターである、[14]に記載のウイルスベクター。
[16]がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、がん胎児性抗原(CEA)、低酸素応答性領域(HRE)、Grp78、L−プラスチン、ヘキソキナーゼII、またはサバイビンのプロモーターである、[14]に記載のウイルスベクター。
[17]哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV)である、[14]に記載のウイルスベクター。
[18][1]〜[17]のいずれか1つに記載のウイルスベクターを含有する癌治療剤。
[19][1]〜[17]のいずれか1つに記載のウイルスベクターを含有する臨床診断剤。
[20]がんの診断用である、[19]に記載の診断剤。
を提供する。
[2][1]に記載の発現カセットを包含するベクター。
[3]ベクターがウイルスベクターである、[2]に記載のベクター。
[4]更に、少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが(a)Auroraキナーゼプロモーターまたは(b)Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターで置換されていることを特徴とする、[3]に記載のウイルスベクター。
[5]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、またはE1BΔ55Kである、[4]に記載のウイルスベクター。
[6]Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、または哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターである、[4]に記載のウイルスベクター。
[7]臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミン、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原(PSA)、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)、ミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)、または神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターである、[6]に記載のウイルスベクター。
[8]がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、がん胎児性抗原(CEA)、 低酸素応答性領域(HRE)、Grp78、L−プラスチン、ヘキソキナーゼII、またはサバイビンのプロモーターである、[6]に記載のウイルスベクター。
[9]哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV)である、[6]に記載のウイルスベクター。
[10]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターで置換されていることを特徴とするウイルスベクター。
[11]更に、少なくとも1つの他のウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターで置換されていることを特徴とする、[10]に記載のウイルスベクター。
[12]少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、およびE1BΔ55Kから選択される因子である、[10]または[11]に記載のウイルスベクター。
[13]更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に結合した、AuroraキナーゼプロモーターまたはAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する[10]〜[12]のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
[14]Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、または哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターである、[11]または[13]に記載のウイルスベクター。
[15] 臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミン、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原(PSA)、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)、ミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)、または神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターである、[14]に記載のウイルスベクター。
[16]がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、がん胎児性抗原(CEA)、 低酸素応答性領域(HRE)、Grp78、L−プラスチン、ヘキソキナーゼII、またはサバイビンのプロモーターである、[14]に記載のウイルスベクター。
[17]哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV)である、[14]に記載のウイルスベクター。
[18]ウイルスベクターが、細胞溶解性ウイルスベクターである、[3]〜[17]のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
[19]細胞溶解性ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、[18]に記載のウイルスベクター。
[20]Auroraキナーゼプロモーターが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1363〜1840番目のヌクレオチド配列、または配列番号3に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1595〜2140番目のヌクレオチド配列を含む、[2]〜[19]のいずれか1項に記載のベクター。
[21][2]〜[20]のいずれか1項に記載のベクターを含有する癌治療剤。
[22]有効量の[2]〜[20]のいずれか1項に記載のベクターを、がんを有する哺乳動物に投与することを含む、がんの治療方法。
[23]Auroraキナーゼプロモーターを含むベクターを含有する臨床診断剤。
[24]がんの診断用である、[23]記載の診断剤。
ヒトのAuroraキナーゼAおよびAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターは単離されており(Tanaka, M. et al., J. Biol. Chem., 277(12): 10719−26, 2002; Kimura, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 930−6, 2004)、これらのプロモーターの下流にレポーター遺伝子を挿入した、プロモーター機能の解析のためのプラスミドベクターは報告されている。しかし、ウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターをAuroraキナーゼプロモーターで置換したウイルスベクターや、細胞毒性に関与したり、治療活性を有するタンパク質やRNAをコードする核酸がAuroraキナーゼプロモーターと制御が可能であるように連結されているベクター、ならびに、これらのベクターの治療または予防効果については報告が無かった。また、マーカー遺伝子をAuroraキナーゼプロモーターと制御が可能であるように連結したベクターを利用した診断用途は報告されていない。特には、がん細胞などの標的疾患細胞において特異的に発現するタンパク質が多く報告されている中で、Auroraキナーゼの特異的な発現に着目して、Auroraキナーゼ依存的にウイルス増殖を引き起こし標的疾患細胞を特異的に殺傷するという、標的疾患特異的、特にはがん特異的な増殖制御型ウイルスの作製のためにAuroraキナーゼを用いた例は、いかようなものも報告されていない。
特に、内因性Auroraキナーゼはいくつかのヒトがん細胞で高発現しているが、正常細胞においても若干の発現が見られる(例えば、図3参照)。よって、Auroraキナーゼプロモーターは、ヒトがん細胞の他、正常細胞においても作用することが予想されていた。しかしながら、本発明者が見出した発明によれば、本発明のベクターに搭載され、外因的に導入されたAuroraキナーゼプロモーターは、がん細胞などの標的疾患細胞で極めて特異的に下流に連結された遺伝子の発現を駆動する一方、正常細胞では検出し得る程度の転写活性を示さない(例えば、図4参照)。このようなAuroraキナーゼプロモーターの高度な特異性は、内因的な該キナーゼの発現パターンからは予測不可能なものである。尚、本明細書において「特異的」であるとは、図4に示されるように正常細胞で全く転写活性を示さない場合に限定されるわけではなく、治療上許容される範囲で正常細胞においても遺伝子発現を駆動する場合も包含される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning, 2nd ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、(1) 洗浄に低イオン強度および高温、例えば、50℃で0.015 M 塩化ナトリウム/0.0015 M クエン酸ナトリウム/0.1% 硫酸ドデシルナトリウムを使用し、(2) ホルムアミドのような変性剤、例えば、0.1% ウシ血清アルブミン/0.1% フィコール/0.1% ポリビニルピロリドン/750 mM 塩化ナトリウム、75 mM クエン酸ナトリウムを含む50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.5) とともに、50% (v/v) ホルムアミドを42℃で使用することを特徴とする反応条件が例示される。あるいは、ストリンジェントな条件は、50% ホルムアミド、5xSSC (0.75 M NaCl、0.075 M クエン酸ナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム (pH 6.8)、0.1% ピロ燐酸ナトリウム、5xデンハート溶液、超音波処理鮭精子DNA (50 mg/ml)、0.1% SDS、及び10% 硫酸デキストランを42℃で使用し、0.2xSSC及び50% ホルムアルデヒドで55℃で洗浄し、続いて55℃でEDTAを含有する0.1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄を行うものであってもよい。当業者は、プローブ長等のファクターに応じて、ハイブリダイゼーション反応および/または洗浄時の温度、緩衝液のイオン強度等を適宜調節することにより、容易に所望のストリンジェンシーを実現することができる。
また、Auroraキナーゼプロモーターは、公知のAuroraキナーゼ遺伝子プロモーター配列(例えば、配列番号1または3で表されるヌクレオチド配列)を基に、そのヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸を、市販のDNA/RNA自動合成装置を用いて化学合成することによっても得ることができる。
本発明の、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に結合したAuroraキナーゼプロモーターを含む発現カセットを有するベクターは、ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸がAuroraキナーゼプロモーターまたはAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとして、哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターを使用する場合、サイトメガロウイルス (CMV) 由来プロモーター (例: CMV前初期プロモーター)、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) 由来プロモーター (例: HIV LTR)、ラウス肉腫ウイルス (RSV) 由来プロモーター (例: RSV LTR)、マウス乳癌ウイルス (MMTV) 由来プロモーター (例: MMTV LTR)、モロニーマウス白血病ウイルス (MoMLV) 由来プロモーター (例: MoMLV LTR)、単純ヘルペスウイルス (HSV) 由来プロモーター (例: HSVチミジンキナーゼ(TK) プロモーター)、SV40由来プロモーター (例: SV40初期プロモーター)、エプスタインバーウイルス(EBV) 由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス (AAV) 由来プロモーター (例: AAV p5プロモーター)、アデノウイルス (AdV) 由来プロモーター (Ad2またはAd5主要後期プロモーター) など、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質の遺伝子プロモーターなどの構成的プロモーターを用いることができる。Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとしては、標的疾患細胞で特異的に発現し得る遺伝子のプロモーター、標的臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターや誘導性プロモーターを用いることもできる。臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターとしては、例えば、肝臓などに特異的なアルブミンおよびα−フェトプロテインのプロモーター、前立腺に特異的な前立腺特異的抗原(PSA)のプロモーター、筋肉や脳など様々な臓器に特異的なミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)のプロモーター、ならびに、脳などの神経系に特異的なミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)および神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターなどを例示できる。また、例えば、標的疾患ががんの場合、Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとして、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターを用いることができ、例えば、がん細胞でのみ特異的に発現するCEA(Carcinoembryonic antigen、がん胎児性抗原)プロモーター(Mol. Cell. Biol., 10(6), 2738−2748, 1990)、E2Fプロモーター(Neuman, E. et al., Mol. Cell. Biol., 14(10), 6607−6615, 1994)、OC(オステオカルシン)プロモーター(Morrison, N.A. et al., Science, 246, 1158−1161, 1989)、悪性黒色腫、線維肉腫などに特異的なFLK−1プロモーター(Xie, B. et al., Br. J. Cancer, 81, 1335−1343, 1999)、肺がんなどに特異的なVEGFプロモーター(Koshikawa, N. et al., Cancer Res., 60, 2936−2941, 2000)、小細胞肺がんなどに特異的なc−Mycプロモーター(Kumagai, T. et al., Cancer Res., 354−358, 1996)、肺がん、卵巣がんなどに特異的なSLPIプロモーター(Garver, R.I. et al., Gene Ther., 1, 46−50, 1994)、前立腺がんに特異的なPSAプロモーター(Latham, J.P. et al., Cancer Res., 60, 334−342, 2000)、悪性黒色腫などに特異的なTyrosinaseプロモーター(Vile, R.G. et al., Cancer Res., 53, 962−967, 1993)、乳がんに特異的なAP−2プロモーター(Pandha,H.S. et al., J. Clin. Oncol., 17, 2180−2189, 1999)、脳腫瘍をはじめ多くのがんに特異的なテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)プロモーター(Takakura, M. et al., Cancer Res., 59, 551−557, 1999)、ならびに、様々ながんに特異的な低酸素応答性領域(HRE)プロモーター、Grp78プロモーター、L−プラスチンプロモーター、ヘキソキナーゼIIプロモーター、およびサバイビンプロモーターなどを例示できる。また、誘導性プロモーターとしては、例えば、メタロチオネイン−1遺伝子プロモーターなどを用いることができる。メタロチオネイン−1遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に標的疾患細胞の位置に局所投与することにより、任意の時期に標的疾患細胞特異的にウイルスタンパク質の発現を誘導することができる。
本発明のAuroraキナーゼプロモーター依存性CRVは、少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸をAuroraキナーゼプロモーターの制御下におくことにより構築することができる。「ウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子」とは、ウイルスの構造タンパク質などの、ウイルスが自己複製を行うために必須のタンパク質のいずれかをコードする遺伝子、またはウイルスがアッセンブリを行うために必須のタンパク質のいずれかをコードする遺伝子を意味する。より具体的には、ウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子は,用いるウイルス種によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合、感染初期から転写が開始された後のウイルスタンパク質の転写制御に働く初期遺伝子(Early gene)であるE1A、E1B、E2およびE4、または後述のRb結合領域欠損型E1A(E1AΔ24)、p53結合領域欠損型E1B(E1BΔ55K)などが挙げられる。特にE1Aは、アデノウイルスの感染後最初に転写され、E1Aの発現がなければその後のウイルス複製が起こらないことより、Auroraキナーゼプロモーターでがんなどの標的疾患特異的にウイルス増殖制御を行なう目的に非常に適している遺伝子であるが、ウイルスの複製に必須のその他の初期遺伝子を制御することでも同様の効果を得ることができる。また、アデノウイルスの構造遺伝子をコードする核酸の後期遺伝子(Late gene)のL1、L2、L3、L4およびL5などは、感染後の細胞分裂が起こる後期に転写されて、ウイルス構造を構成するタンパク質であるが、これらの後期遺伝子をAuroraキナーゼプロモーターで発現制御してもがんなどの標的疾患特異的にウイルス増殖制御を行なうことができる。このように、本発明のAuroraキナーゼプロモーター依存性増殖型ウイルスベクターにおいてAuroraキナーゼプロモーターで発現制御されるウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスの複製またはアッセンブリに必須のウイルス遺伝子であれば、いずれのものでもよい。かかるAuroraキナーゼプロモーター依存性増殖型ウイルスベクターは、ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸の内因性プロモーターをAuroraキナーゼプロモーターで置換することにより得ることができる。好ましくは、本発明の増殖型アデノウイルスベクターにおいて、E1Aおよび/またはE1Bをコードする核酸、より好ましくは少なくともE1Aをコードする核酸がAuroraキナーゼプロモーターの制御下におかれる。
細胞内に導入された本発明のAuroraキナーゼプロモーター依存性CRVは、Auroraキナーゼプロモーターが活性化されない環境下(例えば、正常細胞)では増殖できないため、当該細胞は傷害を受けない。一方、本発明のAuroraキナーゼプロモーター依存性CRVが、Auroraキナーゼプロモーターが活性化される環境(例えば、標的疾患細胞)内に侵入すると、そこでウイルスが増殖し、ウイルスタンパク質の細胞毒性により細胞が傷害される。溶解した細胞から放出されたウイルスは周辺のベクター未導入の細胞に次々と感染し、同様のステップが繰り返される。こうして、最終的には病巣内のすべての疾患細胞に本発明の増殖型ウイルスベクターが導入され得る。
ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸の少なくとも1つがAuroraキナーゼプロモーターの制御下におかれていれば、ウイルスの増殖またはアッセンブリはAuroraキナーゼプロモーターが活性化される環境下に限定されるので、他のウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸は任意のAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターの制御下に置かれてよい。例えば、Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとして、哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターを使用する場合、サイトメガロウイルス (CMV) 由来プロモーター (例: CMV前初期プロモーター)、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) 由来プロモーター (例: HIV LTR)、ラウス肉腫ウイルス (RSV) 由来プロモーター (例: RSV LTR)、マウス乳癌ウイルス (MMTV) 由来プロモーター (例: MMTV LTR)、モロニーマウス白血病ウイルス (MoMLV) 由来プロモーター (例: MoMLV LTR)、単純ヘルペスウイルス (HSV) 由来プロモーター (例: HSVチミジンキナーゼ(TK) プロモーター)、SV40由来プロモーター (例: SV40初期プロモーター)、エプスタインバーウイルス(EBV) 由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス (AAV) 由来プロモーター (例: AAV p5プロモーター)、アデノウイルス (AdV) 由来プロモーター (Ad2またはAd5主要後期プロモーター) など、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質の遺伝子プロモーターなどの構成的プロモーターを用いることができる。Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとしては、標的疾患細胞で特異的に発現し得る遺伝子のプロモーター、標的臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターや誘導性プロモーターを用いることもできる。臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターとしては、例えば、肝臓などに特異的なアルブミンおよびα−フェトプロテインのプロモーター、前立腺に特異的な前立腺特異的抗原(PSA)のプロモーター、筋肉や脳など様々な臓器に特異的なミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)のプロモーター、ならびに、脳などの神経系に特異的なミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)および神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターなどを例示できる。また、例えば、標的疾患ががんの場合、Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターとして、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターを用いることができ、例えば、がん細胞でのみ特異的に発現するCEA(Carcinoembryonic antigen、がん胎児性抗原)プロモーター(Mol. Cell. Biol., 10(6), 2738−2748, 1990)、E2Fプロモーター(Neuman, E. et al., Mol. Cell. Biol., 14(10), 6607−6615, 1994)、OC(オステオカルシン)プロモーター(Morrison, N.A. et al., Science, 246, 1158−1161, 1989)、悪性黒色腫、線維肉腫などに特異的なFLK−1プロモーター(Xie, B. et al., Br. J. Cancer, 81, 1335−1343, 1999)、肺がんなどに特異的なVEGFプロモーター(Koshikawa, N. et al., Cancer Res., 60, 2936−2941, 2000)、小細胞肺がんなどに特異的なc−Mycプロモーター(Kumagai, T. et al., Cancer Res., 354−358, 1996)、肺がん、卵巣がんなどに特異的なSLPIプロモーター(Garver, R.I. et al., Gene Ther., 1, 46−50, 1994)、前立腺がんに特異的なPSAプロモーター(Latham, J.P. et al., Cancer Res., 60, 334−342, 2000)、悪性黒色腫などに特異的なTyrosinaseプロモーター(Vile, R.G. et al., Cancer Res., 53, 962−967, 1993)、乳がんに特異的なAP−2プロモーター(Pandha,H.S. et al., J. Clin. Oncol., 17, 2180−2189, 1999)、脳腫瘍をはじめ多くのがんに特異的なテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)プロモーター(Takakura, M. et al., Cancer Res., 59, 551−557, 1999)、ならびに、様々ながんに特異的な低酸素応答性領域(HRE)プロモーター、Grp78プロモーター、L−プラスチンプロモーター、ヘキソキナーゼIIプロモーター、およびサバイビンプロモーターなどを例示できる。また、誘導性プロモーターとしては、例えば、メタロチオネイン−1遺伝子プロモーターなどを用いることができる。メタロチオネイン−1遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に標的疾患細胞の位置に局所投与することにより、任意の時期に標的疾患細胞特異的にウイルスタンパク質の発現を誘導することができる。
また、2以上のウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸をAuroraキナーゼプロモーターの制御下におく場合、用いるプロモーターは同一のプロモーターであってもよいし、異なるものであってもよい。例えば、AuroraキナーゼAプロモーターとAuroraキナーゼBプロモーターとを、1つのベクター内で併用することもできる。また、Auroraキナーゼプロモーター依存性CRVが、更に細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に結合したAuroraキナーゼプロモーターを含む発現カセットを備えていてもよい。
本発明のベクターは、宿主細胞で自律増幅するための複製起点や、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等) をさらに含有することもできる。
後述の実施例に示した具体的な実施形態では、Auroraキナーゼプロモーターと機能的に連結したE1A遺伝子(24KDa領域を欠損していてもよい)、および構成的プロモーター(CMVプロモーターなど)と機能的に連結したE1B遺伝子(19KDaまたは55KDa領域を欠損していてもよい)を含むプラスミドベクターP1、構成的プロモーター(CMVプロモーターなど)と機能的に連結されたレポーター遺伝子(細胞毒性因子または治療因子のモデル系として)を含むプラスミドベクターP2、ならびにE1領域を欠失するアデノウイルスゲノム(ファイバー遺伝子内に標的細胞特異的な変異を有していてもよい)を含むバックボーンプラスミドP3が提供される。これら3種のプラスミドを適宜組み合わせ、CreリコンビナーゼloxPシステムを用いてプラスミド融合と、各プラスミドに搭載された薬剤耐性遺伝子とoriを利用した目的プラスミドの選択により、Auroraキナーゼプロモーター−E1A発現カセット、構成的プロモーター−E1B発現カセットおよび構成的プロモーター−細胞毒性因子または治療因子発現カセットを搭載した、がん細胞特異的増殖型アデノウイルス(CRA)ベクタープラスミドを作製する。続いて該ベクターを用いて、E1Aを相補する細胞株(例:293細胞)にトランスフェクションすることにより、CRAベクターを作製することができる。図2に示したm−CRAベクターは、E1Aの発現を制御するプロモーター(Aurora−Aまたは−B)、E1B遺伝子(E1BΔ55K)の2因子でベクターの増殖が制御されているが、E1A遺伝子、E1Bの発現を制御するプロモーター、細胞毒性因子または治療因子の発現を制御するプロモーター、細胞毒性因子または治療因子、さらにはバックボーンのファイバー遺伝子を他の要素に置換することにより、さらに多因子による高度な増殖および発現制御が可能となる。
本発明の非ウイルスベクターは、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (dhfr) 遺伝子 [メソトレキセート (MTX) 耐性]、アンピシリン耐性(Ampr) 遺伝子、ネオマイシン耐性 (Neor) 遺伝子 (G418耐性) 等が挙げられる。
非ウイルスベクターを使用する場合、該ベクターの導入は、ポリL−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。リポソームはリン脂質からなる数10〜数100 nmの粒径のカプセルで、その内部にAuroraキナーゼプロモーターの制御下にある細胞毒性因子または治療因子を含むプラスミド等のベクターを封入できる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化ベンザルコニウム、 塩化ベンゼトニウム、 モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、例えばポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリドン、 カルボキシメチルセルロースナトリウム、 メチルセルロース、 ヒドロキシメチルセルロース、 ヒドロキシエチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D−マンニトール、D−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素(例: 食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素)、水不溶性レーキ色素 (例: 前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など)、天然色素 (例: β−カロチン、クロロフィル、ベンガラなど) などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
例えば、被験者の、がんが疑われる病変部から採取した細胞に、Auroraキナーゼプロモーターを含むベクターを導入し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現や該細胞の溶解性を検出することにより、好ましくは対照正常細胞に該ベクターを導入した場合と比較することにより、正常細胞よりも有意にレポーター遺伝子の発現レベルや細胞の溶解性が高い場合に、被験者はがんを発症している可能性が高いと診断することができる。
本発明を以下の実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
Ad.Aurora−LacZは、「がん特異的な目的遺伝子の発現が誘導できるか」という予備的な検証実験のために作製されるものである。最終的には、続いて作製するAurora.CRAを用いて、「Auroraキナーゼを高発現するがん細胞に特異的(優位)にウイルス増殖を誘導し、それによりがん細胞特異的に増幅されたウイルスタンパク質ががん細胞特異的に細胞死を引き起こし、さらに増殖するウイルスが連続的にがん細胞に特異的(優位)に感染して細胞死を誘導してがん細胞を特異的に殺傷していく」という、「がん特異的なウイルス増殖および細胞死の誘導という作用ならびにがん治療効果」の検証実験、すなわち「Aurora.CRAががん治療薬となり得る」という本発明の主題となる実験を行なうものである。このように目的と構造が全く異なる2種類のアデノウイルスベクターを以下のように作製した。
ヒトAurora−A(L)プロモーター(配列番号1; 1840 bp; −1486〜+354)は、pGL3−1486(横浜市立大学、上田博士より供与)からMluI/BsmI制限部位を用いて切り出し、平滑末端化した。ヒトAurora−A(S)プロモーター(配列番号2; 478 bp; −124〜+354)は、プライマー(センス: 5’−TCAGTAGGGCCCCAGCTGTGGGACTGCCACAGGTCTGGCTGG−3’ (配列番号5); アンチセンス: 5’−ATCTAGTCTAGACAGCTGCTCTAGCTGTAATAAGTAACAAGC−3’ (配列番号6))を用いてpGL3−1486からPCRにて増幅し、適当なプラスミドベクターにクローニングした後、ApaI/XbaI制限部位を用いて切り出し、平滑末端化した。ヒトAurora−B(L)プロモーター(配列番号3; 2140 bp; −1779〜+361)は、pGL3−1879からXhoI/HindIII制限部位を用いて切り出し、平滑末端化した。ヒトAurora−B(S)プロモーター(配列番号4; 546 bp; −185〜+361)は、pGL−187(岐阜大学、木村博士から供与)からXhoI/HindIII制限部位を用いて切り出し、平滑末端化した。これらの4種類のプロモーターを、以下のAd.Aurora−LacZおよびAurora.CRAの作製に用いた。
プラスミドpHMΔPr−LacZをApaI制限酵素で切り出し、平滑末端化し、CIP酵素で処理した。このプラスミドベクターに、上記のように切り出し平滑末端化した4種類のAuroraキナーゼプロモーターをライゲーションすることで、Aurora−A(S)、Aurora−A(L)、Aurora−B(S)、Aurora−B(L)の各AuroraキナーゼプロモーターからマーカーのLacZ遺伝子を発現する4種類のシャトルベクタープラスミド、pHM.Aurora−A(S)、pHM.Aurora−A(L)、pHM.Aurora−B(S)、pHM.Aurora−B(L)を作製した。
これらのシャトルベクタープラスミドを、E1領域欠損のアデノウイルスゲノムを持つプラスミドpAd.HM4にI−CeuI/PI−SceIの制限酵素部位でサブクローニングすることで、4種類のアデノウイルスベクタープラスミドpAd.Aurora−A(S)、pAd.Aurora−A(L)、pAd.Aurora−B(S)、pAd.Aurora−B(L)を作製した。後述するように、これらのアデノウイルスベクタープラスミドを293細胞にトランスフェクションして、各Auroraキナーゼプロモーターの制御下にマーカーのLacZ遺伝子を発現する「非」増殖型アデノウイルスベクターを、最終的に4種類作製した。
増殖制御型プラスミド(図1のP1プラスミド)であるpΔPr−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD(特許第4478775号、Nagano S et al. Gene Ther 12: 1385−1393, 2005)を制限酵素NotIで切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化し、CIP酵素で処理した。このシャトルベクタープラスミドに、上記1.1で得た4種類のプロモーター配列(ヒトAurora−A(L)、ヒトAurora−A(S)、ヒトAurora−B(L)およびヒトAurora−B(S); 配列番号1〜4)のDNA断片をライゲーションすることで、それらをpΔPr−wtE1A−CMV−E1BΔ55KDのE1Aの上流にそれぞれ挿入し、pAurora−A(L)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD、pAurora−A(S)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD、pAurora−B(L)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD、およびpAurora−B(S)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KDを得た。
上記1.2で得られたプラスミド(pAd.Aurora−LacZ)をヒト胎児腎細胞由来の293細胞にトランスフェクションすることにより、Auroraキナーゼプロモーターの制御下にマーカーのLacZ遺伝子を発現する「非」増殖型アデノウイルスベクターを4種類(Ad.Aurora−A(L)−LacZ、Ad.Aurora−A(S)−LacZ、Ad.Aurora−B(L)−LacZ、およびAd.Aurora−B(S)−LacZ)作製した。また、陽性コントロールとして、恒常的発現プロモーターであるラウス肉腫ウイルスLTR(RSV)およびCMVプロモーターのそれぞれ制御下にLacZを発現するアデノウイルス(それぞれ、Ad.RSV−LacZおよびAd.CMV−LacZ)、ならびに、陰性コントロールとして、E1領域を欠損したアデノウイルス(AdΔE1)も、同様に作製した。
上記1.3で得られた増殖制御型アデノウイルスベクタープラスミドを293細胞にトランスフェクションすることにより、4種類のAuroraキナーゼプロモーター依存性増殖制御型アデノウイルスベクター、AdAurora−A(L)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD/CMV−EGFP、AdAurora−A(S)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD/CMV−EGFP、AdAurora−B(L)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD/CMV−EGFP、およびAdAurora−B(S)−wtE1A−CMV−E1BΔ55KD/CMV−EGFPを作製した。
上記のように、非増殖型アデノウイルスベクターおよび増殖制御型アデノウイルスベクターは、目的も構造もアデノウイルスベクタープラスミドの作製法も全く異なるものである。しかし、アデノウイルスベクタープラスミドを作製した後のウイルスを作製する実験過程は同一である。つまり、それぞれのアデノウイルスベクタープラスミドを293細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスを作製するものであり、その詳細は以下の通りである。
293細胞の培養には、10% FBS添加DMEMを用いた。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 9.1.4−9.1.9, 1999)に従って行った。具体的には、1.5 mLのHEPES緩衝生理食塩液(pH 7.1)に上記アデノウイルスゲノムを含む直鎖状DNA 20 μg、サケ精子DNA(SIGMA)20 μgの合計40 μgのDNAを加え、2.5 M CaCl2 75 μLを撹拌しながら滴下し、室温で30分間静置した後、培養液を撹拌しながら293細胞に滴下した。CO2インキュベーター中で細胞を4時間半静置した後、10% FBS添加α−MEMと1% アガロースゲル溶液を等量混合した溶液を培養ディッシュに重層し、固形培地中で293細胞の培養を続けた。アデノウイルスが産生されると、293細胞は細胞変性し、プラークを形成する。
トランスフェクション後1週間程度でプラークが出現したので、固形培地ごとプラークを回収し、培地に懸濁して−80℃で保存した(ウイルスシード液)。
次に、得られたウイルスシード液に対して凍結・融解を3回繰り返して、細胞からウイルスを放出させ、これを用いて培養中の293細胞に感染させた。変性細胞を培地ごと回収し、これを新たな293細胞に感染させた。徐々にスケールを拡大して、最終的には15 cmディッシュ40枚の293細胞に感染させ、変性細胞を培地ごと回収した。細胞変性後、培地ごと細胞を回収して、1,000 rpmで遠心し、上清を除去して24 mLのリン酸緩衝生理食塩液(PBS)に懸濁し、−80℃で保存した。
この細胞浮遊液に対して凍結・融解を3回繰り返し、1,000 rpmで遠心して上清を回収し、塩化セシウム密度勾配遠心を、まず10℃、35,000 rpmで1時間実施し、続いて10℃、35,000 rpmで18時間実施し、ウイルスが含まれるバンドを回収した。得られたウイルス液を、脱塩カラムでさらに精製した。この一連の過程で、非増殖型アデノウイルスおよび増殖制御型アデノウイルスのいずれについても、ウイルス作製、増幅、濃縮、精製を行なうことができる。
作製した非増殖型アデノウイルスベクターおよび増殖制御型アデノウイルスベクターの構造を図2に示す。
種々の細胞株における内因的なAuroraキナーゼのmRNA発現を、定量的RT−PCR解析により解析した。
セパゾールキット(ナカライテスク)を用いて、各種細胞からトータルRNAを回収し、DNaseIで処理した。1 μgのトータルRNAを、SuperScriptIIリバーストランスクリプターゼ(Invitrogen)およびランダムプライマー(Invitrogen)を用いて逆転写し、得られたcDNAの100分の1を、DyNAmoTMHS SYBR(登録商標)Green qPCRキット(FINZYMES)を用いるリアルタイムPCRに供した。PCRの反応条件は、以下のとおりである:94℃、10秒間;58℃、30秒間および72℃、30秒間を40サイクル。反応にはRotor−Gene3000(Corbett)を用いた。プライマー配列は、以下のとおりである:Aurora−A (220 bp): センス: 5’−TCTTTTGGGTGTTATTCAGTGGC−3’ (配列番号7)、アンチセンス: 5’−TTTTCTGTTTTGATGCCAGTTCC−3’ (配列番号8); Aurora−B (167 bp): センス: 5’−AGAACTCCTACCCCTGGCCCTAC−3’ (配列番号9)、アンチセンス: 5’−ATGCTCCACGCCCTCCTTCTCT−3’ (配列番号10)。
結果を図3に示す。各細胞でのmRNA量は、II型ポリメラーゼ遺伝子のmRNA量に対して補正し、HeLa細胞での値を1とする比として表している。Aurora−AおよびAurora−Bの内因性発現は、グラフの左側に示したがん細胞株の一部で顕著に高く、右側に示した正常細胞株では低いことが見て取れる。このことから、本発明で用いるAuroraキナーゼプロモーターが、内因的に、一部のがん細胞で特異的に活性化されていることが示された。
単離されたAuroraキナーゼプロモーターのプロモーター活性を、がん細胞株(HepG2細胞およびHOS−MNNG細胞)および正常細胞株(WI−38細胞)で比較した。
プロモーター活性は、β−Galactosidase Enzyme Assay System(Promega)を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより検出した。HepG2細胞(ヒト肝臓がん由来)、HOS−MNNG細胞(ヒト骨肉腫由来)、またはWI−38細胞(ヒト胎児肺線維芽細胞:正常対照)に、Ad.Aurora−A(L)−LacZ、Ad.Aurora−A(S)−LacZ、Ad.Aurora−B(L)−LacZ、Ad.Aurora−B(S)−LacZ、Ad.RSV−LacZ、およびAd.CMV−LacZを、それぞれMOI(Multiplicity of infection)10にて1時間、MOI 100にて1時間、またはMOI 30にて24時間感染させた。これらの条件は、それぞれの細胞タイプに対して、明らかな細胞毒性を示さずに、ほぼ同一の遺伝子導入効率をもたらした。アデノウイルス感染の48時間後に細胞を回収し、上記のアッセイシステムを製造業者の取扱説明書にしたがって用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。活性は、既定濃度のβ−ガラクトシダーゼについての標準曲線にしたがって算出した。
結果を図4に示す。肝臓がん細胞株であるHepG2細胞および骨肉腫由来細胞であるHOS−MNNG細胞では、本発明で用いるAuroraキナーゼプロモーター(Aurora−A(L)、Aurora−A(S)、Aurora−B(L)およびAurora−B(S))からのLacZ発現によるβ−ガラクトシダーゼ活性が高いレベルで検出された。一方で、正常細胞由来のWI−38細胞では、本発明で用いるAuroraキナーゼプロモーターからのLacZ発現によるβ−ガラクトシダーゼ活性がまったく検出されなかった。対照的に、CMVプロモーターの制御下にLacZを発現するAd.CMV−LacZを感染させた場合には、いずれの細胞株においてもβ−ガラクトシダーゼ活性が検出された。
このことから、本発明で用いるAuroraキナーゼプロモーターは、がん細胞で特異的に活性化され、下流の遺伝子の発現をもたらすことが示された。図3に示されるように、Auroraキナーゼは内因的にはWI−38を含む正常細胞正常細胞においても若干の発現が見られるが、しかしこのように適切な領域をプロモーターとして取り出して外来遺伝子の発現に利用する場合には、さらに内因性のAuroraキナーゼ遺伝子のがん特異的遺伝子発現パターンを遥かに凌駕する極めて高度ながん特異性がみられることがわかった。つまり、このようなAuroraキナーゼプロモーターを外来遺伝子の発現に使用した場合に非常に高度ながん細胞特異的な発現が得られるということは、単なるAuroraキナーゼの内因性発現パターンのみからは全く予測することができなかったものである。
Auroraキナーゼプロモーターを担持する本発明のウイルスベクターによる細胞毒性効果を評価した。
以下のようにして細胞生存率を定量した。96ウェルプレート中の細胞に、4種類のAurora.CRA、またはAdΔE1を、MOI 0.01〜1で感染させた。アデノウイルス感染の2〜6日後に、Cell Count Reagent SF(ナカライテスク)を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて、WST−8アッセイにより細胞生存率を定量化した。WST−8アッセイは、簡潔には、ミトコンドリア内の酵素によって変換され、呈色を示す化合物を用いて、ミトコンドリア酵素活性を呈色反応として検出することに基づく。サンプルの450 nmでの吸収、および参照として690 nmでの吸収は、Microplate Reader Model 550(Bio−Rad)を用いて計測した。
がん細胞特異的な細胞傷害能の結果を図5に示す。特にHepG2細胞での4日目、およびHOS−MNNG細胞での6日目の結果から顕著なように、これらのがん細胞株では、対照であるAdΔE1(複製欠損型アデノウイルス)感染細胞に比べて、本発明の増殖制御型ウイルスベクター感染細胞の生存率が低く、本発明の増殖制御型ウイルスベクターによる細胞変性効果を示している。これに対して、正常細胞であるWI−38では、対照ウイルスと本発明のウイルスとの間にほとんど差が見られない。
このことから、本発明の増殖制御型ウイルスベクターが、がん細胞で特異的に細胞変性効果を示し、したがって、生体内のがんを特異的に傷害し得るものであることが明らかとなった。
さらに、このがん細胞障害能(がん治療効果)が、多種多様ながん、つまりがん全般に起こることを示すべく、さらにもう一種の異なる肝がん細胞株のHep3B細胞、ならびに乳がん細胞株であるMCF−7細胞を用い、同様の実験を行った。結果を図6に示す。各ウイルスの感染をMOI 0.01〜10で感染行い、6日目に同様にWST−8アッセイで細胞生存率を定量化した。がん細胞の種類によって各Aurora.CRAの殺傷効果の程度には若干の違いはあるものの、4種類全てのAurora.CRAがコントロール(AdΔE1: 複製欠損型アデノウイルス)に比べて著明ながん細胞傷害効果を示した。このことから、本発明の増殖制御型ウイルスベクターが、がん細胞の種類を問わずがん全般に細胞傷害効果を示し、従ってがん全般の治療薬となり得ることが明らかとなった。
4種類全てのAurora.CRAの実際のがん疾患に対する治療効果を調べるため、がん動物モデルにて、前臨床的ながん治療効果を調べた。肝がん細胞Hep3Bを107 細胞(総量200 μlになるようPBSで調整)、8週齢の雌BALB/Cヌードマウスの左背部皮下に注入し、腫瘤形成後 (7−12 mm)、各種ウイルスを5.0×108 pfu/100 μl/tumorで2回(2日空けて)注射を行った。2回注射後、4, 7, 11, 18, 21, 25日後に腫瘤サイズを計測し、25日後にマウスを安楽死させて腫瘍(腫瘤部)を採取した。図7には腫瘤サイズの経過を示しているが、いずれのAurora.CRAにおいても、コントロールと比べて著明な腫瘤径の増大の抑制、すなわち腫瘍増殖の抑制効果がみられた。さらに25日目で病理組織解析したところ、コントロールではがん細胞死はごく一部にみられるに過ぎないのに対し、いずれのAurora.CRAでも、コントロールに比べて非常に顕著ながん細胞死の像がみられた。よって単に腫瘤径を表した図6だけでも、コントロールに対して全てのAurora.CRAが腫瘍抑制効果があることは明確であるが、さらに病理組織像からは、コントロールでの腫瘤部を構成する大部分の細胞は生存したがん細胞であるのに対し、いずれのAurora.CRAで治療したマウスの腫瘤も、多くは死んでいるがん細胞、あるいはそれに伴う出血などによって構成されていることがわかった。つまり腫瘤の大きさを示す図6でみられるよりも、実際にはいずれのAurora.CRAでもさらに著明ながん細胞殺傷効果を示しているものであり、この動物実験により全てのAurora.CRAが著明ながん治療効果を示すことが明確となった。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、2010年9月30日付で日本国に出願された特願2010−223150を基礎としており、それらの内容は全て本明細書に包含される。
配列番号2:ヒトAurora−A(S)プロモーター
配列番号3:ヒトAurora−B(L)プロモーター
配列番号4:ヒトAurora−B(S)プロモーター
配列番号5〜10:プライマー
Claims (20)
- 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターで置換されていることを特徴とする細胞溶解性ウイルスベクター。
- Auroraキナーゼプロモーターが、ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターである、請求項1に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1363〜1840番目のヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号1に記載の塩基配列からなるプロモーターである、請求項2に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーターが、配列番号2に記載の塩基配列からなるプロモーターである、請求項2に記載のウイルスベクター。
- Auroraキナーゼプロモーターが、ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターである、請求項1に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号3に示されるヌクレオチド配列中少なくとも1595〜2140番目のヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号3に記載の塩基配列からなるプロモーターである、請求項6に記載のウイルスベクター。
- ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターが、配列番号4に記載の塩基配列からなるプロモーターである、請求項6に記載のウイルスベクター。
- 更に、少なくとも1つの他のウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターがAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターで置換されていることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、およびE1BΔ55Kから選択される因子である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24から選択される因子である、請求項11に記載のウイルスベクター。
- 更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に結合した、AuroraキナーゼプロモーターまたはAuroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する請求項1〜12のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- Auroraキナーゼプロモーターとは異なる外来性プロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、または哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターである、請求項10又は13に記載のウイルスベクター。
- 臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミン、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原(PSA)、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)、ミエリン塩基性タンパク質(MB)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)、または神経特異的エノラーゼ(NSE)のプロモーターである、請求項14に記載のウイルスベクター。
- がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、がん胎児性抗原(CEA)、低酸素応答性領域(HRE)、Grp78、L−プラスチン、ヘキソキナーゼII、またはサバイビンのプロモーターである、請求項14に記載のウイルスベクター。
- 哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV)である、請求項14に記載のウイルスベクター。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含有する癌治療剤。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含有する臨床診断剤。
- がんの診断用である、請求項19に記載の診断剤。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003025190A1 (fr) * | 2001-09-14 | 2003-03-27 | The New Industry Research Organization | Agent promoteur de tumeur specifique et utilisation associee |
JP2005046101A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Nagoya Industrial Science Research Inst | 増殖制御型組換えアデノウイルスベクターの効率的な作製方法及びその作製用キット |
WO2005115476A1 (ja) * | 2004-05-25 | 2005-12-08 | Univ Kurume | サービビン(Survivin)プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬 |
JP2007508036A (ja) * | 2003-10-15 | 2007-04-05 | セル・ジェネシス・インコーポレイテッド | 肝細胞癌特異的プロモーターおよびその使用 |
JP2007535315A (ja) * | 2004-04-02 | 2007-12-06 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 癌特異的プロモーター |
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---|
ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 61, JPN6017023212, 2009, pages 554 - 571, ISSN: 0003583768 * |
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 316, JPN6011066657, 2004, pages 930 - 936, ISSN: 0003583762 * |
CANCER RESEARCH, vol. 58, JPN6011066660, 1998, pages 4811 - 4816, ISSN: 0003583763 * |
CANCER RESEARCH, vol. 59, JPN6011066667, 1999, pages 2041 - 2044, ISSN: 0003583766 * |
CLIN CANCER RES, vol. 12, no. 23, JPN6011066669, 2006, pages 6869 - 6875, ISSN: 0003583767 * |
MOL CANCER RES, vol. 6, no. 12, JPN6011066652, 2008, pages 1937 - 1945, ISSN: 0003583760 * |
NATURE GENETICS, vol. 20, JPN6011066665, 1998, pages 189 - 193, ISSN: 0003583765 * |
THE EMBO JOURNAL, vol. 17, no. 11, JPN6011066663, 1998, pages 3052 - 3065, ISSN: 0003583764 * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 12, JPN6011066655, 2002, pages 10719 - 10726, ISSN: 0003583761 * |
ケミカル・エンジニヤリング, vol. 54, no. 1, JPN6011066650, 2009, pages 32 - 38, ISSN: 0003583759 * |
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