JP2017019800A

JP2017019800A - Ｃｌｌ血液サンプルにおけるｃｄ３７抗体の優れた効果

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Publication number: JP2017019800A
Application number: JP2016148217A
Authority: JP
Inventors: シュティルゲンバウアー，シュテファン; Stilgenbauer Stephan; ツェンツ，トルステン; Zenz Thorsten; ハイダー，カール−ハインツ; Karl-Heinz Heider
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2017-01-26
Also published as: MX341463B; EP3252077A1; JP2013538790A; KR20130100918A; CN103003309A; AU2011278227A1; BR112013001012A2; EP2593479A1; EA025365B1; IL222775A0; WO2012007576A1; AU2011278227B2; US20120189618A1; NZ703225A; CA2799036A1; US20150266967A1; US20130236454A1; CL2013000101A1; NZ603161A; MX2012013613A

Abstract

【課題】Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための抗体、および抗体を含む医薬組成物を提供する。【解決手段】Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための、ＣＤ３７抗体。Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置における使用のための、好ましくは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ハイリスク患者の処置における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物。ハイリスク患者は、フルダラビン処置に抵抗性の患者、ＴＰ５３機能障害を有する患者、１７ｐ１３欠失を有する患者、及び、リツキシマブ処置にもはや反応しない患者からなる群より選択されてよい。【選択図】なし

Description

技術分野
本発明は、Ｂ細胞枯渇に基づく免疫療法に関する。特に、本発明は、このような治療、例えばＢ細胞悪性腫瘍及び自己免疫症状の処置における使用のためのＣＤ３７抗体分子、特にＡ２及びＢ２に関する。

背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する免疫療法は、ガン及び他の疾患の処置のための安全かつ選択的な方法として登場した。特に、Ｂ細胞枯渇に基づく治療、例えばＢ細胞悪性腫瘍の処置におけるモノクローナル抗体の役割は、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））（Ｂ細胞表面のＣＤ２０抗原に対する抗体）の導入以来拡大している。多くの研究によって、単剤療法及び併用療法としてのリツキシマブの有効性が、低度ＮＨＬ（Hiddemann W, et al. Frontline therapy with rituximab added to the combination of cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone (CHOP) significantly improves the outcome for patients with advanced-stage follicular lymphoma compared with therapy with CHOP alone: results of a prospective randomized study of the German Low-Grade Lymphoma Study. Group. Blood 2005; 106: 3725-3732 (2005)）、マントル細胞リンパ腫（Forstpointner R, et al. The addition of rituximab to a combination of fludarabine, cyclophosphamide, mitoxantrone (FCM) significantly increases the response rate and prolongs survival as compared with FCM alone in patients with relapsed and refractory follicular and mantle cell lymphomas: results of a prospective randomized study of the German Low-Grade Lymphoma Study Group. Blood, 2004; 104: 3064-3071.）、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（Coiffier B, et al. Rituximab (anti-CD20 monoclonal antibody) for the treatment of patients with relapsing or refractory aggressive lymphoma: a multicenter phase II study. Blood 1998; 92: 1927-1932）及びバーキットリンパ腫（Thomas DA, et al. Chemoimmunotherapy with hyper-CVAD plus rituximab for the treatment of adult Burkitt and Burkitt-type lymphoma or acute lymphoblastic leukemia. Cancer 2006; 106: 1569-1580）において確認されている。

しかしながら、一部の患者だけが治療に反応し、それらの大部分は、最終的には、リツキシマブ処置後に再発する。従って、リツキシマブよりも効果の高い（特に、リツキシマブ処置に対して反応不良である一部の患者に関して効果の高い）免疫療法を見つける必要がある。

発明の概要
本発明は、ＣＬＬを有する患者、特に「ハイリスク」グループの患者に属する患者の処置のためのＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２を説明する。それらの患者は、フルダラビン処置に抵抗性の患者、又は、予後不良若しくは処置失敗のリスクの増加を示す遺伝子マーカーを保有する患者（例えば、ＴＰ５３突然変異又は染色体１７ｐ１３の欠失）である。抗体Ａ２及びＢ２は、悪性ＣＬＬ細胞を枯渇するそれらの能力に関して、ＣＬＬ患者に由来する全血サンプルにおいて試験される。ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ、及び、ＣＤ５２抗体であるアレムツズマブは、比較抗体として、同時に試験される。Ａ２及びＢ２は両方とも、これらのサンプルにおいて、高度のＣＬＬ細胞枯渇を介在し、これは、ＣＤ２０抗体リツキシマブ及びＣＤ５２抗体アレムツズマブのものよりも明らかに優れている。異なる患者に由来する一連の血液サンプル２１個は、それらの遺伝的ステータス及びフルダラビン処置への反応に従って特性化される（臨床曝露及びｉｎｖｉｔｒｏ試験後に）。これらの患者のサブセット分析では、Ａ２及びＢ２の優れたＣＬＬ枯渇活性が、分析されたすべてのサブセットに存在することが明らかである。特に、Ａ２及びＢ２は、染色体１７ｐ１３における欠失、ＴＰ５３突然変異を保有するか、又はフルダラビン処置に抵抗性の「ハイリスク」患者において、リツキシマブ及びアレムツズマブよりも優れている。さらに、Ａ２及びＢ２のＣＬＬ枯渇効果は、「ハイリスク」患者と同様に、通常のリスク患者において顕著であり、このことは、ＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２の優れたＣＬＬ枯渇活性が、処置失敗に関する通常のリスクを有する患者に限定されず、処置失敗に関するリスクの増加を抱える患者に特に適用されることを示している。標準的処置と対照的に、ＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２は、異なるＣＬＬ患者サブグループすべてにわたって、ｉｎｖｉｔｒｏで優れたＣＬＬ枯渇活性を示し、これは、驚くべきことに、認可された抗体リツキシマブ及びアレムツズマブよりも明らかに優れている。

これまで、原発性ＣＬＬ細胞上のＣＤ３７をターゲティングするために利用可能なｉｎｖｉｔｒｏの実験データだけが、ＣＤ３７抗体又は抗ＣＤ３７ＳＭＩＰ分子が、原発性ＣＬＬ細胞でアポトーシス及びＡＤＣＣを誘導できることを示しているが、ｉｎｖｉｔｒｏ全血アッセイにおいて、ＣＬＬ細胞枯渇が観察されたという証拠はない（Zhao XB, Lapalombella R, Joshi T, Cheney C, Gowda A, Hayden-Ledbetter MS, Baum PR, Lin TS, Jarjoura D, Lehman A, Kussewitt D, Lee RJ, Caligiuri MA, Tridandapani S, Muthusamy N, Byrd JC. Targeting CD37+ lymphoid malignancies with a novel engineered small modular immunopharmaceutical 2007; BLOOD, 1 OCTOBER 2007, VOLUME 110, NUMBER 7, Epub ahead of print . Blood. 2007 Apr 17）。さらに、患者由来の血液サンプルにおける、ＣＤ３７抗体を使用したＣＬＬ細胞枯渇が、Ｂ細胞に対する他の抗体を使用するものよりも優れているという証拠はない。Zenzら（Abstract 2379, ASH 2009, New Orleans）及びPlatzら（Abstract 2365, ASH 2009, New Orleans）による最近の出版物において、リツキシマブ及びＦｃ操作された新規ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１の効果が、比較アッセイ形式で、ＣＬＬ患者に由来する血液サンプルにおいて試験されている。これらの発表において開示された結果は、Ｆｃ操作された新規ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１がリツキシマブよりも優れていることを示しているが、ＧＡ１０１の観察された最大効果は、Ａ２及びＢ２を用いて観察されたものよりも明らかに低い。従って、Ｆｃ操作されたＣＤ３７抗体が、Ｆｃ操作されたＣＤ２０抗体のものよりも特に優れた活性を示すことは予想外である。

利点
ＣＬＬを有する患者における高度のＣＬＬ細胞枯渇は、ＣＬＬ患者の処置に有利であり、このような薬剤で処置された患者にとっての臨床的利点の増加につながると考えられる。抗体Ａ２及びＢ２は、全血アッセイにおいて、このような高度のＣＬＬ細胞枯渇を示し、これは、ＣＤ２０抗体リツキシマブ（この出願に開示されるデータを参照）及びＧＡ１０１（Zenz et al., 2009, Abstract 2379, ASH 2009, New Orleans）の効果よりも優れている。Ａ２及びＢ２のこの優れた効果は、ハイリスクグループに属する患者（例えば、フルダラビンに抵抗性の患者、又は、現在の標準的治療（例えば、化学療法レジメンを含むフルダラビンとＣＤ２０抗体とを組み合わせる治療）を使用する処置結果の不良を予測する遺伝子マーカー（例えば、ＴＰ５３突然変異又は１７ｐ１３欠失）を保有する患者）に由来する患者サンプルにおいて、特に明らかである。加えて、抗ＣＤ２０処置に過去に失敗した患者は、処置方法の改善を必要とする。従って、ＣＤ２０に関連しない処置方法（例えば、ＣＤ３７に特異的な抗体、特にＡ２及びＢ２）の適用は、ＣＬＬに罹患している患者、特にハイリスクグループの患者に属する患者のための処置の改善を提供することが期待される。ＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２の、ＣＬＬ細胞を枯渇する能力は、通常のリスクを有する患者、及び、リスクの増加を有する患者（「ハイリスク」又は「超ハイリスク」患者）に由来する患者サンプルの両方において高く、リツキシマブ及びアレムツズマブのものよりも明らかに優れている。

治療用途の適用性及び方法
本発明によれば、本発明において記載されるように、ＣＤ３７抗体を使用する新規な示唆が提供される。従って、本発明のＣＤ３７抗体は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患している「ハイリスク」又は「超ハイリスク」患者を処置するのに使用され得る。

治療に使用するために、ＣＤ３７抗体は、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に含められる。ＣＤ３７抗体分子の典型的な製剤は、ＣＤ３７抗体分子を生理学的に許容されうる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥若しくは乾燥製剤、又は水溶液、又は水性若しくは非水性懸濁液の形態で調製され得る。

本発明によるＣＤ３７抗体と共に使用するための薬学的に許容しうる担体及びアジュバントは、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、水、塩又は電解質及びセルロースに基づく物質を含む。

担体、賦形剤、改変剤又は安定化剤は、使用する用量及び濃度において無毒性である。それらは、リン酸、クエン酸、酢酸及び他の無機酸又は有機酸並びにその塩などの緩衝系；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリン又はデキストランを含む、単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はイオン性又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）又は脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル又は糖エステルを含む。エタノール又はイソプロパノールなどの有機溶媒も、抗体製剤に含められ得る。賦形剤は、放出改変機能又は吸収改変機能も有し得る。これは、可能な薬学的に許容しうる担体及びアジュバントの完全なリストではなく、当業者であれば、当技術分野における多くの他の可能性を知っているであろう。

ＣＤ３７抗体分子はまた、乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、近臨界若しくは超臨界ガスによる乾燥、真空乾燥、風乾）、沈降又は結晶化され得るか、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン及びポリ−（メチルメタクリレート）を使用した、例えばコアセルベーション技術によって若しくは界面重合によって調製されるマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル）に、マクロエマルションに封入され得るか、あるいは、例えば、ｐｃｍｃ技術（タンパク質でコーティングされた微結晶）によって担体又は表面上に沈降又は固定化され得る。このような技術は、当技術分野において公知である。

当然のこととして、ｉｎｖｉｖｏ投与のために使用されるべき医薬組成物／製剤は、無菌でなければならない；滅菌は、従来の技術によって（例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって）行われ得る。

いわゆる高濃度液体製剤（ＨＣＬＦ）となるように、ＣＤ３７抗体の濃度を増加させることが有用であり得る；このようなＨＣＬＦを作製するための様々な方法が、記載されている。

ＣＤ３７抗体分子は、持続放出調製物中にも含められ得る。このような調製物は、固体、半固体又は液体の疎水性又は親水性ポリマーマトリックスを含み、成形品（例えば、フィルム、スティック又はマイクロカプセル）の形態であり得、適用器具を介して適用され得る。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート又は酪酸酢酸スクロース）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（US 3,773,919）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間におよぶ分子の放出を可能とするが、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内に留まる場合、３７℃で湿気にさらされそれらは変性又は凝集し得、その結果、生物学的活性が消失し、免疫原性の変化が生じる可能性がある。安定化のために、合理的な戦略が、関与するメカニズムに応じて考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化を達成し得る。

ＣＤ３７抗体分子、特にＡ２及びＢ２は、分散剤、懸濁剤又はリポソーム、錠剤、カプセル剤、散剤、噴霧剤、透過促進デバイスを含む若しくは含まない経皮若しくは皮内パッチ又はクリーム、ウエハース、鼻腔用、頬側用若しくは肺内用製剤などの他の適用剤形にも取り込まれ得るか、又は、移植された細胞によって、又は遺伝子治療後に個体自身の細胞によって産生され得る。

また、ＣＤ３７抗体分子、特にＡ２及びＢ２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基又はエチル基、又は炭水化物基などの化学基を用いて誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改良するために、例えば血清中半減期を延長するために又は組織結合を増加させるために有用であり得る。

好ましい適用形態は、注入又は注射による非経口であるが（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内）、吸入、経皮、鼻腔内、頬側内、経口によるなどの他の適用形態も適用可能であり得る。

治療的使用のために、化合物は、治療有効量で、任意の従来の投与形態で、任意の従来の様式で投与され得る。投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、滑液嚢内、注入により、舌下、経皮、経口、局所又は吸入により、錠剤、カプセル、カプレット、液剤、溶液、懸濁剤、乳濁液、ロゼンジ、シロップ、再構成粉剤、顆粒、座薬及び経皮パッチを含むが、これらに限定されない。このような投与形態を調製するための方法は公知である（例えば、H.C. Ansel and N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)を参照）。治療有効量は、当業者によって、体重、代謝及び苦痛の重度などの因子に基づき決定され得る。

好ましくは、活性化合物は、毎日、体重１キログラム当たり約１mg〜約５００mgで投与される。より好ましくは、活性化合物は、毎日、体重１キログラム当たり約１mg〜約１００mgで投与される。

疾患の予防又は処置に関して、抗体の適切な用量は、処置されるべき疾患の種類、疾患の重度及び経過、抗体が予防又は治療目的のために投与されるのか、過去の治療、患者の病歴及び抗体に対する反応、並びに担当医の判断に依存する。抗体は、一度に又は一連の処置を通して、患者に適切に投与される。

疾患の種類及び重度に応じて、約０．０１μg/kg〜４０mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）の抗体、特にＡ２及びＢ２が、例えば、１回以上の別々の投与によるものであっても、又は、連続的な注入によるものであろうと、患者への投与のための初回候補量である。数日間又はそれ以上の反復投与に関して、状態に応じて、処置は、病徴の所望の抑制が起こるまで継続される。しかしながら、他の用量レジメンが、有用であり得る。治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって（例えば、Ｂ細胞枯渇の程度を測定することによって（例えば、フローサイトメトリーを使用して））、容易にモニタリングされる。

Ａ２に関して、７０kgのヒトに対する推定週投与量は、８６〜１８４mgの範囲である。Ｂ２に関して、７０kgのヒトに対する推定ヒト週投与量は、１８９〜４０４mgである。

投与されるべき抗体の「治療有効量」は、疾患又は障害を予防、回復又は処置するのに必要な最小量である。

Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、ホジキン症の種々の型、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び関連リンパ腫（例えば、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも称される）又は中枢神経系リンパ腫）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも称される）、毛状細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病）及びミエローマ（例えば、多発性ミエローマ）を含むが、これらに限定されない。さらなるＢ細胞悪性腫瘍は、小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁層リンパ腫、形質細胞ミエローマ、骨の孤立形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の外リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞型リンパ腫、血管内大Ｂ細胞型リンパ腫、原発性滲出型リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、灰白色層リンパ腫、悪性性が未確認のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症及び移植後のリンパ球増殖性異常を含む。

ＣＤ３７抗体は、単独で、又は、アジュバント（これは、安定性を増強させ、ある実施態様においてそれらを含む医薬組成物の投与を促し、溶解又は分散の増加を提供し、活性を増加させ、アジュバント治療を提供などする）と組み合わせて投与され得る。有利なことに、このような組み合わせは、より低投与量の有効成分を利用し得、従って、起こりうる毒性及び有害な副作用を減少させる。

処置されるべき障害に応じて、ＣＤ３７抗体分子、特にＡ２及びＢ２は、それ自体で、あるいは、ＤＮＡ損傷剤若しくはチューブリン結合剤、又はガン細胞において血管新生、シグナル伝達経路若しくは有糸分裂チェックポイントを阻害する治療的に活性な化合物から特に選択される１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用され得る。

さらなる治療剤は、場合により同じ薬学的調製物の一成分として、ＣＤ３７抗体分子と同時に、あるいはＣＤ３７抗体分子の投与前又は投与後に投与され得る。

図１：全血アッセイ：生存ＣＬＬ細胞に対する抗体Ａ２及びＢ２の効果。漸増濃度（０．００１μg/ml〜１００μg/ml）の抗体Ａ２及びＢ２を用いて、ＣＬＬ患者に由来する全血サンプルを３時間インキュベーションした。抗体濃度に関するインキュベーション期間終了時点の生存ＣＬＬ細胞のパーセンテージを示し、曲線は、個々の患者サンプル１１個の平均を表す。試験した各濃度に関する標準偏差を示す。Ａ２：黒三角；Ｂ２：白三角。点線は、コントロール抗体に適合したアイソタイプの活性を表す。図２：ＣＬＬ患者サンプルを用いた全血アッセイ：異なる抗体の比較。１０μg/mlの抗体Ａ２、Ｂ２、リツキシマブ、アレムツズマブ及びアイソタイプ適合コントロール抗体を用いて、血液サンプルを３時間インキュベーションした。インキュベーション期間終了時点の生存ＣＬＬ細胞のパーセンテージを示し、バーは、患者サンプル１１個の平均を表す。標準偏差を示す。点線は、アイソタイプ適合コントロール抗体の活性を表す。図３：ＣＬＬ患者サンプルを用いた全血アッセイ：異なる患者サブグループの比較。（Ａ）１０μg/mlの抗体Ａ２、Ｂ２、リツキシマブ及びアレムツズマブを用いて、血液サンプルを３時間インキュベーションする。異なる患者サブグループに関するインキュベーション期間終了時点の生存ＣＬＬ細胞のパーセンテージを示し、バーは、表示数の患者サンプルの平均を表す。標準偏差を示す。図３：ＣＬＬ患者サンプルを用いた全血アッセイ：異なる患者サブグループの比較。（Ｂ）１０μg/mlの抗体Ａ２、Ｂ２、リツキシマブ及びアレムツズマブを用いて、通常のリスク患者（ｎ＝１１）及びハイリスク患者（ｎ＝１０）に由来する血液サンプルを８時間インキュベーションした。２つの患者サブグループに関するインキュベーション期間終了時点の生存ＣＬＬ細胞のパーセンテージを示し、バーは、平均値を表し、標準偏差を示す。Ｆｃγレセプター３ａへの結合。プラズモン共鳴分析（ＳＦＰ）（Edwards and Leatherbarrow, Analytical Biochemistry 246, 1997; Nieba et al., Analytical Biochemistry 234, 1996）によって、Ｆｃγレセプター３ａに対する抗体Ａ２及びＢ２の親和性を決定する。Ｆｃγレセプター３ａタンパク質高親和性アロタイプ：Ｖ１５８。Ｆｃγレセプター３ａタンパク質低親和性アロタイプ：Ｆ１５８。Ｆｃ操作されていないＩｇＧ１型の抗体を、参照抗体として使用する。抗体をセンサー表面にコーティングし、ＳＦＰにより決定した錯体形成（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）の比を使用して、抗体Ａ２及びＢ２の解離定数Ｋ_Ｄを計算する。バーは、３回の独立した測定の平均を表し、標準偏差を示す。

配列表の説明
配列番号１：核酸配列可変重（Ｖｈ）鎖
配列番号２：アミノ酸配列可変重鎖
配列番号３：核酸配列可変軽（Ｖｌ）鎖
配列番号４：アミノ酸配列可変軽鎖
配列番号５：Ａ２重鎖アミノ酸配列
配列番号６：Ａ２軽鎖アミノ酸配列
配列番号７：定常重鎖アミノ酸配列
配列番号８：定常軽鎖アミノ酸配列
配列番号９：Ａ４重鎖アミノ酸配列
配列番号１０：Ａ４軽鎖アミノ酸配列
配列番号１１：Ｂ２重鎖アミノ酸配列
配列番号１２：Ｂ２軽鎖アミノ酸配列
配列番号１３：Ｂ４重鎖アミノ酸配列
配列番号１４：Ｂ４軽鎖アミノ酸配列
配列番号１５：ＣＤＲ１重鎖（Ｈ１）
配列番号１６：ＣＤＲ２重鎖（Ｈ２）
配列番号１７：ＣＤＲ３重鎖（Ｈ３）
配列番号１８：ＣＤＲ１軽鎖（Ｌ１）
配列番号１９：ＣＤＲ２軽鎖（Ｌ２）
配列番号２０：ＣＤＲ３軽鎖（Ｌ３）
配列番号２１：別のＣＤＲ２重鎖（Ｈ２ｂ）

発明の詳細な説明
ＣＬＬ患者血液サンプルを用いた全血アッセイ：最初の実験において、ＣＬＬ患者１１人に由来する全血サンプルを、漸増濃度（０．００１〜１００μg/ml）のＣＤ３７抗体Ａ２及びＢ２で３時間処置する。両抗体は、全血アッセイにおいて、効果的かつ濃度依存的なＣＬＬ細胞枯渇を示す。図１に示されるように、Ａ２及びＢ２は両方とも、約１０００ng/mlのＥＣ_５０値でＣＬＬ細胞を非常に強力に枯渇する。血液サンプルを３時間インキュベーションした後に、１０μg/mlの抗体濃度におけるＡ２及びＢ２のＣＬＬ細胞枯渇効果を、同じ抗体濃度におけるリツキシマブ及びアレムツズマブのものと比較する。図２に示されるように、１０μg/mlの抗体濃度におけるＡ２（９％生存細胞）及びＢ２（２６％生存細胞）のＣＬＬ細胞枯渇は、アレムツズマブ（７１％生存細胞）及びリツキシマブ（８０％生存細胞）を用いて観察されたものよりも明らかに優れている。総合すると、これらのデータは、抗体Ａ２及びＢ２が、全血サンプルに由来するＣＬＬ細胞の強力かつ濃度依存的な枯渇をｉｎｖｉｔｒｏでもたらすことを明確に実証している。ＣＬＬ細胞枯渇の程度は、リツキシマブ及びアレムツズマブを用いて観察されたものよりも明らかに優れている。

本発明の具体的な実施態様では、ゲノム異常（例えば、ＴＰ５３突然変異又は１７ｐ１３欠失）の症例、フルダラビン抵抗性の症例、及び、抗ＣＤ２０処置が過去に失敗した患者において、ＣＤ３７抗体Ａ２及びＢ２の効果を調査する（図３Ａ及び３Ｂ）。これらの症例は、一般的には、現在の処置方法で約２年の平均生存期間を有するハイリスク又は超ハイリスク患者集団であると考えられる。この目的を達成するために、患者２１人（ハイリスク又は超ハイリスクグループの患者１０人、及び、あらゆる特定のリスク特性がないサンプル１１個を含む）に由来する血液サンプルを特性化する（図３Ｂ）。本発明者らは、ハイリスクグループ（１７ｐ１３欠失、ＴＰ５３突然変異、フルダラビン抵抗性）及びあらゆる特定のリスクがない残りの患者において、ＣＬＬ細胞枯渇を比較する。両抗体Ａ２及びＢ２に関して、ＣＬＬ細胞枯渇は、両リスクグループにおいて高い。すなわち、１０μg/mlにおいて、Ａ２平均残存ＣＬＬ細胞：１１．１％（８時間）通常のリスク対２１．３％ハイリスク；１０μg/mlにおいて、Ｂ２平均残存ＣＬＬ細胞：３３．２％（８時間）通常のリスク対４３．１％ハイリスク（図３Ｂ）。

結論として、ＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２は、ＣＬＬ患者に由来する全血サンプルにおいて、非常に効果的かつ強力なＣＬＬ細胞枯渇を示す。この効果は、試験した患者リスクグループすべてにおいて高く、特に、ハイリスクを有する患者に由来する血液サンプルは、通常のリスクグループに由来する血液サンプルとよく似た高度のＣＬＬ細胞枯渇を示す。従って、ＣＤ３７抗体、特にＡ２及びＢ２は、遺伝的リスクに関係なく、試験したＣＬＬサンプルすべてにおいて、非常に効果的であり、従って、処置失敗のリスクの増加を有する患者（いわゆる「ハイリスク」患者若しくは患者集団（例えば、ＴＰ５３突然変異、１７ｐ１３欠失、フルダラビン抵抗性又は抗ＣＤ２０治療の失敗）又は「超ハイリスク」患者若しくは患者集団）の処置に特によく適している。

定義
一般的な実施態様「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定的な方法において使用されない。本発明の中で使用される用語は、以下の意味を有する。

テトラスパニンスーパーファミリーのメンバーであるＣＤ３７は、高度にグリコシル化された細胞表面分子であり、４つのトランスメンブレンドメイン及び２つの細胞外ループを有する。ＣＤ３７は、Ｂ細胞又はＢ細胞悪性腫瘍上で主に発現され、ＣＤ３７の低レベル発現は、Ｔ細胞、顆粒球及び単球で報告されている。高レベルのＣＤ３７発現は、慢性リンパ性白血病（ＣＣＬ）、及び、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の異なるサブタイプを有する患者のサンプルで観察されている（Schwartz-Albiez et al, Journal Immunol 140: 905-914, 1988; Barrena et al., Leukemia 19: 1376-1383, 2005）。この発現パターンにより、ＣＤ３７は、抗体介在ガン治療の有望なターゲットとなっている。

ＣＤ３７特異的ｍＡｂのガン細胞への結合は、様々な作用メカニズムをトリガーし得る：第一に、抗体がＣＤ３７抗原の細胞外ドメインに結合した後、それは、補体カスケードを活性化し、ターゲット細胞を溶解させ得る。第二に、抗ＣＤ３７抗体は、ターゲット細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（これは、結合抗体のＦｃ部分が、免疫系の細胞傷害性細胞上の適切なレセプターによって認識された後に起こる）を仲介し得る。第三に、抗体は、抗原又は他の刺激に対して反応するＢ細胞の能力を変化させ得る。最後に、抗ＣＤ３７抗体は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を開始させ得る。

本発明において使用される「ＣＤ３７抗体」、「ＣＤ３７抗体分子」、「抗ＣＤ３７抗体」及び「抗ＣＤ３７抗体分子」という用語は、具体的には、ＣＤ３７抗原に対する結合特異性を有する抗体に関する。このような抗体の例は、当技術分野において公知であり、以下にさらに記載される。

「抗ＣＤ３７抗体分子」、「抗ＣＤ３７抗体」、「ＣＤ３７抗体」及び「ＣＤ３７抗体分子」という用語は、交換可能に使用される。

「ハイリスク患者」又は「ハイリスク」患者集団という用語は、この患者グループの平均余命が非常に短く（平均２〜３年）、現在の標準的処置に対する反応が、これらのハイリスク特性がない患者よりも非常に悪いことを意味する。より具体的には、このグループは、フルダラビン抵抗性疾患を有する患者（これは、フルダラビンを単独で又は組み合わせて受けており、処置後６ヶ月以内に反応しないか（部分寛解又は完全寛解の達成失敗）、又は進行した患者を意味する）を含む。さらに、このようなハイリスク患者は、「ＴＰ５３機能障害」患者、及び、１７ｐ１３欠失のような染色体異常を有する患者を含む。

「ＴＰ５３機能障害」患者は、患者が、腫瘍抑制遺伝子ＴＰ５３又はＰ５３タンパク質の機能障害を有することを意味する。現在のところ、これは、ＴＰ５３遺伝子の１コピーの突然変異若しくは欠失又はそれらの組み合わせによるＰ５３タンパク質の不活性化に関係している。これらの異常のいずれかは、難治性ＣＬＬ、標準的処置に対する反応不良、並びに、短期の無進行生存及び全生存に関連している。

１７ｐ１３欠失は、遺伝的事象（例えば、ゲノムの不安定性）による染色体１７ｐ１３又はその一部の欠失を意味する。

「超ハイリスク」患者又は「超ハイリスク」患者集団という用語は、具体的には、特定の予後不良又はリスクファクター（例えば、ＴＰ５３機能障害及び１７ｐ１３欠失及びフルダラビン抵抗性）の組み合わせを有するハイリスク患者のグループを含む。超ハイリスク患者は、ハイリスク患者のものよりも少ない平均余命（例えば、２年未満の平均生存期間）を有し得る。さらに、超ハイリスク患者は、当初は処置に抵抗性（例えば、フルダラビン抵抗性）の患者として定義され得る。

「抗体」又は「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体及び一本鎖抗体並びにそれらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ及びＦｃ’フラグメント、軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）免疫グロブリン鎖並びにそれらの定常領域、可変領域又は超可変領域ばかりでなくＦｖ及びＦｄフラグメントを含む。「抗体（antibody）」又は「抗体（antibodies）」という用語は、ヒト由来又は非ヒト由来の抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体、さらにはＦｃ操作された抗体又はＦｃ融合分子を含む。

Ｆａｂフラグメント（抗原結合フラグメント＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域によって共に結合された両鎖の可変領域からなる。それらは、例えば、パパインなどのプロテアーゼで処理することによって、又は、ＤＮＡクローニングによって、従来の抗体から製造され得る。他の抗体フラグメントは、ペプシンによるタンパク質分解によって製造され得るＦ（ａｂ’）_２フラグメントである。

遺伝子クローニングによって、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみからなる短縮抗体フラグメントを調製することも可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（可変フラグメント＝可変部分のフラグメント）として公知である。これらのＦｖフラグメントにおいて、定常鎖のシステイン基を介した共有結合は、不可能なので、それらは、いくつかの他の方法によって安定化されることが多い。このために、重鎖及び軽鎖の可変領域は、約１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の短いペプチドフラグメントによって、共に結合されることが多い。これにより、ＶＨ及びＶＬがペプチドリンカーによって共に結合された単一のポリペプチド鎖が生じる。このような抗体フラグメントは、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）とも称される。ｓｃＦｖ抗体の例は、当技術分野において公知である。

過去数年において、多量体化ｓｃＦｖ誘導体を製造するために、様々な戦略が開発されてきた。その意図は、薬物動態特性の改善及び結合親和性の増加を有するリコンビナント抗体を製造することである。ｓｃＦｖフラグメントの多量体化を達成するために、それらは、多量体化ドメインを有する融合タンパク質として製造される。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域又はロイシンジッパードメインなどのらせん構造体（「コイルドコイル構造」）であり得る。他の戦略において、多量体化（例えば、ダイアボディ、トリアボディ及びペンタボディ）のために、ｓｃＦｖフラグメントのＶＨ領域とＶＬ領域の間の相互作用が使用される。

当技術分野において、「ダイアボディ」という用語は、二価ホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味するために使用される。ｓｃＦｖ分子においてペプチドリンカーを５〜１０アミノ酸に短縮すると、ＶＨ／ＶＬ鎖の重ね合わせによるホモダイマーの形成が生じる。ダイアボディは、ジスルフィド架橋の挿入によってさらに安定化され得る。ダイアボディの例は、文献中に見られ得る。

当技術分野において、「ミニボディ」という用語は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味するために使用される。それは、二量体化領域として、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む融合タンパク質からなる。これが、同様にＩｇＧのヒンジ領域とリンカー領域とによりｓｃＦｖフラグメントを結合させる。このようなミニボディの例は、当技術分野において公知である。

当技術分野において、「トリアボディ」という用語は、３価のホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を意味するために使用される。リンカー配列を使用しないＶＨ−ＶＬの直接的な融合が、三量体の形成をもたらす。

二価、三価又は四価構造を有する、当技術分野においてミニ抗体として公知のフラグメントも、ｓｃＦｖフラグメントの誘導体である。多量体化は、二量体、三量体又は四量体コイルドコイル構造によって達成される。

当技術分野において、「骨格タンパク質」又は「骨格抗体」もある。この用語を使用して、骨格タンパク質は、遺伝子クローニングによって、又は、別の機能を有する別のタンパク質若しくはタンパク質の一部との同時翻訳プロセスによって結合されたタンパク質、特に抗体の任意の機能的ドメインを意味する。

抗体／抗体分子の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲｓ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域（相補性決定領域、略して「ＣＤＲ」とも称される）を意味する。ＣＤＲは、本来は、多数の抗体配列の配列変化の程度に基づいて、Kabatらによって定義された（"Sequences of Proteins of Immunological Interest" Kabat, E., of al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983) and Kabat E. A., Wu T. T., Perry H. M., Gottesman K. S. and Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.). NIH Publication No. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991）。ＣＤＲは、抗体のターゲット抗原と接触し、結合に関して主に責任があると考えられている。Chothiaら（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901- 917 (1987)）は、超可変領域又はＣＤＲの別の定義を与えている。Chothia定義は、抗体の３次構造において、ループを構成する残基に基づいている。

本発明の具体的な文脈において、ＣＤＲは、Kabatシステムに基づいて決定される。配列番号２及び配列番号４に示される可変領域の配列から、ＣＤＲ配列は、通常、配列の特徴に関するKabat配列データベースを探索することによって決定され得る。配列番号２に示される可変重鎖内に含まれる３個のＣＤＲは、好ましくは、３１〜３５位（Ｈ１、配列番号１５）、５０〜６６位（Ｈ２、配列番号１６）又は５０〜６２位（Ｈ２ｂ、配列番号２１）及び９９〜１０５位（Ｈ３、配列番号１７）を含み、配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれる３個のＣＤＲは、好ましくは、２４〜３４位（Ｌ１、配列番号１８）、５０〜５６位（Ｌ２、配列番号１９）及び８９〜９７位（Ｌ３、配列番号２０）を含む。

実施態様
本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための、ＣＤ３７抗体に関する。

別の実施態様では、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のためのＣＤ３７抗体及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク若しくは超ハイリスク患者の処置のための薬剤の製造のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物の使用に関する。

さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物に関する。具体的には、本発明は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ハイリスク患者の処置における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための方法における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物に関する。具体的には、本発明は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ハイリスク患者の処置のための方法における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法であって、治療有効量のＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物を、それを必要とするハイリスク患者に投与することを含む、方法に関する。

さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者を処置するための方法であって、治療有効量のＣＤ３７抗体を前記患者に投与することを含む、方法に関する。

別の実施態様では、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍又はＢ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者を処置するための方法であって、（ｉ）Ｂ細胞悪性腫瘍に関する前記処置を必要とするハイリスク又は超ハイリスク患者を同定すること、及び（ｉｉ）治療有効量のＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物を前記ハイリスク又は超ハイリスク患者に投与することを含む、方法に関する。

上記発明の具体的な実施態様では、ハイリスク患者は、フルダラビン処置に抵抗性の患者、ＴＰ５３機能障害を有する患者、１７ｐ１３欠失を有する患者、及び、リツキシマブ処置にもはや反応しない患者からなる群より選択される。具体的な実施態様では、ハイリスク患者は、平均２〜３年、特に２年以下の平均余命である。

本発明の具体的な実施態様では、患者は、超ハイリスク患者である。

具体的な実施態様では、抗体は、ａ）配列番号２に示される可変重鎖内に含まれるＣＤＲ、及びｂ）配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれるＣＤＲを含む。好ましくは、可変重鎖内に含まれる前記ＣＤＲは、配列番号１５、１６又は２１及び１７を有する。好ましくは、可変軽鎖内に含まれる前記ＣＤＲは、配列番号１８、１９及び２０を有する。

本発明の具体的な実施態様では、抗ＣＤ３７抗体分子／ＣＤ３７抗体は、
ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変重鎖；
ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖
によって定義されるキメラ抗体である。

好ましくは、定常重鎖及び定常軽鎖は、ヒト由来である。キメラマウス／ヒト抗体の構築及び製造は、当技術分野において周知である。

好ましくは、ｉ）定常重鎖はＩｇＧ１鎖であり、ｉｉ）定常軽鎖はκ鎖である。具体的な実施態様では、抗体分子は、１つ以上のエフェクター機能をモデュレーションするＦｃドメインにおいて、１つ以上の突然変異を有し、好ましくは、エフェクター機能の前記モデュレーションは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の増加であり、好ましくは、Ｆｃドメインにおける前記１つ以上の突然変異は、Kabat ＥＵ番号付けインデックスに従って番号付けされた２３９位及び３３２位，又は２３６位及び３３２位，又は２３６位、２３９位及び３３２位における置換の組み合わせであり、好ましくは、前記置換は、Ｉ３３２Ｅ及びＳ２３９Ｄ又はＩ３３２Ｅ及びＧ２３６Ａ，又はＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＧ２３６Ａである。

好ましくは、ＣＤ３７抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。さらに、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するＣＤ３７抗体が好ましい。また、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するＣＤ３７抗体が好ましい。

本発明の別の具体的な実施態様では、抗ＣＤ３７抗体分子は、ヒトＣＤ３７に結合し、
ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変重鎖；及び
ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖
によって定義されるマウスモノクローナル抗体に由来し、
ａ）配列番号２に示される可変重鎖内に含まれるＣＤＲ、
ｂ）配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれるＣＤＲ、
ｃ）ヒト抗体に由来する前記ＣＤＲを支持するフレームワーク
によって定義されるヒト化抗体であり、
定常重鎖及び定常軽鎖がヒト抗体に由来する。好ましくは、可変重鎖内に含まれる前記ＣＤＲは、配列番号１５、１６又は２１及び１７を有する。好ましくは、可変軽鎖内に含まれる前記ＣＤＲは、配列番号１８、１９及び２０を有する。

具体的な実施態様では、抗体分子は、１つ以上のエフェクター機能をモデュレーションするＦｃドメインにおいて、１つ以上の突然変異を有し、好ましくは、エフェクター機能の前記モデュレーションは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の増加であり、好ましくは、Ｆｃドメインにおける前記１つ以上の突然変異は、Kabat ＥＵ番号付けインデックスに従って番号付けされた２３９位及び３３２位，又は２３６位及び３３２位，又は２３６位、２３９位及び３３２位における置換の組み合わせであり、好ましくは、前記置換は、Ｉ３３２Ｅ及びＳ２３９Ｄ又はＩ３３２Ｅ及びＧ２３６Ａ，又はＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＧ２３６Ａである。

好ましい実施態様では、ＣＤ３７抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。さらに、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体が好ましい。

本発明の抗体におけるＦｃ変異体は、それらを含むアミノ酸改変に従って定義される。従って、例えば、Ｉ３３２Ｅは、親のＦｃポリペプチドに対して置換Ｉ３３２Ｅを有するＦｃ変異体である。同様に、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、親のＦｃポリペプチドに対して置換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅを有するＦｃ変異体を定義し、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａは、置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＧ２３６Ａを有するＦｃ変異体を定義する。

番号付けは、ＥＵ番号付け体系（Kabat et al., 1991、上記参照）（これは、ＥＵ抗体（Edelman et al. Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, 1969）の番号付けを意味する）に従う。当業者であれば、これらの取り決めが、免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的な番号付けからなり、これによって免疫グロブリンファミリーにおいて保存された位置に対して標準化された参照が可能となることを理解するであろう。

上記抗体において、置換された２３６位、２３９位及び３３２位は、配列番号７に示されるＩｇＧ１重鎖のそれぞれ１１９位、１２２位及び２１５位に対応する。配列番号５、９、１１及び１３に示される抗体Ａ２、Ａ４、Ｂ２及びＢ４の重鎖の完全長配列において、置換されたアミノ酸は、２３５位、２３８位及び３３１位に存在する。

本発明の具体的な実施態様では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン症、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも称される）、中枢神経系リンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも称される）、毛状細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病）、ミエローマ、多発性ミエローマ、小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁層リンパ腫、形質細胞ミエローマ、骨の孤立形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の外リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、侵攻性Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞型リンパ腫、血管内大Ｂ細胞型リンパ腫、原発性滲出型リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、灰白色層リンパ腫、悪性性が未確認のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症及び移植後のリンパ球増殖性異常からなる群より選択される。好ましくは、Ｂ細胞悪性腫瘍はＣＬＬである。

さらに、本発明は、ＴＰ５３欠損細胞の集団からＣＤ３７発現Ｂ細胞を枯渇する方法であって、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物、及び、薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を前記細胞の集団に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、前記方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで実施される。

具体的な実施態様では、前記方法の前記ＣＤ３７抗体は、ａ）配列番号２に示される可変重鎖内に含まれるＣＤＲ、及びｂ）配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれるＣＤＲを含む抗体である。前記枯渇方法に有用であるこのようなＣＤ３７抗体の具体例は、上記の通りである。

本発明の実践では、特に明記しない限り、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの従来の技術を使用するが、それらは当業者の技術中にある。これらの技術は、本文献中に完全に開示される。

この明細書において言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する当業者の技術水準を示す。本発明が関連する技術水準をより十分に記載するために、本明細書において引用されるすべての刊行物及び特許出願は、その全体が参照によりここに組み込まれる。一般的に上に記載される本発明は、以下の実施例の参照によって、より容易に理解されるであろう。単に、本発明のある実施態様の例示の目的のために、実施例は、本明細書に含まれる。以下の実施例は非限定的である。それらは、単に、本発明の可能な実施態様を示す。当業者であれば、それを他の実施態様に適用するために、条件を容易に調整し得る。

実験
材料及び方法
ＣＬＬ患者血液サンプルのセットにおいて、いくつかの抗体（Ａ２、Ｂ２、リツキシマブ、アレムツズマブ）のＣＬＬ細胞枯渇活性をｉｎｖｉｔｒｏで研究する。遺伝的特徴（ゲノム異常、ＴＰ５３突然変異、１７ｐ１３欠失）並びに臨床経過及び免疫表現型に関して、ＣＬＬサンプルを特性化する。ＴＰ５３突然変異の状態は、Zenzら（Zenz T, Krober A, Scherer K, Habe S, Buhler A, Benner A, Denzel T, Winkler D, Edelmann J, Schwanen C, Dohner H, Stilgenbauer S. Monoallelic TP53 inactivation is associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia: results from a detailed genetic characterization with long-term follow-up. Blood. 2008 Oct 15;112(8):3322-9. Epub 2008 Aug 8.）によって記載される自動化蛍光配列決定により、又は、当技術分野において公知の他の適切な方法（例えば、Coll-Mulet et al., Multiplex ligation-dependent probe amplification for detection of genomic alterations in chronic lymphocytic leukaemia., Br J Haematol. 2008 Sep;142(5):793-801. Epub 2008 Jun 17.に記載されるように）により、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインのコーディングエクソン（例えば、エクソン４〜１０）又は他の関連エクソンを配列決定することによって決定できる。ゲノム異常（例えば、染色体１７ｐ１３の欠失）及びＶＨの状態（例えば、ＩＧＶＨ突然変異の状態）の分析は、文献（例えば、Dohner et al., Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2000 Dec 28;343(26):1910-6; Krober et al., Additional genetic high-risk features such as 11q deletion, 17p deletion, and V3-21 usage characterize discordance of ZAP-70 and VH mutation status in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 2006 Feb 20;24(6):969-75. Epub 2006 Jan 17.）に記載されるように実施できる。蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ゲノム異常及び染色体の欠失（例えば、１７ｐ１３欠失）を検出するために当技術分野において広く使用されている公知の方法である（Dohner et al., 11q deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood. 1997 Apr 1;89(7):2516-22.）。

ＣＬＬ細胞に対する効果を研究するために、本発明者らは、全血培養系におけるｉｎｖｉｔｒｏ処置後に、リツキシマブ及びアレムツズマブと同時にＣＤ３７抗体を評価する。ＰＢＳ中に希釈した抗体２０μlを、ヘパリン化又はＡＣＤ（クエン酸デキストロース）血液１８０μlに添加し、４８ウェルプレートにおいて、一定に振とうさせながら室温で３時間又は８時間インキュベーションする。その後、等分した血液−抗体混合物を、BD TruCountチューブに移し、ＣＬＬ細胞を同定するために、ＦＩＴＣラベル化ＣＤ１９抗体２０μlを添加する。赤血球の溶解後に、FACS Caliburフローサイトメトリー装置を用いてサンプルを測定する。ＣＤ１９陽性及びサイドスキャッターへの出現によって、生存ＣＬＬ細胞を測定する。蛍光ラベル化ビーズ（これは、既知数でTruCountチューブ中に含まれる）を内部標準として使用することによって、生存ＣＬＬ細胞の定量化を実施する。GraphPad Prism software package version 5.02を使用して、濃度反応曲線を計算する。

実施例
実施例１：ＣＬＬ全血アッセイ
全血アッセイを用いて、ＣＬＬ患者に由来する全血サンプルにおいて、ＣＬＬ細胞に対する抗体処置の効果を評価する。漸増濃度（０．００１μg/ml〜１００μg/ml）の抗体Ａ２及びＢ２を、ヘパリン化又はクエン酸デキストロース血液に添加し、室温で３時間インキュベーションする。抗体のインキュベーション後に、定量的アッセイを使用するＦＡＣＳ分析によって、残存する生存ＣＬＬ細胞（ＣＤ１９陽性）を測定する。図１に示されるように、Ａ２及びＢ２は両方とも、約１０００ng/mlのＥＣ_５０値でＣＬＬ細胞を非常に強力に枯渇する。高い抗体濃度におけるＣＬＬ細胞枯渇の平均最大程度は、Ａ２に関して９０％超であり、Ｂ２に関して約７５％である。これらのデータは、抗体Ａ２及びＢ２が、ＣＬＬ患者の全血サンプルに由来するＣＬＬ細胞の強力かつ濃度依存的な枯渇をｉｎｖｉｔｒｏでもたらすことを実証している。

実施例２：ＣＬＬ全血アッセイ：リツキシマブ及びアレムツズマブとの比較
ＣＬＬ処置に関して、Ａ２及びＢ２の効果を認可された抗体と比較するために、同じ患者サンプルにおいて、ＣＤ２０抗体リツキシマブ及びＣＤ５２抗体アレムツズマブを同時に試験する。図２に示されるように、３時間インキュベーションした後の、１０μg/mlの抗体濃度におけるＡ２（９％生存細胞）及びＢ２（２６％生存細胞）を用いたＣＬＬ細胞枯渇は、アレムツズマブ（７１％生存細胞）及びリツキシマブ（８０％生存細胞）を用いて観察されたものよりも明らかに優れている。これらのデータは、ＣＬＬ患者に由来する全血サンプルにおけるＡ２及びＢ２のＣＬＬ細胞枯渇の程度が、リツキシマブ及びアレムツズマブを用いて観察されたものよりも明らかに優れていることを実証している。

実施例３：ＣＬＬ全血アッセイ：異なる患者リスクグループの比較
本発明者らは、ゲノム異常（例えば、ＴＰ５３突然変異又は１７ｐ１３欠失）の症例、フルダラビン抵抗性の症例、及び、抗ＣＤ２０治療が失敗した後の患者における、Ａ２及びＢ２の効果に特に注目する。これらの症例は、一般的には、ハイリスク又は超ハイリスク患者集団であると考えられる。この目的を達成するために、患者１９人（図３Ａ）〜２１人（図３Ｂ）（ハイリスク又は超ハイリスクグループの患者１０人、及び、あらゆる特定のリスク特性がないサンプル９個（図３Ａ）〜１１個（図３Ｂ）を含む）に由来する血液サンプルを特性化する。ハイリスク又は超ハイリスクの患者グループは、１７ｐ１３欠失、ＴＰ５３突然変異を有する患者、フルダラビン処置に抵抗性の患者、及び、抗ＣＤ２０処置後の患者を含む。本発明者らは、ハイリスク又は超ハイリスクグループ（１７ｐ１３欠失、ＴＰ５３突然変異、フルダラビン抵抗性、抗ＣＤ２０処置後；ｎ＝１０図３Ｂ）、及び、あらゆる特定のリスクがない残りの患者（ｎ＝９図３Ａ及びｎ＝１１図３Ｂ）において、ＣＬＬ細胞枯渇を比較する。両抗体Ａ２及びＢ２に関して、ＣＬＬ細胞枯渇は、両リスクグループにおいて高い。すなわち、１０μg/mlにおいて、Ａ２平均残存ＣＬＬ細胞：１１．１％（８時間）通常のリスク；２１．３％ハイリスク；１０μg/mlにおいて、Ｂ２平均残存ＣＬＬ細胞：３３．２％（８時間）通常のリスク；４３．１％ハイリスク（図３Ｂ）。図３、特に図３Ｂに示されるように、調査した患者サブグループすべてにおいて、Ａ２及びＢ２の効果は、リツキシマブ及びアレムツズマブのものよりも明らかに優れている。この分析からの知見は、抗体Ａ２及びＢ２が、調査した患者サブグループすべてにおいて、優れたＣＬＬ枯渇活性を示し、処置失敗のリスクの増加を有するＣＬＬ患者を処置するのに特に適していることを実証している。

実施例４：抗体Ａ２及びＢ２は、Ｆｃγレセプター３ａへの高度に改善された結合を示す
表面プラズモン共鳴分析（ＳＦＰ）（Edwards and Leatherbarrow, Determination of Association Rate Constants by an Optical Biosensor Using Initial Rate Analysis. Analytical Biochemistry 246, 1-6, 1997; Nieba et al., Competition BIAcore for Measuring True Affinities: Large Differences from Values Determined from Binding Kinetics. Analytical Biochemistry 234, 155-165, 1996）によって、Ｆｃγレセプター３ａに対する抗体Ａ２及びＢ２の親和性を決定する。つまり、リコンビナントＦｃγレセプター３ａタンパク質（高親和性Ｖ１５８アロタイプ又は低親和性Ｆ１５８アロタイプのいずれか）を、センサー表面にコーティングし、ＳＦＰにより決定した錯体形成（ｋ_ａ）と解離（ｋ_ｄ）の比を使用して、抗体Ａ２及びＢ２の解離定数Ｋ_Ｄを計算した。Ｆｃ操作されていないＩｇＧ１型の抗体を、参照抗体として使用する。Ａ２は、Ｖ１５８アロタイプに対して８．８nMのＫ_Ｄ、及び、Ｆ１５８アロタイプに対して１７．５nMのＫ_Ｄを示し、同様に、Ｂ２は、９．３及び２１．１nMのＫ_Ｄをそれぞれ示した。対照的に、Ｆｃ操作されていないＩｇＧ１参照抗体は、高親和性アロタイプＶ１５８に対して３７９nMのＫ_Ｄ、及び、低親和性アロタイプＦ１５８に対して１４００nMのＫ_Ｄを示す。要するに、抗体Ａ２及びＢ２は、約４０倍増加したＦｃγレセプター３ａＶ１５８への結合、及び、約６０倍〜８０倍増加したＦｃγレセプター３ａＦ１５８への結合を示し、これは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の顕著な増加、並びに、Ａ２及びＢ２の臨床効果の改善につながることが期待される。

Claims

Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための、ＣＤ３７抗体。
Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置における使用のための、好ましくは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ハイリスク患者の処置における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物。
Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患しているハイリスク患者の処置のための方法における使用のための、好ましくは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ハイリスク患者の処置のための方法における使用のための、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物。
ハイリスク患者が、フルダラビン処置に抵抗性の患者、ＴＰ５３機能障害を有する患者、１７ｐ１３欠失を有する患者、及び、リツキシマブ処置にもはや反応しない患者からなる群より選択される、請求項１〜３記載のＣＤ３７抗体。
ハイリスク患者が、平均２〜３年、具体的には２年以下の平均余命を有する、請求項１〜４記載のＣＤ３７抗体。
ａ．配列番号２に示される可変重鎖内に含まれるＣＤＲ、好ましくは、配列番号１５、１６又は２１及び１７を有する前記ＣＤＲ、並びに
ｂ．配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれるＣＤＲ、好ましくは、配列番号１８、１９及び２０を有する前記ＣＤＲ
を含む抗体である、請求項１〜５記載のＣＤ３７抗体。
ａ．配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び
ｂ．配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖
によって定義されるキメラ抗体であり、
定常重鎖及び定常軽鎖が、好ましくはヒト由来である、請求項１〜６記載のＣＤ３７抗体。
ヒト抗体に由来する前記ＣＤＲを支持するフレームワークによって定義されるヒト化抗体であり、定常重鎖及び定常軽鎖がヒト抗体に由来する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項６記載のＣＤ３７抗体。
Ｂ細胞悪性腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫、侵攻性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン症、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも称される）、中枢神経系リンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも称される）、毛状細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病）、ミエローマ、多発性ミエローマ）、小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁層リンパ腫、形質細胞ミエローマ、骨の孤立形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の外リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞型リンパ腫、血管内大Ｂ細胞型リンパ腫、原発性滲出型リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、灰白色層リンパ腫、悪性性が未確認のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症及び移植後のリンパ球増殖性異常からなる群より選択され、Ｂ細胞悪性腫瘍が、好ましくはＣＬＬである、請求項１〜１３記載のＣＤ３７抗体。
Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法であって、治療有効量の
ａ．請求項１〜１４記載のＣＤ３７抗体、又は
ｂ．ＣＤ３７抗体を含む医薬組成物
をそれを必要とするハイリスク又は超ハイリスク患者に投与することを含む、方法。
抗体が、
ａ．配列番号２に示される可変重鎖内に含まれるＣＤＲ、好ましくは、配列番号１５、１６又は２１及び１７を有する前記ＣＤＲ、並びに
ｂ．配列番号４に示される可変軽鎖内に含まれるＣＤＲ、好ましくは、配列番号１８、１９及び２０を有する前記ＣＤＲ
を含む抗体である、請求項１５記載の方法。
ＣＤ３７抗体が、
ａ．配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び
ｂ．配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖
によって定義されるキメラ抗体であり、
定常重鎖及び定常軽鎖が、好ましくはヒト由来である、請求項１５又は１６記載の方法。
抗体が、ヒト抗体に由来する前記ＣＤＲを支持するフレームワークによって定義されるヒト化抗体であり、定常重鎖及び定常軽鎖がヒト抗体に由来する、請求項１６記載の方法。
抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１６記載の方法。
抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１６記載の方法。
抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１６記載の方法。
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１６記載の方法。
抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１６記載の方法。
Ｂ細胞悪性腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫、侵攻性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン症、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも称される）、中枢神経系リンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも称される）、毛状細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病）、ミエローマ、多発性ミエローマ）、小リンパ球型リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁層リンパ腫、形質細胞ミエローマ、骨の孤立形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の外リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞型リンパ腫、血管内大Ｂ細胞型リンパ腫、原発性滲出型リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、灰白色層リンパ腫、悪性性が未確認のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症及び移植後のリンパ球増殖性異常からなる群より選択され、Ｂ細胞悪性腫瘍が、好ましくはＣＬＬである、請求項１５〜２３記載の方法。
ハイリスク患者が、フルダラビン処置に抵抗性の患者、ＴＰ５３機能障害を有する患者、１７ｐ１３欠失を有する患者、及び、リツキシマブ処置にもはや反応しない患者からなる群より選択される、請求項１５〜２４記載の方法。
ハイリスク患者が、平均２〜３年、具体的には２年以下の平均余命を有する、請求項１５〜２５記載の方法。
ＴＰ５３欠損細胞の集団からＣＤ３７発現Ｂ細胞を枯渇する方法であって、ＣＤ３７抗体又はＣＤ３７抗体を含む医薬組成物、及び、薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を前記細胞の集団に投与することを含み、好ましくはｉｎｖｉｔｒｏで実施される、方法。