JP2017012189A - Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ - Google Patents

Abstract

【課題】ヘモグロビンと特異的な結合を行なうＲＮＡアプタマーおよびセンサの提供。
【解決手段】ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列を備える、ＲＮＡアプタマーにより、ヘモグロビンの分画成分のうち少なくとも１種と特異的に結合することが可能となる。上述のＲＮＡアプタマー、すなわちヘモグロビンの分画成分のうち少なくとも１種と特異的に結合することが可能ＲＮＡアプタマーを基体に固定化することによって得られるセンサ。
【選択図】図１

Description

本発明は、検体液の性質あるいは検体液に含まれる成分を測定することができるＲＮＡアプタマーおよびそれを用いたセンサに関するものである。

検出素子を用いて、検体液に含まれるヘモグロビンを測定するための抗体およびそれを用いたセンサが知られている（例えば、特許文献１または２参照。）。

しかしながら、特許文献１および２に開示されているのは、検体液に含まれるヘモグロビンを測定する抗体およびセンサであって、アプタマーについては開示されていなかった。

ここで、測定に用いられる抗体は、動物細胞を使用して作製するため、個体差によるバッチ間変動が生じるとともに、化学合成による大量生産に向いておらず生産コストの低減も難しかった。さらに、抗体はタンパク質であるために、高温や乾燥環境下で変性しやすく保存性に乏しいという性質を有していた。

そのため、ヘモグロビンと特異的な結合を行なうことができ、しかも品質ばらつきが小さく低コストで保存性に優れたアプタマーが求められていた。

特開２００２−２０９５７９号公報 特開平０６−１１３８３０号公報

ヘモグロビンと特異的な結合を行なうアプタマーおよびそれを用いたセンサが求められていた。

本発明の実施形態に係るＲＮＡアプタマーは、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備える。ここで、塩基がアデニンであるヌクレオチドをＡ、塩基がグアニンであるヌクレオチドをＧ、塩基がシトシンであるヌクレオチドをＣ、および塩基がウラシルであるヌクレオチドをＵ、と表記する。このような構成を有することで、効果的にヘモグロビン（以下、Ｈｂとも表記する。）の分画成分のうち少なくとも１種と特異的に結合することが可能となる。

本発明の実施形態に係るセンサは、基体と、基体に固定化されている上述のＲＮＡアプタマーとを備える。このような構成を有することで、効果的にヘモグロビンの分画成分のうち少なくとも１種と特異的に結合することが可能となる。

本発明の実施形態に係るＲＮＡアプタマーを示す図である。 本発明の実施形態に係るセンサを示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は長さ方向の断面図、（ｃ）は幅方向の断面図である。 図２のセンサの一部を拡大して示す断面図である。 図２のセンサの検出素子を示す平面図である。 図２のセンサの分解平面図である。 図２のセンサの製造工程を示す平面図である。 図２のセンサの変形例を示す平面図であり、（ａ）および（ｂ）は図６（ｄ）に対応する図であり、（ｃ）は図２（ａ）に対応する図である。 図２のセンサの変形例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は長さ方向の断面図、（ｃ）は幅方向の断面図である。 図８のセンサの製造工程を示す平面図である。 図２のセンサの変形例を示す図であり、特に製造工程を示す図である。 図２のセンサの変形例を示す平面図であり、図６（ｄ）に対応する図である。 図２のセンサの検出部の実施例を示す側面図である。 図２のセンサの検出部の実施例を示す側面図である。 本発明の実施形態に係るセンサ（ＲＮＡアプタマー）に関する実験データを示す図である。 本発明の実施形態に係るセンサ（ＲＮＡアプタマー）に関する実験データを示す図である。 本発明の実施形態に係るセンサ（ＲＮＡアプタマー）に関する実験データを示す図である。

以下、本発明の実施形態に係るＲＮＡアプタマーおよびそれを用いたセンサの実施形態について、図面などを参照しつつ詳細に説明する。なお、以下に説明する各図面において同じ構成部材には同じ符号を付すものとする。また、各部材の大きさや部材同士の間の距離などは模式的に図示しており、現実のものとは異なる場合がある。

＜ＲＮＡアプタマー＞
本発明の実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０は、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列Ｓ（配列番号１）を備える。ここで、塩基がアデニンであるヌクレオチドをＡ、塩基がグアニンであるヌクレオチドをＧ、塩基がシトシンであるヌクレオチドをＣ、および塩基がウラシルであるヌクレオチドをＵ、と表記する（以下において、同様とする。）。このような配列Ｓを有することで、効果的にＨｂの分画成分のうち少なくとも１種と特異的に結合することが可能となる。具体的には、本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０は、Ｈｂの分画成分のうち少なくともＨｂＡ０と特異的に結合することが可能である。なお、本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)およびヒトＩｇＧ（ｈ-ＩｇＧ）とは結合しない傾向がある。

なお、ＲＮＡアプタマー１３０に含まれるＣおよびＵのうち少なくとも一方は、ヌクレオチドを構成している糖の２´位にフッ素基を有するようにすればよい。これによれば、ＲＮＡアプタマー１３０の構造の安定性を向上させることができる。本実施形態においては、ＣおよびＵのいずれも、ヌクレオチドを構成している糖の２´位にフッ素基を有する。

本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０の一例は、配列Ｓの両端に位置しているＵの塩基およびＡの塩基を有する第１領域１３０ａと、上記Ｕから上記Ａへと、ＡＵＵＡＧＧＡＣＣの順に結合している第２領域１３０ｂと、を備えている。さらに、ＲＮＡアプタマー１３０は、３´末端１３０ｃ１および５´末端１３０ｃ２を含む末端領域１３０ｃを備えている。

なお、本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０の一例を、２次構造を予測するソフトウェア（ソフトウェア名：CentroidFold）を用いて表示させると、図１（ｂ）に示すような形状となる。まず、第１領域１３０ａにおけるＵの塩基およびＡの塩基が構成している第１塩基対１３０ａと、第２領域１３０ｂにおいて、第１塩基対１３０ａを構成するＵからＡへとＡＵＵＡＧＧＡＣＣの順に結合している部位とが、ループ形状を示す。また、第１領域１３０ａにおいて、Ｕの塩基とＡの塩基との第１塩基対１３０ａに連続する部位に、複数のヌクレオチドによって少なくとも１つの塩基対を有することによってステム形状を示す。すなわち、本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０は、いわゆるステムループ形状を有する。

（第１領域）
第１領域１３０ａは、上述の通り、Ｕの塩基とＡの塩基とを有する。

また、第１領域１３０ａは、配列Ｓの両端に位置しているＵおよびＡのうち少なくとも一方に結合する複数のヌクレオチドをさらに有してもよい。これによれば、他の部材に対する固定化を容易にすることができる。例えば、複数のヌクレオチドは、配列Ｓの第１端部１３０ａ１１に位置しているＵに結合している少なくとも１つのヌクレオチドからなる第１配列１３０ａａと、配列Ｓの第２端部１３０ａ１２に位置しているＡに結合している少なくとも１つのヌクレオチドからなる第２配列１３０ａｂと、を有するように構成することができる。

また、第１領域１３０ａは、第１配列１３０ａａと第２配列１３０ａｂとが少なくとも１つの塩基対を構成している第１部位１３０ａｘを有するようにしてもよい。これによれば、塩基対によってＲＮＡアプタマー１３０自体の構造を安定化させることが可能となる。なお、第１領域１３０ａは、複数の塩基対を有するようにしてもよい。そして、複数の塩基対が互いに連続していてもよい。

また、第１領域１３０ａは、第１配列１３０ａａと第２配列１３０ａｂとが塩基対を構成していない第２部位１３０ａｙを有するようにしてもよい。これによれば、柔軟性を有することで固定化に際して効果的な配向を取ることができる。なお、第１領域１３０ａは、塩基対を構成しない部位を複数有するようにしてもよい。そして、これらの塩基対を構成しない部位が互いに連続していてもよい。

また、配列Ｓの第１端部１３０ａ１１に位置しているＵは、配列Ｓの第２端部１３０ａ１２に位置しているＡよりも、５´末端１３０ｃ２側に位置するようにすればよい。これによれば、Ｈｂへの特異的な結合が生じ易くなる。

（第２領域）
第２領域１３０ｂは、上述の通り、第１領域１３０ａにおける上記Ｕから上記Ａへと、ヌクレオチドがＡＵＵＡＧＧＡＣＣの順に結合している。このような構成を有することにより、第２領域１３０ｂの立体構造と、検出対象であるヘモグロビンの立体構造とが相互に関係することによって、ＲＮＡアプタマーとヘモグロビンとが特異的に結合して、ヘモグロビンを効果的に検出することができるものと考えられる。

（末端領域）
末端領域１３０ｃが、ビオチン、チオール基、あるいはアミノ基などの修飾基を有するようにすることができる。末端領域１３０ｃとは、ＲＮＡアプタマー１３０の端部を意味するものであって、３´末端１３０ｃ１および５´末端１３０ｃ２を有する。これによれば、ＲＮＡアプタマー１３０を他の部材に対して固定化することを容易にすることができる。ここで、上述の修飾基はそれぞれ、末端領域１３０ｃのうち３´末端１３０ｃ１あるいは５´末端１３０ｃ２のうち少なくとも一方に結合させることができる。例えば、上述の修飾基を両末端と結合させることで、固定化のバリエーションを増やすことが可能となる、あるいは固定化の結合性を向上させることが可能となる。

ここで、末端領域１３０ｃがビオチンを有する場合には、このビオチンにストレプトアビジン（以下、ＳＡと表記する場合がある。）を結合するようにすればよい。これによれば、ビオチンとストレプトアビジンとのアミド結合によって、他の部材への固定化が容易となる。

また、末端領域１３０ｃがチオール基を有する場合には、金−チオール結合によって金と結合させることができる。それ故、チオール基と結合した金を介して、他の部材に対して比較的容易に固定化させることができる。なお、末端領域１３０ｃにチオール基を有する場合において、チオール基とＲＮＡアプタマー１３０との間に所定長さのスペーサを介在させることができる。これによれば、基体からＲＮＡアプタマー１３０までの高さを適度に調整することによって、ＲＮＡアプタマー１３０による検出対象の検出感度を向上させることができる。

また、末端領域１３０ｃがアミノ基を有する場合には、このアミノ基とアミド結合を形成している第１物質を有するようにすればよい。ここで、第１物質としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。この際、アミノ基は、ポリエチレングリコールの末端に修飾されたカルボキシル基とアミド結合を形成することとなる。そして、ポリエチレングリコールの他の末端に修飾されたチオール基を介して、他の部材と固定化することができる。

＜センサ＞
本発明の実施形態に係るセンサ１００について、図２〜図６を用いて説明する。

本実施形態に係るセンサ１００は、図２に示すように、主に第１カバー部材１、中間カバー部材１Ａ、第２カバー部材２および検出素子３を備える。

具体的には、センサ１００は、図２（ｂ）に示すように、検体液が流入する流入部１４と、流入部１４と連続しており且つ中間カバー部材１Ａと第２カバー部材２とで囲まれて少なくとも検出部１３まで延びている流路１５とを備えている。図２（ｃ）は、図２（ａ）の断面図を示すものであり、上から順に、ａ−ａ断面、ｂ−ｂ断面、ｃ−ｃ断面を示す。流入部１４は、図２（ｂ）に示すように、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２の側面に位置している。なお、流入部１４は、図２（ｂ）に示すように、第２カバー部材２を厚み方向に貫通するようにしてもよい。

本実施形態に係るセンサ１００では、第１カバー部材の上面に検出素子と流路の少なくとも一部を構成する中間カバー部材とを併設したことから、厚みのある検出素子を用いた場合でも流入部から検出部に至る検体液の流路を確保することができ、毛細管現象などによって流入部から吸引された検体液を検出部まで流すことができる。すなわち、厚みを有する検出素子を用いつつ、それ自体に検体液の吸引機構を備えた測定作業が簡便なセンサを提供することができる。また、検体液の流路において、検出素子よりも上流側に位置している部材表面の検体液に対する接触角θ１ａ、θ２ａは、検出素子の表面の検体液に対する接触角θ３よりも小さいことから、流入部から流入した検体液を、上流側に位置する部材表面を通じて検出素子（検出部）に向かってスムーズに流すことが可能となる。

（第１カバー部材１）
第１カバー部材１は、図２（ｂ）に示すように平板状である。厚みは、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍである。第１カバー部材１の平面形状は概ね長方形状である。第１カバー部材１の長さ方向の長さは、例えば１ｃｍ〜５ｃｍであり、幅方向の長さは、例えば１ｃｍ〜３ｃｍである。第１カバー部材１の材料としては、例えば、紙、プラスチック、セルロイド、セラミックス、不織布、ガラスなどを用いることができる。必要な強度とコストとを兼ね備える観点からプラスチックを用いることが好ましい。
また、第１カバー部材１の上面には、図２（ａ）に示すように、端子６および端子６から検出素子３の近傍まで引き回された配線７が形成されている。端子６は、中間カバー部材１Ａの上面において、検出素子３に対して幅方向に両側に形成されている。センサ１００を外部の測定器（図示せず）で測定する際に、端子６と外部の測定器とが電気的に接続される。また、端子６と検出素子３とは、配線７などを介して電気的に接続されている。そして、外部の測定器からの信号が端子６を介してセンサ１００に入力されるとともに、センサ１００からの信号が端子６を介して外部の測定器に出力されることとなる。

（中間カバー部材１Ａ）
本実施形態において、図２（ａ）に示すように、中間カバー部材１Ａが、第１カバー部材１の上面に、検出素子３と並んで位置している。また、中間カバー部材１Ａと検出素子３とは間隙を介して位置している。

中間カバー部材１Ａは、平板状の板に凹部形成部位４を有する平板枠状であり、その厚みは、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍである。

本実施形態において、凹部形成部位４は、図２（ａ）に示すように、第１上流部１Ａａおよび第１下流部１Ａｂを分断する部位である。凹部形成部位４が設けられた中間カバー部材１Ａを平板状の第１カバー部材１と接合することによって、第１カバー部材１および中間カバー部材１Ａによって素子収容凹部５が形成されることとなる。すなわち、凹部形成部位４の内側に位置する第１カバー部材１の上面が素子収容凹部５の底面となり、凹部形成部位４の内壁が素子収容凹部５の内壁となる。

中間カバー部材１Ａの材料としては、例えば、樹脂（プラスチックを含む）、紙、不織布、ガラスを用いることができ、より具体的には、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、シリコーン樹脂などの樹脂材料を用いることが好ましい。なお、第１カバー部材１の材料と中間カバー部材１Ａの材料とを異なるようにしてもよい。

また、本実施形態において、中間カバー部材１Ａは、第１上流部１Ａａと第１下流部１Ａｂとを有しており、図２（ａ）に示すように、上面視において、検出素子３は、第１上流部１Ａａと第１下流部１Ａｂとの間に位置している。これによれば、流路１５のうち第１上流部１Ａａを通って検出素子３上を流れる検体液は、測定に必要な量を超える量が第１下流部１Ａｂ側に流れていくことから、検出素子３に適切な量の検体液を供給することが可能となる。

なお、中間カバー部材１Ａの厚みは、検出素子３の厚みよりも大きいことが好ましい。

（第２カバー部材２）
第２カバー部材２は、図２（ｂ）に示すように、検出素子３の少なくとも一部を覆うとともに中間カバー部材１Ａに接合されている。第２カバー部材２の材料としては、例えば、樹脂（プラスチックを含む）、紙、不織布、ガラスを用いることができ、より具体的には、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、シリコーン樹脂などの樹脂材料を用いることが好ましい。なお、第１カバー部材１の材料と第２カバー部材２の材料とを同一としてもよい。これによって、互いの熱膨張係数の差に起因する変形を抑制することが可能となる。なお、第２カバー部材２は、中間カバー部材１Ａにのみ接合される構成、あるいは第１カバー部材１および中間カバー部材１Ａの双方に接合される構成にしてもよい。

ここで、第２カバー部材２は、第３基板２ａと第４基板２ｂとを有する。

第３基板２ａは、中間カバー部材１Ａの上面に貼り合わされている。第３基板２ａは平板状であり、その厚みは、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍである。第４基板２ｂは、第３基板２ａの上面に貼り合わされている。第４基板２ｂは平板状であり、その厚みは、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍである。そして、第４基板２ｂが第３基板２ａと接合されることによって、図２（ｂ）に示すように、第２カバー部材２の下面に流路１５が形成されることとなる。流路１５は、流入部１４から少なくとも検出部１３の直上領域まで延びており、その断面形状は、例えば矩形状である。

本実施形態において、流路１５の端部は、図２（ｂ）に示すように、第３基板２ａが存在せずに第４基板２ｂと中間カバー部材１Ａとの隙間が排気孔１８として機能する。排気孔１８は、流路１５内の空気などを外部に放出するためのものである。排気孔１８は、円柱状または四角柱状など、流路１５内の空気を抜くことができればどのような形状であってもよい。ただし、排気孔１８の開口が大きすぎると、流路１５内に存在する検体液が外気に触れる面積が大きくなり、検体液の水分が蒸発しやすくなる。そうすると、検体液の濃度変化が起こりやすくなり、測定精度の低下を招くこととなる。そのため、排気孔１８の開口は、必要以上に大きくならないように設定することが好ましい。具体的には、円柱状からなる排気孔１８の場合にはその直径を１ｍｍ以下となるようにし、四角柱からなる排気孔１８の場合にはその１辺が１ｍｍ以下となるようにしている。また、排気孔１８の内壁は疎水性となっている。これにより、流路１５内に満たされた検体液が排気孔１８から外部に漏れ出ることが抑制される。

第１カバー部材１、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２は、すべて同じ材料によって形成することもできる。それによれば、各部材の熱膨張係数をほぼ揃えることができるため、部材ごとの熱膨張係数の差に起因する変形が抑制される。また、検出部１３には生体材料が塗布されることがあるが、その中には紫外線などの外部の光によって変質しやすいものもある。その場合は、第１カバー部材１、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２の材料として、遮光性を有する不透明なものを用いるとよい。一方、検出部１３の外部の光による変質がほとんど起こらない場合は、流路１５を構成する第２カバー部材２を透明に近い材料によって形成してもよい。この場合は、流路１５内を流れる検体液の様子を視認することができる。

（検出素子３）
検出素子３は、図２（ｂ）に示すように、第１カバー部材１の上面に位置している基体１０、および基体１０の上面に位置しており且つ検体液に含まれる検出対象の検出を行なう少なくとも１つの検出部１３を有する。検出素子３の詳細については、図３（ｂ）および図４に示している。

なお、本実施形態においては、図４に示すように、基体１０の上面に電極パターンが設けられており、必要に応じて、電極パターンを覆うように絶縁性部材２８が設けられてもよい。なお、電極パターンとしては、検出素子３としてＳＡＷ素子を用いる場合にはＩＤＴ（InterDigital Transducer）電極が相当する。本実施形態において、基体１０の上面には、後述する、第１ＩＤＴ電極１１、第２ＩＤＴ電極１２、第１引出し電極１９および第２引出し電極２０などが設けられている。本実施形態では、図３（ｂ）に示すように、基体１０の上面に第２カバー部材２が、例えばＩＤＴ電極１１、１２上に固定されている。

（基体１０）
基体１０は、例えば、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ_３）単結晶，ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ_３）単結晶または水晶などの圧電性を有する単結晶の基板からなる。基体１０の平面形状および各種寸法は適宜に設定されてよい。一例として、基体１０の厚みは、０．３ｍｍ〜１ｍｍである。

（ＩＤＴ電極１１、１２）
図４に示すように、第１ＩＤＴ電極１１は、１対の櫛歯電極を有する。各櫛歯電極は、互いに対向する２本のバスバーおよび各バスバーから他のバスバー側へ延びる複数の電極指を有している。そして、１対の櫛歯電極は、複数の電極指が互いに噛み合うように配置されている。第２ＩＤＴ電極１２も、第１ＩＤＴ電極１１と同様に構成されている。第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極１２は、トランスバーサル型のＩＤＴ電極を構成している。

第１ＩＤＴ電極１１は、所定の弾性表面波（ＳＡＷ：Surface Acoustic Wave）を発生させるためのものであり、第２ＩＤＴ電極１２は、第１ＩＤＴ電極１１で発生したＳＡＷを受信するためのものである。第１ＩＤＴ電極１１で発生したＳＡＷを第２ＩＤＴ電極１２が受信できるように、第１ＩＤＴ電極１１と第２ＩＤＴ電極とは同一直線上に配置されている。第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極１２の電極指の本数、隣接する電極指同士の距離、ならびに電極指の交差幅などをパラメータとして周波数特性を設計することができる。ＩＤＴ電極によって励振されるＳＡＷとしては、種々の振動モードのものが存在するが、本実施形態に係る検出素子３においては、例えばＳＨ波とよばれる横波の振動モードを利用している。

なお、第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極１２のＳＡＷの伝搬方向（幅方向）における外側に、ＳＡＷの反射抑制のための弾性部材を設けてもよい。ＳＡＷの周波数は、例えば、数メガヘルツ（ＭＨｚ）から数ギガヘルツ（ＧＨｚ）の範囲内において設定可能である。中でも、数百ＭＨｚから２ＧＨｚとすれば、実用的であり、且つ検出素子３の小型化ひいてはセンサ１００の小型化を実現することができる。

（引出し電極１９、２０）
図４に示すように、第１引出し電極１９は、第１ＩＤＴ電極１１に接続されており、第２引出し電極２０は、第２ＩＤＴ電極１２に接続されている。第１引出し電極１９は、第１ＩＤＴ電極１１から検出部１３とは反対側に引き出され、第１引出し電極１９の端部１９ｅは第１カバー部材１に設けた配線７に電気的に接続されている。第２引出し電極２０は、第２ＩＤＴ電極１２から検出部１３とは反対側に引き出され、第２引出し電極２０の端部２０ｅは配線７に電気的に接続されている。

ここで、第１ＩＤＴ電極１１、第２ＩＤＴ電極１２、第１引出し電極１９および第２引出し電極２０は、例えばアルミニウムあるいはアルミニウムと銅との合金などからなる。また、これらの電極は、多層構造としてもよい。多層構造とする場合は、例えば、１層目にチタンまたはクロムを含め、２層目にアルミニウムまたはアルミニウム合金を含めることができる。

（検出部１３）
検出部１３は、図４に示すように、基体１０の表面であって、第１ＩＤＴ電極１１から第２ＩＤＴ電極１２へと伝搬する弾性波の伝搬路に位置している。以下、上述した本実施形態に係るＲＮＡアプタマー１３０を用いた例について説明する。

例えば、検出部１３は、図１２（ａ）に示すように、基体１０に固定化された複数のＳＡ１３４と、複数のＳＡ１３４にそれぞれ結合している複数のビオチン１３１ａと、複数のビオチン１３１ａに二本鎖１３３を介してそれぞれ結合している複数のＲＮＡアプタマー（結合部）１３０とを有する。すなわち、ＲＮＡアプタマー（結合部）１３０は末端領域１３０ｃに二本鎖１３３を介してビオチン１３１ａを有する。そして、二本鎖１３３は、ＲＮＡアプタマー１３０の３´末端に付加されたＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）と、ビオチン１３１ａに結合している５´−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）とが塩基対を形成した構成を有する。

なお、検出部１３の変形例として、図１２（ｂ）に示すような構成にしてもよい。

本変形例において、検出部１３は、基体１０の表面に位置している固定化膜１３ａと、固定化膜１３ａに結合している鎖状物質（ＳＡＭ）１３ｃと、ＳＡＭに結合している複数のＳＡ１３４と、複数のＳＡ１３４にそれぞれ結合している複数のビオチン１３１ａと、複数のビオチン１３１ａにそれぞれ結合している複数のＲＮＡアプタマー（結合部）１３０とを有するようにすることができる。ここで、固定化膜１３ａを形成する物質としては、例えばＡｕ（金）、Ｔｉ、およびＣｕなどを用いることができ、Ａｕが好ましい。なお、固定化膜１３ａは、例えば、金の膜、あるいはクロムの膜上に成膜された金の膜からなる２層構造としてもよい。また、基体１０と固定化膜１３ａとの間に保護膜１３ｂを介在させてもよい。また、鎖状物質１３ｃとしては、例えば、アルカン、ポリエチレングリコール、あるいはアルカンとポリエチレングリコールとの複合分子などが挙げられる。

また、検出部１３の変形例として、図１３（ａ）に示すような構成にしてもよい。

本変形例において、検出部１３のＲＮＡアプタマー１３０は末端領域１３０ｃにアミノ基を有している。この場合には、このアミノ基１３１ｃとアミド結合を形成している第１物質１３２（鎖状物質１３ｃ）を有するようにすればよい。ここで、第１物質１３２としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。この際、アミノ基１３１ｃは、ポリエチレングリコールの末端に修飾されたカルボキシル基とアミド結合を形成することとなる。そして、ポリエチレングリコールの他の末端に修飾されたチオール基１３１ｂを介して、他の部材と固定化することができる。具体的には、検出部１３は、図１３（ａ）に示すように、基体１０の表面に位置している固定化膜（Ａｕ）１３ａと、固定化膜１３ａに結合している複数の鎖状物質（ポリエチレングリコール）１３ｃと、複数の鎖状物質１３ｃにアミノ基１３１ｃを介してそれぞれ結合している複数のＲＮＡアプタマー（結合部）１３０とを有するようにすることができる。そして、ポリエチレングリコールの末端に位置するカルボキシル基を活性エステル化して、ＲＮＡアプタマー１３０と結合させればよい。

また、検出部１３の変形例として、図１３（ｂ）に示すような構成にしてもよい。

本変形例において、検出部１３のＲＮＡアプタマー１３０は末端領域１３０ｃにチオール基１３１ｂを有している。この場合には、金−チオール結合によって金と結合させることができる。それ故、チオール基１３１ｂと結合した金を介して、他の部材に対して比較的容易に固定化させることができる。具体的には、検出部１３は、図１３（ｂ）に示すように、基体１０の表面に位置している固定化膜（Ａｕ）１３ａと、固定化膜１３ａにそれぞれ結合している複数の鎖状物質（ポリエチレングリコール）１３ｃおよび複数のＲＮＡアプタマー（結合部）１３０と、を有するようにすることができる。

ここで、センサ１００の幅方向に沿って配置された第１ＩＤＴ電極、第２ＩＤＴ電極および検出部１３を１セットとすると、本実施形態に係るセンサ１００には、図４に示すように、そのセットが２つ設けられている。これにより、一方の検出部１３で反応する検出対象を、他方の検出部１３で反応する検出対象と異なるように設定することによって、１つのセンサで２種類の検出対象の検出を行なうことが可能となる。例えば、一方の検出部１３にＨｂと特異的に結合可能なＲＮＡアプタマー１３０を設け、他方の検出部１３にＨｂＡ１ｃと特異的に結合可能な抗体を設けるようにしてもよい。このように異なる検出対象に用いるアプタマーと抗体とをセットで使用することで、複数の検出対象を同時に検出することができる。例えば図１６に示すように、ＨｂとＨｂＡ１ｃとを同時に測定したデータを用いて、ＨｂにおけるＨｂＡ１ｃの比率を算出することができる。また、２つのうち１つのセットについては、検出部１３の代わりに、参照用電極を設けてリファレンス部として用いてもよい。

（検出素子３を用いた検出対象の検出）
ＳＡＷを利用した検出素子３において検体液の検出を行なうには、まず、第１ＩＤＴ電極１１に、配線７や第１引出し電極１９などを介して外部の測定器から所定の電圧を印加する。そうすると、第１ＩＤＴ電極１１の形成領域において基体１０の表面が励振され、所定の周波数を有するＳＡＷが発生する。発生したＳＡＷは、その一部が検出部１３に向かって伝搬し、検出部１３を通過した後、第２ＩＤＴ電極１２に到達する。検出部１３では、検出部１３のＲＮＡアプタマー１３０が検体液中のヘモグロビンと結合し、結合した分だけ検出部１３の重さが変化するため、検出部１３の下を通過するＳＡＷの位相などの特性が変化する。このように特性が変化したＳＡＷが第２ＩＤＴ電極に到達すると、それに応じた電圧が第２ＩＤＴ電極に生じる。この電圧が第２引出し電極２０、配線７などを介して外部に出力され、それを外部の測定器で読み取ることによって、検体液の性質や成分を調べることができる。

ここで、検体液を検出部１３に誘導するために、センサ１００では毛細管現象を利用する。

具体的には、上述のように、流路１５は、第２カバー部材２が中間カバー部材１Ａに接合されることによって、第２カバー部材２の下面に細長い管状となる。そのため、検体液の種類、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２の材質などを考慮して、流路１５の幅あるいは径などを所定の値に設定することによって、細長い管状の流路１５に毛細管現象を生じさせることができる。流路１５の幅は、例えば０．５ｍｍ〜３ｍｍであり、深さは、例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍである。なお、流路１５は、検出部１３を超えて延びた部分である下流部（延長部）１５ｂを有し、第２カバー部材２には延長部１５ｂにつながった排気孔１８が形成されている。そして、検体液が流路１５内に入ってくると、流路１５内に存在していた空気は排気孔１８から外部へ放出される。

このような毛細管現象を生じる管を、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２を含むカバー部材によって形成すれば、流入部１４に検体液を接触させることによって、検体液が流路１５を流れてカバー部材の内部に吸い込まれていく。このように、センサ１００は、それ自体が検体液の吸引機構を備えているため、ピペットなどの器具を使用することなく検体液の吸引を行なうことができる。

（流路１５の親液性）
本実施形態に係るセンサ１００においては、流路１５の内面全体、あるいは内面の一部、例えば流路１５の底面および壁面などが親液性を有している。流路１５の内面が親液性を有することによって、毛細管現象が起こり易くなり、検体液が流入部１４から吸引され易くなる。

流路１５の内面のうち親液性を有する部分は、例えば水との接触角が６０°以下になるようにすればよい。接触角が６０°以下であれば、毛細管現象がより起こり易くなり、検体液を流入部に接触させたときの検体液の流路１５内への吸引がより確実なものとなる。以下、図３（ａ）を用いて詳細に説明する。図３（ａ）は図２（ｂ）のセンサ１００の一部を拡大して示す断面図である。

流路１５の内面が親液性を有するようにするには、例えば、流路１５の内面に新液化（親水化）処理を施す方法、流路１５の内面に親液性のフィルムを貼り付ける方法、および流路１５を構成するカバー部材２を親液性の材料で形成する方法などを採用することができる。中でも、流路１５の内面に親液化処理を施す方法および流路１５の内面に親液性のフィルムを貼り付ける方法を用いれば、検体液が親液性の部分に沿って流路１５内を流れていくため、検体液が意図しない場所へ流れることを抑制して、精度の高い測定をすることができる。また、これらの方法によれば、疎液性（疎水性）の材料からなるカバー部材を用いる場合においても、毛細管現象を起こすことができるため、カバー部材として使用することができる材料の選択肢が増えるという利点もある。

流路１５の内面に親液化処理を施す方法としては、例えば親水化処理であれば、流路１５の内面を酸素プラズマによってアッシングにより表面の官能基を変化させた後、シランカップリング剤を塗布し、最後にポリエチレングリコールを塗布すればよい。その他にも、流路１５の内面を、ホスホリルコリンを有する処理剤を用いて表面処理するという方法もある。

また、親液性のフィルムを貼り付ける方法において、親液性のフィルムとしては、親水化処理が施された市販のポリエステル系のフィルムあるいはポリエチレン系のフィルムなどを使用することができる。親液性のフィルムは、流路１５の上面、側面、あるいは下面にのみ形成するようにしてもよく、これらを組み合わせてもよい。

（流路１５と検出素子３との位置関係）
本実施形態において、検体液の流路１５は深さが０．３ｍｍ程度であるのに対し、検出素子３は厚みが０．３ｍｍ程度であり、図２（ｂ）に示すように、流路１５の深さと検出素子３の厚さとがほぼ等しい。そのため、流路１５上に検出素子３をそのまま置くと流路１５が塞がれてしまう。そこで、センサ１００においては、図２（ｂ）および図３に示すように、検出素子３が実装される第１カバー部材１と第１カバー部材１上に接合される中間カバー部材１Ａとによって素子収容凹部５を設けている。この素子収容凹部５の中に検出素子３を収容することによって、検体液の流路１５が塞がれないようにしている。すなわち、素子収容凹部５の深さを検出素子３の厚みと同程度にし、その素子収容凹部５の中に検出素子３を実装することによって、流路１５を確保することができる。

検体液の流路１５を十分に確保する観点からは、図２（ｂ）および図３に示すように、素子収容凹部５の底面から基体１０の上面までの高さを、素子収容凹部５の深さと同じかまたはそれよりも小さく（低く）しておくとよい。例えば、基体１０の上面の素子収容凹部５の底面からの高さを素子収容凹部５の深さと同じにしておけば、流入部１４から流路１５の内部を見たときに、流路１５の底面と検出部１３とをほぼ同一高さとすることができる。

なお、素子収容凹部５の平面形状は、例えば基体１０の平面形状と相似の形状としてもよく、素子収容凹部５は基体１０よりも若干大きく設定すればよい。より具体的には、素子収容凹部５は、基体１０を素子収容凹部５に実装したときに、基体１０の側面と素子収容凹部５の内壁との間に２００μｍ程度の隙間が形成されるような大きさである。

検出素子３は、例えばエポキシ樹脂、ポリイミド樹脂またはシリコーン樹脂などを主成分とするダイボンド材によって、素子収容凹部５の底面に固定されている。

第１引出し電極１９の端部１９ｅと配線７とは、例えばＡｕなどからなる金属細線２７によって電気的に接続されている。第２引出し電極２０の端部２０ｅと配線７との接続も同様である。なお、第１引出し電極１９および第２引出し電極２０と配線７との接続は、金属細線２７によるものに限らず、例えばＡｇペーストなどの導電性接着材によるものでもよい。第１引出し電極１９および第２引出し電極２０と配線７との接続部分には空隙が設けられているため、第２カバー部材２を第１カバー部材１に貼り合わせた際に、金属細線２７の破損が抑制される。第１引出し電極１９、第２引出し電極２０、金属細線２７および配線７は、絶縁性部材２８によって覆われている。第１引出し電極１９、第２引出し電極２０、金属細線２７および配線７が絶縁性部材２８で覆われていることによって、これらの電極などが腐食することを抑制することができる。

以上のように、本実施形態に係るセンサ１００によれば、検出素子３を第１カバー部材１の素子収容凹部５に収容したことによって、流入部１４から検出部１３に至る検体液の流路１５を確保することができ、毛細管現象などによって流入部から吸引された検体液を検出部１３まで流すことができる。すなわち、厚みのある検出素子３を用いつつ、それ自体に吸引機構を備えたセンサ１００を提供することができる。

次に、実施形態に係るセンサ１００の変形例について説明を行なう。

＜変形例＞
図７は、図２のセンサ１００の変形例に係るセンサ１００ａ、１００ｂ、１００ｃを示す平面図であり、図７（ａ）および図７（ｂ）は図６（ｄ）に対応する図であり、図７（ｃ）は図２（ａ）に対応する図である。

本変形例に係るセンサ１００ａ、１００ｂは、上述の実施形態に係るセンサ１００とは異なり、中間カバー部材１Ａの幅および第２カバー部材２の幅が検出素子３の幅よりも大きい。センサ１００ａは、図７（ａ）に示すように、検出素子３の下流において、第１カバー部材１の上に中間カバー部材１Ａ（第２下流部１Ａｂ）が設けられていない。それに対して、センサ１００ｂは、図７（ｂ）に示すように、検出素子３の下流において、第１カバー部材１の上に中間カバー部材１Ａ（第２下流部１Ａｂ）が設けられている。

次に、本変形例に係るセンサ１００ｃは、上述の実施形態に係るセンサ１００と比較して、検出素子３に対する端子６の配置が異なる。

具体的には、センサ１００では、図２に示すように、端子６は、検出素子３のうち流入部１４側の端部よりも排気孔１８側に配置されている。これに対して、本変形例のセンサ１００ｃでは、図７（ｃ）に示すように、端子６のうち少なくとも一部は、検出素子３のうち流入部１４側の端部よりも流入部１４側に配置されている。

また、流路１５の長手方向を基準にして検出素子３の一方側に配列している４つの端子６において、外側の２つの端子６に接続される配線７の長さが互いに略同一であり、また、内側の２つの端子６に接続される配線７の長さが互いに略同一である。これによれば、検出素子３で得られる信号が、配線７の長さによってばらつくことを抑制することが可能となる。さらに、例えば、一方の略同一の長さの配線７が、検出素子３の検出部１３において検出対象を検出する部位に接続され、他方の略同一の長さの配線７が、検出素子３の検出部において検出対象に対する参照電極に接続される構成とすれば、上記の信号のばらつきを抑制することが可能となり、検出の信頼性を向上させることが可能となる。

図８は、図２のセンサ１００の変形例に係るセンサ１０１を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は長さ方向の断面図、（ｃ）は幅方向の断面図である。

本変形例に係るセンサ１０１は、上述の実施形態に係るセンサ１００とは異なり、第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極１２は、絶縁性部材２８によって覆われている。

絶縁性部材２８は、第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極１２の酸化防止などに寄与するものである。絶縁性部材２８は、例えば、酸化珪素、酸化アルミニウム、酸化亜鉛、酸化チタン、窒化珪素またはシリコンによって形成されている。絶縁性部材２８の厚さは、例えば、第１ＩＤＴ電極１１および第２ＩＤＴ電極の厚さの１／１０程度（１０〜３０ｎｍ）である。絶縁性部材２８は、第１引出し電極１９の端部１９ｅおよび第２引出し電極２０の端部２０ｅを露出するようにして、基体１０の上面全体に亘って形成されてよい。

また、本変形例に係るセンサ１０１は、上述の実施形態に係るセンサ１００とは異なり、検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間隙に充填部材９が設けられている。

充填部材９は、中間カバー部材１Ａおよび基体１０とは異なる材料を含むようにすることができ、例えばＰＤＭＳなどの樹脂材料を用いることができる。なお、充填部材９は、検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間隙の全ての領域に設けられる必要はなく、例えば流路１５に対応する部位のみに設けるようにしてもよい。検出素子と中間カバー部材との間隙に充填部材が位置していることから、間隙による毛細管現象の阻害を抑制することができ、検体液をよりスムーズに検出素子に向けて吸引することが可能となる。

図９は、図８のセンサ１０１の製造工程を示す平面図である。
まず、図９（ａ）に示すように、端子６および配線７が形成された第１カバー部材１を用意する。

次に、図９（ｂ）に示すように、第１カバー部材１の上に、中間カバー部材１Ａを積層する。ここで、中間カバー部材１Ａは、第１上流部１Ａａと第１下流部１Ａｂとからなる。

次に、図９（ｃ）に示すように、中間カバー部材１Ａの第１上流部１Ａａと第１下流部１Ａｂとの間に、検出素子３を金属細線２７を用いて実装する。ここで、第１カバー部材１の上に、中間カバー部材１Ａおよび検出素子３を載置する工程は、いずれを先に実行してもよい。

次に、図９（ｄ）に示すように、検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間の間隙に、充填部材９を配置する。

次に、図９（ｅ）に示すように、中間カバー部材１Ａの上に、第２カバー部材２の第３基板２ａを積層する。

そして、図９（ａ）に示すように、第３基板２ａの上に第４基板２ｂを積層することによって、本実施形態に係るセンサ１０１が製造される。

図１０は、図２のセンサ１００の変形例に係るセンサ１０１ａを示す図であり、特に製造工程を示す図である。

本変形例に係るセンサ１０１ａは、上述の実施形態に係るセンサ１００とは異なり、上面視において、検出素子３が中間カバー部材１Ａで全周を囲まれている。そして、充填部材９は、図１０（ｄ）および図１０（ｅ）に示すように、検出素子３の外周を囲うように、検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間隙に位置している。これによれば、流路１５において検出素子３とその周囲との段差あるいは隙間を低減することができることから、検体液をスムーズに検出素子３上に流すことが可能となる。また、充填部材９は、検出素子３と端子６との領域において、配線７の一部および検出素子３と配線７とを接続する導線２７を覆うことができることから、これらと検体液との接触による検出感度の低下を抑制することが可能となる。

なお、本変形例では、図１０（ｂ）に示すように中間カバー部材１Ａと検出素子３とを形成した上で、図１０（ｃ）に示すように検出素子３と配線７とを導線２７によって接続している。これに代えて、検出素子３を形成し、検出素子３と配線７とを導線２７によって接続した後で、中間カバー部材１Ａを形成するようにしてもよい。

図１１は、図２のセンサ１００の変形例に係るセンサ１０１ｂ、１０１ｃを示す平面図であり、図６（ｅ）に対応する図である。

本変形例に係るセンサ１０１ｂ、１０１ｃは、上述の実施形態に係るセンサ１００とは異なり、充填部材９は、図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示すように、検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間隙のうち、流路１５の長手方向に沿うように位置している。これによれば、検出素子３とその両側との段差を低くあるいは隙間を狭くすることができることから、検出素子３に対して側方からも検体液をスムーズに流すことが可能となる。また、充填部材９は、検出素子３と端子６との領域において、配線７の一部および検出素子３と配線７とを接続する導線２７を覆うことができることから、これらと検体液との接触による検出感度の低下を抑制することが可能となる。

また、図１１（ｂ）に示すように、充填部材９を検出素子３と中間カバー部材１Ａとの間隙のみならず、検出素子３と配線７とを接続するための導線２７のうち検出素子３（基体１０）の上面に位置している部分をも覆うことができる。これによれば、導線２７と検体液との接触による検出感度の低下をさらに抑制することが可能となる。

上述した実施形態に係るＲＮＡアプタマーおよびこれを用いたセンサの実施例について以下に説明する。

第１実施例

分子間相互作用解析装置であるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ヘルスケア製）を用いて評価を実施した。この装置は、４つのフローセルを有している。

評価用の基板（基体）として、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ ヘルスケア製）を用いた。

以下において、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ上に、各種のＲＮＡアプタマーを固定化し、ヘモグロビンを検出する手順を示す。

ここで、ヘモグロビン検体として、アブカム株式会社製のＨｕｍａｎ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ （ａｂ７７８５８）を用いた。

また、ランニング緩衝液として、ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ ヘルスケア製）にＭｇＣｌ２が１ｍＭ含有されるようにＭｇＣｌ２を追加したものを用いた（以下、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）と記す。）。

（１） 全てのフローセルを、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。

（２） 上記（１）を２回繰り返した。

（３） フローセルの１つ（以下、Ｆｃ２と記す。）に、５´末端にビオチンを有する５μＭ の ５´−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）を、流速５μｌ／ｍｉｎで６分間流して固定化した。この際、希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行なった。

（４） Ｆｃ２に、５´末端にビオチンを有する５μＭ の ５´−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）を、流速５μｌ／ｍｉｎで２分間流して固定化した。

（５） フローセルの１つ（以下、Ｆｃ１と記す。）に、１ｍｇ／ｍｌビオチンを流速５μｌ／ｍｉｎで６分間流して固定化する。この際、希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行なった。

（６） 全てのフローセルを、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。

（７） 上記（６）を１回繰り返した。

（８） Ｆｃ２に、２μＭＲＮＡアプタマーを流速５μｌ／ｍｉｎで４分間流して固定化した。ここで、ＲＮＡアプタマーとして、３´末端にＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）を付加し、ＣとＵは２´位がフッ素基に置換されており、予めアニール処理したものを用いた。この際、希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行なった。

（９） 全てのフローセルに、１μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間流し、その後１分間の解離状態をモニターした。

（１０） 全てのフローセルに、１０μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間流し、その後１分間の解離状態をモニターした。

（１１） 全てのフローセルを、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。この作業により、ＲＮＡアプタマーが外れて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡは上記（７）が完了した状態に戻る。

（１２） その後、上記（８）〜（１１）を繰り返し、表１に示す各種のＲＮＡアプタマーを順に評価した。これらの評価結果について、表２に示す。なお、表２に記載の配列の塩基数は、表１に記載された配列の３´末端にＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）を付加した配列の塩基数を示す。

表２は、アプタマーの固定化量およびＨｂの検出量とともに、ＲＮＡアプタマー１つ当たりのＨｂの結合割合を示している。そして、その結合割合の値が０．２以上の場合を◎とし、０．１以上０．２未満の場合を○とし、０よりも大きく０．１未満の場合を△とし、０以下の場合を×とした。

これによれば、表１に示されるように、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備えるＲＮＡアプタマーを用いると、いずれについてもＨｂに結合することが分かった。特に、Ｎｏ．３，８，９，１１，１２，２８，および３３のＲＮＡアプタマーは、Ｈｂとの高い結合力を示した。

また、図１４（ａ）は、上述の手順（９）において、ヘモグロビン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)およびヒトＩｇＧ（ｈ-ＩｇＧ）の３種それぞれを検体とした結果を示している。これによると、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備えるＲＮＡアプタマーは、上述の通りヘモグロビンとは特異的に結合し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)およびヒトＩｇＧ（ｈ-ＩｇＧ）とは結合しない傾向があることが分かった。

図１４（ｂ）は、上述の手順（９）において、表１に示す６Ｒ_１１のＲＮＡアプタマーを用いて、ヘモグロビンの分画成分との結合について測定した結果を示している。具体的には、時間０秒の時点で、フローセルに、Ｈｂ、ＨｂＡ０およびＨｂＳのそれぞれを検体として注入した。１２０秒までがアプタマーと標的との結合であり、１２０秒からは解離信号を示す。縦軸がアプタマーとの結合量を示す。これによると、６Ｒ_１１のＲＮＡアプタマーは、Ｈｂの分画成分のうち少なくともＨｂＡ０およびＨｂＳと結合することが分かった。

第２実施例

分子間相互作用解析装置であるＢｉａｃｏｒｅ Ｘ（ＧＥ ヘルスケア製）を用いて評価を実施した。この装置は、２つのフローセルを有している。

評価用の基板（基体）として、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ ヘルスケア製）を用いた。

以下において、「Ｓｅｒｉｅｓ Ｃｈｉｐ ＳＡ」上に、ＲＮＡアプタマーを固定化し、ヘモグロビンを検出する手順を示す。

なお、ヘモグロビン検体およびランニング緩衝液は、上述の第１実施例と同一のものを用いた。

手順（１）〜（７）は、基本的に上述の第１実施例における手順（１）〜（７）と同一とした。ただし、手順（２）において上記（１）を３回繰り返した。また、手順（７）において上記（６）を１回繰り返した。

（８） Ｆｃ２に、上述の実験と同様、２μＭ ＲＮＡアプタマーを流速５μｌ／ｍｉｎで４分間流して固定化した。この際、希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行なった。なお、ＲＮＡアプタマーとして、実施例１と同様に、３´末端にＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）を付加したものを用いた。

（９） フローセルに１μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間流し、その後１分３０秒間の解離状態をモニターした。

（１０） 全てのフローセルを、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。この作業により、ＲＮＡアプタマーが外れて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｃｈｉｐ ＳＡは（７）が完了した状態に戻る。

（１１） その後、上記（８）〜（１０）を繰り返し、表３に示す各種のＲＮＡアプタマーを順に評価した。これらの評価結果について、表４に示す。なお、表４に記載の配列の塩基数は、表３に記載された配列の３´末端にＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）を付加した配列の塩基数を示す。

表４は、上述の表２と同様に、アプタマーの固定化量およびＨｂの検出量とともに、ＲＮＡアプタマー１つ当たりのＨｂの結合割合を示している。そして、その結合割合の値が０．２以上の場合を◎とし、０．１以上０．２未満の場合を○とし、０よりも大きく０．１未満の場合を△とし、０以下の場合を×とした。

これによれば、表４に示されるように、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備えるＲＮＡアプタマーを用いると、いずれについてもＨｂと特異的に結合することが分かった。特に、Ｎｏ．１０１，１０２，１０３，１０４および１０６のＲＮＡアプタマーは、Ｈｂとの高い結合力を示した。また、上述の第１実施例における各種アプタマーのように、本実施例における短鎖の各種アプタマーにおいても、Ｈｂと特異的に結合することが分かった。

第３実施例（末端にビオチンを有する例）

以下において、実装基板上に、ＲＮＡアプタマーを固定化し、ヘモグロビンを検出する手順を示す。ここで、本実施例において、表１に示す６Ｒ_２８の一部の配列を有するＲＮＡアプタマーを用いた。具体的には、ＣＧＵＡＵＵＡＣＧＧＣＡＵＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡＡＵＧＣＵＧＡＧＵＡＣＧ（配列番号６０）の配列からなるＲＮＡアプタマーを用いた。なお、後述する第４実施例および第５実施例においても同一のＲＮＡアプタマーを用いた。

（１） 検出素子３を準備した。なお、固定化膜１３ａとしてＡｕ（金）を用いる。

（２） 検出部１３を含む領域をピラニア溶液（濃硫酸と３０％過酸化水素の混合溶液）で洗浄した。

（３） 検出部１３を含む領域を水およびエタノールでリンスした。
続く手順である下記（４）〜（７）において、固定化膜Ａｕ上にアプタマーを固定化した。

（４） ３，３´−ジチオジプロピオン酸を検出部１３を含む領域に滴下し、１０分間放置後、水で洗浄した。

（５） １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド水溶液とＮ−ヒドロキシスクシンイミド水溶液との混合液を検出部１３を含む領域に滴下し、２０分間放置後、水で洗浄することにより、３，３´−ジチオジプロピオン酸の末端に位置するカルボキシル基を活性エステル化した。

（６） １ｍＭＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８．０）液に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でストレプトアビジンを溶解した溶液を検出部１３を含む領域に滴下し、２０分間放置後、１ｍＭＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８．０）液で洗浄することにより、エステル化したカルボキシル基とストレプトアビジン中のアミノ残基とをアミド結合させた。

（７） １ｍＭＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８．０）液をＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）に置換した後、５´末端にビオチンを有するＲＮＡアプタマーの濃度が５μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈した溶液を検出部１３を含む領域に滴下し、５分間放置後、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で洗浄した。なお、参照電極を形成する際には、この処理は行なわなかった。

（８） １１．６μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を、流路１５を用いて検出素子３に導入し、５分間反応させた際に生じる位相変化量を測定した。
これによれば、結合力の高いＳＡおよびビオチンの結合を用いることで、ＲＮＡアプタマーを高い安定性にて固定化することができ、Ｈｂを検出することができた。

第４実施例（末端にアミノ基を有する例）

以下において、実装基板上に、ＲＮＡアプタマーを固定化し、ヘモグロビンを検出する手順を示す。

（１）〜（３）は、上述の第３実施例における（１）〜（３）と同一とした。

続く手順である下記（４）〜（６）において、固定化膜Ａｕ上にアプタマーを固定化した。

（４） 平均分子量２０００ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解させたリン酸緩衝液を、検出部１３を含む領域に滴下し、５分間放置後、リン酸緩衝液で洗浄した。ここで、ＰＥＧの末端は、一方がチオール基であり、もう一方がカルボキシル基である。

（５） リン酸緩衝液を水に置換し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド水溶液とＮ−ヒドロキシスクシンイミド水溶液との混合液を検出部１３を含む領域に滴下し、２０分間放置後、水で洗浄することにより、３，３´−ジチオジプロピオン酸の末端に位置するカルボキシル基を活性エステル化した。

（６） 水を除去し、５´末端にアミノ基を有するＲＮＡアプタマーの濃度が５μＭとなるようにＨＢＳ−Ｎ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を滴下し、５分間放置後、処理した。なお、参照電極を形成する際には、この処理は行なわなかった。

（７） １１．６μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を、流路１５を用いて検出素子３に導入し、５分間反応させた際に生じる位相変化量を測定した。

これによれば、ＲＮＡアプタマーを固定化する際に、金への非特異結合が抑制され、ＰＥＧの末端にＲＮＡアプタマーを優れた配向性にて結合させることができ、Ｈｂを検出することができた。

第５実施例（末端にチオール基を有する例）

以下において、実装基板上に、ＲＮＡアプタマーを固定化し、ヘモグロビンを検出する手順を示す。

（１）〜（３）は、上述の第３実施例における（１）〜（３）と同一とした。

続く手順である下記（４）〜（１０）において、固定化膜Ａｕ上にアプタマーを固定化した。

（４） 検出側のＡｕ膜上に、５´末端にチオール基を有するＲＮＡアプタマーを、検出側のＡｕ膜上に滴下し、５分間流して放置した。この際、ＲＮＡアプタマーは、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）に溶解させた。

（５） 検出側および参照側のそれぞれのＡｕ膜上に、平均分子量２０００ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解させたリン酸緩衝液を滴下し、５分間放置した。ここで、ＰＥＧの末端は、チオール基、もう一方がメトキシ基である。

（６） 上記（５）を２回繰り返した。

（７） １０ｍＭ ＮａＯＨを用いて、検出部１３を含む領域を洗浄した。

（８） 検出側および参照側のそれぞれのＡｕ膜上に、平均分子量１０００ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解させたリン酸緩衝液を滴下し、５分間放置した。ここで、ＰＥＧの末端は、一方がチオール基、もう一方がメトキシ基である。

（９） 上記（８）を３回繰り返した。

（１０） １０ｍＭ ＮａＯＨを用いて、検出部１３を含む領域を洗浄した。

（１１） １１．６μＭとなるようにＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）で希釈したヘモグロビン検体を、流路１５を用いて検出素子３に導入し、５分間反応させた際に生じる位相変化量を測定した。同様に、検体として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)を用いて測定を行なった。これらの測定結果について、図１５（ａ）に示す。また、ヘモグロビン検体については、各種濃度にて測定を行なった。この測定結果について、図１５（ｂ）に示す。

図１５（ａ）は、時間０秒の時点で検出素子３に検体を導入し、３００秒までアプタマーと標的の結合を観測した結果を示している。縦軸がアプタマーと標的が結合した際の位相変化量を示す。

これにより、ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備えるＲＮＡアプタマーは、Ｈｂと特異的に結合することが可能であるとともに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ)とは結合しない傾向があることが分かった。

図１５（ｂ）は、ＲＮＡアプタマーと検体であるＨｂ濃度との関係性を示している。ここでは、各検体濃度に対して、検体導入後１８０秒から３００秒の位相変化量の平均値を取得して示している。

これにより、ＲＮＡアプタマーは、Ｈｂの濃度が高くなるにつれて、Ｈｂとの結合割合が高くなることが分かった。

本発明は、以上の実施形態に限定されず、種々の態様で実施されてよい。
例えば、上述した実施形態においては、検出部１３が金属膜と金属膜の表面に固定化されたＲＮＡアプタマー１３０からなるものについて説明したが、金属膜に代えて、導電性を有さない膜の表面にＲＮＡアプタマー１３０を固定化してもよい。

また、上述した実施形態においては、検出素子３が弾性表面波素子からなるものについて説明したが、検出素子３はこれに限らず、例えば、表面プラズモン共鳴が起こるように光導波路などを形成した検出素子３を用いてもよい。この場合は、例えば、検出部における光の屈折率の変化などを計測する。その他、水晶などの圧電基板に振動子を形成した検出素子３を用いることもできる。この場合は、例えば、振動子の発振周波数の変化を計測する。

また、検出素子３として、１つの基板上に複数種類のデバイスを混在させても構わない。例えば、ＳＡＷ素子の隣に酵素電極法の酵素電極を設けてもよい。この場合は、抗体やＲＮＡアプタマーを用いた免疫法に加えて酵素法での測定も可能となり、１度に検査できる項目を増やすことができる。

また、上述した実施形態においては、検出素子３が１個設けられている例について説明したが、検出素子３を複数個設けてもよい。この場合、検出素子３ごとに素子収容凹部５を設けてもよいし、全ての検出素子３を収容できるような長さあるいは幅を有する素子収容凹部５を形成するようにしてもよい。

また、上述した実施形態においては、第１カバー部材１、中間カバー部材１Ａおよび第２カバー部材２がそれぞれ別部材である例を示したが、これに限らず、いずれかの部材同士が一体化されたものを用いてもよい。

本発明は、以下の実施形態が可能である。

（１）ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列を備える、ＲＮＡアプタマー。
（ここで、塩基がアデニンであるヌクレオチドをＡ、塩基がグアニンであるヌクレオチドをＧ、塩基がシトシンであるヌクレオチドをＣ、および、塩基がウラシルであるヌクレオチドをＵ、と表記する。）

（２）前記配列の両端に位置している前記Ｕの塩基と前記Ａの塩基とが第１塩基対を構成している第１領域を有する、ＲＮＡアプタマー。

（３）前記第１領域の前記Ｕは、前記第１領域の前記Ａよりも、５´末端側に位置している、ＲＮＡアプタマー。

（４）前記第１領域は、前記第１塩基対を構成する前記Ｕおよび前記Ａのうち少なくとも一方に結合する複数のヌクレオチドをさらに有する、ＲＮＡアプタマー。

（５）前記複数のヌクレオチドは、
前記第１塩基対を構成する前記Ｕに結合している少なくとも一つのヌクレオチドからなる第１配列と、
前記第１塩基対を構成する前記Ａに結合している少なくとも一つのヌクレオチドからなる第２配列と、を有する、ＲＮＡアプタマー。

（６）前記第１領域は、前記第１配列と前記第２配列とが少なくとも一つの塩基対を構成している第１部位を有する、ＲＮＡアプタマー。

（７）前記第１領域は、前記第１配列と前記第２配列とが塩基対を構成していない第２部位をさらに有する、ＲＮＡアプタマー。

（８）前記第１塩基対を構成している前記Ｕから前記Ａへと、ＡＵＵＡＧＧＡＣＣの順に結合している第２領域とをさらに有する、ＲＮＡアプタマー。

（９）前記配列において前記Ｃおよび前記Ｕのうち少なくとも一方は、ヌクレオチドの２´位にフッ素基を有する、ＲＮＡアプタマー。

（１０）末端に位置しているビオチンをさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１１）前記ビオチンに結合しているストレプトアビジンをさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１２）末端に位置しているチオール基をさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１３）前記チオール基に結合しているＡｕをさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１４）末端に位置しているアミノ基をさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１５）前記アミノ基とアミド結合を形成している第１物質をさらに備える、ＲＮＡアプタマー。

（１６）前記第１物質は、ポリエチレングリコールを有する、ＲＮＡアプタマー。

（１７）基体と、
前記基体に固定化されている、ＲＮＡアプタマーと、を備える、センサ。

（１８）前記ＲＮＡアプタマーおよび前記基体の間に位置し、前記ＲＮＡアプタマーおよび前記基体の少なくとも一方と結合している、固定化部材、をさらに備えるセンサ。

１・・・第１カバー部材
１Ａ・・・中間カバー部材
１Ａａ・・・第１上流部
θ１ａ・・・接触角
１Ａｂ・・・第１下流部
θ１ｂ・・・接触角
２・・・第２カバー部材
２ａ・・・第３基板
２ｂ・・・第４基板
２ｂａ・・・第２上流部
θ２ａ・・・接触角
２ｂｂ・・・第２下流部
θ２ｂ・・・接触角
３・・・検出素子
３ａ・・・上流領域
θ３ａ・・・接触角
３ｂ・・・検出領域（検出部）
θ３ｂ・・・接触角
３ｃ・・・下流領域
θ３ｃ・・・接触角
４・・・凹部形成部位
５・・・素子収容凹部
６・・・端子
７・・・配線
９・・・充填部材
１０・・・基体
１１・・・第１ＩＤＴ電極
１２・・・第２ＩＤＴ電極
１３（３ｂ）・・・検出部
１３ａ・・・固定化膜（固定化部材）
１３ｂ・・・保護膜
１３ｃ・・・鎖状物質
１３０・・・ＲＮＡアプタマー（結合部）
Ｓ・・・配列
１３０ａ・・・第１領域
１３０ａ１・・・第１塩基対
１３０ａ１１・・・第１端部
１３０ａ１２・・・第２端部
１３０ａａ・・・第１配列
１３０ａｂ・・・第２配列
１３０ａｘ・・・第１部位
１３０ａｙ・・・第２部位
１３０ｂ・・・第２領域
１３０ｃ・・・末端領域
１３０ｃ１・・・・３´末端
１３０ｃ２・・・・５´末端
１３１ａ・・・ビオチン
１３１ｂ・・・チオール基
１３１ｃ・・・アミノ基
１３２・・・第１物質
１３３・・・二本鎖
１３４・・・ストレプトアビジン
１３５・・・検出対象（ヘモグロビン）
１４・・・流入部
１５・・・流路
１５ａ・・・上流部
１５ｂ・・・下流部（延長部）
１８・・・排気孔
１９・・・第１引出し電極
１９ｅ・・・端部
２０・・・第２引出し電極
２０ｅ・・・端部
２７・・・導線（金属細線）
２８・・・絶縁性部材
３０・・・吸液材
１００、１０１・・・センサ

Claims (22)

1. ＵＡＵＵＡＧＧＡＣＣＡの順に結合した配列（配列番号１）を備え、かつ、Ｈｂに対する結合能を有する、ＲＮＡアプタマー。
   （ここで、塩基がアデニンであるヌクレオチドをＡ、塩基がグアニンであるヌクレオチドをＧ、塩基がシトシンであるヌクレオチドをＣ、および、塩基がウラシルであるヌクレオチドをＵ、と表記する。）
2. 前記配列（配列番号１）の第１端部に位置している前記Ｕは、前記配列（配列番号１）の第２端部に位置している前記Ａよりも、５´末端側に位置している、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
3. 前記配列（配列番号１）の両端に位置している、前記Ｕと前記Ａとを含む第１領域を有する、請求項１または２に記載のＲＮＡアプタマー。
4. 前記配列（配列番号１）の両端に位置している前記Ｕの塩基と前記Ａの塩基とが第１塩基対を構成しており、前記配列（配列番号１）において両端以外の塩基が塩基対を構成していない、請求項１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
5. 前記配列（配列番号１）のうちＡＵＵＡＧＧＡＣＣの順に結合している配列がループ形状を示す、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
6. 前記配列（配列番号１）の両端に位置している前記Ｕおよび前記Ａのうち少なくとも一方に結合する複数のヌクレオチドをさらに備える、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
7. 前記複数のヌクレオチドは、
   前記配列（配列番号１）の第１端部に位置している前記Ｕに結合している少なくとも１つのヌクレオチドからなる第１配列と、
   前記配列（配列番号１）の第２端部に位置している前記Ａに結合している少なくとも１つのヌクレオチドからなる第２配列と、を有する、請求項６に記載のＲＮＡアプタマー。
8. 前記第１配列と前記第２配列とが少なくとも１つの塩基対を構成している第１部位を有する、請求項７に記載のＲＮＡアプタマー。
9. 前記第１配列と前記第２配列とが塩基対を構成していない第２部位をさらに有する、請求項７または８に記載のＲＮＡアプタマー。
10. 総塩基数が、３６〜９６である、請求項１〜９のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
11. 前記第１配列の３´末端の９塩基、および前記第２配列の５´末端の９塩基のそれぞれは、ＡＣＡＵＣＵＡＣＧおよびＣＧＣＧＧＡＧＵＧ、ＵＣＵＡＣＧＵＡＵおよびＡＵＧＣＧＵＡＧＣ、ＡＣＡＵＣＵＡＣＧおよびＵＧＵＡＧＧＵＧＧ、ＡＧＡＧＵＵＧＵＣおよびＧＡＣＡＵＵＵＵＵ、ＡＣＡＵＣＵＡＣＧおよびＵＧＵＡＧＡＣＧＧ、ＵＵＡＣＧＧＣＡＵおよびＡＵＧＣＵＧＡＧＵ、またはＡＣＡＵＣＵＡＣＧおよびＣＧＣＵＡＧＡＵＧである、請求項７〜９のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
12. 配列番号５〜１２、１４〜１７、１９〜２３、２５〜３１、３３〜３７、４０〜４２、および４４〜６０のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
13. 前記配列（配列番号１）において前記Ｃおよび前記Ｕのうち少なくとも一方は、ヌクレオチドの２´位にフッ素基を有する、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
14. 末端に位置しているビオチンをさらに備える、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
15. 前記ビオチンに結合しているストレプトアビジンをさらに備える、請求項１４に記載のＲＮＡアプタマー。
16. 末端に位置しているチオール基をさらに備える、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
17. 前記チオール基に結合しているＡｕをさらに備える、請求項１６に記載のＲＮＡアプタマー。
18. 末端に位置しているアミノ基をさらに備える、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマー。
19. 前記アミノ基とアミド結合を形成している第１物質をさらに備える、請求項１８に記載のＲＮＡアプタマー。
20. 前記第１物質は、ポリエチレングリコールを有する、請求項１９に記載のＲＮＡアプタマー。
21. 基体と、
    前記基体に固定化されている、請求項１〜２０のいずれか１つに記載のＲＮＡアプタマーと、を備える、センサ。
22. 前記ＲＮＡアプタマーおよび前記基体の間に位置し、前記ＲＮＡアプタマーおよび前記基体の少なくとも一方と結合している、固定化部材、をさらに備える請求項２１に記載のセンサ。